Embed Size (px)
Citation preview
DISEÑO Y EVALUACIÓN DE UN PROGRAMA DE
SEGURIDAD VIRAL EN LA PRODUCCIÓN DE
PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE USO
TERAPÉUTICO EN HUMANOS.
MINISTERIO DE EDUCACIÓN SUPERIOR CENTRO DE INMUNOLOGIA MOLECULAR
Tesis presentada en opción al Grado Científico de Doctor en Ciencias de la Salud.
L I C . A Y M A R A N I E T O C A B A L L E R O , M s . C .
Ciudad Habana, Cuba 2003
DISEÑO Y EVALUACIÓN DE UN PROGRAMA DE
SEGURIDAD VIRAL EN LA PRODUCCIÓN DE
PROTEÍNAS RECOMBINANTES DE USO
TERAPÉUTICO EN HUMANOS.
Tesis presentada en opción al Grado Científico de
Doctor en Ciencias de la Salud.
MINISTERIO DE EDUCACIÓN SUPERIOR CENTRO DE IN MUNOLOGÍA M OLECULAR
A u t o r a : L i c . A y m a r a N i e t o C a b a l l e r o , M s . C . T u t o r a : D r a . T e r e s i t a R o d r í g u e z O b a y a , D r . C
A s e s o r : I n g . E r n e s t o C h i c o V e l i z , O r . C
Ciudad Habana, Cuba 2003
El sueño se hace a mano y sin permiso ...................
A G R A D E C I M I E N T O S .
Al finalizar una labor como esta se hace muy difícil en un breve párrafo, nombrar
aquellas personas de las cuales una se siente eternamente agradecida por su
importante ayuda, aliento constante y su amistad, hicieron posible la culminación de
este sueño.
Para mí sería muy fácil en el día de hoy solo decir gracias, pero esto sería un facilismo
de mi parte y por ello me he propuesto hacer un máximo esfuerzo en tratar de encerrar
en estas líneas a todas aquellas personas e instituciones que me han soportada durante
este tiempo.
Primeramente quisiera agradecer al Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", a los
compañeros de Docencia y a mis colegas de Virología por permitirme finalizar este
sueño.
A los mis compañeros del Departamento de Control de Calidad y de Desarrollo del
Centro de Inmunología Molecular, los cuales me han apoyado incondicionalmente y
han alegrado mis momentos difíciles.
A mis dos ejemplos de científicos, al Dr. Agustín Lage porque desde siempre ha creado
en mi el espíritu de la búsqueda constante, y a la Dra. Teresita Rodríguez, que me ha
enseñado a vencer retos y a perfeccionar mi carácter.
Por último, quiero dedicar este trabajo a todos aquellos hombres y mujeres que
anónimamente han hecho posible el desarrollo de la investigación en todos los campos
de la Ciencia en Cuba y junto a ellos a mis padres, abuelos y hermano, como parte de
este pueblo que cada día en su hacer cotidiano construyen nuestra historia.
A b r e vi a t u r a s : Por orden de alfabético.
ADN Ácido desoxirribonucleico. AcM Anticuerpo monoclonal. CHO Ovario de hámster chino. CIM Centro de Inmunología Molecular. CV Coeficiente de variación. DICT50 Dosis infectiva media en cultivo de tejido. DMEM/F12 Medio mínimo esencial de Dulbecco y Medio F12. ECP Efecto citopatogénico. EDTA Ácido Etilendiaminotetracético. EGF Factor de crecimiento epidérmico. EGF-R Receptor del factor de crecimiento epidérmico. ELISA Ensayo inmunoenzimático de fase sólida. EPO-hr Eritropoyetina humana recombinante. FPLC Cromatografía Líquida Rápida de Proteínas. FR Factor de Reducción. HAP Producción de anticuerpos en hámster. HI Ensayo de inhibición de la hemaglutinación. HPB Rama de la Salud Pública "Health Public Branch" (Canadá). HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución. ICH Conferencias de Armonización Internacional. IFA Ensayo de inmunofluorescencia indirecta. IRC Insuficiencia renal crónica. MAP Producción de anticuerpos en ratón. ME Microscopía Electrónica. MEM Medio mínimo esencial . MuLV Virus de la Leucemia Murina. MVM Virus Diminuto de Ratón. PBS Solución fosfato salino. SFB Suero Fetal Bovino. SIDA Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida. SPF Libre de patógenos específicos. TGF-a Factor de crecimiento transformante a. UFP Unidades formadoras de placas.
ÍNDICE
SÍNTESIS
CAPITULO I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1
1.1. Antecedentes ....................................................................................................................... 1
1.2. Hipótesis de trabajo ............................................................................................................ 4
1.3. Objetivos .............................................................................................................................. 4
1.4. Novedad científica y aplicación práctica ......................................................................... 5
1.5. Breve descripción del contenido de la tesis...................................................................... 6
1.6. Eventos científicos donde han sido expuestos los resultados de la tesis ....................... 8
1.7. Informes técnicos de la autora donde se presentan los resultados de la tesis ............... 8
CAPITULO II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 11
2.1. Proteínas recombinantes en células superiores .................................................................................. 11
2.1.1. Eritropoyetina humana recombinante…………………………………………………………………..…11
2.1.2. Anticuerpos monoclonales para el diagnóstico y tratamiento del cáncer ............................................. 15
2.2. Aspectos regulatorios de la Industria Biofarmacéutica .................................................................... 20
2.1.3. Antecedentes de contaminaciones en productos biológicos ................................................................... 20
2.1.4. Contaminanción viral de las líneas celulares de origen murino ............................................................ 23
2.1.5. Control de las contaminaciones virales ..................................................................................................... 29
2.1.6. Validación de la eliminación viral .............................................................................................................. 30
CAPITULO III. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................................ 35
3.1. Aspectos generales ................................................................................................................................... 35
2.1.7. Líneas celulares ............................................................................................................................................. 35
2.1.8. Inóculos virales ............................................................................................................................................. 37
3.2. Caracterización de los contaminantes virales en los procesos productivos .................................. 38
2.1.9. Etapas de confección de bancos celulares y de fermentación ................................................................. 38
2.1.10. ........................................................................................................................... Ensayos para
la detección e identificación viral ........................................................................................................................... 39
3.3. Validación viral de los procesos de purificación ................................................................................ 50
3.3.1. Selección de los modelos virales ................................................................................... 50
3.3.2. Desescalado .................................................................................................................... 54
3.3.3. Experimentos de inactivación viral .............................................................................. 56
3.3.4. Experimentos de remoción viral ................................................................................... 57
3.3.5. Cálculo de los factores de eliminación viral ................................................................ 57
3.4. Diseño del Programa de Control Virològico........................................................................................ 58
CAPITULO IV. RESULTADOS .................................................................................................................... 61
4.1. Ensayo de placa XC para la detección de retrovirus murinos ecotrópicos .................................... 61
4.1.1. Desempeño de la técnica modificada ................................................................... 61
4.1.2. Validación del ensayo ............................................................................................ 62
4.2. Caracterización de los contaminates virales en los procesos productivos .................................... 64
4.2.1. Proceso productivo de EPO-hr ............................................................................. 64
4.2.2. Proceso productivo del AcM h-R3 ........................................................................ 65
4.3. Validación viral de los procesos de purificación ............................................................................... 68
4.3.1. Proceso de purificación de la EPO-hr ................................................................... 68
4.3.2. Proceso de purificación del AcM h-R3 ................................................................. 71
4.3.3. Comportamiento cromatogràfico de las matrices de los procesos de purificación
para la eliminación de los virus modelos ........................................................... 77
CAPITULO V. DISCUSIÓN ................................................................................................... 79
CAPITULO VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ........................................... 95
CAPITULO VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 98
SÍNTESIS.
Desde el surgimiento de la industria biotecnológica y el empleo de líneas celulares de origen
animal para producir anticuerpos monoclonales (AcM) y proteínas recombinantes de uso
terapéutico, se motivaron muchas preocupaciones relacionadas con la transmisión potencial al
humano de virus de animales presentes en las mismas. Se han establecido requerimientos'
regulatorios por agencias de diversos países para minimizar cualquier riesgo potencial de
transmisión viral en productos de uso humano o veterinario. Nuestro trabajo estuvo
encaminado a diseñar, desarrollar y establecer las acciones de control virològico en la
producción de proteínas recombinantes obtenidas a partir de líneas celulares de origen murino,
como la Eritropoyetina humana recombinante (EPO-hr) y el AcM h-R3, empleados en el
tratamiento de anemia y tumores malignos, respectivamente. Se desarrollaron e implementaron
ensayos en líneas celulares y animales sensibles a la infección de un amplio rango de virus de
diferentes especies para la caracterización de los contaminantes virales en las diferentes etapas
del proceso productivo. Para garantizar la capacidad de los sistemas de purificación de ambos
procesos de inactivar y/o eliminar virus, se llevaron a cabo estudios de validación con cuatro
virus modelos. Partículas retrovirales fueron observadas como único contaminante en la línea
celular del h-R3, sin embargo, los valores de los factores de reducción alcanzados, mostraron
niveles satisfactorios de eliminación viral para ambos sistemas de purificación. Se demostró la
utilidad del Programa de Control Virològico para garantizar la seguridad de los productos
terapéuticos EPO-hr y h-R3.
Introducción
1
CAPITULO I. INTRODUCCIÓN.
1.1 Antecedentes.
Con el advenimiento de la tecnología de ADN recombinante y el mapeo completo de varios
organismos unicelulares y multicelulares, incluyendo el hombre, todas las actividades
asociadas con la manipulación genética se han incluido en el dominio del campo de la
Biotecnología. En la actualidad, ha sido considerada una ciencia multidisciplinaria y por esta
razón su vasto potencial ha influenciado todos los caminos de la vida. La Biotecnología, una
revolución tecnológica emergente, está modificando radicalmente la propia definición de la
existencia humana, debido a la habilidad para clonar genes y producir productos génicos
cruzando barreras de especies y sexo, lo cual esencialmente significa la generación de
productos de proteínas terapéuticas tales como insulina, hormona de crecimiento,
interferones, estreptoquinasa, AcM, citocinas, vacunas, etc. Muchos de estos productos se
encuentran en el mercado, y han estado sometidos a problemas técnicos tales como, la
producción a gran escala, purificación, formulación final y llenado bajo condiciones de
Buenas Prácticas de Producción.
Desde el surgimiento de la Industria Biotecnológica y el uso de líneas celulares continuas de
origen animal para producir AcM y proteínas recombinantes terapéuticas para uso humano,
se han motivado muchas preocupaciones relacionadas con la transmisión potencial al
humano de virus de animales presentes en las líneas celulares, particularmente los
retrovirus.
Introducción
2
Por tal razón, las autoridades regulatorias de Estados Unidos, Europa y Japón formularon
guías con requerimientos encaminados a minimizar cualquier riesgo potencial de
transmisión viral. Esto involucró la evaluación extensiva de bancos celulares, sobrenadantes,
líquidos ascíticos y producto final para determinar la presencia de agentes infecciosos1.
Hasta la fecha ningún producto biofarmacéutico derivado de cultivos celulares continuos se
ha visto implicado en la transmisión de virus infectivos al humano2. Sin embargo, la
experiencia ha demostrado que no se puede estar satisfecho, como ha sido reflejado en
algunos artículos referidos en la literatura, donde se han manifestado algunos de los
ejemplos más recientes de contaminación viral en productos de origen biológico3.
Actualmente, son numerosos los productos biotecnológicos registrados y en fase de
evaluación clínica4. Sin embargo, para aprobarse su aplicación en humanos, así como su
futuro registro y comercialización, se debe cumplir con una serie de exigencias regulatorias
relacionadas con la seguridad viral, debido al origen animal de las líneas celulares
productoras5. En los últimos años la Industria Biotecnológica en Cuba ha arribado a una
etapa de madurez, al enfrentar novedosas y complejas investigaciones, verticalizadas en el
mantenimiento de una acertada política de producción y comercialización.
El Centro de Inmunología Molecular (CIM), primera institución del país que cuenta con
instalaciones requeridas para la producción de proteínas recombinantes expresadas en
células superiores de mamíferos, a escala industrial, ha desarrollado y establecido diferentes
procesos productivos entre los cuales se encuentran la producción de Eritropoyetina humana
recombinante (EPO-hr), así como un anticuerpo monoclonal
Introducción
3
humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico (AcM h-R3), empleados
en el tratamiento de la anemia generada por insuficiencia renal crónica (IRC) y de tumores
malignos de origen epitelial, respectivamente. Ambos procesos productivos tienen la
característica común y novedosa de que la etapa de fermentación se lleva a cabo en
fermentadores heterogéneos ó también denominados de fibra hueca, sin que exista
precedente en la literatura de procesos semejantes aplicados a estos productos. Estos logros
conllevaron al otorgamiento de dos patentes al CIM, una al proceso productivo de EPO-hr6 y
otra al método de humanización del AcM h-R37.
Cada proceso productivo de una proteína recombinante resulta, en sí, totalmente nuevoi®, por
lo que es necesario diseñar un programa de control que garantice la seguridad de cada
nuevo producto desde todos los puntos de vista y en especial de los contaminantes virales.
El trabajo realizado incluye los resultados alcanzados en la caracterización de los
contaminantes virales en las diferentes etapas de los procesos productivos de la EPO-hr y del
AcM h-R3, así como los obtenidos en los estudios de la validación de la capacidad del
proceso de purificación de inactivar y/o eliminar virus de ambos productos, con la finalidad
de garantizar la seguridad de los productos finales, tanto para los ensayos clínicos, como
para su posterior registro y comercialización. Por todas las razones anteriormente expuestas,
y con la finalidad de dar cumplimento a las exigencias regulatorias planteadas en las Guías
de Armonización Internacional (ICH)1 nos planteamos la siguiente hipótesis de trabajo:
Introducción
4
1.2. Hipótesis de trabajo.
"El programa de control virologico desarrollado para la producción de proteínas recombinantes en
células superiores de origen murino, es capaz de determinar si los procesos productivos de EPO-hr y el
AcM h-R3, cumplen con los requerimientos regulatorios de las Conferencias de Armonización
Internacional (ICH,) desde el punto de vista del control de los contaminantes virales, y de esta forma,
garantizan la seguridad de estos productos de uso terapéutico en humanos".
Para demostrar esta hipótesis nos planteamos los siguientes objetivos:
1.3. Objetivos.
General.
■ Diseñar, desarrollar y evaluar un programa de control virològico que abarque las
diferentes etapas de producción de proteínas recombinantes expresadas en células
superiores de origen murino, teniendo como modelo los procesos productivos de la EPO-
hr y del AcM h-R3, de acuerdo con las exigencias regulatorias de las ICH.
Específicos.
1. Diseñar la metodología del programa y establecer los ensayos necesarios para llevar a
cabo la evaluación del mismo.
2. Modificar y validar el ensayo de formación de placas XC para la determinación de
retrovirus murinos ecotrópicos.
Introducción
5
3. Caracterizar los contaminantes virales en las líneas celulares que constituyen los Bancos
Semilla, Maestro y Extendido o al límite de la cosecha, de los procesos productivos de la
EPO-hr y del AcM h-R3.
4. Caracterizar los contaminantes virales en 5 lotes de sobrenadantes de las cosechas de
fermentación y determinar la carga viral de los mismos, en ambos procesos.
5. Validar los procesos de purificación de la EPO-hr y del AcM h-R3 para determinar la
capacidad de estos para inactivar y/o eliminar virus.
1.4. Novedad científica y aplicación práctica.
El diseño e implementación del programa para el control de contaminantes virales en las
diferentes etapas del proceso de producción de proteínas recombinantes, constituye un
aporte adicional al conocimiento de los Sistemas de Calidad para la Iitdustria Biofarrnacéutica y el
primer programa con que se cuenta en Cuba para garantizar la seguridad viral durante el
proceso de manufactura de proteínas de uso terapéutico en humanos, derivadas de células
de mamíferos transfectada y producidas en fermentadores de fibra hueca. Además, brinda
nuevos conocimientos al comportamiento de los virus en su interacción con las matrices
cromatográficas, permitiendo diseñar sistemas de purificación de mayor eficiencia en la
eliminación de contaminantes virales de los procesos productivos de proteínas
recombinantes.
