Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
ESCUELA DE POSTGRADO
SECCIÓN DE POSTGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
DISEÑO Y CONSTRUCCIÓN DE UN SISTEMA DE
BIORREACTORES DE INMERSIÓN TEMPORAL NEUMÁTICA
PARA LA MULTIPLICACIÓN DE Ananas comosus var. ROJA
TRUJILLANA
TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS
MENCIÓN EN BIOTECNOLOGÍA AGROINDUSTRIAL Y AMBIENTAL
Autor: Br. RICHARD ANDI SOLÓRZANO ACOSTA
Asesora: Dra. ANA MARLENE GUERRERO PADILLA
Trujillo – Perú
2016
N° de Registro
JURADO DICTAMINADOR
Dra. Eva Villanueva de Cueva
PRESIDENTA
Ms. Aníbal Quintana Díaz
SECRETARIO
Dra. Ana Marlene Guerrero Padilla
MIEMBRO
i
DEDICATORIA
A Francho y Sachi mis eternos amigos
ii
AGRADECIMIENTO
Porque en la individualidad estamos solos, porque en el camino siempre aparecen las
personas que necesitamos aunque no cuándo y cómo queramos, porque tras la
adversidad al final todo parece tener sentido y las cosas haber estado escritas, porque
nada es sólo nuestro y existe sin la voluntad de otros que comparten nuestros
anhelos, quiero expresar mi agradecimiento a todos ellos.
Quiero agradecer de manera especial y sincera a mi asesora, la Dra. Marlene
Guerrero Padilla por su amabilidad y especial cuidado en la revision del presente
trabajo.
Sinceramente a la Dra. Miryam Borbor Ponce por permitirme realizar las pruebas
con el cultivo de piña roja trujillana en el laboratorio de Biotecnología de la Escuela
de Agronomía de la Universidad Naional de Trujillo.
Agradezco al Ing. Rubino Mejía Anaya por su apoyo con las plantas de piña y medio
de cultivo en el laboratorio de Biotecnología.
A la Dra. Eva Villanueva Tarazona por su orientación en el Sistema de filtrado y su
Amistad.
Al ing. Manuel Zapata por su apoyo en el Sistema de automatización con el
temporizador electrónico.
iii
Agradezco a mis padres por soportar varias veces, cortes del fluido eléctrico, ruido,
apoyo incondicional y su orientación en instalaciones eléctricas, tuberías y tiendas
plásticas que me sirvieron de mucho.
A Kathy por su compañia en todas las compras y la búsqueda de componentes y a los
amigos Raúl y Guillermo, porque hicieron más llevadero el proceso con su
curiosidad y a veces extravío.
A Felipe, quien indirectamente sin saberlo me facilitó financiar este proyecto y a la
mosca de la fruta, ella sabe lo que pasamos y todo lo que me dió.
A todos aquellos que en el proceso me dijeron “No” y me impulsaron a esforzarme el
doble.
iv
ÍNDICE
DEDICATORIA ........................................................................................................... i
AGRADECIMIENTO ................................................................................................. ii
ÍNDICE ....................................................................................................................... iv
RESUMEN .................................................................................................................. v
ABSTRACT ................................................................................................................ vi
I. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 1
II. MATERIALES Y MÉTODOS ......................................................................... 9
2.1. OBJETO DE ESTUDIO ............................................................................ 9
2.2. INSTRUMENTACIÓN O FUENTE DE DATOS .................................... 9
2.3. MÉTODOS Y TÉCNICAS ....................................................................... 9
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................... 13
3.1. Diseño del sistema de soporte o andamiaje ............................................. 13
3.2. Diseño del sistema de iluminación .......................................................... 15
3.3. Diseño del sistema de aireación .............................................................. 17
3.4. Diseño del sistema de filtrado ................................................................. 19
3.5. Diseño de los tanques o contenedores ..................................................... 21
3.6. Diseño del sistema de control y automatización ..................................... 24
3.7. Pruebas de funcionamiento ...................................................................... 26
3.8. Pruebas de cultivo de Ananas comosus var. roja trujillana ..................... 27
3.9. Determinación de la tasa de multiplicación del cultivo ........................... 29
IV. CONCLUSIONES .......................................................................................... 35
V. RECOMENDACIONES ................................................................................. 36
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 37
ANEXOS ....................................................................................................... .42
Anexo 1. Ficha técnica del filtro de venteo……...……………...……...……42
Anexo 2. Cálculo de las pérdidas de carga por fricción en las tuberías y
accesorios del sistema de aireación………..…………………………..……45
v
RESUMEN
Existe la problemática de diseñar y construir un biorreactor de inmersión temporal
que sea de bajo costo y con igual o mejor eficiencia que los prototipos comerciales.
Adquirirlos en el mercado extranjero y su alto precio son motivos por lo que no se ha
implementado esta tecnología en países en desarrollo. El presente trabajo pretende
inicialmente identificar los parámetros de diseño de un biorreactor de inmersión
temporal para luego escalarlo a un sistema completo de 24 tanques, luego
implementar el sistema de automatización electro-neumático y realizar una prueba de
eficiencia en la multiplicación in vitro de Ananas comosus var. roja trujillana. Así se
diseñó y construyó un sistema de biorrreactores de inmersión temporal neumática de
bajo costo con 24 tanques de 2 L cada uno. Se diseñó e implementó la
automatización del sistema de biorrreactores de inmersión temporal neumática
mediante un circuito temporizador cuyos parámetros de diseño fueron: duración del
proceso de propagación, el cual depende del periodo de multiplicación del cultivo y
es una variable abierta lo que quiere decir que el operario decide cuándo apagar el
sistema; la duración de cada inmersión, la cual por motivos de complejidad del
algoritmo se estandarizó como 1 minuto; frecuencia de inmersión, la cual se
programó para intervalos de 1,2,3,4,5,6,7,8 horas respectivamente y duración de la
aireación, la cual a partir de una prueba de funcionamiento se eligieron tiempos de
0,20,30,40,50,60,70,y 80 segundos que corresponden a la vez con el tiempo de
entrega de aire comprimido; adicionalmente se determinó la tasa de multiplicación
de Ananas comosus var. roja trujillana en el sistema de inmersión la cual fue de 6.5
veces por unidad propagativa inoculada en treinta días. Se concluye que el sistema
escalado de biorreactores de inmersión temporal neumática automatizado diseñado y
construido funciona según los parámetros de diseño y se logra una apropiada tasa de
multiplicación para la propagación del cultivo de la piña roja trujillana.
vi
ABSTRACT
The problems to lay plans and to construct a biorreactor of temporary immersion that
be of low cost and with equal or better efficiency exist than the commercial
prototypes. To acquire them motives are what this technology at developing
countries has not taken effect for in the foreign market and his high cost. The present
work attempts initially identifying the designing parameters of one twin-jet of
temporary immersion stops next climbing a complete system of 24 tanks, next
implementing the system of automatization pneumatic electro and accomplishing an
efficiency test in the multiplication in Ananas's vitro comosus var roja trujillana.
That way one laid plans and the L constructed biorrreactores's system of temporary
pneumatic immersion of low cost with 24 tanks of 2 each one. One laid plans and a
circuit implemented the automatization of biorrreactores's system of temporary
pneumatic intervening immersion timer whose designing parameters matched :
Duration of the process of propagation, which depends on the period of
multiplication of cultivation and a sincere variable is that means that the laborer
makes a decision when putting out the system; The duration out of every immersion,
which on the grounds of complexity of the algorithm standardized itself like 1
minute; Frequency of immersion, which programmed itself for intervals of
1.2.3.4.5.6.7.8 hours respectively and duration of aeration, which as from a
performance testing elected times themselves of 0.20.30.40.50.60.70, and 80 seconds
that correspond at the same time in the course of time of delivery of compressed air;
Additionally determined him Ananas's rate of multiplication comosus var. truxilian
red in the system of immersion which went from 6,5 times for propagative inoculated
unit in thirty days. One comes to an end than the system increased of biorreactores of
temporary pneumatic automated immersion designed and constructed works
according to the designing parameters and gets an appropriate rate of multiplication
for the propagation of the cultivation of the roja trujillana pineapple.
1
I. INTRODUCCIÓN
Dentro de las técnicas de cultivo de tejidos, la micropropagación es una
técnica desarrollada para la producción a gran escala de plantas, que ha sido utilizada
con éxito desde los años 60 del siglo pasado (Basail et al., 2012), con ventajas como,
tasas de crecimiento mayores que en condiciones naturales lo que permite obtener
una gran cantidad de plantas en corto tiempo reduciendo la superficie necesaria para
mantenerlas, la obtención de plantas libres de bacterias, hongos y virus, la
posibilidad de producir plantas durante todo el año (Juárez et al., 2011).
No obstante, esta técnica presenta ciertas limitaciones, requiere gran cantidad
de recipientes de cultivo, mano de obra calificada, una escaza posibilidad de
automatización, la eficiencia de propagación es limitada y son altos los costos de
producción (Georgiev et al., 2014). Existen Biorreactores comerciales que permiten
micropropagar plantas y tienen una gran aplicación en la biotecnología, dichos
reactores se venden en el extranjero con un alto costo, estos prototipos son
desechables.
Un biorreactor es un dispositivo o sistema que soporta un ente biológicamente
activo, en biotecnología vegetal es un recipiente cuya función principal es
proporcionar un ambiente controlado que permita alcanzar las condiciones óptimas
para la micropropagación. La inmersión temporal es un método que consiste en
humedecer de manera intermitente y por un corto periodo de tiempo el tejido de una
planta con medio líquido, seguido por el secado por gravedad, todo esto ocurre
dentro de un biorreactor (Juárez et al., 2011; Georgiev et al., 2014).