Introducción
6
Los resultados alcanzados de este trabajo permitieron los siguientes logros:
^ La aprobación del Registro Sanitario de la EPO-hr y su comercialización en Cuba, así como
en otros países.
^ La aprobación por parte de la agencia regulatoria canadiense HPB del primer ensayo
clínico de un producto biotecnológico cubano en un país desarrollado.
^ Otorgamiento del Registro de Medicamento Condicionado en Cuba al AcM humanizado
h-R3, convirtiéndose en el primero registrado en el mundo para la terapéutica de tumores
de cabeza y cuello de origen epitelial, lo cual beneficiará a gran número de pacientes con
esta patología.
Por último, la experiencia adquirida en estos estudios puede ser de utilidad a centros
biotecnológicos en Cuba, en los que se producen medicamentos de uso humano y
veterinario de esta naturaleza.
1.5. Breve descripción del contenido de la tesis.
El documento de tesis consta de 7 capítulos fundamentales que incluyen: Introducción,
Revisión Bibliográfica, Materiales y Métodos, Resultados, Discusión, Conclusiones y
Recomendaciones. Se adiciona, además, el listado de la Bibliografía consultada con un total
de 183 citas. En la primera página del documento se muestra el índice resumido con los
epígrafes y sub-epígrafes paginados. En la Introducción se exponen los antecedentes
fundamentales de la tesis, así como la hipótesis de trabajo y los principales objetivos. En el
capítulo de Revisión Bibliográfica se incluye un análisis de la información más actualizada
sobre los temas relacionados con el contenido de la tesis, abordándose aspectos
Introducción
7
del desarrollo de los procesos productivos de de EPO-hr y el AcM humanizado h-R3,
características principales de sus moléculas así como el uso terapéutico de los mismos.
Además se abordan los accidentes por contaminación viral ocurridos en la historia de los
biológicos, contaminantes virales más frecuente en líneas celulares de origen murino, y los
requerimientos de las agencias regulatoria para el control de los mismos, poniendo énfasis en
la importancia de la estrategia en la selección de los ensayos y métodos de control a emplear
en el diseño, desarrollo e implementación de un programa que permita garantizar la
seguridad del uso de estos productos terapéutico en humano, desde el punto de vista
virològico. En Materiales y Métodos se describen los principales materiales empleados en el
desarrollo de la parte experimental de la tesis. La metodología empleada requirió de una
amplia variedad de procedimientos, incluyendo una batería de ensayos in vitro, in vivo,
desarrollo y validación de la técnica para la determinación de retrovirus murinos de tipo
ecotrópico, por primera vez en el país, y por último, la validación de los procesos de
purificación para determinar la capacidad de ambos para inactivar y/o remover posibles
contaminantes virales. En Resultados se presenta la utilidad de la aplicación de la estrategia
analítica establecida, en la caracterización de los contaminantes en las etapas de cultivo y
fermentación, y los valores de reducción viral alcanzados durante los estudios de validación
de los procesos de purificación, realizando un breve análisis de aquellos aspectos más
importantes encontrados. En la Discusión se analizan de forma integral los resultados
alcanzados en las diferentes etapas de este trabajo, relacionándolos con la bibliografía más
actualizada sobre el tema. En las Conclusiones se concretan los aportes más relevantes del
trabajo, terminando con un conjunto de Recomendaciones acerca de
Introducción
8
nuevas tareas a bordar que consideramos, que enriquecerían aspectos importantes referentes
al programa de control virològico.
1.6 Eventos científicos donde han sido expuestos los resultados de la tesis.
^ XI Forum Tecnológico Especial. Ponencia secreta 0302032. "Programa de Control virológico
del Proceso de Producción de la Eritropoyetina Humana Recombinante”, 1998. Relevante.
Autora.
^ XI Forum Nacional de Ciencia y Técnica. Ponencia secreta. "Establecimiento del Proceso
Productivo y Registro de la Eritropoyetina Humana Recombinante", 1998. Destacada. Autora.
^XIII Forum Nacional de Ciencia y Técnica. Ponencia secreta. "Validación de la capacidad de
inactivación y/o remoción viral del proceso de purificación del Anticuerpo Monoclonal Humanizado h-
R3", 2000. Destacada. Autora.
^Premio de la Academia de Ciencia en el año 2000. "Establecimiento del Proceso Productivo
y Registro de la Eritropoyetina Humana Recombinante". Colectivo de autores del CIM.
1.7. Informes técnicos de la autora, donde se presentan los resultados de la tesis.
Dado que los datos que se brindan en esta tesis son susceptibles a la competencia por los
aspectos novedosos de estos productos y por estar establecido en el contrato firmado con la
compañía YMBioscience ine. (anexol), se tomó la decisión por la dirección del CIM de no
realizarse publicaciones con los resultados contenidos en este trabajo. Sin embargo, a
continuación se exponen los títulos de los informes técnicos elaborados y que fueron
avalados por el Consejo Científico del CIM como publicaciones y que a su vez forman
Introducción
9
parte de los expedientes de Solicitud de Ensayos Clínicos y de Registros de Medicamentos,
presentados y aprobados por las agencias regulatorias de Cuba, Canadá, China e Irán, y que
constan en el Departamento de Aseguramiento de Calidad del CIM.
^ Caracterización de los contaminantes virales de la línea celular CHO productora de
Eritropoyetina (EPO) humana recombinante Nieto A. y Rodríguez T., 1997.
^ Validación de la capacidad de inactivación y/o remoción del virus Herpes Simplex tipo 1
en la purificación de EPO. Nieto A., Pérez N., Gómez T., y Rodríguez T., 1997.
^ Validación de la capacidad de inactivación y/o remoción del virus Polio tipo 2 en la
purificación de EPO. Nieto A., Pérez N., Gómez T., y Rodríguez T., 1997.
^ Validación de la capacidad de inactivación y/o remoción del virus de la Leucemia murina
en la purificación de EPO. Nieto A., Pérez N., Gómez T., y Rodríguez T., 1998.
^ Caracterización de los contaminantes virales de los bancos semilla maestro y extendido de
la línea celular productora del AcM h-R3. Nieto A. y Rodríguez T., 1998.
^ Validación de la capacidad de inactivación y/o remoción del virus Herpes Simplex tipo 1
en la purificación de AcM h-R3. Nieto A., Arroyo E., Calvo L., Pérez N. y Rodríguez T.,
1999.
^ Validación de la capacidad de inactivación y/o remoción del virus Polio tipo 2 en la
purificación de AcM h-R3. Nieto A., Arroyo E., Calvo L., Pérez N. y Rodríguez T., 1999.
^ Validación de la capacidad de inactivación y/o remoción del virus de la Leucemia Murina
en la purificación de AcM h-R3. Nieto A., Arroyo E., Calvo L., Pérez N. y Rodríguez T.,
1999
Introducción
10
^Validación de la capacidad de inactivación y/o remoción del Parvovirus Porcino en la
purificación de AcM h-R3. Nieto A., Arroyo E., Calvo L., Pérez N. y Rodríguez T., 1999
^ Programa de control virològico para la producción de proteínas recombinantes de uso
terapéutico obtenidas de células de mamíferos. Nieto A. y Rodríguez T., 1999.
^ Documento de solicitud del Registro de la Eritropoyetina Humana Recombinante.
Coautora, 1997.
^ Documento de Solicitud de Ensayo Clínico: "Evaluación de la farmacocinética y la
toxicidad del AcM h-R3 marcado con 99mTC. Coautora, 1998.
^ Documento de Solicitud de Ensayo Clínico: "Uso del AcM h-R3 y radioterapia en el
tratamiento de pacientes con tumores de cabeza y cuello. Coautora, 1999.
^Documento: Investiga ti onal New Drug Submission (IND): “Humanizeá Monoclonal
Antibody to Epidermal Growth Factor Receptor, h-R3". Coautora, 1999.
^Documento: Investigational New Drug Submission (IND): "IND far DIACIM for
INJECTION ". Canadá. Coautora, 1999.
^Documento de solicitud del Registro del AcM humanizado h-R3. Coautora, 2001.
Revisión Bibliográfica
11
CAPITULO II. REVISION BIBLIOGRAFICA.
2.1. Proteínas recombinantes en células superiores.
Desde finales de la década de los 70, la biotecnología inició una nueva era en el tratamiento
de diferentes patologías con la producción de proteínas recombinantes, las cuales han
proporcionado un nuevo enfoque a la terapéutica de diversas de ellas, dando lugar al
surgimiento de la actual industria Biofarmacéutica. Productos tales como, factores de
crecimiento, anticuerpos monoclonales (AcMs) y más recientemente las vacunas de ADN
para la terapia génica, han permitido alcanzar recursos terapéuticos en enfermedades para
las que no existían alternativas posibles con los tratamientos existentes. Tal es el caso del
cáncer, las enfermedades hereditarias, virales y otras9. Entre estos productos se encuentra la
Eritropoyetina humana recombinante (EPO-hr), citocina destinada al tratamiento de
anemias producidas por diversas causas y los AcMs dirigidos contra tumores, sobre los
cuales centraremos nuestra atención.
2.1.1. Eritropoyetina humana recombinante.
La Eritropoyetina (EPO) humana fue aislada en la orina en 197710. La molécula de EPO
consiste en una glicoproteína de cadena simple, cuya fracción protéica constituye
aproximadamente un 58 % y los carbohidratos un 40 % de la estructura de la molécula. Las
cuatro cadenas de carbohidratos están unidas a la proteína por un enlace O- glucosídico y
tres N-glucosídicos, siendo el ácido siálico el principal compuesto hidrocarbonado, y sus
residuos fundamentales para la actividad biológica11'12.
Revisión Bibliográfica
12
Los ácidos siálicos terminales protegen a la molécula de la degradación rápida en el hígado,
conservando así su actividad en la médula ósea sobre receptores que se encuentran
fundamentalmente en los progenitores eritroides produciendo la proliferación y
diferenciación de los mismos. Como consecuencia de esta acción, se produce un aumento de
los reticulocitos y consecuentemente de los glóbulos rojos13. La importancia fisiológica de la
EPO se basa en adaptar la producción de eritrocitos a las necesidades de oxígeno de los
tejidos, en coordinación con los mecanismos de regulación de la circulación y metabolismo.
En la insuficiencia renal crónica, por el inadecuado funcionamiento del riñón en la
producción de esta citocina, tiene lugar la disminución de los glóbulos rojos provocando
una anemia crónica que puede terminar con la vida del paciente. No solamente la EPO está
indicada en el tratamiento de la anemia asociada con la IRC14'17, incluyendo los pacientes en
diálisis (estadio final de enfermedad renal)18*21, sino también resulta de gran utilidad en el
tratamiento de la anemia de los pacientes con SIDA en régimen terapéutico con
Zidovudina22, así como en los pacientes con neoplasias malignas sometidos a
quimioterapia23'24.
La posibilidad que brinda este producto de elevar o mantener el nivel de eritrocitos en
sangre es por lo tanto beneficioso, no solo por elevar los niveles de hematocrito y
hemoglobina si no también, al reducir también el número de transfusiones necesarias en
estos pacientes y con ella, los riegos de adquirir otras patologías infecciosas presentes en la
sangre25.
Revisión Bibliográfica
13
En 1985, esta proteína fue obtenida utilizando la tecnología del ADN recombinante,
lográndose una actividad similar a la de la hormona natural13'26. En la actualidad, varias
firmas biofarmacéuticas son productoras de este medicamento empleando para ello dos
sistemas productivos, basados en el cultivo de un sistema complejo de botellas rotatorias o
mediante la fermentación en tanque agitado de la línea celular, obtenida de Ovario de
Hámster Chino (CHO)27.
Aunque este medicamento ya tiene varios años en el mercado internacional, y fue
reconocido por el Colegio Español de Farmacéuticos como un producto con novedad
terapéutica de carácter excepcional, ha sido considerado como uno de los productos de la
Biotecnología que ha revolucionado esta industria28'29. La posibilidad de acceso al mismo en
nuestro país, ha estado limitada por ser un medicamento de alta tecnología, con un elevado
precio en el mercado. Esto significa una inversión anual de al menos 4 Millones de USD
para cubrir solamente 1000 pacientes sometidos a diálisis por IRC, sin contar los pacientes
oncológicos y los de SIDA.
En 1995, el Centro de Inmunología Molecular (CIM) establece un nuevo sistema de
producción de esta proteína, empleando la tecnología de fermentadores heterogéneos o
también denominada fermentación en fibra hueca, con la finalidad de dar cobertura a la
demanda nacional de este producto y crear otro renglón exportable para el país.
Revisión Bibliográfica
14
2.I.I.I. Proceso productivo de la EPO-hr.
Las células CHO transfectadas con el gen de la EPO humana crecen en cultivo dependiente
de anclaje en frascos T y luego en botellas rotatorias, hasta lograr la confluencia de la
monocapa celular necesaria para la conformación del inóculo para los fermentadores. El
cultivo en sistemas de bioreactores se puede realizar en los Acusyst-Jr ó el P3X. Este
sistema consiste en un cartucho de fibra hueca en el caso del primero y seis para el
segundo, que se alimentan por su espacio extracapilar con medio de cultivo suplementado
con Suero Fetal Bovino (SFB) y con el medio basal, sin suero, por el espacio intracapilar. El
mismo posee un cartucho intercambiador de gases que posibilita mantener los niveles de
oxígeno disuelto a los niveles necesarios para el cultivo. Las células se inoculan en el
espacio extracapilar del cartucho, donde se le crean las condiciones para la expansión.
Durante la corrida se toman muestras para evaluar la contaminación microbiana del cultivo
en las cosechas 1, 8 y 15, así como para evaluar la concentración de EPO por el ensayo
inmunoenzimático ELISA. Un lote de fermentación está compuesto por las 15 cosechas que
se obtienen al terminar la corrida. Esta se lleva a cabo durante 49 días y el número de
cosechas se restringe a 15 debido a razones económicas del proceso.
Para la purificación de esta molécula recombinante, se emplea un sistema de columnas
cromatográficas, compuesto primeramente por una matriz de afinidad, no específica (Blue
Sepharose Fast Flow), diseñada con la finalidad de eliminar la albúmina bovina y otros
contaminantes del medio de cultivo. El proceso continúa con un cambio de
Revisión Bibliográfica
15
solución mediante una cromatografía de filtración en gel (Sephadex G-25) necesaria para
la aplicación en el siguiente paso, a una matriz cargada positivamente con iones de cobre
cuyo principio es de afinidad por metales (Quelating Sepharose Fast Flow) destinado a
eliminar los contaminantes remanentes del paso anterior. Seguidamente, una columna de
intercambio catiónico (SP Sepharose Fast Flow), permite separar las isoformas ácidas de la
EPO, de las básicas. A continuación otro intercambio iónico, ahora aniónico (Q Sepharose
Fast Flow) elimina las proteínas contaminantes remanentes, así como el ADN, al
emplearse tampones con diferentes fuerzas iónicas, permitiendo a su vez la concentración
del producto. Finalmente, luego de un cambio de solución mediante otro paso de
filtración en gel, se llega a la etapa de formulación, llenado, envase y etiquetado del
producto final. En la tabla siguiente se resume el proceso de purificación anteriormente
descrito.
2.1.2. AcM para el diagnóstico y tratamiento del cáncer.
La tecnología de generación de hibridomas establecida por Kohler y Milstein en 1975 para
la obtención de AcM30, brindó una poderosa herramienta para el posterior desarrollo del
diagnóstico y la terapia de diferentes patologías.
Tabla 1 Proceso de puri f icación de la EPO-hr del CIM. Paso cromatográfico Columna Lecho / Volumen Matriz Equipo Purificación BPG 100/500 Blue SFF / 800 mL Afinidad Bioprocess Cambio de Tampón BPG 100 /950 Sephadex G-25 / 6 L Filtración en gel Bioprocess Purificación XK 50 1 20 Quelating SFF / 200 mL Afinidad a metales Biopilot Cambio de tampón X K 5 0 / 1 0 0 Sephadex G-25 / 1 . 7 L Filtración en gel Biopilot Purificación de isoformas ácidas XK 50 / 20 SP SFF / 200 mL Intercambio catiónico Biopilot Remoción de ADN XK 2 6 / 2 0 Q-SFF / 80 mL Intercambio aniónico Biopilot Cambio de tampón XK 50 / 20 Sephadex G-25 / 200 mL Filtración en gel Biopilot
Revisión Bibliográfica
16
La posibilidad de seleccionar AcMs de elevada afinidad y especificidad por antígenos
asociados a tumores31*33, ha generado un gran interés en el uso de estas moléculas, no sólo
para el diagnóstico in intro sino también para el diagnóstico in vivo de patologías
tumorales34'35. Con estos fines se han realizado estudios mediante técnicas de
inmunohistoquímica para detectar la presencia o no de determinados marcadores de
tejidos o células36'37. Más recientemente, la técnica de inmunogammagrafía ha permitido
dirigir isótopos radioactivos para la visualización y localización de marcadores tumorales
en tejidos y órganos38-43.
El desarrollo de nuevas drogas para el tratamiento de patologías tumorales, se ha
encaminado durante los últimos 20 años, fundamentalmente a estudios de inhibición de
factores de crecimiento, terapia pasiva y a la generación de inmunoconjugados con drogas,
toxinas e isótopos radioactivos y vacunas anti-idiotípicas, entre otros.
En el campo de la oncología el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y su receptor (EGF-
R), constituyen un complejo molecular de alta especificidad, cuya interacción desencadena
importantes mecanismos de regulación del crecimiento celular, demostrándose que es
capaz de provocar estimulación sobre el crecimiento de líneas celulares de tumores
dependientes de EGF44'45. El EGF es un polipéptido de 53 aminoácidos con un peso
molecular de 6 045 daltons, obtenida originalmente de las glándulas submaxilares de
ratones y posteriormente de orina humana46'47. Por su parte, EGF-R es una glicoproteína
madura de membrana de 170Kd y 1 186 aminoácidos, transmembranal con actividad
tirosina cinasa y expresada en la mayoría de las células
Revisión Bibliográfica
17
normales48'49. Transmite acción mitogénica e inhibitoria de ligandos de la familia EGF,
TGF-a, HB-EGF, betacelulina50'51. Es el prototipo de la subfamilia de receptores de factores
de crecimiento tipo I, la cual incluye además a otros miembros como c-erbB2, c- erb6B3 y c-
erbB452-54. El EGF-R se expresa en una gran variedad de células y fue primero purificado
de una línea celular A431 derivada de un carcinoma epidermoide humano, el cual
expresaba un número alto de receptores de superficie55. Posteriormente, se demostró que
esta alta expresión de receptores se debía a una amplificación del gen que codifica para el
receptor56. Los estudios bioquímicos e histológicos de biopsias de tumores humanos
mostraron la sobre expresión del EGF-R en diferentes neoplasias humanas, incluyendo
cáncer de mama, vejiga, riñón, ovario, pulmón, cerebro, páncreas, entre otros57-62. En
algunos casos se ha demostrado que estos cambios son factores de pronósticos
importantes63'64. Por ejemplo, se sabe que el EGF-R juega un relevante papel en la
progresión y pronóstico del cáncer de mama, además de su relación con los receptores de
estrògeno en estos tumores65-67. La asociación encontrada entre la sobre expresión de EGF-
R y el riesgo de muerte de pacientes con neoplasia debido al fallo de los tratamientos
convencionales68'69, indican la necesidad de encontrar formas alternativas de tratamiento
para estos tumores70.
Los AcMs se han convertido en importantes herramientas para estudios del mecanismo de
interacción del factor de crecimiento con su receptor y en la detección de receptores en
tejidos y fluidos corporales de individuos sanos y pacientes con cáncer71'72.
Revisión Bibliográfica
18
Por esta razón, Fernández y cols, en 198773, en el Instituto Nacional de Oncología y
Radiobiología generaron un mieloma productor de un AcM murino denominado ior
egf/r3, el cual reconoce el EGF-R con alta afinidad y que es capaz de inhibir la unión del
EGF y por tanto, la proliferación de líneas tumorales en cultivo y en ratones
xenotrasplantados, constatándose evidencias de actividad antitumoral.
Los estudios toxicológicos y ensayos clínicos en pacientes con cáncer de pulmón llevados a
cabo, dieron evidencias de la posibilidad terapéutica de este anticuerpo. Sin embargo,
debido a las reacciones adversas provocadas en los pacientes por la inmunogenicidad de
esta proteína de ratón74, que impide su utilización terapéutica en ciclos prolongados y
repetidos, se impuso una versión humanizada de este AcM. El ior egf/r3 fue humanizado
(h-R3) por Mateo y cois, en 199675 en el CIM, mediante el clonaje de las regiones variables
murinas a una región constante humana de subclase IgGl. El AcM h-R3 fue reformado
usando los marcos humanos de regiones variables, homologas a la región variable murina
dando lugar a una patente.
2.I.2.I. Proceso productivo del h-R3.
La dosis necesaria del AcM h-R3 para producir una adecuada respuesta en los pacientes
fluctúa entre 1.2 y 2.4 gramos, lo que representaría una producción total de 840 a 1 480
gramos para un ensayo clínico dado. Por tal razón, el CIM diseñó y estableció un proceso
productivo para dar respuesta a esta demanda. El sistema productivo se basa en un sistema
de fermentación en perfusión, empleando fermentadores de fibra hueca, seguido de varios
pasos cromatográficos con la finalidad de obtener un producto de alta
Revisión Bibliográfica
19
pureza. La producción del sobrenadante que contiene el AcM h-R3 se genera in vitro,
utilizando un cartucho del sistema de cultivo de fermentación de fibra hueca Acusyst-Jr. El
bioreactor se inocula con una suspensión celular del mieloma NSO recombinante, que
secreta el AcM h-R3. El inóculo para un lote de fermentación se produce a partir de un
ámpula fresca del Banco de Trabajo (BT), se expande en frascos plásticos de cultivo y luego
a frascos agitados (spinner) hasta alcanzar una concentración aproximada de 3 a 12 x 108
de células viables. Posteriormente, la suspensión celular es sembrada en uno o dos
cartuchos del bioreactor, una vez que ha sido esterilizado y se han obtenido los resultados
de los ensayos de citotoxicidad. El sistema de cultivo de fibra hueca se opera en modo de
perfusión durante 60 días, aproximadamente. La colección de la cosecha comienza a los 5 a
7 días después de la inoculación. Se toman tres cosechas por semana del espacio
intracapilar durante el tiempo de fermentación y se determinan la concentración de IgGl,
glucosa, lactato, glutamina y amonio. El sobrenadante cosechado se centrifuga a baja
velocidad y se almacena a -20 °C, hasta su purificación.
El AcM h-R3 se purifica utilizando un sistema cromatogràfico que incluye 3 matrices y
cuatro pasos cromatográficos:
1. Proteina A Fast Flow. Cromatografía de afinidad, la cual une s electiva y reversiblemente
la IgGl mediante un enlace covalente a la matriz de la columna, permitiendo que otras
proteínas y sustancias contaminantes pasen a través de la misma. La IgGl se recobra de
la columna mediante cambios en las condiciones de la solución tampón. Este paso
cromatogràfico se util iza para puri ficar moléculas del t ipo IgG derivadas de la célula.
Revisión Bibliográfica
20
2. Sephadex G-25. Cromatografía de fi l tración en gel , donde las sales de la solución original
fluyen rápidamente a través de la columna, mientras que las proteínas son retenidas y
salen posteriormente en la solución tampón de elusión en la cual se apl ica a la columna
cromatográfica siguiente.
3 . DEAE Sepharose Fast Flow. Cromatograf ía de intercambio aniónico que a un pH neutro
retiene las impurezas, específicamente los ácidos nucleicos provenientes de la célula
hospedera, endotoxinas y otras proteínas contaminantes que permanecen con el eluato
de IgGl , proveniente de la columna de Proteína A.
4 . Sephadex G-25. Finalmente, este paso se emplea para intercambiar la solución del eluato
por la de formulación final , en la cual se envasará el producto.
2.2. Aspectos regulatorios de la Industria Biofarmacéutica.
Aunque estos productos traen indudables beneficios para la salud humana, uno de los
aspectos de mayor contradicción está dado por ser fuentes potenciales de contaminación
viral al obtenerse de tejidos y células de origen animal, los cuales pueden ser causantes de
serias enfermedades en el humano76.
2.2.1. Antecedentes de contaminaciones en productos biológicos.
A través de la historia de los biológicos administrados a humanos, se puede encontrar
numerosos ejemplos de productos que han estado contaminados con patógenos, los
cuales, en muchas ocasiones, fueron identificados varios años después que el producto
había sido introducido en el mercado y administrado en muchas personas.
La regulación de los biológicos fue establecida por primera vez en 1902 por el Gobierno
Federal de EE.UU., después de una epidemia de difteria durante la cual murieron 10 niños
tratados con una antitoxina contaminada con tétano, producida a partir de un caballo
infectado77.
Revisión Bibliográfica
21
Durante la Segunda Guerra Mundial, la vacuna de la fiebre amarilla fue contaminada por
el virus de la Leucosis Aviar debido a que en su producción se utilizaban embriones de
pollo infectados con este agente78, igualmente fue contaminada por el virus de la Hepatitis
B, proveniente del suero humano utilizado como estabilizador de este producto vacunal79.
En la mitad de la década de 1950 y en los comienzos de los '60, el advenimiento de la
tecnología de cultivos celulares inició una nueva era en la producción de vacunas. Sin
embargo, los primeros cultivos celulares primarios de riñón de mono Rhesus, hospedero
natural del virus de simio tipo 40, sin aparente infección clínica, fueron utilizados en la
producción de la vacuna contra el virus que produce la Poliomielitis y se encontraron
subsecuentemente contaminadas con este virus oncogénico, implicado recientemente en
ciertos tipos de tumores humanos80.
El uso de material derivado del hombre para producir biofarmacéuticos constituye la
variante de mayor riesgo de contaminación para un paciente, debido a que el agente
potencial no requiere atravesar ninguna barrera de especie para volverse patogénico.
Durante 1970, antes del surgimiento de productos recombinantes, la hormona de
crecimiento humana extraída de glándulas pituitarias de cadáveres, fue utilizada para
tratar niños con síndrome de crecimiento limitado. Este producto fue el responsable de la
transmisión de enfermedades como Creutzfeldt-Jakob, una de las encefalitis espongiformes
transmisibles, y de numerosas muertes, años después de la administración del producto81.
Revisión Bibliográfica
22
En los últimos 20 años, los productos derivados de plasma y sangre humana han sido
responsables de numerosos casos de transmisión a pacientes de virus como el de la
Inmunodeficiencia humana, diferentes Hepatitis (A, B, C), Parvovirus B19, etc.82, y aunque
se han diseñado técnicas de monitoreo muy sensibles para eliminar donaciones
contaminadas, la experiencia ha demostrado que no es suficiente para garantizar la
seguridad de un hemoderivado en particular. De esta forma se afirma que las
contaminaciones virales de un biológico, pueden resultar de la materia prima, por ejemplo,
los bancos celulares de origen animal, e igualmente, de nuevas fuentes celulares de
diversos orígenes como células de insectos, sangre humana, tejido animal y humano o de
agentes indeseables introducidos en el proceso productivo por el empleo de suplementos
como el suero animal y la tripsina porcina83.
Con el advenimiento de la industria biotecnológica y el uso de líneas celulares continuas
de origen animal para producir AcMs y proteínas recombinantes terapéuticas para uso
humano, existieron muchas preocupaciones relacionadas con la transmisión potencial al
humano de virus de animales presentes en las líneas celulares, particularmente los
retrovirus. Por tal razón, las autoridades regulatorias de Estados Unidos, Europa y Japón
formularon guías diseñadas para minimizar cualquier riesgo potencial de transmisión
viral2. Esto involucró el requerimiento de una evaluación extensiva de los bancos celulares,
el sobrenadante, los líquidos ascíticos y el producto final para determinar la presencia de
agentes infecciosos. Hasta la fecha, ningún producto biofarmacéutico derivado de cultivos
celulares continuos se ha visto implicado en la
Revisión Bibliográfica
23
transmisión de virus infectivo al hombre2. Sin embargo, la experiencia ha demostrado que
no se puede estar satisfecho como se demuestra en la tabla 2, donde se resumen algunos
de los ejemplos más recientes de contaminación viral en estos productos.
En cada caso la contaminación fue de tipo adventicio, es decir, introducida por fuentes
externas tales como, el medio o el 5FB utilizado en el proceso de cultivo, o un operador a
través del incumplimiento de los procedimientos que rigen las Buenas Prácticas de
Producción.
2.2.2. Contaminación viral de las líneas celulares de origen murino.
Las líneas celulares que pueden ser utilizadas para las técnicas de manipulación genética,
pueden estar contaminadas por virus murinos y deben ser muy bien estudiadas, aún
antes de dichas manipulaciones, para partir desde el mismo comienzo del diseño
investigativo con una línea celular bien caracterizada92 93. Las células pueden portar
infecciones latentes o persistentes, como por ejemplo con herpesvirus o retrovirus, los
cuales pueden transmitirse de una generación de célula a la siguiente como genoma viral
y expresarse intermitentemente como virus infeccioso durante el proceso productivo.
Tabla 2 Ejemplos de contaminación viral adventicia de productos biotecnológicos Virus Posible fuente Material analizado / Producto Referencia Diminuto de ratón Medio de cultivo Sobrenadante CHO/ ADN-r 84 Rinovirus humano Desconocida Sobrenandante BHK /ADN-r 85 Polioma bovino SFB SFB 1 Vacuna veterinaria 86 Diarrea Bovina SFB ¿? Producto final 1 Interferón 87 Diarrea Bovina SFB ¿? Producto final / Vacuna veterinaria 88 Virus de la lengua azul Desconocida Producto Final / Vacuna veterinaria 89 Fiebre hemorrágica epizoótica SFB ¿? Sobrenadante CHO / ADN-r 90 Parvovirus canino Desconocida Producto final / Vacuna veterinaria 91
Revisión Bibliográfica
24
Los herpesvirus tienen una elevada incidencia en la población cubana y mundial,
produciendo una gama amplia de enfermedades clínicas, que van desde la infección
inaparente hasta cuadros severos ocasionalmente fatales. Estos virus penetran a través de
la piel y las mucosas por contacto personal con secreciones infecciosas, como saliva,
lágrimas, orina y otras. Una vez que los virus han penetrado al organismo, son propensos a
producir infección latente, inaparentes clínicamente, con la aparición de síntomas y signos
clínicos a intervalos de tiempo relacionados con factores virales y del hospedero, lo cual
dificulta el diagnóstico clínico de estos agentes.
Los retrovirus de roedores94'95, conocidos como contaminantes endógenos de líneas
celulares murinas, son clasificados en cuatro grupos basados en las diferencias de la
morfología del virión y la homología de sus secuencias. Solamente dos clases, los virus de
la leucemia murina tipo C (MuLV) y los virus del tumor mamario tipo B son de replicación
competente96. Las partículas intracisternales tipo A se encuentran asociadas al retículo
endoplasmático, sin secretarse a la fase extracelular97. El último grupo corresponde a las
llamadas VL30s, que son secuencias parecidas a retrovirus, las cuales no producen ningún
componente estructural del virión, pero pueden ser empaquetadas eficientemente y
trasmitidas como seudotipos de virus tipo C. Se ha aislado una amplia variedad de
retrovirus murinos, algunos representan auténticos virus recombinantes aislados de tejido
neoplásico o de inoculaciones seriadas en animales o de infinitos pases en cultivos
celulares. Otros son productos de provirus derivados de la línea germinal o trasmitidos
congènitamente en poblaciones de roedores específicas98.
Revisión Bibliográfica
25
Los MuLV tipo C son los mejores caracterizados de todos los retrovirus murinos y han sido
divididos por su rango de hospedero, los cuales difieren predominantemente en su
principal glicoproteína viral, Suenv (formalmente gp 70)99. En otras palabras, se han
subdivido en cuatro clases sobre la base de la especificidad de la especie hospedera
determinado por el receptor100:
I. Xenotrópico : Virus que infectan y se repl ican efic ientemente solo en las células de
especies de animales di ferentes a la hospedera.