2
Los biorreactores constituyen una tecnología especializada, equipada y
diseñada entre otros para el cultivo de tejidos vegetales; reconociéndose el cultivo de
células, tejidos y órganos como una herramienta importante para la propagación
clonal de cultivos de importancia comercial diversa, la producción de diversos
metabolitos secundarios, la expresión de proteínas complejas (molecular farming), la
fitorremediación convencional o mediante raíces transformadas (Georgiev et al.,
2014).
Un biorreactor de inmersión temporal se caracteriza por sumergir
parcialmente los explantes durante periodos iterativos. Entre sus diversas
aplicaciones se encuentran: cultivos celulares para la producción de metabolitos,
embriogénesis somática para la regeneración de plantas, cultivo de microbios
procariotas (Gueguim et al., 2010), producción de compuestos fenólicos y
flavonoides (Georgiev et al., 2014), producción de la enzima oxidativa laccasa que
cataliza la degradación de lignina (Risdianto et al., 2007); además la producción de
especies ornamentales como Gypsophila paniculata “lluvia” (Radmann, et al., 2001;
citado por Newton et al., 2009). Así se prefiere la multiplicación clonal basada en el
cultivo de tejidos de plantas porque proporciona una producción comercial libre de
patógenos y homogénea genéticamente (Basail et al., 2012).
Utilizar un biorreactor de inmersión temporal es la mejor alternativa para la
solución de los problemas del cultivo in vitro en medio sólido debido a que ofrece las
ventajas de ser una tecnología importante en el incremento considerable de la
velocidad de producción de biomasa en los explantes cultivados, reducción de la
mano de obra, ofrece bajos costos de producción, automatización del proceso
(Alvard et al. Citado por Basail, 2012), permite controlar las condiciones de
operación y es suficiente para establecer un sistema práctico para la propagación
masiva de diversas especies. Todas las ventajas mencionadas se deben a que se
3
maximiza el área de contacto del medio de cultivo con los explantes, ya que estos se
sumergen en el medio líquido.
A nivel técnico y económico, el uso de biorreactores presenta ventajas a nivel
de costos, ya que el consumo del sustrato es de manera eficiente, proporciona una
mayor área de contacto con el explante reduciendo el costo por planta (Gueguim et
al., 2010). El diseño y construcción de un biorreactor de inmersión temporal propio
implica una menor inversión comparada con prototipos comerciales que son
desechables y de alto costo; además la mayor velocidad de crecimiento se alcanza en
menor tiempo, por lo tanto se obtiene explantes de igual tamaño en menor tiempo
(Acuña, 2009).
La automatización reduce la mano de obra empleada en el proceso lo cual
repercute en costos de operación, además el control de los parámetros de operación
permite que la micropropagación sea más eficiente ya que se proporcionan las
condiciones óptimas para el desarrollo de los explantes (Gueguim et al., 2010).
También se pueden controlar algunas variables del proceso como el tiempo de
inmersión y la frecuencia, el fotoperiodo y el flujo de CO2 (Arencibia, et al., 2013).
Finalmente es posible el escalamiento, ello implica que el trabajar con medio líquido
permite micropropagar un mayor número de plantas en un mismo espacio, por lo
tanto aumentar el volumen de operación permitirá producir más explantes (Juárez et
al., 2011).
Existe la problemática de diseñar y construir un biorreactor de inmersión
temporal que sea de bajo costo y con igual o mejor eficiencia que los prototipos
comerciales. Adquirirlos en el mercado extranjero y su alto precio son motivos por lo
que no se ha implementado esta tecnología en países en vías de desarrollo.
4
Al respecto existen experiencias exitosas en otros países en la construcción de
prototipos para esta índole. Monroy y Filgueira en 2010, en la Universidad Militar de
Nueva Granada construyeron un prototipo con dos frascos gemelos para la
micropropagación de Dianthus caryophyllus “clavel” empleando frascos de vidrio
resistentes al calor y tapones de caucho perforados en los que se insertaron tubos de
vidrio; el aire se adicionó a través de una bomba de pecera controlado por
electroválvulas y un timer.
Empleando materiales de catálogo, Acuña (2009) en México, menciona el
ensamblado de dos frascos gemelos. En Chile diversos proyectos han buscado
introducir esta técnica en sus universidades y empresas agrícolas, para el caso
particular de Vaccinium corymbosum “arándano” Arencibia et al. (2013) menciona el
uso de frascos gemelos diseñados para su estudio.
Gueguim et al. (2010) construyeron un prototipo centrado en la
implementación de detalles por computadora empleado un software para el control
del proceso de fermentación de Pleurotus pulmonarius “seta ostra”. Juárez et al.
(2011) diseñaron un biorreactor de inmersión temporal neumático y otro mecánico
para la propagación de Aztekium hintonii, una cactácea en peligro de extinción, este
sistema consta de un solo tanque en ambos casos.
La experiencia de Cuba en el uso de Sistemas de inmersión temporal los llevó
a crear el sistema de frascos gemelos en el centro de Bioplantas, en reemplazo del
recipiente de inmersión temporal automatizado (RITA) creado en el CIRAD en
Francia, en este sistema se ha propagado especialmente bananos y piñas como
menciona Basail et al. (2012) donde ensaya la multiplicación del clon de banano
FHIA-18 (AAAB).
5
En Nigeria, bajo el patrocinio del Ministerio Federal de Ciencia y Tecnología,
El Centro Nacional para los Recursos Genéticos y Biotecnología (NACGRAB) en
2012 construyeron un sistema completo de biorreactores de inmersión temporal de
frascos gemelos y ensayan diversas especies agrícolas. Balogun et al. en 2014, en el
mismo país, emplea una innovación en los Biorreactores de inmersión temporal de
frascos gemelos consistente en tanques rectangulares superpuestos de la marca
SETIS de la empresa BIOCHEMIE B.V.
A nivel nacional, el instituto de Biotecnología de La Universidad Nacional
Agraria La Molina (2009) cuenta con un sistema, producto de un proyecto de
propagación de Ananas comosus “piña” de la variedad Golden MD-2 financiado por
CONCYTEC en asociación con Ecosolutions S.A. La empresa in vitro Perú S.A. en
Lima comercializa un prototipo de índole cubana y el Centro Internacional de la papa
(CIP) en Lima estudia su uso para lograr producir microtubérculos como semilla
mejorada. Al margen de estas experiencias ninguno de estos sistemas son lo
suficientemente accesibles económica y técnicamente para su uso masivo,
convirtiéndose en exclusividad de quienes contratan el servicio de las instituciones
mencionadas, por lo que el presente trabajo es pionero en su construcción y difusión
técnica en nuestro país.
La piña es la tercera fruta tropical más importante en el mundo, después del
banano y los cítricos (Bartholomew et al., 2003). Previo al descubrimiento de la fruta
de piña por Cristóbal Colón en 1493 (Morrison 1963, citado por Bartholomew et al.,
2003), la fruta era ya un componente estable de los cultivos y dieta de los nativos
americanos de las tierras bajas del trópico. De acuerdo con Bartholomew et al.
(2003), la piña comestible se clasifica taxonómicamente en: Orden Bromeliales;
Familia Bromeliaceae; Subfamilia Bromelioideae; Género: Ananas; Especie:
comosus.
6
Entre las variedades de piña comerciales de mayor demanda en el Perú están
la Criolla Selva, la Cayenna Lisa y la MD-2, cuya producción se concentra
principalmente en la selva central (provincias de Chanchamayo y Satipo); sin
embargo importantes áreas cultivadas corresponden a variedades como Samba de
Chanchamayo, Pucallpina, Roja trujillana y Motilona (Llanos, 2015).
En Poroto la variedad Roja trujillana es la más comercializada por su
resistencia al transporte y grado de acidez (CEDEPAS NORTE, 2015); además se
reportan en la zona variedades como Española, Piña Blanca, Vanila, Hawaiana,
Selvática, Ecuatoriana, y Guayana Francesa cuyos sembríos se extienden por
caseríos y anexos como Platanar, Con Con, Miñate, Dos de Mayo, Shirán, Chille y
Cambarra, entre otros (Mendoza, 2010).
Las piñas rojas presentan una pulpa de consistencia más áspera (fibrosa) y de
calidad algo inferior (alta acidez) a las piñas blancas, especialmente en zonas de
clima caluroso. Dentro de este grupo se puede mencionar a la “Roja Trujillana”. La
piña roja trujillana sembrada en Poroto y alrededores en La Libertad, hasta hace 5
años atrás, tenía una duración de 10 a 15 años de cultivo, pero en la actualidad la
duración del cultivo se ha reducido a 4 a 5 años por factores aun no definidos,
perjudicando así la producción de piña (Zavaleta, 2015).
7
Los productores de piña de Poroto y Salpo en La Libertad frecuentemente se
abastecen de semillas de campos vecinos, teniendo graves problemas de uniformidad
en las plantaciones y proliferación de plagas y enfermedades. Por lo que es
importante realizar una limpieza de material propagativo y multiplicación mediante
cultivo in vitro para evitar esta constante contaminación (Zavaleta, 2015). Esta
actividad también permitiría establecer campos para semilla o unidades propagativas
a fin de evitar llevar a campo definitivo plantas que presentan graves problemas
sanitarios, además de seleccionar la semilla por tamaño y tipo para uniformizar cada
área de cultivo (Sotomayor, et al., 2012). De esta manera se asegura una uniformidad
de plantas en campo y por consecuencia fruta de buena calidad al momento de la
cosecha.
Al utilizar la técnica de micropropagación, mediante la aplicación del
método del SIT, en el cultivo de piña; se pretende mostrar el impacto que esta tiene,
con respecto a los métodos tradicionales de micropropagación; ya que se obtiene una
mayor tasa de multiplicación y aclimatación, así como mayores niveles de
supervivencia en condiciones de campo (Cruzat, 2009).
La ventaja de utilizar el sistema de inmersión temporal, en la
micropropagación masal en piña, es que el contacto del medio líquido, con el tejido
del explante, se realiza de manera intermitente y no permanente; evitando la
vitrificación de los explantes, generando en poco tiempo, una mayor cantidad de
material vegetativo, que mantenga su calidad. Utilizando métodos convencionales de
propagación, resultarían lentos en producir y de elevados costos de producción
(Angel y Gonzáles, 2013).
8
En las diferentes instituciones públicas de enseñanza superior que posee el
país, existen carreras o especializaciones biotecnológicas; Genética y biotecnología
en la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Ingeniería Biotecnológica en la
Universidad Católica Santa María de Arequipa, Biotecnología en la Universidad
Nacional del Santa, además de diversos institutos y laboratorios dedicados al cultivo
de tejidos vegetales como el Instituto de Biotecnología Vegetal de la Universidad
Nacional Agraria La Molina por citar los más representativos, en la mayoría de los
casos orientadas hacia el cultivo de tejidos vegetales dada la naturaleza agrícola de
nuestro país.
Es también cierto que los procesos en los casos citados, salvo la Universidad
Nacional Agraria La Molina, no cuentan con el sistema de inmersión temporal dado
su elevado costo y el hecho que la tecnología no se encuentra difundida en nuestro
medio además que no existe información técnica suficiente para construir el sistema
o muchos de los materiales son de importación o están destinados a otros usos.
El presente trabajo tiene como objetivos, diseñar y construir un sistema de
biorrreactores de inmersión temporal neumática de bajo costo, diseñar e implementar
la automatización del sistema de biorrreactores de inmersión temporal neumática y
determinar la tasa de multiplicación de Ananas comosus var. roja trujillana en el
sistema de biorreactores de inmersión temporal. De este mismo modo a partir del
logro de los objetivos, contribuir a solucionar la falta de material propagativo para la
ampliación de la frontera agrícola en nuestro país, en especial para resolver la falta
de uso de semilla de calidad en la región La Libertad en sus distritos representativos
en este cultivo como Poroto y Shirán, y ofertar precios más competitivos en nuestra
región.
9
II. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. OBJETO DE ESTUDIO
El sistema de biorreactores de inmersión temporal neumática
2.2. INSTRUMENTACIÓN O FUENTE DE DATOS
Se empleó como instrumentos para la toma de datos, fichas bibliográficas
para recopilar los parámetros de diseños propuestos por cada autor
consultado. Además se empleó fichas técnicas por cada producto a emplear
en la construcción del Sistema de biorreactores para poder seleecionarlos
según los parámetros establecidos.
2.3. MÉTODOS Y TÉCNICAS
2.3.1. Diseño del sistema de soporte o andamiaje (Acuña, 2009).
Se analizaron las dimensiones, material, tipo, forma y color para el
adecuado soporte de los Biorreactores.
2.3.2. Diseño del sistema de iluminación (Georgiev et al., 2014).
Se analizaron los requerimientos de luminosidad: tipo, cantidad y
periodo para mantener los niveles de crecimiento óptimos de los
cultivos.
10
2.3.3. Diseño del sistema de aireación
Se analizaron los materiales, dimensiones, componentes, presión,
volumen, caudal, velocidad, periodicidad y frecuencia de inmersión
para el correcto mecanismo neumático que garantice la inmersión en
los Biorreactores según los requerimientos del cultivo basado en
Gueguim et al. (2010).
2.3.4. Diseño del sistema de filtrado
Se analizaron según Ducos et al. (2008) los filtros respecto a los tipos,
dimensiones, material, porosidad, eficiencia, durabilidad y acople para
garantizar la esterilidad en el proceso de cultivo en los Biorreactores.
2.3.5. Diseño de los tanques o contenedores (Arencibia et al., 2013 y Muñoz
et al., 2009).
Se analizaron los tanques respecto al volumen, forma, dimensiones,
material, durabilidad, resistencia al autoclavado y transparencia para
el ensamblado de los Biorreactores basado en
2.3.6. Diseño del sistema de control y automatización (Juárez et al., 2011).
Se analizaron los tiempos de apertura y cierre del flujo de aire del
sistema de aireación, así como las combinaciones mínimas de
frecuencia y periodos de inmersión para ser seleccionados en la
programación del cultivo. El sistema de control y automatización con
estos parámetros de cultivo fueron construidos por un técnico en
automatización con los componentes adecuados, priorizando
funcionalidad y bajo costo.
11
2.3.7. Pruebas de funcionamiento
Se analizaron de acuerdo a los parámetros establecidos en los
numerales 2.3.1 al 2.3.6 el buen funcionamiento de los componentes
para el correcto desempeño del sistema de biorreactores de inmersión
temporal neumática y corrigieron las fallas encontradas.
2.3.8. Pruebas de micropropagación de Ananas comosus var. roja trujillana
Una vez determinada la operatividad del sistema de biorreactores se
procedió a una prueba de micropropagación con la especie conocida
como “piña” en la variedad mencionada. Las vitro-plantas o hijuelos
(yemas con protocormo) introducidos en los biorreactores fueron
proporcionados por el Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la
Escuela Académico Profesional de Agronomía, en un total de 90
hijuelos que fueron incubados en tres biorreactores para la prueba
de eficiencia. Para ello se empleó como medio de cultivo el
propuesto por el laboratorio de Biotecnología, el cual es una
modificación del medio de Murashige y Skoog (1962) que se detalla
en la tabla 1, no sólo el trabajo de construcción de este sistema es
pionero en nuestro país sino también el cultivo in vitro de la piña
roja trujillana, que no había sido introducida antes en un laboratorio
para el cultivo de tejidos ni existen publicaciones de ello todavía
hasta el término de este trabajo de investigación.
Para la introducción de los explantes en los biorreactores se empleó
una cabina de flujo laminar. En donde se seccionó el material
parental por hijuelos, se introdujeron 30 hijuelos por biorreactor
previamente autoclavado y conectó al sistema de aireación para su
incubación por inmersión temporal.
12
2.3.9. Determinación de la tasa de multiplicación del cultivo
A los treinta días después de incubados los hijuelos, se determinó la
tasa de multiplicación (TM) expresada en una razón del número
promedio de material obtenido de hijuelos o unidades propagativas
por biorreactor (NHF) entre el número de material parental
sembrado (NHI):
TM = NHF / NHI
Ecuación 1. Tasa de multiplicación
Estos resultados fueron comparados con la literatura científica al respecto para
determinar las diferencias entre los sistemas de biorreactores.
13
III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. Diseño del sistema de soporte o andamiaje
Se analizaron las dimensiones, material, tipo, forma y color para el
adecuado soporte de los biorreactores a partir de Acuña (2009).
Obteniéndose que:
a. Material: Los materiales más empleados son el aluminio, madera y plástico.
Analizando las ventajas y desventajas de cada uno se prefirió el plástico que
presenta buena durabilidad similar al aluminio sólo que sin oxidarse, no es
susceptible al ataque de plagas como si lo es la madera y se puede adquirir en
el comercio local en forma modular.
b. Tipo: Los tipos predominantes son los sistemas de soporte compacto y
modular, se prefirió optar por el sistema modular porque facilita su
ensamblado y desensamblado así como su manipulación y transporte.
c. Forma: Las formas estructurales más empleadas son cuadradas y
rectangulares, se emplean las formas cuadradas para mayor resistencia, como
no se requirió mayor resistencia de carga siendo los elementos que soportó
son en su mayoría de plástico se optó por una forma rectangular cuya altura
fue mayor que el ancho.
d. Color: Se seleccionó el color blanco que refracta la luz lo que permite una
mayor eficiencia lumínica y regula la temperatura sin calentarse demasiado
respecto a otros colores.
14
e. Dimensiones: La altura de los contenedores más grandes a probar fue de 25
cm, a esta medida se le sumó la altura de los filtros que fue de 10 cm; se
determinó que la altura mínima de cada nivel fue 35 cm y el ancho del mismo
de 45 cm a partir del ancho de los contenedores más cinco centímetros
adicionales de separación entre los mismos, la altura total del andamio y el
número de niveles dependió de la disponibilidad de andamios en el mercado
que cumplan las dimensiones por nivel antes especificadas.
Se adquirió un estante de tres niveles de 160 cm de altura y 90 cm de ancho,
donde cada nivel tenía 45 cm de ancho y 40 cm de alto.
Fig. 1. Estante de tres niveles para el sistema de soporte de los biorreactores de
inmersión temporal neumática.
15
3.2. Diseño del sistema de iluminación
Se analizaron los requerimientos de luminosidad: tipo, cantidad y periodo
para mantener los niveles de crecimiento óptimos de los cultivos
(Georgiev et al., 2014).
a. Tipo de luz: Con respecto al tipo de luz dependiendo de la bombilla
eléctrica esta puede ser incandescente, fluorescente o LED. Se eligió
el tipo fluorescente ya que su emisión corresponde a luz blanca fría
que se asemeja a la luz natural bajo la cual crecen las plantas.