II . Ecotrópico: Virus que infecta y se replica efic ientemente en las células de su misma
especie.
II I . Anfotrópico : Virus que infecta y se repl ica efic ientemente en las células de su misma
especie hospedera y en células de especie heteróloga.
IV. Politrópico : También conocidos como virus inductores de focos en células de bisontes,
son similares a los anfotrópicos en cuanto a su tropismo celular , pero di ferente desde el
punto de vista antigénico y genómico.
El término "xenotrópico" (X-trópico) fue dado a estos virus (del griego xenos, que significa
"extraño", y tropos, que significa "tendencia")101. El MuLV que induce leucemias y linfomas
en el ratón, denominado "ecotrópico" (E-trópico, del griego oikos, que significa "hogar"),
por su tropismo en células de ratón102. Los virus ecotrópicos de cepas de laboratorio (Mus
musculus) también pueden ser distinguidos por su capacidad de multiplicarse
preferentemente en células provenientes de ciertas cepas de ratones prototipo103. Los virus
N-trópicos se replican preferentemente en células de ratones NIH Swiss (células tipo N),
mientras que los virus B-trópicos se multiplican mejor en células de ratones BALB/c
(células tipo B); los virus NB-trópicos se multiplican rápidamente en ambos tipos de
células104.
Revisión Bibliográfica
26
Unos años más tardes, fue encontrado en ratones salvajes otro MuLV que podía infectar
tanto células de ratón, como células de especies heterólogas. Ellos fueron llamados
"anfotrópicos" (A-trópicos; del griego amphos, que significa "ambos") para designar este
tropismo dual99105. A diferencia de los virus X-trópicos y los E-trópicos, los cuales son
inherentes a las células de ratón, los virus A-trópicos son adquiridos por transmisión
exógena. Luego fueron hallados ratones que liberaban MuLV politrópicos (P-trópicos) que
parecían el resultado de la recombinación de virus E-trópicos infecciosos con secuencias
relacionadas con los MuLV P-trópicos en las células de ratón. Muchos de estos virus
indujeron focos en cultivo de células de pulmón de bisonte, y se ha sugerido por estudios
genéticos que comparten el mismo receptor de superficie celular que los X- trópicos99'106'107.
El reconocimiento, por estudios biológicos, que los MuLV X-trópicos no pueden infectar
las células de las especies hospederas, pero dichas células pueden liberar espontáneamente
estos virus, soporta la hipótesis virogénica de que los virus pueden ser heredados a través
de la célula germinal. Virus similares con un rango de hospederos X-trópicos fueron
descubiertos recientemente en gatos, mandriles, ratas, venados, y otras especies de
animales. El mecanismo de resistencia de las células de ratón a la infección viral por el
virus X-trópico heredado, continua siendo una respuesta muy buscada, pero que aún
permanece desconocida108.
Los retrovirus murinos tipo C también han sido agrupados sobre la base de su
potencialidad para causar neoplasias. En el primero se agrupan los MuLV, los cuales se
replican en cultivos de células fibroblásticas y epiteliales y generalmente no producen
Revisión Bibliográfica
27
efecto citopático (ECP) ni transformación de la morfología celular. En el segundo se
agrupan los virus del sarcoma murino, los cuales son defectivos en cuanto a su capacidad
de replicación, requieren virus MuLV "auxiliadores" para su propagación continuada en
cultivo de células y producen transformación morfológica de las células susceptibles in
vitro109. El virus de la Leucemia Murina Moloney de tipo ecotrópico (E- MuLV), es una
cepa exógena e infecciosa, aislada originalmente de un tumor de ratón110. La cepa
Moloney y otras de MuLV (Friend, Rauscher) pertenecen a un gran y diverso grupo de
retrovirus relacionados y clasificados por sus características genómicas como retrovirus
tipo C de mamíferos111. Los virus que pertenecen a este género pueden ser endógenos o
exógenos, competentes o defectivos para la replicación y en algunos casos contener
oncogenes. Muchos de los virus exógenos relacionados con MuLV están asociados con
enfermedades, mientras que los endógenos por lo general son benignos112.
Se conoce que muchas líneas celulares derivadas de roedores, utilizadas frecuentemente
en la producción de proteínas recombinantes, contienen usualmente partículas
retrovirales endógenas infecciosas (partículas tipo C), o no infecciosas (partículas tipo A)
y que difícilmente son patógenos al hombre, convirtiéndose este modelo viral como
relevante en nuestros procesos productivos113.
Recientemente, el virus diminuto de ratón (MVM) se ha convertido en un foco de
atención regulatoria en la industria biofarmacéutica debido a contaminaciones
encontradas de este agente en procesos de fermentación utilizando la línea celular de
Ovario de Hámster Chino (CHO)114'115. Este virus es un miembro de la familia
Revisión Bibliográfica
28
Parvoviridae, género Parvovirus, de tamaño pequeño (18-26 nm), no envuelto y que
contiene una sola molécula de ADN de simple cadena. El hospedero natural es el ratón
Mus musculus y el virus persiste en colonias de ratones salvajes y de laboratorio, con altas
tasas de infección. La infección en ratones es clínicamente inaparente, y persiste, con
excreción en orina y heces, en presencia de anticuerpos circulantes. El virus parece ser
transmitido exclusivamente por ratones, aunque ocurre por inoculación a ratas y ratones.
Los Parvovirus son relativamente específicos de hospederos por su tropismo, pero se ha
reportado que puede replicarse en líneas celulares transformadas genéticamente de ratón
y hámster116-118.
Las propiedades biológicas de estos agentes proporcionan la potencialidad de infectar al
humano y es necesario realizar una caracterización profunda de los mismos, así como
evaluar la carga viral que la línea celular aporta al proceso productivo119.
2.2.3. Control de las contaminaciones virales.
En el control de las contaminaciones virales de los biológicos, deben considerarse tres
acciones complementarias, las cuales van desde la selección y evaluación de la fuente de
materia prima, el control del producto en etapas apropiadas del proceso productivo,
hasta la evaluación de la capacidad de los procedimientos de producción para remover o
inactivar los virus. Esto significa que ninguna acción individual es suficiente para
asegurar el nivel de seguridad, solo esto se alcanza empleando la combinación de dichas
acciones.
Revisión Bibliográfica
29
La selección de las fuentes iniciales de materia prima es esencial para minimizar la
contaminación viral, pero deben tenerse en cuenta aspectos fundamentales en su alcance
como los que a continuación se señalan:
^Pruebas que pueden ser capaces de detectar uno o más t ipos de virus. Ningún ensayo
virològico es capaz de demostrar la presencia de todos los t ipos conocidos.
^Todos los sistemas de ensayo requieren un nivel mínimo de partículas virales que
pueden ser detectadas.
^Algunos ensayos sólo se hacen posi t ivos t iempo después de la infección.
^Los ensayos t ienen l imitaciones estadísticas en su muestreo.
En muchas ocasiones la seguridad de no tener una contaminación viral probable en un
biológico, no se alcanza por la sola demostración de que los ensayos sean negativos, si no
por una demostración de que el proceso productivo es capaz de eliminar o inactivar a los
mismos120. De este modo, la llamada validación viral de un proceso, juega un papel
fundamental cuando se trata de establecer la seguridad de los productos biológicos,
especialmente cuando las materias primas presentan una alta probabilidad de estar
contaminadas con virus conocidos como patógenos al hombre o animales. La validación
viral como evaluación del proceso productivo, da una medida de confianza de que un
amplio rango de virus, incluidos los no sospechados o conocidos, pueden ser
eliminados121.
2.2.4. Validación de la eliminación viral.
El proceso de validación viral se basa en la estimación cuantitativa del nivel total de
reducción viral obtenido a lo largo de las diferentes etapas del proceso de purificación,
cuando se le adiciona deliberadamente cantidades significativas de virus en el material a
Revisión Bibliográfica
30
purificar. Este concepto de validación se aplica a todas las operaciones que están dirigidas
a remover o inactivar virus. Debe demostrarse la confiabilidad de cada sistema
productivo para alcanzar la calidad del producto requerida en una manera reproducible.
La racionalidad para la validación de la inactivación y/o remoción, se fundamenta sobre
los posibles efectos secundarios peligrosos de contaminación viral potencial de un
producto biotecnológico, derivado de un cultivo de células de mamíferos destinado para
el uso como droga terapéutica o reactivo diagnóstico in vivo.
La contaminación potencial con virus adventicios o retrovirus, es una preocupación para
la seguridad del producto. Aún cuando no puede ser detectada infectividad viral o
actividad de reverso transcriptasa en los bancos celulares, la presencia de partículas
retrovirales, puede ser demostrada frecuentemente por microscopía electrónica (ME)122.
La evaluación microscópica no da respuesta a la relevancia biológica de estas partículas,
especialmente referidas a la infectividad. Un ejemplo prominente, es la presencia de un
número elevado de partículas de tipo A en hibridomas, donde la infectividad es baja o no
detectable113'123'124. A pesar de esta discrepancia entre el número de partículas semejantes
a virus y la infectividad, es una recomendación general, calcular el factor de reducción
(FR) total basado en el número de partículas125. Sin embargo, la presencia de un virus de
origen desconocido no puede ser excluida, el cual pudiera tener efectos fisiológicos
desconocidos y potencialmente dañinos, y donde su naturaleza desconocida pudiera
complicar el desarrollo de un ensayo específico. Sin un ensayo sensible y
Revisión Bibliográfica
31
específico, es imposible monitorear la presencia, así como la remoción o inactivación del
virus a lo largo del proceso de purificación del producto126.
En los estudios de validación viral, debe hacerse una distinción clara entre los estudios de
inactivación y los de remoción viral.
"La inactivación viral es la pérdida irreversible de la infectividad viral". La pérdida de la
infectividad viral no significa necesariamente la destrucción completa o desintegración
del virión, lo cual seria lo más deseable, pero sí la desnaturalización irreversible de
componentes virales distintivos que son requeridos esencialmente para infectar la célula
hospedera. Por ejemplo, el tratamiento con detergente/solvente de un virus envuelto: la
membrana lipídica, esencial para el reconocimiento de la célula hospedera, se disuelve,
pero la nucleocápsida viral permanece intacta, es decir, la proteína viral del núcleo, así
como el genoma, son aún totalmente funcionales, solamente ha perdido la capacidad de
unirse y penetrar la membrana de la célula hospedera127.
"La remoción viral es la reducción mecánica del número de partículas virales". Las
partículas virales completas son funcionales e infectivas. Existen diversas metodologías
ampliamente utilizadas para la remoción mecánica de los virus. La separación de los
virus del producto, pudiera ser alcanzada mediante la adsorción del producto a una
matriz cromatográfica, mientras que el virus pasa a través de la columna, o viceversa.
Revisión Bibliográfica
32
Otra aproximación es la retención de partículas virales mediante filtración, ya sea por
filtración profunda o ultrafiltración en modo de flujo tangencial128*131.
Otro aspecto importante a considerar para el diseño de los estudios de inactivación y/o
remoción viral, lo constituye la selección de los virus que van a ser utilizados en el estudio.
Los mismos se seleccionan teniendo en cuenta las características de aquellos que puedan
contaminar el producto, que representen un rango amplio de propiedades físico-
químicas: presencia o ausencia de envoltura lipídica, tamaño, forma, características del
genoma, etc., que manifiesten altos títulos virales y sean susceptibles a un ensavo fácil, de
forma tal que se pueda definir la habilidad del sistema de purificación para eliminar
contaminantes virales. Bajo estas condiciones, se han definido 3 categorías de virus132'133:
■ Virus relevantes : Identi ficados como reales o potenciales contaminantes del sustrato
celular ó de los materiales que intervienen en el proceso productivo.
■ Virus modelos: Empleados en lugar de uno relevante cuando este úl timo no cumple con
algunas de las condiciones antes referidas, que esté más cercano a las característ icas
del conocido en cuanto a género y famil ia y que mantengan semejanza con relación a
sus propiedades fís ico-químicas.
■ Virus modelos no específicos: Con diferentes propiedades uti l izados para caracterizar
la capacidad general del proceso de producción para el iminar y/o inactivar virus.
El concepto de validación se aplica a todas las operaciones que son dedicadas a remover o
inactivar virus, por lo que se debe demostrar la confiabilidad de una unidad de operación
dada para alcanzar la calidad del producto requerida de una manera
Revisión Bibliográfica
33
reproducible. Varios aspectos deben tenerse en cuenta a la hora de diseñar un desescalado
representativo de la escala del proceso productivo real, en cuanto a pureza y rendimiento,
relacionados con la altura de la columna, el flujo lineal y la carga de proteína132'134. En los
estudios de remoción, deben añadirse altas concentraciones de virus al material de partida
a procesar en las diferentes etapas críticas a validar del proceso de purificación,
evaluándose la efectividad de la remoción de las partículas virales al final de cada paso
cromatogràfico135. Debe conocerse además, el nivel de contaminación del material a
purificar, con el objetivo de diseñar el reto viral con un valor superior de forma tal, que
permita saber si el proceso es capaz de lograr un (FR) mayor a la contaminación real que
presenta el proceso productivo. No sólo la cuantificación de los virus inactivados y/o
eliminados en un paso o pasos, da como conclusión que se tendrá un producto seguro.
Hay numerosos factores que contribuyen a dar la completa efectividad del paso y deben
ser evaluados todos los datos de la forma más cuidadosa. La naturaleza de inactivación o
eliminación puede ser más o menos selectiva para diferentes clases de virus. Solamente
esta evaluación combinada proporcionará la decisión de que un paso de producción
pueda considerarse efectivo, moderadamente efectivo o inefectivo en la eliminación de los
contaminantes virales136.
Aún cuando han sido varios los productos biotecnológicos registrados en diferentes
países, no existen datos publicados que permitan abordar los problemas que deben ser
enfrentados desde el punto de vista regulatorio en el momento de desarrollar y registrar
un producto, debido a que esta información es susceptible de ser utilizada por la
Revisión Bibliográfica
34
competencia y además, cada proceso productivo en sí es novedoso8 y tienen que ser
valorados todos los aspectos antes expuestos para el diseño y establecimiento de un
programa de control virològico, y de esta forma, garantizar la seguridad viral de un
producto terapéutico.
Materiales y Métodos
35
CAPITULO III. MATERIALES Y MÉTODOS.
3.1. Aspectos generales.
Para una mejor comprensión de los diseños experimentales en este acápite, se describen
aquellos aspectos comunes en los diferentes ensayos que forman parte del programa.
3.1.1. Líneas celulares.
Todas las líneas celulares que a continuación se describen fueron cultivadas en
condiciones de esterilidad y mantenidas a 37 °C en atmósfera húmeda de CC>2al 5 %.
Para la realización de los pases de las células dependientes de anclaje, se utilizó una
solución estéril de Tripsina 0.25 %, Ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 1 mM en
solución salina fosfato (PBS).
1. C H O C 3 B (Clon 2F4), células de Ovario de Hámster Chino, dihidrofolato reductasa
negativa (DHFR-) y productora de Eri tropoyetina humana mediante la introducción
del plásmido pKG-Xho-EPO-Hind, conteniendo el gen de la EPO humana y el vector
SV2 DHFR. Crecen en cul t ivo dependiente de anclaje en Medio Esencial Mínimo de
Dulbecco y medio F12 (DMEM/F12) suplementado con 5 % de SFB, 2 mM de
Glutamina, 15 mM de Hepes, 26 mM de Bicarbonato de sodio, 2xl0" 5 M de 2-
Mercaptoetanol y 1 mM de Piruvato de s odio con un t iempo de doblaje de
aproximadamente 16-18 horas.
2 . R 3 U T / 1 6 es un mieloma murino NSO transfectado con la construcción genética que
codifica para la expresión de cadena pesada y l igera de una IgGl humana (AcM
humanizado) que reconoce al EGF-R. Esta l ínea celular crece en suspensión en
DMEM/F12 suplementado con 5 % de SFB, 4 mM de Glutamina, 26 mM de Bicarbonato
de sodio, 15 mM de Hepes, 2xl0 - 5 M de 2-Mercaptoetanol y 1 mM de Piruvato de sodio
con un t iempo de doblaje de aproximadamente 18-20 horas.