Adicionalmente el tipo de fluorescente elegido fue de tubo horizontal
de 65 cm de longitud basado en las dimensiones del estante.
b. Cantidad de luz: Según Mejía y Vittorelli (1988), los niveles de
iluminación oscilan entre 1000 y 4000 Lux. Esto se logró colocando
tubos fluorescentes blancos (40W) a una altura de 10-20 pulgadas
sobre los cultivos.
c. Fotoperiodo: El fotoperiodo empleado para los cultivos in vitro de
plantas es por lo general 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. Como
los autores revisados no especifican este parámetro el fotoperiodo fue
diseñado para ser controlado con un timer digital que permite su
control y cambio según criterio del especialista.
La instalación del sistema de iluminación en el estante fue en paralelo, empleando
cable mellizo número 14, con un tubo fluorescente e interruptor por cada nivel, al
final de la conexión se instaló un temporizador digital 555 que programa el
encendido y apagado de las luces según el requerimiento del cultivo.
16
Fig. 2. Timer digital programable 555 de 8 tiempos de encendido y apagado para el
control de paso de corriente en los fluorescentes.
Fig. 3. Fluorescente tubular de 40 watts de luz blanca fría
17
3.3. Diseño del sistema de aireación
Se analizaron los materiales, dimensiones, componentes, presión, volumen,
caudal, velocidad, periodicidad y frecuencia de inmersión para el correcto
mecanismo neumático que garantice la inmersión en los Biorreactores según
los requerimientos del cultivo basado en Gueguim et al. (2010).
Gueguim et al. (2010), emplearon un compresor de aire AS9 280 (Ningbo
Haosheng Pneumatic Machinery Ltd) en cual entregaba un caudal de 10 L
por minuto y tranfería 3000 mL de medio en 20 segundos empleando 10
frascos gemelos (biorreactores) de 950 mL de capacidad.
Basail et al.(2012) emplearon una presión de aire de 2.0 atm (0.202 MPa)
proveniente de un compresor la cual fue regulada por un manómetro, no
menciona a cuanto fue regulado pero empleo tanques de 10 L de capacidad
y adicionó 2 L de medio de cultivo.
Para el dimensionamiento del compresor se calculó las pérdidas por fricción
en las tuberías y accesorios empleando la ecuación de Darcy-Weisbach y la
fórmula de Colebrook-White automatizadas en una hoja de cálculo, según
Mataix (1982) y Saldarriaga (1998) (Anexo 2).
Luego del dimesionamiento del compresor, se optó por un compresor de
aire libre de aceite de la marca Werken de 116 L/min de capacidad a una
presión máxima de 0.8 MPa., que comprirmió el aire y lo entregó a presión
para alimentar los biorreactores.
18
El sistema transfiere desde 500 mL de medio de cultivo en 10 segundos hasta 6 litros
de medio de cultivo cuando se emplearon los 12 frascos gemelos (biorreactores) en
20 segundos a un caudal de compresor de 116 L por minuto.
Fig. 4. Compresor de aire de 0.8 MPa
Este aire comprimido se distribuyó a los biorreactores a través de una red de tuberías
de media pulgada cuyo flujo está regulado por llaves de paso al inicio y final de cada
nivel, cuyos terminales en cada nivel son en total de ocho y su diámetro de 10 mm.
19
Figura 5. Tuberías, llaves de paso y terminales del sistema de aireación
3.4. Diseño del sistema de filtrado
Se analizaron según Ducos et al. (2008) los filtros respecto a los tipos,
dimensiones, material, porosidad, eficiencia, durabilidad y acople para
garantizar la esterilidad en el proceso de cultivo en los Biorreactores.
Basail et al.(2012) usaron filtros hidrofóbicos de 0.22 µm, MIDISTART
2000, de la compañía SARTORIUS para garantizar la esterilidad del aire.
Se optó por los filtros de venteo de membrana de PTFE
(politetrafluoroetileno) sobre soporte de polipropileno, autoclavable, marca
Acro 50 de la corporación PALL ideal para la filtración de gases. La
propiedad principal de este material es que es prácticamente inerte, no
reacciona con otras sustancias químicas excepto en situaciones muy
especiales. Esto se debe básicamente a la protección de los átomos de flúor
sobre la cadena carbonada.
20
Estos filtros tienen un muy bajo coeficiente de rozamiento y gran
impermeabilidad, manteniendo además sus cualidades en ambientes
húmedos. El acpople es rugulable ya que entrega dimensiones en una
entrada cónica progresiva con crestas, desde 5mm hasta 10 mm.
Fig. 6. Filtro de venteo Acro 50 de 0.22 µm de poro
Estos filtros fueron conectados entre los biorreactores y las salidas del sistema de
aireación mediante manguera de silicona autoclavable de 10 mm de ancho.
21
Fig. 7. Manguera de silicona autoclavable de 10 mm de diámetro
3.5. Diseño de los tanques o contenedores
El contenedor más adecuado deberá ser de plástico claro, traslúcido y autoclavable,
preferiblemente de boca ancha (Acuña, 2009). Existen diversos materiales en el
mercado como el Carboy, Policarbonato y Boro-Silicato (vidrio). Estas botellas
tienen como aditivo aparte tapas ventiladas con adaptadores para conectarlas con
manguera de silicón autoclavable; así mismo se reportan envases de este tipo de
varios volúmenes desde 250 ml hasta 10 L (Arencibia et al., 2013; Muñoz et al.,
2009). Según Basail et al. (2012), los contenedores son frascos de cultivo tipo
clearboys (Compañá Nalgene, E.U.A.) de 10 L.
En nuestro país estos productos no son comunes y son importados en las marcas
Tygon y Nalgene por citar algunas de ellas, siguiendo los parámetros detallados por
los autores antes citados, se buscó en el mercado local envases plásticos cuya
etiqueta de fabricación prometía resistencia al calor, estos envases fueron sometidos
al autoclave para evaluar su resistencia, encontrándose sólo un tipo de ellos que
aprobó el test, de la marca PLASTIOLED de 2 L de capacidad, traslúcido.
22
Figura 8. Contenedor de plástico resistente al calor de 2 L de capacidad
Dichos contenedores si bien es cierto soportan el autoclavado, la tapa no presentaba
ninguna conexión hermética para la entrada y salida del aire filtrado, estas
conexiones se adicionaron empleando conectores de riego de 10 mm, perforando en
la tapa dos orificios con la ayuda de un taladro con una broca de 16 mm.
Figura 9. Conector de riego de 10 mm de diámetro
23
Una vez construidos los contenedores o biorreactores se realizó una prueba de
funcionamiento empleando aire a presión. El detalle del mecanismo se explica en la
figura 10.
Figura 10. Principios de operación del Sistema de Frascos Gemelos (Georgiev et al.,
2014)
(A) Periodo de exposición. Todo el volumen del medio líquido se encuentra en el
tanque de almacenamiento del medio. Las conexiones de ambos recipientes están
cerradas y las válvulas de solenoide se abren a la atmósfera; (B) Traslación del
medio de cultivo líquido de la cámara con explantes al tanque de almacenamiento.
La línea de aire de la cámara de cultivo se abre, y la línea de aire se cierra en el
tanque de almacenamiento de medio, la sobrepresión mueve el medio de un tanque a
otro; (C) Período de inmersión. Los propágulos se sumergen en el medio líquido. El
24
tanque de almacenamiento del medio está vacío. Las líneas de aire para ambos
recipientes están cerradas y las válvulas de solenoide se abren a la atmósfera; (D) que
drena el medio nutritivo de nuevo a el tanque de medio de cultivo. La línea de aire de
la cámara de cultivo se abre, mientras que la línea de aire del tanque de
almacenamiento de medio está cerrada. El exceso de presión se mueve hacia el
tanque de almacenamiento.
3.6. Diseño del sistema de control y automatización
A partir de lo mencionado por Gueguim et al. (2010), acerca de las variables
de control en la automatización, se tomaron las siguientes, con sus
respectivos parámetros:
a) Duración del proceso de propagación: es el tiempo total en horas o
días que el biorreactor debe funcionar mientras se multiplica la planta. Para
esta variable se consideró dejar este periodo abierto por lo que el sistema
sólo dejará de repetir la frecuencia y duración de la inmersión por acción
humana no programada; es decir, si se desconecta de la fuente de energía
eléctrica o se desconfigura para iniciar otro cultivo o frecuencia.
b) Tiempo de inmersión: Indica el periodo de tiempo que el organismo
puede estar en contacto con el medio de cultivo. Respecto a esta variable se
escogió como tiempo fijo un minuto para la duración de cada inmersión.
Esto debido a la complejidad de ejecutar un algoritmo para el
funcionamiento del circuito de control, por ello se optó por escoger un
tiempo mínimo, al respecto Etienne et al. (1997) citado por Basail et al.
(2012) sugiere que los tiempos de inmersión deben ser cortos, gracias a ello
los explantes están cubiertos de una película de medio de cultivo líquido y
de esta forma se evita la desecación de los mismos. La resistencia a la
difusión de gases es baja y existe una mínima ruptura de intercambio
gaseoso entre los tejidos y la atmósfera interna del frasco de cultivo.