3 . V E R O (ATCC CCL-81 )1 3 7 , células de r iñón de mono verde afr icano cul t ivadas en
Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 5 % de SFB. Esta l ínea se ha
Materiales y Métodos
36
empleado ampliamente en estudios de repl icación de una gran variedad de virus de
di ferentes especies, especialmente las de origen humano.
4 . MRC-5 (ATCC CCL-171)1 3 7 , células diploides embrionarias de pulmón humano cult ivadas
en MEM con 2 mM de Glutamina, 1 mM de Pi ruvato de Sodio y 10 % de SFB, la cual ha
mostrado un rango amplio de susceptibi lidad a virus humanos.
5 . A9 (ATCC CCL-1.4)1 3 7 , células de tejido conectivo de ratón derivadas del c lon 929 de la
l ínea celular NCTC cult ivadas en DMEM conteniendo 4.5 g/L de Glucosa y 10 % SFB. Es
susceptible a di ferentes virus murinos como Adenovirus, Coriomeningit is l infocít ica y
con particular preferencia por el MVM, el cual se ha convertido recientemente en un foco
de atención regulatoria por su demostrada capacidad de repl icarse en l íneas celulares
transformadas de ratón y hámster .
6 . BT (ATCC CRL-1390)1 3 7 , células bovinas derivadas de t ejido turbinado de recién nacido
cul t ivadas en MEM con 2 mM de Glutamina, 1 mM de Piruvato de sodio y Suero de
Cabal lo al 10 %. Estas células son muy úti les para el crecimiento de virus bovinos como
la Diarrea Bovina, la Rinotraqueit is Infecciosa Bovina, algunas cepas de Parainfluenzas y
algunos t ipos de Adenovirus y Enterovirus bovinos.
7 . ST (ATCC CRL-174 6)1 3 7 , células de test ículo fetal porcino cul tivadas en MEM
conteniendo 1 mM de Piruvato de sodio, 0 .5% de Hidrol izado de lactoalbúmina y 10 % de
SFB. Esta l ínea celular ha sido uti l izada en la propagación y aislamiento de di ferentes
virus porcinos como Parvovirus, Coronavirus, Enterovirus, Pseudorabia y la
Gastroenteri t is Trasmisible del Cerdo.
8 . SC-1 (ATCC CRL-1404)1 3 7 , células embrionarias de ratón cul t ivadas en MEM con 10 % de
SFB. Estas células exhiben una al ta sensibi l idad a la mayoría de las cepas de los MuLV
de t ipo Ecotrópico (E-MuLV)y hasta un nivel l imitado soportan la repl icación de los
t ipos Xenotrópicos.
9 . XC (ATCC CCL-165)1 3 7 , células de tumor de rata Wistar inducido por la cepa Praga del
v irus del Sarcoma de Rous, son cul tivadas en MEM con 10 % de SFB, las cuales son
capaces de detectar el crecimiento de MuLV en cul t ivo celular mediante un método
indirecto cuando son co-cult ivadas con células embrionarias de ratón infectadas con la
subsiguiente formación de sinci t ios.
Materiales y Métodos
37
3.1.2. Inóculos virales.
1. Parainfluenza t ipo 3 bovina (Pl-3 ) , cepa SF-4 (ATCC VR-281 1 3 8 ) , pertenece a la famil ia
Paramixovir idae del género Paramixovirus, se repl ica en células VERO produciendo
ECP a los 2-3 días de incubación y es capaz de hemaglutinar er i troci tos de curiel ,
pol lo, humano y bovino a temperatura ambiente.
2 . Sarampión, cepa Edmonston (ATCC VR-24 1 3 8 ) , la cual fue obtenida de la sangre de un
paciente con fase aguda de sarampión t ípico. Este virus de la famil ia Paramixovirus
del género Morbi l l ivirus, es capaz de infectar las células humanas diploides MRC-5,
producir ECP entre 4 y 14 días después de la inoculación y hemaglutinar er i troci tos de
primates no humanos.
3 . Virus Diminuto de Ratón (MVM), cepa Prototipo (ATCC VR-13 4 6 1 3 8 ) , ais lada de una
placa puri ficada de la cepa Crawford. Pertenece a la famil ia Parvoviridae del género
Parvovirus, se replica en células A9 produciendo ECP a las 72 horas de incubación y
hemaglutina eri troci tos de curiel .
4 . Parvovirus Bovino (PVB), cepa Haden (ATCC VR-767 1 3 8 ) , ais lada originalmente de
heces fecales de t ernero. Pertenece al mismo género de MVM y se repl ica en células BT
con ECP a los 7 d ías y hemaglutina eri troci tos humanos y de curiel a temperatura
ambiente.
5 . Parvovirus Porcino (PVP), cepa NADL-2 (ATCC VR-742 1 3 8 ) , ais lada de leucoci tos de
muestras de sangre porcina colectadas en un matadero. Infecta células ST con
presencia de ECP (inclusión nuclear , necrosis celular) 72 horas después de su
inoculación y produce actividad hemaglutinante con eri troci tos de gato, curiel y pol lo
a 4 °C y temperatura ambiente.
6 . Virus Ecotrópico de la Leucemia Murina (E-MuLV), cepa Moloney (ATCC VR- 1350 1 3 8 ) ,
genti lmente donada por el Laboratorio de Biología Molecular del Insti tuto de
Investigaciones Cl ínicas de Montreal , Canadá. Este retrovirus de mamífero t ipo C
infecta células murinas SC-1 y produce placas en células XC9 8 .
7 . Herpes Simplex t ipo 1 (VHS-1), cepa MacIntyr e, aislada de un paciente e identi ficada
mediante técnica de Inmunofluorescencia indirecta (IFA) usando un AcM (Herpes
monoclonal-ki t , BioMerieux). Crece con t ítulos elevados en células VERO con MEM
suplementado con 5 % de SFB.
8 . Poliovirus humano t ipo 2, (Polio 2 ), cepa vacunal Sabin, recibida del National
Insti tute for Biological Standards and Control , Inglaterra, y pasada 4-5 pases en el
Materiales y Métodos
38
laboratorio de Enterovirus del Insti tuto de Medicina Tropical "Pedro Kouri" : primero
en la l ínea celular Hep 2 y el resto en Vero.
3.2. Caracterización de los contaminantes virales en los procesos productivos. 3.2.1. Etapas de
confección de bancos celulares y sobrenadantes de fermentación. Bancos Celulares (BC): Se
descongeló un ámpula de cada uno de los bancos celulares (Semilla y Maestro) de las
líneas celulares CHO y NSO, productoras de la EPO-hr y del AcM h-R3, respectivamente.
Las células fueron sembradas en frascos de cultivos de 162 cm2en DMEM/F12 con 10 % de
SFB e incubadas a 37 °C. Después de 4 días de cultivo se prepararon suspensiones
celulares según el diseño descrito en la tabla 3. Todas las muestras, con excepción de la
empleada en los estudios de microscopía electrónica (ME), fueron congeladas y
descongeladas tres veces y centrifugadas a 3500 r.p.m. durante 15 minutos a 4 °C. Los
sobrenadantes obtenidos se filtraron a través de membranas de acetato de celulosa con
una porosidad de 0.45 j^m y se almacenaron a -70 °C hasta su posterior evaluación.
Células al límite de la cosecha o banco extendido (BE): Las células provenientes del final de la
corrida de los fermentadores fueron obtenidas en el caso de EPO-hr del cartucho de
fermentación por apertura del mismo bajo condiciones estériles y remoción de las células
mediante tratamiento con Tripsina porcina 0.25 % y EDTA 1 mM en medio de cultivo. Por
su parte, el BE del AcM h-R3 se confeccionó a partir de un ámpula del banco de trabajo
2016/T980520 realizándole 5 pases consecutivos en DMEM/F12 al 5 % de SFB,
suplementado con 31.2 ng/mL de Xantina y 3 ng/mL de Ácido micofenólico.
Materiales y Métodos
39
Las células obtenidas fueron expandidas y procesadas en iguales condiciones que las que
se describieron anteriormente para los Bancos Celulares.
Sobrenadantes de las corridas de fermentación (SN): Para caracterizar los contaminantes
virales que pudieran haberse generado durante la etapa de fermentación, así como
determinar la carga viral que entra al proceso de purificación al finalizar cinco corridas
consecutivas de fermentación, se seleccionaron los sobrenadantes de cada una de ellas y
se aplicó la misma estrategia de ensayo empleada en las líneas celulares productoras. Se
tomaron 100 mL de cada uno de los sobrenadantes y se realizaron todos los ensayos
excepto el de producción de anticuerpos (MAP y HAP test).
3.2.2. Ensayos para la detección e identificación viral.
La estrategia para la selección de los ensayos estuvo fundamentada en buscar métodos
sencillos, reproducibles, sensibles y que cubrieran un amplio rango de virus de diferentes
especies.
Tabla 3 Sistema de muestreo para los ensayos virológicos. Etapa Ensayo a realizar Células /mL Volumen (mL) Total de células en la muestra BC MAP o HAP 10« 5 10 X 106 BC / BE / SN In vi tro 3.3 x 106 3 60 x 106 BC / BE / SN Ratones lactantes 10 x 10® 2 20 x 106 BC / BE / SN Ratones adultos 10 x 106 7 70 x 106 BC / BE / SN Curíeles 10 x 106 35 350 x 105 BC / BE / SN ME 2 x 10« 10 20 x 10s BC / BE / SN XC Sobrenadante 2 NP *
* NP = No pr ocede
Materiales y Métodos
40
3.2.2.I. Ensayo de producción de anticuerpos específicos.
Para la inducción de anticuerpos en ratón (MAP test) ó hámster (HAP test) mediante la
estimulación de la respuesta inmune del animal frente al virus potencialmente presente en el
material inoculado, se emplearon animales destetados, no consanguíneos (ratones NMRI y
hámster Chino), libres de patógenos específicos, los cuales fueron mantenidos en
condiciones de asepsia (aisladores). Al inicio del ensayo se definieron los siguientes grupos
de inoculación:
G r u p o 1: Tres animales inoculados con lx lO6 células.
G r u p o 2: Tres animales inoculados con lx lO5 células.
G r u p o 3 : Tres animales inoculados con medio de cul t ivo.
G r u p o 4: Tres animales inoculados con lx lO5 células.
G r u p o 5 : Tres animales inoculados con medio de cul t ivo.
Todos los grupos fueron inoculados por vía intraperitoneal (i.p.), intranasal (i.n.) e
intracraneal (i.c.) Para la detección indirecta de contaminación con el virus de la Lactato
deshidrogenasa (LDV) en el material biológico inoculado se le extrajeron 200 |iL de sangre a
los grupos 4 y 5 a los tres días de inoculados, y se midieron los niveles de la enzima Lactato
deshidrogenasa mediante un ensayo colorimétrico. Luego de 28 días de inoculación todos
los grupos fueron desangrados y colectado el suero para su posterior evaluación serológica.
Los sueros extraídos fueron analizados por ELISA, IFA e Inhibición de la Hemaglutinación
(HI) de acuerdo a los protocolos establecidos por el Centro de Referencia ICLAS para virus
murinos en Holanda139, con la finalidad de conocer los contaminantes vírales endógenos de
origen murino que puedan estar
Materiales y Métodos
41
presentes en la línea celular. En la tabla 4 se muestran de manera resumida los aspectos más
importantes de este ensayo.
3.2.2.2. Ensayo in vitro para la presencia de virus adventicios.
Se seleccionaron las líneas celulares MRC-5, Vero, A9, BT, ST por su alta susceptibilidad de
infección a un amplio rango de virus de origen humano, primate no humano, murino,
bovino y porcino (Tabla 5). Se conformaron bancos maestros y de trabajo de las líneas
celulares y de las cepas virales, algunas no existentes en Cuba.
Tabla 4 Vi rus murinos detectados por los ensayos de MAP o HAP. Virus Abreviatura Fami l ia HAP/MAP Ensayo Sendai 13 SdV Paramixoviridae MAP / HAP Elisa Coriomeningitis linfocítica 1*3 LCMV Arenaviridae MAP / HAP Elisa Hantaan13 HTV Bunyaviridae MAP / HAP IFA Reo tipo 3 1-3 Reo3 Reoviridae MAP/HAP Elisa Neumonía de ratón 2 3 PVM Paramixoviridae MAP Elisa Polioma2 PV Papovaviridae MAP HI Citomegalovirus de ratón 23 MCMV Herpesviridae MAP Elisa Rotavirus de ratón 2 3 EDIM Reoviridae MAP Elisa Tímico de ratón 2 MTV Herpesviridae MAP Elisa Lactato deshidrogenasa 13 LDV Togaviridae MAP Colorimétrico K2 K Papovaviridae MAP HI Ectromelia2'3 Vaccinia Poxviridae MAP Elisa Diminuto de ratón 2 3 MVM Parvoviridae MAP Elisa Encefalomielítis de ratón 2 TMEV Picornaviridae MAP Elisa Adenovirus de ratón 2 3 MAdV Adenoviridae MAP Elisa Hepatitis de ratón 2 MHV Coronaviridae MAP Elisa Simio tipo 5 SV-5 Paramixoviridae HAP Elisa
1. Existen evidencias de su capa cidad de in fect ar a humanos y pr imates no human os. 2 . No e xisten eviden cias de su capacidad par a in fect ar a humanos. 3 . Capace s de r ep l i car se en célu las i n v i t ro de or igen humano y pr imate no humanos.
Tabla 5 Líneas celu lares para la detección de contaminantes v irales adventicios . Línea celu lar Virus contro l Virus contaminantes Fuente de contam inación MRC-5 Sarampión Humanos; Primates Operario VERO PI-3 Humanos, Primates, Bovinos Operario, SFB A9 MVM Murinos Linea Celular BT PVB Bovinos SFB ST PVP Porcinos Tripsina SC-1 E-MuLV Retrovirus Linea Celular
Materiales y Métodos
42
Cada muestra fue inoculada por triplicado en placas de 6 pozos (Costar, USA) con
aproximadamente un 80 % de monocapas de células confluentes, dejándose 0.5 mL del
inóculo por pozo en contacto con la monocapa celular durante 1 hora a 37 °C en atmósfera
húmeda y 5 % de CO2. Transcurrido el tiempo de adsorción, se añadió a las placas, medio de
cultivo suplementado con 2 % de suero y fueron mantenidas bajo las condiciones anteriores.
Los controles del ensayo se inocularon por duplicado de la misma forma que las muestras a
analizar, donde los positivos correspondieron a las cepas virales mencionadas en la tabla 5,
mientras que los negativos al medio de cultivo específico para cada línea celular. Las células
fueron observadas diariamente por un período de 14 días en un microscopio invertido
(Leica, Alemania) en busca de aparición de ECP o cambios morfológicos. Al término de este
período, se realizaron 3 pases a ciegas (cada 14 días) en cultivos celulares frescos en las
mismas condiciones que las descritas anteriormente y se observaron diariamente en busca
de ECP. Al finalizar el estudio y para determinar la presencia de virus hemaglutinantes, se
colectaron los sobrenadantes de los cultivos provenientes de VERO, MRC-5, A9, ST y BT y se
les realizó la prueba de hemaglutinación, utilizando como soporte placas de microtitulación,
de poliestireno, fondo U (Costa, USA) y concentraciones de 0.5 %, 0.75% y 1 % de eritrocitos
de pollo, curiel y mono rhesus como sistemas indicadores, siguiendo el protocolo descrito
por Hierzoler y Rosen en 1969140. Los resultados de la prueba se interpretaron según lo
recomendado por los autores antes mencionados. En caso de ocurrir ECP se procedió al
aislamiento y caracterización del virus sospechado.