25
c) Frecuencia de inmersión: Indica la ocurrencia de cada inmersión
expresada en minutos u horas. Para el sistema de control se programaron las
siguientes horas como espacio entre cada inmersión: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8
horas; de lo cual se entiende que la mayor frecuencia por día es de
aproximadamente 24 veces por día y la mínima de tres veces.
d) Duración de la aireación: Indica el tiempo en que se proporciona
oxígeno disuelto en el medio de cultivo, en este tiempo el aire entregado por
compresión al sistema es suficiente para trasladar el medio de cultivo de un
envase a otro, se determinó a partir del funcionamiento del sistema de
biorreactores completo en tres repeticiones, que el tiempo mínimo promedio
para ejecutar este proceso de traslación fue de diez segundos para el sistema
de 12 frascos gemelos de 2 L de capacidad y 1/2 L de medio de cultivo por
sistema de frascos gemelos (2 frascos).
El circuito temporizador se diseñó para entregar aire comprimido en base a
este tiempo mínimo y se programaron periodos de aireación de: 10, 20, 30,
40, 50, 60, 70 y 80 segundos respectivamente.
Todos los parámetros antes mencionados fueron controlados mediante un circuito
temporizador fabricado para accionar el compresor y cuatro electroválvulas,
dispuestas dos en las entradas y dos en las salidas de las tuberías del sistema de
aireación.
26
Fig. 11. Sistema de biorreactores de Inmersión temporal neumática ensamblado y en
funcionamiento.
3.7. Pruebas de funcionamiento
Se analizaron de acuerdo a los parámetros establecidos en los numerales
2.3.1 al 2.3.6 el adecuado funcionamiento de los componentes para el
correcto desempeño del sistema de Biorreactores de inmersión temporal
neumática y corregieron las fallas encontradas.
27
3.8. Pruebas de cultivo de Ananas comosus var. roja trujillana
Una vez determinada la operatividad del sistema de biorreactores se
procedió a pruebas de cultivo con la especie conocida como “piña” en la
variedad mencionada. Los hijuelos introducidos fueron proporcionados
por el laboratorio de biotecnología vegetal de la Escuela Académico
Profesional de Agronomía de la Universidad Nacional de Trujillo en un
total de 90 hijuelos o unidades propagativas provenientes de un subcultivo
en frascos en medio líquido los cuales fueron incubados en tres
biorreactores (30 hijuelos por biorreactor) para la prueba de eficiencia.
Para ello se empleó como medio de cultivo el propuesto por Murashige y
Skoog (1962), que se expresa en la siguiente tabla.
Tabla 1. Composición del medio de cultivo a utilizar en la multiplicación de
Ananas comosus en la prueba de Biorreactores
Sales de macronutrientes (mg·L-1) Sales de micronutrientes (mg·L-1)
NH4NO3 1650 KI 0.83
KNO3 1900 H3BO3 6.2
CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3
MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6
KH2PO4 170 Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
Na2·EDTA 37.3
FeSO4·7H2O 27.8
28
Vitaminas:
1. Ácido nicotínico 5 mg·L-1
2. Tiamina hidrocloruro 5 mg·L-1
3. Piridoxina hidrocloruro 1 mg·L-1
Otros componentes
Mio-inositol 1 g·L-1
Sacarosa 3 %
BAP
ANA
Dicho medio básico se suplementó con las vitaminas MS, que estuvieron
preparadas en disoluciones concentradas stock y adicionalmente con sacarosa
como fuente carbonada y con los reguladores de crecimiento ácido naftalen acético
(ANA) y bencil amino purina (BAP) a una concentración en ambos casos de 2
mg·L-1.
Para la introducción de los explantes en los Biorreactores se empleó una cabina de
flujo laminar, se seccionó el material parental por hijuelos, se introdujeron 15
hijuelos por biorreactor previamente autoclavado y conectó al sistema de aireación
para su incubación por inmersión temporal.
29
Fig. 12. Biorreactores instalados en el sistema de aireación e iluminación
3.9. Determinación de la tasa de multiplicación del cultivo
A los treinta días después de incubados los hijuelos, se determinó la tasa
de multiplicación (TM) expresada en una razón del número promedio de
material obtenido de hijuelos o unidades propagativas por biorreactor
(NHF) entre el número de material parental sembrado (NHI):
TM = 195 / 30 = 6.5
30
Fig. 13. Unidades propagativas obtenidas en un biorreactor a los 30 días después
de la siembra.
Tabla 2. Biomasa promedio de plántulas in vitro de piña, obtenida en el biorreactor
DÍA BIOMASA (g) N° UNID. PROPAGATIVAS
1 35 30
15 62 60
30 120 195
TASA DE MULTIPLICACIÓN 6.5
31
Fig. 14. Evolución de la acumulación de biomasa de plántulas in vitro de piña,
obtenidas en el biorreactor hasta los treinta días.
Bajo el sistema convencional de recipientes de vidrio de 200 mL se obtienen de 2 a 3
yemas por cada hijuelo cultivado, de ello se contrasta el aumento considerable de la
tasa de multiplicación en el biorreactor.
Fig. 15. Plántulas obtenidas en frascos en el sistema tradicional
y = 0.0764x2 + 0.564x + 34.36
0
20
40
60
80
100
120
140
0 5 10 15 20 25 30 35
gram
os
de
bio
mas
a
días
32
Como se mencionó anteriormente, el empleo de medio de cultivo liquido en las
diferentes etapas de la micropropagación favorece el desarrollo de explantes y tal
como se reportó para diferentes especies vegetales existen incrementos significativos
de la tasa de proliferación (Bermúdez et al., citado por Albarracín 2012).
Llanos (2015) en el Sistema Automatizado de Inmersión Temporal (biorreactores)
aplicó frecuencias de inmersión de 3 min cada 3 horas por un periodo de seis a ocho
meses, para Ángel y Gonzáles (2013) en la fase de multiplicación, determinaron que
al utilizar el Sistema de Inmersión Temporal con un tiempo de 5 minutos de
inmersión, cada 2 horas, generó la mayor cantidad de brotes de piña variedad
Golden. A diferencia del presente trabajo donde se sometió a periodos de inmersión
de 1 minuto cada 8 horas.
Llanos (2015) incubó los biorreactores a una temperatura de 25 – 30°C, con un
fotoperiodo de 11 o 12 horas diarias bajo luz blanca fluorescente que junto con el
medio seleccionado de concentraciones BAP (2,1 mg L -1) - ANA (0,3 mgL-1)
adicionados al medio de Murashige y Skoog (1962), por presentar un índice de
multiplicación mayor dio lugar a una tasa de multiplicación de 11; mientras que
Newton et al., suplementaron el medio de Murashige y Skoog (1962) con BAP (1 mg
L -1) - ANA (0,25 mgL-1), en este trabajo con luz constante y un medio con la
combinación de concentraciones BAP (2 mg L -1) - ANA (2 mgL-1) y en un periodo
de 1 mes se obtuvo una tasa de multiplicación de 6.5 tabla 2, fig. 13 y fig. 14), es
primordial resaltar que las unidades propagativas (hijuelos) obtenidas tenían en
promedio 2 cm de largo, con un periodo mayor de incubación habrían seguido
desarrollándose, las diferencias pueden deberse además del tiempo de incubación a
un mayor contenido de ANA en este trabajo con respecto a Llanos (2015).
33
Para Sepea y Sagawa, citados por García y Serrano (2005) la adición de reguladores
y sus concentraciones son muy importantes, ellos lograron obtener alrededor de 5000
plantas a partir de un solo explante con medio liquido Murashige y skoog (MS)
adicionado con agua de coco y transferidos a BAP para formar brotes axilares
capaces de enraizar.
En cuanto al volumen de medio de cultivo empleado en este caso fue de 500 mL por
contenedor de 2 L, al respecto Escalona et al., citado por Berthouly y Etienne (2005),
demostrarón de manera similar con piña que un volumen de medio de cultivo óptimo
para la proliferación de brotes, que se estimó es 200 ml por explante para esa especie.
En este caso, volúmenes más grandes también condujo a una caída en la tasa de
proliferación.
En sistemas de inmersión temporal de cultivo con tejido, es evidente que el tiempo
de inmersión es muy importante, puesto que regula la absorción de nutrientes y
expresión de hiperhidricidad (Ángel y Gonzáles, 2013). Los tiempos de inmersión
utilizados para diferentes trabajos varían considerablemente; esto es probablemente
debido a la gran variedad de especies, procesos y sistemas de micropropagación de
inmersión temporal utilizado. Los largos tiempos de inmersión (1 h cada 6 h)
demuestran ser eficaces para la tuberización de papa, mientras que los cortos tiempos
de inmersión (1 min cada 12 h) estimulan la producción de embriones somáticos más
en el café y el caucho (Berthouly y Etienne, 2005).
La frecuencia de inmersión de este ensayo fue de cada 8 horas (3 veces por día)
Estudios realizados por González (2003) demuestran que el efecto de la frecuencia
de inmersión en el desarrollo de brotes puede explicarse por la disponibilidad de los
nutrientes y ello a la vez explique la tasa de multiplicación obtenida.
34
Salisbury, citado por González (2003), indica que utilizar una mayor frecuencia de
inmersión puede presentar efectos como una baja en la concentración de oxígeno. El
choque osmótico sufrido por los explantes durante cada inmersión en el medio de
cultivo, posiblemente a mayor frecuencia los tejidos sufran un nivel de estrés que
afecte la respuesta del explante (Maya, citado por González 2003).
La aireación es uno de los factores más influyentes sobre la propagación in vitro
mediante sistemas de inmersión temporal. En primer lugar debido al ingreso del flujo
de aire a los envases del SIT se acciona el mecanismo de cada ciclo de inmersión que
eventualmente mantendrá a los explantes en contacto con el medio de cultivo líquido.
Ziv, citado por Albarracín (2012), señala que el empleo de biorreactores con
levantamiento de aire presenta un aumento en la proliferación de yemas
meristematicas y una reducción de los cortes de los tejidos siendo este el resultado
deseado al propagar plántulas mediante SIT. Los autores consultados no refieren
caudales entregados de aire a presión en el sistema, para este ensayo se empleó un
caudal de compresor de 116 L/min (Fig. 4) que al dividirse en cada una de las doce
conexiones para cada biorreactor, se entrega 9.666 litros de aire por minuto a 0.066
MPa de presión aproximadamente ya que las pérdidas en la tubería y accesorios por
ser muy cortos son casi despreciables.
35
IV. CONCLUSIONES
Se diseñó y construyó un sistema de biorrreactores de inmersión
temporal neumática con 24 tanques de 2 L cada uno para la
micropropagación de plantas de piña.
Se diseñó e implementó la automatización del sistema de
biorrreactores de inmersión temporal neumática mediante un
circuito temporizador que controló los mecanismos neumáticos de
electroválvulas y compresor de aire.
La tasa de multiplicación de Ananas comosus var. roja trujillana en
un sistema de biorrreactores de inmersión temporal neumática, fue
de 6.5 plántulas por cada yema incubada.
36
V. RECOMENDACIONES
Continuar con los ensayos del Sistema de Biorreactores de Inmersión
Temporal Neumática para ajustar los parámetros de cultivo, como
fotoperiodo, tiempo de inmersión y frecuencia de inmersión en el cultivo
de la piña para generar y optimizar el protocolo de su cultivo in vitro.
Ensayar otras especies en el Sistema de Biorreactores de Inmersión
Temporal Neumática para comparar su eficiencia en la multiplicación
masiva de especies de interés económico en nuestro país como el banano,
la estevia y el arándano.
Producir el prototipo en su forma comercial para el desarrollo en
investigación de la universidad, instituciones involucradas en el área
agrícola y la comunidad para garantizar la seguridad alimentaria y
económica, así como la disposición de material propagativo durante la
expasión agrícola que afronta nuestro país gracias a la exportación.
37
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Acuña, R. (2009). Cómo fabricar un biorreactor artesanal para la macropropagación
de brotes organogénicos de tejidos vegetales con componentes de catálogo.
Tecnología en Marcha. Costa Rica, 17 (1) 92-96 p.
Albarracín, C. (2012). Evaluación de la eficiencia de un sistema de inmersión
temporal frente al método de propagación convencional en la multiplicación in vitro
de cilantro cimarrón (Eryngium foetidum) a partir de hojas, yemas y segmentos
nodales. Tesis Ing. Biotecnología. Sangolquí, EC, 203 p.
Angel J. y Gonzales J. (2013). Evaluación de dos métodos de micropropagación
masal en piña (Ananas comosus L. Merr.) variedad golden. Tesis para optar el título
de Ingeniero Agrónomo, Universidad del Salvador, San Salvador 86 p.
Arencibia, A., Vergara, C., Quiroz, K., Carrasco, B. (2013). Establishment of
photomixotrophic cultures for raspberry micropropagation in Temporary Inmersion
Bioreactors (TIBs). Scientia Horticulturae, Estados Unidos, 49-53 p.
Arencibia, A., Vergara, C., Quiroz, K., Carrasco, B., Bravo, C., García, R. ( 2013).
An approach for micropropagation of blueberry (Vaccinium corymbosum L.) plants
mediated by Temporay Inmersion Bioreactors (TIBs). American Journal of Plant
Sciences, Estados Unidos, 4: 1022-1028 p.
Balogun, M., Maroya, N., Asiedu, R., Taiwo, J. (2014). Novelty, rapidity and quality
in seed yam production: the case of Temporary Inmersion Bioreactors. YIIFSWA
Working Paper Series, Nigeria, 6-10 p.
38
Bartholomew, D.; Paull, R.; Rohrbach, K. (eds). (2003). The pineapple: botany,
production and uses. New York, US, CAB International. 301 p.
Basail, M., Medero, V., Ventura, J., Otero, E., Torres, M., López, J., Cabrera, M.,
Santos, A., Rayas, A., Bauta, M., Beovidez, Y. (2012). Multiplicación del clon de
banano FHIA-18 (AAAB) en Sistema de Inmersión Temporal. Revista Colombiana
Biotecnología, XIV (1): 8-19 p.
Berthouly M; Etienne H. (2005). Temporaly inmersión system: a new concept for
use liquid medium in mass propagation. Eds. AK Hvoslef-Eide; W Preil. Francia,
CIRAD AMIS, 165-195 p.
Castro, D. (2001). Propagación mixotrófica de Eucaliptus grandis Hill ex Maidem
em biorreactores de inmersión temporal. Tesis Doctor en Ciencias Agrícolas.
Universidad de Ciego de Ávila. Cuba, 89 p.
Centro Ecuménico de Promoción y Acción Social Norte (CEDEPAS NORTE).
Producción de piña roja trujillana (Entrevista). Trujillo, (Comunicación personal) 2
de febrero de 2016.
Cruzat, G. (2009). Resultados y lecciones en sistema de inmersión temporal en
especies anuales, frutales y vides. Chile. Ograma Ltda. 8-10 p.
De Feria, M., Jiménez, E., Chávez, M. (1998). Influencia de la densidad de inóculo y
la renovación del medio de cultivo en la propagación in vitro de la caña de azúcar
(Saccharum officinarum) utilizando sistema de inmersión temporal. III Encuentro
39
Latinoaméricano de Biotecnología Vegetal. REBIO’98. 1-5 Junio, La Habana, Cuba.
Libro de Resúmenes, 42 p.
Ducos, J., Terrier, B., Courtois, D., Pétiard, V. (2008). Improvement of plastic-based
disposable bioreactors for plant science needs. Phytochem Rev., Francia, 7: 607-613
p.
García, M. y Serrano H.( 2005). La piña, Ananas comosus (L.) Merr.
(Bromeliaceae), algo más que un fruto dulce y jugoso. Contactos. 56: 55-61 p.
Georgiev, V., Schumann, A., Pavlov, A., Bley, T. (2014). Temporary inmertion
systems in plant biotechnology. Engieering in life sciences, Estados Unidos, 14: 607-
621 p.
Gobierno Regional La Libertad. (2012). Estadisticas Agropecuarias Agrícola 2010-
2011. (Consultado 28 Ago 2015 a las 5:30 pm). Disponible en
http://www.agrolalibertad.gob.pe/?q=node/34
González, K. (2003). Respuesta de tres explantes de vainilla (Vanilla planifolia) a
diferentes frecuencias de inmersión temporal. Tesis. Bach. Ing. Biot. Cartago, CR.
Instituto Tecnológico de Costa Rica. 10-11 p.
Gueguim, E., Oloke, J., Lateef, A., Azanfack, R., Adeyemi, A. (2010).
Implementation details of computerized temporary inmersion bioreactor (TIB): A
fermentation case of Pleurotus pulmonarius. Biotechnol. & Biotechnol, Nigeria, 24
(4): 2149-2153 p.
40
Juárez, A., Manjarrez, E., Barrón, H. (2011). Diseño de un biorreactor de inmersión
temporal para la micropropagación de Aztekium hintonii. Expociencias Nacional
México D.F. 13 p.
Llanos, C. (2015). Micropropagación in vitro de piña, Ananas comosus (L.) merr var.
MD2 (bromeliaceae) bajo un sistema de biorreactores de inmersión temporal. Tesis
para optar el título profesional de Biólogo con mención en Botánica. Universidad
Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú. 64 p.
Mataix, C. (1982). Mecánica de fluidos y máquinas hidraúlicas. México, D.F.,
Oxford, 660 p.
Mejía, R. y Vittorelli, C. (1988). Cultivo in vitro de plantas de papa. Manual de
Laboratorio - Cultivo in vitro. INIAA (Sector Agrario) 60 p.
Mendoza, P. (2010). Plan de manejo de residuos sólidos municipales del distrito de
Poroto, provincia de Trujillo - La Libertad. (Tesis) Trujillo: Universidad Nacional de
Trujillo. PostGrado en Ingeniería, 125 p.
Muñoz, M., Seemann, P., Jara, G., Riegel, R. (2009). Influence of vessel type,
physical state of medium and temporary inmertion on the micropropagation of three
Rhodophiala species. Chilean JAR 69 (4): 581-587 p.
Murashige, T.y Skoog, F. (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physilogia Plantarum, 15: 473-497 p.
41
National Center for Genetic Resources and Biotechnology (NACGRAB). (2012).
The potential of Temporary Inmersion Bipreactors (TIBs) in meeting crop
production demand in Nigeria. Journal of Biology Life Science, 3 (1): 66-86 p.
Newton, S., Haruko, A., Sugitani, J., Franke, A., Rigon, M., Lorenci, A., Biasi, L. y
Soccol, C. (2009). Utilization of the biorreactor of imersion by bubbles at the
micropropagation of Ananas comosus L. Merril. Brazilian Archives of Biology and
Technology, 52(spe), 37-43 p.
Risdianto, H., Harjati, S., Niloperbowo, W. y Setiadi, T. (2007). “The Influence of
Immersion Period on Laccase Production by Marasmius sp. in A Modified
Temporary Bioreactor”, The 20th International symposium on Chemical
Engineering, Hambat National University, Daejeon, Korea.