Materiales y Métodos
43
Para la detección de retrovirus murinos, las muestras provenientes de los BC, BE y SN se
prepararon según lo referido en la tabla 3. Primeramente se sembraron frascos de cultivos
de 25 cm2 con 1.2 x 1G5 células totales de SC-1 en MEM conteniendo 10 % de SFB y 5 ng/mL
de Polibreno 24 horas antes de la infección. Cada frasco fue inoculado de forma
independiente con la muestra a evaluar y se incubaron toda la noche a 37° C en atmósfera
húmeda y 5% de CO2. Al día siguiente, el inóculo fue eliminado y remplazado por medio de
mantenimiento y las células fueron incubadas bajo las mismas condiciones mencionadas
anteriormente. Una vez alcanzado un 95 % de confluencia, se realizaron 5 pases
consecutivos, siguiendo el mismo régimen de mantenimiento. Después del pase final, los
sobrenadantes resultantes se cosecharon, filtraron y almacenaron en alícuotas a -85° C. Para
la detección de partículas retrovirales murinas, las muestras fueron tituladas mediante el
ensayo de formación de placas XC y las dosis infecciosas expresadas como unidades
formadoras de placas (UFP/mL).
3.2.2.3. Ensayo in vivo para la presencia de virus inaparentes.
Para el aislamiento de virus de origen murino, bovino, porcino, primates no humanos y
humanos que no son capaces de causar ningún ECP u otros efectos discernibles en cultivos
celulares, se emplearon sistemas biológicos vivos (Tabla 6).
Tabla 6 V i r u s a d v e n t i c i o s d é t e c t a b l e s e n s i s t e m a s b i o l ó g i c o s v i v o s 1 4 1
Especie de Anima l Virus Cur ie l Ratón lactante
Ratón adul to
Rabia, Cor iomeningi t is l in foc í t ica, Arbovirus, Éb ola, Encefalomio cardi t is , Junin , Lass a, Marburg. Viruela , Coxsack ie A y B . , Arbovirus, Junin , M achup o.
Herpes, Cor iomeningi t is l in fo cí t ica , Rabia. Arboviru s, Encefalomio cardi t is .
Materiales y Métodos
44
Se utilizaron dos especies de roedores SPF no consanguíneos: ratones NMRI y curíeles
Hartley, distribuidos aleatoriamente, excepto los ratones lactantes para evitar el
canibalismo e inoculados según el diseño mostrado en la Tabla 7, mantenidos durante el
tiempo del ensayo bajo condiciones controladas de temperatura, humedad relativa e
iluminación.
Para detectar la presencia de signos clínicos de infección viral se observaron dos veces al
día, durante 28 días en el caso de los ratones adultos y curíeles. Los ratones lactantes
fueron observados durante 14 días, posteriormente sacrificados y extraído de cada animal
los siguientes órganos: cerebro, pulmones, corazón, hígado, bazo, riñones. Los órganos
embebidos en solución salina 0.9 % fría, fueron macerados en mortero de porcelana,
filtrado el sobrenadante, inoculados (pase a ciegas) en un nuevo grupo de 6 a
Materiales y Métodos
45
8 ratones lactantes en iguales condiciones y observados por otros 14 días. Se consideraron las
muestras no contaminadas si el 80 % de los animales permanecieron sanos, sobrevivieron al
período de observación sin lesiones de ningún tipo en el sitio de inoculación y no mostraron
evidencias de infección viral.
3.2.2.4. Microscopía Electrónica.
Consiste en estudiar mediante la microscopía electrónica de transmisión, la presencia de
partículas semejantes a virus así como el número de las mismas, con la finalidad de conocer
sus características estructurales y la posible carga viral que entra al proceso de purificación.
Inclusión y corte: Las ámpulas de los bancos celulares fueron descongeladas según lo descrito
en el acápite 3.2.1. Las suspensiones celulares obtenidas del proceso de expansión fueron
ajustadas a 2 x 106 células y lavadas con PBS a 4 °C tres veces mediante centrifugación a 1000
gravedades durante 10 minutos. Después de decantado el sobrenadante, al botón celular
obtenido se le añadió 10 mL de Glutaraldehído al 2.5 % en solución de Cacodilato de sodio
0.1 M, pH 7.2 durante una hora a 4 °C. Después de tres lavados con dicha solución en iguales
condiciones de centrifugación, se fijaron en Tetraóxido de osmio al 1 % durante 1 hora a 4
°C. Luego de lavarse nuevamente con solución Cacodilato, se deshidrataron en
concentraciones crecientes de etanol, para ser incluidas en Araldita y de esta forma obtener
un bloque con la muestra, de acuerdo a la técnica descrita por Rodríguez T. y Dovale E. en
1980142. Los bloques obtenidos fueron
Materiales y Métodos
46
cortados en un ultramicrótomo ultratome III (LKB, Suecia) y las rejillas con los cortes
seriados de las muestras fueron contrastadas según Reynols en 1963143. Todas las muestras
fueron examinadas en un microscopio electrónico (Jeol, modelo JEM-100S, Japón), donde se
evaluaron 200 células (por cada muestra analizada) de forma tal que se asegurara con un 95
% de confianza la probabilidad de encontrar la presencia de partículas virales cuando al
menos, el 10 % de las células expresaran virus.
Tinción negativa Se tomaron 20 mL de los sobrenadantes provenientes del cultivo de los
bancos celulares y de 5 lotes de las cosechas al finalizar la corrida de fermentación, que se
concentraron 10 veces por ultracentrifugación a 100,000 gravedades durante 90 minutos a 4
°C en una ultracentrífuga Centrikon, Kontron Instruments. El botón celular obtenido fue
resuspendido en 2 mL de medio de cultivo a temperatura de 4 °C para evitar la degradación
de las posibles partículas virales. De esta suspensión se depositaron 10 µL sobre una tira de
"parafilm" dispuesta en una cámara seca. Sobre la superficie de la gota de sobrenadante se
colocó durante 5 minutos una rejilla de 200 mesh cubierta con una membrana de Formvar.
Luego de lavar gentilmente la rejilla en agua destilada por igual período de tiempo, se
tiñeron las rejillas con una solución acuosa de Acetato de uranilo al 5 % durante 1 minuto,
eliminándose el exceso de líquido por capilaridad con un papel de filtro colocado al borde
de la rejilla. Las muestras así procesadas fueron observadas en el microscopio electrónico a
50,000 aumentos. Un total de 10 huecos por rejillas fueron examinados con la finalidad de
cuantificar el número de partículas existentes. Por cada lote de sobrenadantes se observaron
tres rejillas.
Materiales y Métodos
47
3.2.2.5. Ensayo de formación de placas XC.
Para la estimación de la infectividad viral de los retrovirus murinos, se empleó el método de
placas XC, el cual combina simplicidad, exactitud, y alta reproducibilidad de sus resultados.
Para la determinación de la infectividad viral de retrovirus murinos de tipo Ecotrópico
mediante este ensayo, se utilizó la línea SC-1 permisiva para la multiplicación de estos virus
y la línea XC, sensible a la formación de placas de sincitios por la presencia de partículas
retrovirales murinas.
Las muestras a analizar se inocularon en un cultivo de células semiconfluentes de SC-1,
sembradas en frascos de 25 cm2 en presencia de 5 µg/mL de Polibreno. Luego de cinco pases
a ciegas (cada 5 días) de los sobrenadantes, se procedió a realizar el protocolo para el ensayo
de placa XC descrito por Rowe P.W. y cols, en 1970144. Con la finalidad de lograr un
desempeño más agilizado y económico de este ensayo, se decidió evaluar la posibilidad de
sustituir las placas Petri de 60 mm de diámetro por placas de 6 pozos, modificación que se
describe a continuación.
Las células SC-1 se sembraron en los pozos de las placas a una concentración de 2.3 x
104/mL y son mantenidas a 37 °C en MEM con 10 % de SFB en atmósfera húmeda con 5 %
de CO2. Al día siguiente se les añadió medio fresco con 5 ^ig/mL de Polibreno,
manteniéndose por una hora en iguales condiciones. Después de transcurrido este tiempo se
eliminó el sobrenadante y los cultivos fueron infectados con 1 mL de la muestra a analizar e
incubados por 2 horas, manteniendo las condiciones de cultivo
Materiales y Métodos
48
antes referidas. El medio es cambiado después de la infección y las placas fueron incubadas
durante 5 días hasta alcanzar una monocapa de células confluentes. Posteriormente, se
eliminó el medio de cultivo y las monocapas celulares fueron expuestas por 30 segundos a
una intensidad de luz ultravioleta de 60 erg7mm2/seg. Seguidamente se añadieron 22.3 x 105
células/mL de la línea celular XC en MEM con 10 % de SFB y se co-cultivaron hasta la
formación de placas. Luego de ser lavadas con PBS, se tiñeron las placas con una solución
consistente en 3 partes de Azul de metileno al 1 % en Metanol, 2 partes de Metanol y 1 parte
de Carbón fuchina al 1 % en Metanol, durante 10 minutos, para determinarse en ellas el
número de unidades formadoras de placas (UFP/mL). Para el control positivo se inocularon
seis diluciones seriadas en base 10 (3 réplicas por dilución), del E-MuLV, siguiéndose el
procedimiento descrito anteriormente. Para calcular el valor del título viral, expresado como
el logaritmo de las UFP/ mL, se utilizó la fórmula siguiente:
Log UFP / mL = Log (promedio # de p la cas x 1 / d i lu ción x 1 mL / vo lum en inocul ación)
Siguiendo los lineamientos de las ICH145, el método modificado a validar se clasifica como
ensayo de identificación de impurezas y prueba de cuantificación. Los parámetros que se
evaluaron fueron exactitud, repetibilidad, reproducibilidad, límite de detección y límite de
cuantificación y se calcularon mediante el paquete de programas MS Statistica, instalado en
una computadora personal Pentium 2.
Materiales y Métodos
49
Exactitud: La exactitud se determinó mediante estudios de recobrado (R), al evaluarse tres
veces el título viral de la preparación de la cepa viral de E-MuLV (Lote # 980508CIM) y
compararse con el valor teórico del título viral previamente obtenido por titulaciones
repetidas. La comparación de R con el valor 100 % se realizó mediante un análisis de
varianza.
Precisión intra-ensayo (Repetibilidad): Se realizaron 3 determinaciones del título viral a la
preparación de la cepa viral de E-MuLV (Lote # 980508CIM) bajo las mismas condiciones,
por el mismo analista, con los mismos equipos y reactivos, durante una misma sesión de
trabajo. Se determinó el porcentaje del coeficiente de variación (CV %) para cada una de las
diluciones y los títulos, así como sus intervalos de confianza.
Precisión inter-ensayo (Reproducibilidad): Se evaluó el título de la preparación de la cepa viral
de Moloney del E-MuLV (Lote # 980508CIM) durante 4 experimentos realizados por 2
analistas en 2 días diferentes, bajo las mismas condiciones de trabajo. Se determinó el CV
(%) para cada una de las diluciones y los títulos, así como los intervalos de confianza.
Linealidad: Se realizaron 4 experimentos considerando un total de 6 diluciones seriadas en
base 10 (logio) de la preparación de la cepa viral utilizando 3 pozos por dilución. En cada
experimento se calcularon la media de los conteos por dilución y el error estándar. Se
graficaron las UFP/mL obtenidas para cada dilución en el eje Y contra el logio de las
diluciones seriadas correspondientes en el eje X. La ecuación de la línea de regresión y
Materiales y Métodos
50
sus estimadores se determinó por el método de los mínimos cuadrados. Se calculó el
coeficiente de variación entre los pozos correspondientes a la misma dilución y se
determinó el rango óptimo del número de placas por pozo para obtener una respuesta
lineal.
Límite de detección: Se determinó por el método de Kolmogorov-Smirnov si la frecuencia de
distribución del número de placas formadas se ajusta a una distribución de Poisson, como
corresponde a una variable discontinua de una prueba de cuantificación.
Límite de cuantificación: Corresponde a la menor concentración de virus que puede ser
determinada con una adecuada precisión y exactitud. Para esto se determinó la mayor
dilución donde el conteo de placas virales fuese estadísticamente confiable con un CV
menor del 30%, es decir, que estuviera dentro del rango óptimo del número de placas por
pozo para obtener una respuesta lineal.
3.3. Validación de la capacidad de eliminación viral de los procesos de purificación.
3.3.1. Selección de los modelos virales.
Ante la heterogeneidad de los contaminantes virales que pudieran introducirse durante el
proceso productivo, uno de los elementos más polémicos en los estudios de validación viral
es la selección de los agentes virales. En este sentido, los modelos virales para este estudio
han sido seleccionados teniendo en consideración diferencias en sus
Materiales y Métodos
51
características bioquímicas, envoltura, tamaño, propiedades físico-químicas, etc. Además,
cepas bien caracterizadas que permitieron ser producidas con altos títulos virales y
ensayadas convencionalmente en sustratos celulares certificados y representativas de los
productos derivados de líneas celulares de origen murino146. Los modelos virales
seleccionados para la validación de la capacidad de eliminación viral de los sistemas de
purificación de EPO-hr y del AcM h-R3 se muestran en la tabla siguiente:
El virus de la Leucemia Murina Moloney (E-MuLV), es una cepa exógena e infecciosa,
aislada originalmente de un tumor de ratón. Se conoce que muchas líneas celulares
derivadas de roedores, utilizadas frecuentemente en la producción de proteínas
recombinantes, contienen usualmente partículas retrovirales endógenas infecciosas
(partículas tipo C), o no infecciosas (partículas tipo A) y que difícilmente son patógenos al
hombre, convirtiéndose este modelo viral como relevante en los procesos productivos
derivados de líneas celulares de origen murino.
Como modelo de virus ADN envuelto, se empleó el VHS-1, miembro de la familia
Herpesviridae de la subfamilia Alfaherpesvirinae. La presencia de una envoltura formada
por glicoproteínas y fosfolípidos en todos los miembros de esta familia, los
Materiales y Métodos
52
hacen muy susceptibles a agentes físico-químicos, fundamentalmente a solventes lipídicos, a
los pH ácidos, factores presentes en el proceso productivo.
Para los virus ARN no envueltos, se utilizó al Poliovirus tipo 2, un miembro de la familia
Picomaviridae, del género Enterovirus. Este virus, de tamaño pequeño, es relativamente
estable a bajas temperaturas (-70 °C por varios años) y por el contrario, su infectividad es
destruida a temperaturas superiores a 50 °C. Es estable en un rango de pH entre 3-9 durante
1 a 3 horas de incubación y no es afectado por compuestos químicos como el cloroformo o
un número de desinfectantes en general (Etanol al 70 %, compuestos de amonio cuaternarios
al 1 %, etc.). No es susceptible al Éter, Deoxicolato y otros detergentes utilizados para la
inactivación de virus envueltos.
El último modelo empleado corresponde a la cepa NADL-2 del Parvovirus porcino, un virus
pequeño y muy resistente a un amplio rango de agentes físico-químicos. Representa además
un modelo del virus MVM, el cual ha sido detectado como contaminante en procesos de
fermentación de líneas celulares derivadas de roedores. Al comienzo del estudio de
validación viral de EPO-hr el modelo de PVP no estaba disponible por lo que no fue
incluido. Posteriormente se lograron obtener títulos virales elevados en cultivo celular por lo
que fue posible utilizarlo en el estudio de validación viral del AcM h-R3.
Para la producción de volúmenes suficientes de inóculos virales, las cepas de Polio 2, VHS-1
y PVP se replicaron en sus respectivas líneas celulares a una multiplicidad de
Materiales y Métodos
53
infección de 1. Una vez mostrado el ECP en toda la monocapa celular, se procedió a
recoger por separado el medio y las células aún adheridas. Estas últimas se rompieron
mediante tres ciclos de congelación y descongelación en volumen mínimo de medio de
cultivo. Las células Usadas se centrifugaron a 3500 r.p.m. durante 15 minutos a 4 °C. El
sobrenadante que contenía el virus intracelular, se mezcló con el primer sobrenadante que
contenía el virus extracelular. Las preparaciones de virus resultantes se filtraron a través
de membranas de acetato de celulosa con una porosidad de 0.45 ^im (Sartorious, USA) y
se alicuotaron antes de ser almacenadas a -85 °C. Estas preparaciones virales se titularon
mediante un método de microtitulación en placas de cultivo de 96 pozos (Costar, USA),
sembradas con monocapa confluente de células e inoculadas con diluciones seriadas en
base 10 del inoculo viral en medio de cultivo suplementado con 2% de suero. Se realizaron
8 réplicas de cada dilución y un control celular. Los cultivos inoculados fueron incubados
a 37 °C en atmósfera húmeda y 5 % de CO?, y observados microscópicamente a intervalos
durante 7 días, con lectura por ECP característico. Los cálculos de DICTso/mL fueron
realizados utilizando el ECP y definida por el método de Reed y Muench147 como la
cantidad de inoculo viral capaz de destruir el 50 % de los cultivos celulares.