Saldarriaga, J. (1998). Hidraúlica de tuberías. Santafé de Bogotá, Mc Graw Hill
Interamericana, 564 p.
Sotomayor J, Martínez C. Paquete tecnológico para la producción de piña en el Sur
de Sinaloa. Fundación Produce Sinaloa A.C. (revista on-line) 2012 (consultado 15
oct 2015 a las 7:30 pm); 21p. Disponible en:
http://www.fps.org.mx/divulgacion/attachments/article/812/Paquete%20tecnologico
%20para%20la%20produccion%20de%20pina%20en%20el%20sur%20de%20Sinal
oa.pdf
Zavaleta, J. (2015). Manejo agronomico de piña roja trujillana en Poroto (Entrevista).
Trujillo, (Comunicación personal), 2 de febrero de 2016.
42
ANEXOS
Anexo 1. FICHA TÉCNICA DEL FILTRO DE VENTEO
Acro® 50 Vent Devices
Description
The Acro 50 vent filter is ideal for many filtration applications. The hydrophobic
PTFE membrane repels water yet allows gases to pass freely through, a feature
that makes the Acro 50 vent filter especially suited for venting applications, (i.e.
incubators, bioreactors) and in-line air and gas filtration. The Acro 50 vent filter
is compliant with OSHA standard 1910.1030 for use as a protective barrier
against bloodborne pathogens1.
In organic solvent filtration, the Acro 50 vent filter offers excellent temperature
and solvent-resistant characteristics, and will not lose its hydrophobicity while in
use. The non fiber-releasing membrane and polypropylene housing both
withstand autoclaving. It is available with a wide variety of inlet and outlet
connections to facilitate incorporation into your system.
Acro 50 vent filters are designed to connect easily to hoses of various sizes “in-
line” or as a final filter. Its hydrophobic PTFE membrane will not pass wáter
unless its water breakthrough pressure is exceeded (refer to Integrity Test
section).
Surfactants and solvents (i.e. alcohol) can be used to “wet-out” the membrane to
enable filtration of aqueous solutions. For filtration of other non-aqueous
solutions,
these filters are manufactured with PTFE membranes and polypropylene housing.
Both are chemically resistant to a wide variety of solvents.
43
Certification
Pall Life Sciences certifies that this lot meets or exceeds the following
specifications.
Specifications
Materials of Construction
Filter Media: PTFE on a polypropylene support
Filter Diameter
50 mm
Effective Filtration Area
19.6 cm2
Typical Air Flow Rates
0.2 μm 18 Lpm at 0.2 bar (20 kPa, 3 psi)
0.45 μm 12 Lpm at 0.2 bar (20 kPa, 3 psi)
1 μm 15 Lpm at 0.2 bar (20 kPa, 3 psi)
Maximum Operating Temperature
130 °C (266 °F) at 1.0 bar (100 kPa, 15 psi)
Maximum Operating Pressure
4.1 bar (410 kPa, 60 psi) at ambient temperature
Dimensions
Overall Length: 8.2 cm (3.2 in.)
Diameter: 7.3 cm (2.9 in.)
44
Inlet/Outlet Connections
Stepped hose barbs, 6.4 - 12.7 mm (1/4 - 1/2 in.) diameter. Connections have
internal taper design to accept male slip luer. The 0.2 μm pore size is available
with 1/8 in. MNPT or 3/8 in. (9.5 mm) OD straight type connections.
Biological Safety
Passes United States Pharmacopeia (USP) Biological Reactivity Test, In Vivo
<88>
45
Anexo 2. CÁLCULO DE LAS PÉRDIDAS DE CARGA POR FRICCIÓN EN LAS
TUBERÍAS Y ACCESORIOS DEL SISTEMA DE AIREACIÓN
Los componentes a calcular se señalan en las siguientes figuras:
Fig. 16. Partes del sistema de aireación (tuberías)
Fig. 17. Partes del sistema de aireación (biorreactores)
PORTABIGOTES
PORTALATERAL
VÁLVULA
MATRIZ
FILTROS
BIGOTES
RECIPIENTE
46
Basado en Mataix (1982) y Saldarriaga (1998), para el dimensionamiento del
compresor se calculó las pérdidas por fricción en las tuberías y accesorios empleando
la ecuación de Darcy-Weisbach, que permite calcular la pérdida de carga en un tramo
longitud de tubería mediante la siguiente expresión:
donde,
Δp es la pérdida de carga medida según la altura manométrica
(m.c.a.)
L es la longitud de tramo de la tubería (m)
D es el diámetro interior de la tubería (m)
v es la velocidad del aire en el interior de la tubería (m/s)
g es la acelaración de la gravedad (9,81 m/s2)
f es el es el factor de fricción de Darcy-Weisbach.
De la anterior expresión todos los parámetros son conocidos salvo el factor de
fricción (f). En efecto, la velocidad del aire por la tubería (v) está relacionada con
el caudal o flujo de aire (Q), que es un dato conocido proveniente del consumo
necesario de cada punto de suministro.
En efecto:
Q = v · A
Donde:
Q es el caudal volumétrico o flujo de aire (m3/s)
v es la velocidad del aire en el interior de la tubería (m/s)
A es el área de la sección interna de la tubería (Π·D2 / 4) (m2)
47
En las instalaciones de aire comprimido la velocidad máxima recomendada para
la circulación del aire por las tuberías está entre los 5-10 m/s, por lo que conocido
el caudal (Q) necesario para el consumo y tomando una velocidad de circulación
en ese intervalo, se obtiene de la expresión anterior el diámetro interior de la
tubería (D). Por lo tanto es el factor de fricción (f), la gran incógnita a calcular.
El factor de fricción (f), es un parámetro adimensional que depende del número de
Reynolds (Re) del fluido (en este caso, del aire) y de la rugosidad relativa de la
tubería (εr )
f= f (Re , εr ), donde el número de Reynolds (Re) viene expresado por la siguiente
formulación:
Re =
ρ · v · D
μ
Siendo:
ρ la densidad del fluido, en este caso del aire (ρaire = 1,18 kg/m3 a 25
°C)
v es la velocidad del aire en el interior de la tubería (m/s)
D es el diámetro interior de la tubería (m)
μ es viscosidad dinámica del fluido, en este caso del aire (μaire =
1,76·10-5 kg/m·s)
Por otro lado, la rugosidad relativa de la tubería (εr ) viene dada en función de la
rugosidad absoluta (K) del material del que está fabricada la tubería y de su
diámetro interior (D) de acuerdo a la siguiente expresión:
εr = K
D
Para el cálculo se empleó el valor de rugosidad absoluta de 0,0015 correspondiente al
plástico (PE, PVC).
48
Por otro lado, en el transporte de fluidos por el interior de tuberías, y el aire es un
fluido, existen dos régimen: laminar y turbulento. Para cada fluido, y para una
sección de tubería, a una temperatura determinada, existe una velocidad crítica (vc)
por debajo de la cual el régimen es laminar. Este valor crítico que marca la transición
entre los dos regímenes, el laminar y el turbulento, se corresponde con un Re = 2300,
aunque en la práctica, entre 2000 y 4000 la situación es bastante imprecisa. Por lo
tanto, en función del valor del número de Reynolds (Re) se tiene que:
• Re < 2000: Régimen laminar.
• 2000 < Re < 4000: Zona crítica o de transición.
• Re > 4000: Régimen turbulento.
Este concepto es importante conocerlo, porque la expresión para calcular el factor
de fricción (f) es distinta según si el régimen es laminar o turbulento. Así se tiene
que:
• Régimen laminar
En este caso el factor de fricción (f) depende únicamente del número de Reynolds
a través de la ecuación de Poiseuille:
f =
64
Re
Expresión que resulta sencilla de aplicar para calcular el factor de fricción (f) en
función del Reynolds (Re).
• Régimen turbulento
Para el régimen turbulento este cálculo ya no es tan inmediato dado que el factor
de fricción (f) depende tanto del número de Reynolds como de la rugosidad
relativa de la tubería. En este caso el flujo es turbulento y el factor de fricción fue
calculado mediante la ecuación de Colebrook-White.
49
La expresión de la fórmula de Colebrook-White (1937, 1939), es la siguiente:
Donde, es el número de Reynolds, la rugosidad relativa y el factor de
fricción. Para la obtención de lambda se empleó un método iterativo programado en
Excel versión para Windows 2010. El detalle de los cálculos se muestra a
continuación en las siguientes tablas.
A. Cálculo de la pérdida en Bigotes (x 36 unidades)
DATOS GENERALES
CARACTERÍSTICAS DEL FLUÍDO (Aire)
ρ (densidad) 1.21 Kg/m³
u (viscosidad dinámica) 0.0000180 Pa.s
v (viscosidad cinemática) 1.49E-05 m²/s
OTROS
g (gravedad) 9.81 m/s²
Ht (altura manométrrica del compresor) 81.58 m
E (error) 0.001 -
CARACTERÍSTICAS DE LAS TUBERÍAS
TUBERÍA
Diámetro d metros 0.01
Longitud L metros 7.2
Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015
Coeficiente global de pérdidas menores Km - 0.22
área A m² 0.0000785
50
B. Cálculo de la pérdida en Portabigotes (x 6 piezas)
CARACTERÍSTICAS DE LAS TUBERÍAS
TUBERÍA
Diámetro d metros 0.025
Longitud L metros 7.2
Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015 PVC
Coeficiente global de pérdidas menores Km - 0.99 codo+valvula
área A m² 0.00049
PRESIÓN DE ENTRADA VELOCIDAD MEDIAPÉRDIDA DE CARGA
POR FRICCIÓNPRESION DE SALIDA CAUDAL
Ht ks/d hf v hf i+1 hm Q
m - m m/s (m) m (m³/s)
81.58 0.00015 81.580 7.7363 80.9089 0.6711 0 0.001
81.58 0.00015 80.909 7.6991 80.9153 0.6647 0 0.001
81.58 0.00015 80.915 7.6995 80.9153 0.6647 1 0.001
81.58 0.00015 80.915 7.6995 80.9153 0.6647 1 0.001
81.58 0.00015 80.915 7.6995 80.9153 0.6647 1 0.001
81.58 0.00015 80.915 7.6995 80.9153 0.6647 1 0.001
PRUEBA
PRESIÓN DE ENTRADA VELOCIDAD MEDIAPÉRDIDA DE CARGA
POR FRICCIÓNPRESION DE SALIDA CAUDAL
Ht ks/d hf v hf i+1 hm Q
m - m m/s (m) m (m³/s)
81.58 0.00006 81.580 15.0111 70.2100 11.3700 0 0.007
81.58 0.00006 70.210 13.7866 71.9893 9.5907 0 0.007
81.58 0.00006 71.989 13.9837 71.7131 9.8669 0 0.007
81.58 0.00006 71.713 13.9533 71.7560 9.8240 0 0.007
81.58 0.00006 71.756 13.9580 71.7493 9.8307 0 0.007
81.58 0.00006 71.749 13.9573 71.7504 9.8296 0 0.007
81.58 0.00006 71.750 13.9574 71.7502 9.8298 1 0.007
81.58 0.00006 71.750 13.9574 71.7502 9.8298 1 0.007
81.58 0.00006 71.750 13.9574 71.7502 9.8298 1 0.007
81.58 0.00006 71.750 13.9574 71.7502 9.8298 1 0.007
PRUEBA
51
C. Cálculo de la pérdida en Portalaterales (x 4 piezas)
CARACTERÍSTICAS DE LAS TUBERÍAS
TUBERÍA
Diámetro d metros 0.025
Longitud L metros 4
Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015 PVC
Coeficiente global de pérdidas menores Km - 0.99 valvula+codo
área A m² 0.00049
D. Cálculo de pérdida en la tubería matriz de alimentación
CARACTERÍSTICAS DE LAS TUBERÍAS
TUBERÍA
Diámetro d metros 0.012
Longitud L metros 2
Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015
Coeficiente global de pérdidas menores Km - 1.3 te+codo
área A m² 0.000
PRESIÓN DE ENTRADA VELOCIDAD MEDIAPÉRDIDA DE CARGA
POR FRICCIÓNPRESION DE SALIDA CAUDAL
Ht ks/d hf v hf i+1 hm Q
m - m m/s (m) m (m³/s)
81.58 0.00006 81.580 20.9237 59.4891 22.0909 0 0.010
81.58 0.00006 59.489 17.5085 66.1121 15.4679 0 0.009
81.58 0.00006 66.112 18.5841 64.1531 17.4269 0 0.009
81.58 0.00006 64.153 18.2712 64.7351 16.8449 0 0.009
81.58 0.00006 64.735 18.3646 64.5624 17.0176 0 0.009
81.58 0.00006 64.562 18.3369 64.6137 16.9663 0 0.009
81.58 0.00006 64.614 18.3451 64.5984 16.9816 0 0.009
81.58 0.00006 64.598 18.3427 64.6030 16.9770 0 0.009
81.58 0.00006 64.603 18.3434 64.6016 16.9784 0 0.009
81.58 0.00006 64.602 18.3432 64.6020 16.9780 1 0.009
81.58 0.00006 64.602 18.3433 64.6019 16.9781 1 0.009
81.58 0.00006 64.602 18.3432 64.6019 16.9781 1 0.009
81.58 0.00006 64.602 18.3432 64.6019 16.9781 1 0.009
PRUEBA
52
E. Cálculo de pérdida en los filtros de venteo (x 24 unidades)
PRESIÓN DE ENTRADA VELOCIDAD MEDIAPÉRDIDA DE CARGA
POR FRICCIÓNPRESION DE SALIDA CAUDAL
Ht ks/d hf v hf i+1 hm Q
m - m m/s (m) m (m³/s)
81.58 0.000125 81.580 18.4722 58.9710 22.6090 0 0.002
81.58 0.000125 58.971 15.3450 65.9780 15.6020 0 0.002
81.58 0.000125 65.978 16.3631 63.8390 17.7410 0 0.002
81.58 0.000125 63.839 16.0576 64.4954 17.0846 0 0.002
81.58 0.000125 64.495 16.1518 64.2943 17.2857 0 0.002
81.58 0.000125 64.294 16.1230 64.3559 17.2241 0 0.002
81.58 0.000125 64.356 16.1318 64.3370 17.2430 0 0.002
81.58 0.000125 64.337 16.1291 64.3428 17.2372 0 0.002
81.58 0.000125 64.343 16.1300 64.3410 17.2390 0 0.002
81.58 0.000125 64.341 16.1297 64.3416 17.2384 1 0.002
81.58 0.000125 64.342 16.1298 64.3414 17.2386 1 0.002
81.58 0.000125 64.341 16.1298 64.3415 17.2385 1 0.002
81.58 0.000125 64.341 16.1298 64.3415 17.2385 1 0.002
PRUEBA
Ht ks/d hf v hf i+1 hm Q
m - m m/s (m) m (m³/s)
81.58 0.00012 81.580 11.5216 72.7843 8.7957 0 0.001
81.58 0.00012 72.784 10.7892 73.8670 7.7130 0 0.001
81.58 0.00012 73.867 10.8814 73.7346 7.8454 0 0.001
81.58 0.00012 73.735 10.8702 73.7508 7.8292 0 0.001
81.58 0.00012 73.751 10.8715 73.7488 7.8312 0 0.001
81.58 0.00012 73.749 10.8714 73.7491 7.8309 1 0.001
81.58 0.00012 73.749 10.8714 73.7491 7.8309 1 0.001
81.58 0.00012 73.749 10.8714 73.7491 7.8309 1 0.001
81.58 0.00012 73.749 10.8714 73.7491 7.8309 1 0.001
PRUEBA
CARACTERÍSTICAS DE LAS TUBERÍAS
TUBERÍA
Diámetro d metros 0.0125
Longitud L metros 4.8
Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015
Coeficiente global de pérdidas menores Km - 1.3 ensanchamiento y membrana
área A m² 0.000
53
F. Cálculo de pérdida en los tanques-biorreactores (x24 unidades)
CARACTERÍSTICAS DE LAS TUBERÍAS
TUBERÍA
Diámetro d metros 0.12
Longitud L metros 3.84
Rugosidad absoluta Ks metros 0.0000015
Coeficiente global de pérdidas menores Km - 0.22
área A m² 0.011
G. Cálculo de las pérdidas totales en el sistema
Pérdidas totales de carga por fricción
COMPONENTE hm (altura manométrica) Presión (Mpa) bigotes x 36 0.6647 0.01
portabigotes x 6 9.8298 0.1 portalateral x 4 16.978 0.17
matriz 17.23 0.17 filtros x 24 7.83 0.08
tanques 26.98 0.26 total pérdidas 79.5125 0.79
entrega compresor 81.58 0.8
PRESIÓN DE ENTRADA VELOCIDAD MEDIAPÉRDIDA DE CARGA
POR FRICCIÓNPRESION DE SALIDA CAUDAL
Ht ks/d hf v hf i+1 hm Q
m - m m/s (m) m (m³/s)
81.58 0.0000125 81.580 61.1211 39.6904 41.8896 0 0.691
81.58 0.0000125 39.690 41.1818 62.5633 19.0167 0 0.466
81.58 0.0000125 62.563 52.8590 50.2499 31.3301 0 0.598
81.58 0.0000125 50.250 46.8756 56.9413 24.6387 0 0.530
81.58 0.0000125 56.941 50.2013 53.3212 28.2588 0 0.568
81.58 0.0000125 53.321 48.4258 55.2848 26.2952 0 0.548
81.58 0.0000125 55.285 49.3954 54.2212 27.3588 0 0.559
81.58 0.0000125 54.221 48.8722 54.7977 26.7823 0 0.553
81.58 0.0000125 54.798 49.1564 54.4853 27.0947 0 0.556
81.58 0.0000125 54.485 49.0026 54.6546 26.9254 0 0.554
81.58 0.0000125 54.655 49.0860 54.5629 27.0171 0 0.555
81.58 0.0000125 54.563 49.0408 54.6126 26.9674 0 0.555
81.58 0.0000125 54.613 49.0653 54.5857 26.9943 0 0.555
81.58 0.0000125 54.586 49.0520 54.6003 26.9797 0 0.555
81.58 0.0000125 54.600 49.0592 54.5924 26.9876 0 0.555
81.58 0.0000125 54.592 49.0553 54.5966 26.9834 0 0.555
81.58 0.0000125 54.597 49.0574 54.5943 26.9857 0 0.555
81.58 0.0000125 54.594 49.0563 54.5956 26.9844 0 0.555
81.58 0.0000125 54.596 49.0569 54.5949 26.9851 1 0.555
81.58 0.0000125 54.595 49.0566 54.5953 26.9847 1 0.555
81.58 0.0000125 54.595 49.0568 54.5951 26.9849 1 0.555
81.58 0.0000125 54.595 49.0567 54.5952 26.9848 1 0.555
PRUEBA