Para la propagación de E- MuLV se sembraron frascos de cultivo de 162 cm2 con una
concentración celular de 7 x 105 de la línea SC-1 en MEM conteniendo 10 % de SFB y 5 jig/
mL de Polibreno 24 horas antes de la infección. Las células fueron inoculadas con la
suspensión viral e incubadas toda la noche a 37 °C en atmósfera húmeda y 5 % de
Materiales y Métodos
54
CO2. Al día siguiente, el inóculo fue eliminado y remplazado por medio de
mantenimiento v las células incubadas bajo las mismas condiciones mencionadas
anteriormente. Una vez alcanzado un 95 % de confluencia, se realizaron 5 pases
consecutivos siguiendo el mismo régimen de mantenimiento. Después del pase final, los
sobrenadantes resultantes se cosecharon, filtraron y almacenaron en alícuotas a -85 °C
hasta su descongelación inmediata antes del experimento. El inóculo viral se tituló
utilizando el ensayo de placa XC y las dosis infecciosas expresadas como UFP/ mL.
3.3.2. Desescalado.
Para el desarrollo del estudio de validación se diseñó una escala menor de purificación
que fuera representativa del proceso de manufactura real. Para los sistemas
cromatográficos, se deben considerar parámetros tales como la altura del lecho de la
columna, velocidad de flujo, tiempo de contacto, tipo de geles, pH, temperatura,
concentración de proteínas, sales y producto, rendimiento, actividad biológica y pureza
del producto. Se seleccionaron los parámetros críticos del proceso y se ajustaron a las
condiciones del peor de los casos, es decir, a las condiciones menos favorables para la
inactivación y/o remoción viral.
En la tabla 9 se presenta un resumen de las características de los procesos de purificación
real de EPO-hr y h-R3 comparados con el diseño del desescalado.
Materiales y Métodos
55
Después de calculados los parámetros del desescalado, se realizaron 3 corridas de
purificación independientes para asegurar que el producto obtenido bajo estas
condiciones mantenía las mismas características del obtenido en la escala productiva real.
Para la validación del desescalado se utilizaron 3 lotes de sobrenadantes de cosechas de
EPO-hr y del AcM h-R3 producidas en fermentadores de fibra hueca, modelo ACUSYST
P/3X y el sistema Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) con
Tabla 9 Diseño de l desesca lado de los sistemas cromatográf icos. Parámetro / Cromatograf ía Producto Escala real Desescalado
Altura Blue SFF EPO-hr 13 cm 13 cm Diámetro Blue SFF EPO-hr 5 cm 1.6 cm Velocidad de F lu jo Blue SFF EPO-hr 150 cm/h 150 cm/h Carga a apl icar Blue SFF EPO-hr 50.7-63 mg 6 mg Altura Quelato SFF EPO-hr 10 cm 10 cm Diámetro Quelato SFF EPO-hr 5 cm 0.5 cm Velocidad de F lu jo Quelato SFF EPO-hr 60 cm/h 60 cm/h Carga a apl icar Quelato SFF EPO-hr 68 mg 2 mg Altura SP SFF EPO-hr 10 cm 10 cm Diámetro SP SFF EPO-hr 5 cm 0.5 cm Velocidad de F lu jo SP SFF EPO-hr 60 cm/h 60 cm/h Carga a apl icar SPSFF EPO-hr 46 mg 4 mg A l tura Q-SFF EPO-hr 2 cm 2 cm Diámetro Q-SFF EPO-hr 2.6 cm 0.5 cm Velocidad de F lu jo Q-SFF EPO-hr 100 cm/h 100 cm/h Carga a apl icar Q-SFF EPO-hr 12 mg 2 mg Altura Sephadex G-25 EPO-hr 60 cm 60 cm Diámetro Sephadex G-25 EPO-hr 5 cm 1.6 cm Velocidad de F lu jo Sephadex G-25 EPO-hr 150 cm/h 150 cm/h Volumen a apl i car Sephadex G-25 EPO-hr 500 mL 36 mL Altura DEAE SFF h-R 3 9 cm 9 cm Diámetro DEAE SFF h-Ra 5 cm 0,5 cm Velocidad de F lu jo DEAE SFF h-R 3 60 cm/h 60 cm/h Carqa a apl icar DEAE SFF h-R3 1 L 15 mL Altura Proteina A SFF h-R 3 9 cm 9 cm Diámetro Proteina A SFF h-R 3 5 cm 0,5 cm Velocidad de F lu jo Proteina A SFF h-R 3 120 cm/h 120 cm/h Carqa a apl icar Proteina A SFF h-R 3 2g
Altura Sephadex G-25 h-R 3 60 cm 60 cm Diámetro Sephadex G-25 h-R 3 20 cm 2.5 cm Velocidad de F lu jo Sephadex G-25 h-R 3 76 cm/h 76 cm/h Carga a apl icar Sephadex G-25 h-R 3 1L 15 mL
Materiales y Métodos
56
columnas HR 5/10 y XK 50/60 (Pharmacia, Suecia). Se determinó la consistencia de los
lotes obtenidos mediante las técnicas analíticas y especificaciones establecidas para estos
productos terapéuticos en el Departamento de Control de Calidad del CIM.
3.3.3. Experimentos de inactivación viral.
Se evaluaron todas las soluciones utilizadas en ambos procesos de purificación, que por
sus características de pH y fuerza iónica, potencialmente pudieran inactivar a los modelos
virales seleccionados (Tabla 10 y 11).
Las soluciones fueron contaminadas con cada una de las cepas virales
independientemente, en una relación de 1:10 (inóculo: solución) y se evaluaron las cinéticas
de inactivación teniendo en cuenta el tiempo mínimo de exposición de las mismas a cada
solución. Todos los experimentos fueron conducidos por duplicado a temperatura
ambiente para las soluciones de Blue, Quelato, SP-SFF, Q-SFF, DEAE y Sephadex G-25, y
a 4 °C para las soluciones correspondientes a Proteína A. Las muestras
Materiales y Métodos
57
generadas se colectaron, ajustaron a pH 65-75, filtraron (0.45 nm), y se retitularon
mediante el ensayo de infectividad de DICT50 con lectura de ECP característico y
calculada por el método de Reed y Muench147 para los virus VHS-1, Polio 2 y PVP. Para el
modelo de E-MuLV se cuantificaron las UFP/mL mediante el ensayo de placas XC.
3.3.4. Experimentos de remoción viral.
Para determinar el factor de reducción total de cada proceso de purificación, el material
de partida de cada paso cromatográfico se contaminó con el inóculo de la cepa viral en
estudio en una dilución de 1 : 1 0 (inóculo : material de partida). Para lograr una adecuada
reproducibilidad de los resultados, los estudios se realizaron por triplicado, en diferentes
días y las muestras generadas antes y después de cada etapa de purificación se colectaron,
se ajustaron a pH 6.5-7.5, se filtraron (0.45 |im). Se determinó el título de infectividad
residual al final de cada etapa estudiada mediante los ensayos de DICT50 y el de placas
XC.
3.3.5 Cálculo de los factores de eliminación viral.
Los factores de reducción viral (FR) para cada paso individual de inactivación y/o
remoción fueron calculados mediante la fórmula siguiente:
FR: Factor de reducción vi ra l . V i : Volumen del mat er ia l de par t ida.
FR = log ( V 1C 1 / V2C2) donde Concentración de v i rus en e l mater ia l de par t ida. V 2: Volumen del mater ia l d e proces ado. C 2: Concentración de v i rus en e l mater ia l de proce s ado.
Materiales y Métodos
58
Una vez calculados los FR individuales de cada estudio, fueron sumados aquellos que
alcanzaron valores de infectividad viral superiores a 1 logio UFP/mL ó 1 logio
DICTso/mL para determinar el FR total de cada proceso de purificación. Para comprobar
la confiabilidad y precisión de las titulaciones virales y del cálculo del FR se calcularon los
intervalos de confianza al 95% para una media de los 3 retos, tomándose en cuenta la
varianza estimada.
3.4. Diseño del Programa.
Para una mejor comprensión de la estrategia del programa de control virològico,
continuación se muestra un diagrama de flujo donde se pone de manifiesto la estrategia
que seguimos y las diferentes etapas de desarrollo del mismo.
Como puede apreciarse en el diagrama, la primera etapa contempló el desarrollo y
establecimiento de los ensayos que se requieren para llevar a cabo el control de los
contaminantes virales en las diferentes etapas del proceso productivo.
La segunda etapa estuvo dirigida a la caracterización de las líneas celulares y de los
sobrenandantes obtenidos al finalizar cinco corridas de fermentación empleando las
técnicas referidas en la etapa I, con excepción de los ensayos de MAP y HAP test para los
sobrenadantes de las cosechas.
Por último se encuentra la etapa III o de validación de los procesos de purificación, donde
se llevaron a cabo los estudios de inactivación y remoción viral utilizando los
Materiales y Métodos
59
ensayos para el cálculo de DICT50 y de formación de placa con la finalidad de determinar el título
infectivo de los virus VHS-1, Polio tipo 2, PVP y el virus de la leucemia murina. (E-MuLV), durante
los diferentes experimentos de reto después de haberse demostrado que el desescalado diseñado
del proceso de purificación representara una réplica de la escala industrial, al comprobarse que las
especificaciones de calidad del producto obtenido son semejantes en cuanto a actividad biológica,
pureza, punto isoeléctrico y rendimiento.
DIAGRAMA DE FLUJO DEL PROGRAMA DE CONTROL VIROLÓGICO
Resultados
6 1
Figura 1 Apariencia de los focos infectivos generados por el virus E-MuLV. (A) Ensayo XC en Placas Petri, (B) Ensayo modificado en placas de seis pozos.
CAPITULO IV. RESULTADOS.
Este capítulo aborda los resultados alcanzados en la aplicación del programa de control
virològico para cada una de las etapas de los procesos productivos de EPO-hr y del AcM h-
R3.
4.1. Ensayo de formación de placas XC para la detección de retrovirus murinos
ecótropicos.
La falta de disponibilidad en el país de ensayos para la identificación de retrovirus murinos
nos obligó al establecimiento de un ensayo para la detección y cuantificación de los mismos.
A continuación se presentan los resultados alcanzados.
4.1.1. Desempeño de la técnica modificada.
Como puede observarse en la Figura 1, la
presencia de placas causadas por la
infectividad del E-MuLV fue semejante,
tanto en las placas Petri de 60 mm como en
la de seis pozos. Con relación al título
alcanzado, podemos decir que no
existieron diferencias significativas (T de
student p = 0.09) al comparar las medias
de los experimentos realizados con la técnica original y la modificada, el cual fue de
Resultados
62
105.67UFP/mL. Este resultado nos permitió emplear este ensayo dentro del programa de
control virológico, pero previamente fue necesario realizar la validación de la técnica
analítica. 4.1.2. Validación del ensayo de formación de placas XC.
Exactitud: La media de los valores de los títulos encontrados en el estudio de validación
fue de 10561 UFP/mL, con una desviación estándar de ± 0.15 logio y un 98.03 % de
recobrado, al compararse con el valor del estándar (10558 UFP/mL).
Precisión: La precisión intra-ensayo o repetibilidad estuvo representada por el coeficiente
de variación encontrado cuando se analizaron los valores de las réplicas dentro del
ensayo. En nuestro estudio, el valor de este coeficiente fue de 2,7 % con un rango de
valores entre 10545-10576 UFP/mL. Mientras que los experimentos de reproducibilidad
demostraron que no existieron diferencias significativas (p = 0.08), cuando se realizó el
análisis de varianza teniendo en cuenta los factores días y analistas. (Tabla 12 y Figura 2)
Resultados
63
Linealidad: Al realizar el análisis de los
coeficientes de variación de cada unas de
las diluciones encontramos, que para 101,
las placas eran numerosas y no podían
ser contadas por superposición de las
mismas, mientras que en el caso de la
dilución mayor (ICH), el coeficiente de
variación fue de 46 %, poniéndose de
manifiesto, que solo el trayecto de la
curva comprendida entre las diluciones 1(H y 10°, correspondía con una recta, al
obtenerse un coeficiente de correlación lineal de 0.95, como se aprecia en la Figura 3.
Límite de detección: Como puede observarse en la Figura 4, el análisis de la frecuencia de
distribución del número de placas por el método de Kolmogorov-Smimov demostró, que
no existían diferencias significativas (d=0.118), entre la distribución esperada y la
alcanzada en los experimentos, de esta forma se comprobó la hipótesis de que la misma
Tabla 12 Anál isis de Varianza. Exper imento de Reproducibi l idad Parámetros ANALISTAS
Días 1 2 1 2 Ensayo Total
Media (log del título) 5.58 5.59 5.6 5.59 5.59 Desviación estándar ± 0.08 ± 0.12 ±0.10 ± 0.11 ± 0.093 Coeficiente de variación 1.43% 2.14% 1.80% 1.96% 1.66% Nivel de significación No signif (N =
6) p icación = 0.097 No significación (N =
6) p = 0.089 No significación (N =12) p = 0.08
Resultados
64
corresponde con una distribución de Poisson dado que, la variable número de placas es
discreta148', por tal razón, el límite de detección es
teórico y su valor es una unidad formadora de
placa (UFP).
Límite de cuantificación: El valor del mismo
correspodió a 4 UFP/mL, al sustituir en la
ecuación de la recta encontrada en el análisis de
linealidad, el valor del logaritmo de la dilución
mayor (105), por ser ésta, la que corresponde a la
menor concentración de virus que puede ser determinada con una adecuada precisión y
exactitud (CV < 30 %) de acuerdo a lo definido por la FDA149.
4.2. Caracterización de los contaminantes virales en los procesos productivos.
4.2.1. Proceso productivo de EPO-hr.
En el ensayo para la producción de anticuerpos específicos en hámster (HAP test), los
animales inoculados con las muestras de los Banco Celulares no desarrollaron anticuerpos
específicos a los virus Sendai, Coriomeningitis Linfocítica, Hantavirus, Reovirus 3 y SV-5. Por
otra parte, en las líneas celulares sensibles a virus, no se observó ECP durante el tiempo del
ensayo in vitro y los sobrenadantes resultantes de este ensayo, no hemaglutinaron ninguno de
los glóbulos rojos testados, tanto para las muestras de los bancos celulares, como las células al
límite de la cosecha.
Resultados
65
Tampoco fueron detectados virus inapárente en ninguno de los animales de los ensayos in
vivo al no mostrar signos de infección viral cuando fueron inoculados con las muestras.
El ensayo de formación de placas XC resultó negativo, pues no detectó ningún foco de
infección viral debido a la presencia de partículas retrovirales murinas infectivas.
Al analizar las células de los bancos celulares y al límite de la cosecha por microscopía
electrónica, se corroboró la ausencia de partículas semejantes a virus. La ausencia de
contaminantes virales en dichas etapas del proceso productivo, así como, el amplio
conocimiento que existe sobre la no evidencia de accidentes por contaminación viral con la
línea celular CHO, genéticamente transformada para expresar proteínas recombinantes1,
nos hizo tomar la decisión de no realizar la evaluación de los sobrenadantes provenientes
de las cosechas de fermentación, y asumir un riesgo potencial de contaminanción con
retrovirus murinos endógenos de aproximadamente 106 partículas virales/mL, debido a
que este es el límite de detección reportado para la técnica de microscopía electrónica y
referido por la agencia regulatoria de los Estados Unidos (FDA)150.
4.2.2. Proceso productivo del AcM h-R3.
Los resultados alcanzados en la caracterización de los bancos celulares del AcM h-R3
mediante los ensayos para la producción de anticuerpos en ratón (MAP test), in vitro e in
vivo, fueron semejantes al proceso productivo anterior. De igual manera se comportó el
ensayo para la determinación de retrovirus murinos infectivos. Sin embargo, los
Resultados
66
estudios por microscopía electrónica de los Bancos Semilla, Maestro y Extendido
mostraron la presencia de partículas semejantes a virus con un tamaño de
aproximadamente 100 nni de diámetro, las cuales se observaron en el citoplasma celular v
asociadas a las cisternas del retículo endoplásmico (Figura 5).
En ninguna de las muestras estudiadas se observaron partículas en el espacio extracelular
ni formación de evaginaciones o gemaciones en la membrana citoplasmàtica. Al analizar
estos resultados, consideramos que las partículas presentes en la línea productora del
AcM h-R3 pudieran ser retrovirus murinos del tipo A no infectivo por sus características
morfológicas, presencia solo en el citoplasma celular, y los resultados negativos del
ensayo XC97. Esto concuerda con otros autores, quienes plantean que tanto los mielomas,
como los hibridomas murinos presentan retrovirus endógenos que pueden expresarse
como partículas C infectivas, del tipo A no infectivos o solo incorporado al genoma
celular en forma silente sin expresión citoplasmàtica113. Por estas razones, fue necesario el
estudio de 5 sobrenadantes provenientes de las corridas de fermentación empleando la
batería de ensayos antes descrita.
Resultados
67
Los estudios revelaron que los ensayos in vitro e in vivo fueron negativos. Sin embargo, en
uno de los sobrenadantes se observó que al realizar 5 pases en la línea celular SC-1, y
luego de realizarse el ensayo de infectividad XC, se obtuvo un título de 103 89 UFP/mL.
Esto nos condujo a la caracterización por ME del contaminante viral encontrado en el lote
de sobrenadante SN9909. Las observaciones realizadas demostraron la presencia de
partículas semejantes a virus de aproximadamente 110 nm de diámetro en el citoplasma,
cercanas a la membrana celular y en ocasiones observadas en el espacio extracelular
(Figura 6).
Por todas estas razones, y porque las técnicas para la detección de virus existentes tienen
limitaciones que impiden sean empleadas con la suficiente seguridad, que garantice la
ausencia de estos contaminantes tan peligrosos en el producto final, es que se requiere
diseñar un proceso de purificación que tenga la capacidad de inactivar o eliminar
cualquier contaminante viral que se presente en las diferentes etapas del sistema
productivo. Fue por ello que nos dimos a la tarea de llevar a cabo los estudios de
Resultados
68
validación para demostrar que tanto el proceso de purificación de la EPO-hr, así como el
del AcM h-R3, eran capaces de eliminar los contaminantes detectados en la etapa de
fermentación. En el siguiente acápite se presentan los resultados de los estudios de
validación.
4.3. Validación viral de los sistemas de purificación.
4.3.1 Proceso de purificación de la EPO-hr.
Desescalado: Los resultados de los estudios para demostrar que el desescalado corresponde a una
réplica del proceso productivo real, son presentados en la Tabla 13, la cual muestra que los productos
obtenidos de la tres purificaciones en la escala diseñada, presentan las misma características desde el
punto de vista de las especificaciones de calidad relacionadas con pureza por HPLC (fase reversa y
filtración en gel), electroforesis y actividad específica, así como en el rendimiento, cuando se compara
con el lote proveniente del escalado real
Los valores de los rendimientos alcanzados en las tres purificaciones en el desescalado
del sistema de purificación de la EPO-hr, fueron mayores que los que se obtienen en el
proceso productivo real. Esto puede deberse a que siempre en el escalado se tiene un
porciento de pérdida mayor debido a los volúmenes muertos de columnas, válvulas y
Tabla 13 Resumen de los resultados del desescalado. Ensayos Corr ida # f Corr ida #2 Corr ida #3 Lote 9702
Act iv idad espe cí f ica U l /mg 61,900 53,600 71,600 40,000 Rendimiento (%) 2.4 % 2.1 % 2.8 % 1.47 % Fi l t ración en e l gel ( HPLC) 100 % 100 % 100 % 100 % Fase Reversa (HPLC) 99.9 % 99.9 % 99. 8 % 99.9 % Elect roforesis SDS-PAGE Una banda Una banda Una banda Una banda
Resultados
69
recipientes, lo cual no ocurre en un proceso a escala de laboratorio. Sin embargo, las
características de la molécula corresponden con las establecidas en las especificaciones de
este producto, lo cual nos indicó que el diseño de desescalado que habíamos realizado se
comportaba semejante al proceso de purificación industrial. Esto nos permitió llevar a
cabo los experimentos para determinar la capacidad de este proceso para inactivar y/o
remover virus.
Experimentos de inactivación: Como se puede observar en la Figura 7, las soluciones del
proceso no fueron capaces de inactivar los virus Polio 2 y Herpesvirus, sin embargo,
algunas soluciones inactivaron al virus de la leucemia murina, logrando reducir en su
totalidad el título infectivo.
Figura7 Se observan las curvas que describen las cinéticas de inactivación de las diferentes soluciones del proceso de purificación de la EPO-hr para el virus E-MuLV, las cuales estén descritas en la Tabla 14.
Tiempo (minutos) Solí Sol 2 Sol 3 Sol 4 Sol 5
1 0 0 0 0 0 2 50 15 20 15 10 3 100 30 30 25 20
Tabla 14 Resumen de los resultados de los experimentos de inactivación. No Soluciones Pol io 2
FR ( logi VHS-1
FR ( logie) * E-MuLV
FR ( logi$) * 1 Tr is 20mM, Tween-2 0 1% pH 7. 5 0.64 0.87 1.56 2 Tr is 20mM, Tween-2 0 1 %, NaCL 0.4mM pH 7. 5 0.23 0.67 4.65 3 Tr is 20mM, Tween-2 0 1 %/ , NaCI 2 .5M pH 7.5 0.16 0.82 3.57 4 Na 2HPC>4 20mM, NaCI 0 .5 M pH 4.1 . 0.89 1.01 1.2 5 EDTA 0.05M, NaCL 0.5 M 0.57 0.66 1.16
*FR en el último tiempo de la cinética de inactivación.
Resultados
70
Si tenemos en cuenta que este virus es de tipo envuelto, pudiéramos pensar que la
presencia del Tween en la solución pudiera extraer proteínas de la membrana de la
envoltura lo que traería como consecuencia una disminución de la infectividad de este
virus por estar estrechamente asociadas estas proteínas al reconocimiento por el receptor
en la célula hospedera. Esto no sucede con el virus herpes aunque el mismo también es
envuelto, los mecanismos de penetración en la célula diana son diferentes a los descritos
para los retrovirus murinos151152.
Si se analizan las características de pH, fuerza iónica y los tiempos de exposición a las
mismas, los experimentos de inactivación viral para las soluciones que intervienen en el
proceso de purificación, no representan pasos robustos de inactivación para los virus
restantes pues solo se encontraron valores menores a un logaritmo132.
Debido a que las soluciones empleadas para la higienización de las columnas son
semejantes en los procesos de la EPO-hr y del AcM h-R3, preferimos postergar el análisis
de los resultados, para más adelante, cuando veamos los experimentos de inativación de
este último.
Experimentos de Remoción: En la Figura 8 se pueden apreciar los efectos de las diferentes
matrices cromatográficas sobre la eliminación de los virus seleccionados para este estudio.
Como puede observarse, en el caso del virus Polio solo se encontraron valores de
reducción viral en las columnas de Quelato SFF y Q-SFF, mientras que para los restantes
virus la efectividad de remoción fue mayor, pues en casi todas las columnas se lograron
disminuir los títulos virales. Llama la atención que la eficiencia de
Resultados
7 1
remoción del sistema
de purificación de la
EPO-hr está relacio-
nado con los virus del
tipo envuelto, los
cuales tienen en su
envoltura numerosas
glicoproteínas. Tal vez
la presencia de estas
proteínas y las posibles
modificaciones de las
mismas, causadas por
los pH y fuerzas iónicas de las soluciones de cada uno de los pasos de purificación, sean
las responsables de este efecto en nuestro proceso productivo, pues otros autores han
referido que los pasos cromatográficos no son procesos robustos en el desempeño de
eliminar los contaminantes virales127, tal es el caso de Darling3, quien reportó, un FR viral
menor de un log para el virus Polio en una columna de intercambio aniónico.
4.3.2. Proceso de purificación del AcM h-R3.
Desescalado: De igual manera que en el proceso de purificación de la EPO-hr el
desescalado diseñado para la purificación del AcM h-R3 mostró ser una réplica del
Resultados
72
proceso industrial, al encontrarse que los tres lotes experimentales de purificación tenían
iguales características físico-químicas que el lote de producción como se puede observar
en la Tabla 15 y que los rendimientos alcanzados correspondían con los que se obtienen
por el sistema de purificación a escala industrial.
Experimentos de inactivación: Como puede observarse en la Tabla 16 y Figura 9, solo la
solución que logra disminuir los títulos de los inóculos de VHS-1 y E-MuLV, fue la
correspondiente al paso de regeneración de proteína A (Acido cítrico 0.1 M, pH 3.0), por
tener esta un pH bajo, al cual son sensibles los virus del tipo envuelto, según se ha
planteado por Grun y cois en 1992157.
Esto demuestra que las soluciones empleadas en el proceso de purificación del AcM h-R3,
no son lo suficientemente capaces de inactivar a los cuatro virus estudiados.
Tabla 15 Resumen de los resillados de los experiementos del desescalado. Ensayos Corrida #í Corrida #2 Corrida #3 Lote
producción Concentración de proteínas 490 tig/mL 552 ng/mL 408 fig/mL 354 ng/mL Volumen 30 mi 25 mL 26 mL 35 mL Rendimiento 86,5 % 81,2 % 62,5 % 72.9 %
Pureza Superosa 12 FPLC 100 % 100 % 100 % 100 % Punto Isoeléctrico 8,17-8,68 8,17-8,68 8,17-8,68 8,17-8,68 Actividad Biológica 98 % H125 (+)
(49 (jg/mL) 98 % H125 (+) (55.2 pg/nnL) 98 % H125 (+)
(40.8 pg/mL) 98 % H125 (+) (35.4 pg/mL)
Tabla 16 Resumen de resultados de los experimentos de inactivación. Media FR Retos (loe lio)
Soluciones del proceso Paso Cromatogràfico Polio 2 VHS-1 PVP E-MuLV Glicina 0.75 M / NaCI 1.5 M, pH 8.9 Aplicación Proteina A 0.01 0.73 0.75 0.54 Acido cítrico 0.1 M; pH 3.5 Elusión Proteina A 0.40 0.91 0.2 0.29 Acido cítrico 0.1 M, pH 3.0 Regeneración Proteina A 0.00 4.95 0.62 4.23 NaCI 3 M Regeneración DEAE 0.61 0.48 0.45 0.52
Total < 1.00 4.95 < 1.00 4.23
Resultados
73
Soluciones de higienización: Dado que las soluciones empleadas para la higienización de
las columnas cromatográficas son las mismas para ambos procesos productivos
exponemos y discutimos los resultados alcanzados para el proceso del AcM h-R3 donde se
evaluaron los cuatro virus. La Figura 10 muestra que el Etanol al 70 % no tuvo efecto sobre
los virus no envueltos y de mayor resistencia (Polio y Parvo), mientras que para los virus
envueltos (VHS-1 y E-MuLV) si fue eficiente en la inactivación de los mismos, al lograr
reducir casi totalmente sus títulos. Por su parte el NAOH 0.5 M, logró la reducción de los
títulos de los inóculos empleados en el estudio (Figura 11).
Figura9 Se observan las curvas que describen las cinéticas de inactivación de las diferentes soluciones del proceso de purificación del AcM h-R3 para los virus VHS-1 y E-MuLV.
Resultados
74
En una revisión publicada por Morgenthaler en 1989154, se describe el efecto del Etanol
sobre virus humanos durante el proceso de fraccionamiento de proteínas plasmáticas.
En el mismo se señalan los diversos mecanismos que puedan estar involucrados en la
inactivación viral y entre ellos cita los cambios de las estructuras secundarias y
terciarias de las proteínas virales, que pueden ser causados por el etanol a diferentes
concentraciones y temperaturas.
Resultados
75
Si tenemos en cuenta que los virus inactivados en nuestro estudio son precisamente
aquellos con envoltura, y que los mismos expresan en sus envolturas un número
considerable de glicoproteínas, algunas de ellas involucradas, muy específicamente en la
penetración del mismo en la célula hospedera, nos hace pensar que pudiera ser la causa de
la disminución de los títulos virales, al afectar la interacción de estas proteínas con su
receptor en la célula. El hecho que los virus Polio y Parvo no sufrieron inactivación
pudiera explicarse por la conformación bien estructurada de las proteínas de la cápsida
viral en una estructura cristalina de mayor estabilidad155, que lo hace más resistente a la
acción del alcohol. Por otra parte, a la temperatura a 4 °C en que se lleva a cabo el
experimento y que se conoce puede retardar la acción de este agente desinfectante, por lo
que se necesitaría un período más prolongado de exposición para lograr una inactivación
más eficaz de estos tipos de virus. Es conocido que a pH extremos los virus pierden su
estabilidad y pueden ser degradados por los efectos de los ácidos o los álcalis sobre las
proteínas y el ADN viral153'156, es por ello que consideramos que el empleo del NaOH al
0,5 M, representa una seguridad en la eliminación de los posibles contaminantes virales
que queden atrapados en las columnas durante el proceso de purificación.
Experimentos de Remoción: En la Figura 12, pueden observarse los resultados alcanzados en
los experimentos de remoción del proceso de purificación del AcM h-R3. Los mismos
muestran que las matrices de mayor eficiencia en la eliminación de los modelos virales
empleados, fueron la de afinidad (Proteína A) y de intercambio
Resultados
76
aniónico (DEAE), con
valores de factores de
reducción mayores de 4 logs
para ambas columnas
cromatográficas. Es importante
señalar, en el caso del proceso
de purificación del AcM h-R3,
que el valor de remoción que se
logra para el virus de la
leucemia murina es 6 logs
superiores al título encontrado
en el sobrenadante de la
cosecha de fermentación SN9909, hecho este que demuestra que el sistema cromatogáfico
de este AcM, logra eliminar con eficiencia al contaminante encontrado. De igual manera,
en el caso del VHS-1 se alcanza una adecuada eliminación del virus. Sin embargo, para los
virus de mayor resistencia, como son los virus Polio y Parvovirus, los valores alcanzados
aun cuando son suficientes para nuestro proceso por haber sido desarrollado en una línea
murina y la posibilidad de contaminación con un virus humano es baja, sería
recomendable que en procesos futuros se emplearan otros pasos de mayor eficiencia para
la eliminación de mismos.
Discusión General
77
4.3.3. Comportamiento cromatográfico de las matrices de los sistemas de purificación para
la eliminación de los virus modelos empleados en los estudios de validación.
Al comparar los sistemas de purificación de ambos productos, teniendo en cuenta los
principios cromatográficos, encontramos que de las tres cromatografías de afinidad, la
matriz de Proteína A fue la de mayor eficiencia, al lograr FR viral en los cuatros virus
modelos empleados. Sin embargo, las
otras matrices de igual principio no
tuvieron un comportamiento seme-
jante, pues el valor mas alto de
reducción alcanzado fue de 3,17 log en
la matriz de Blue SFF para el virus de la
leucemia murina, como puede
observarse en la figura 13.
En el caso de Filtración en Gel en la
matriz de Sephadex G-25, observamos
una pequeña diferencia de los valores
de remoción, entre las columnas del
proceso del AcM h-R3 y las del de la EPO-hr, donde para esta última se logró reducir los
títulos de los dos virus envueltos en 1.2 log
Resultados
78
Resultados interesantes fueron los encontrados en las cromatografías de intercambio
iónico, donde las matrices de DEAE y Q SFF fueron eficientes en la redución los títulos
virales de los virus envueltos, mientras que para los no envueltos los resultados fueron
discretos. Sin embargo, en la columna de intercambio catiónico (SP SFF) no se logró
remover ninguno de los modelos virales empleados. (Figura 14)
Figura 14 El gráfico muestra que en las columnas de intercambio aniónico (DEAE y QSFF) se alcanzan valores FR > 4 para los virus VHS-1 y E-MuLV. En el caso del virus Polio 2, el valor fue de 2,45 logs mientras que el Parvovirus porcino, no fue removido por la columna de DEAE. Esto último también ocurrió con la columna de intercambio catiónico SPFF, la cual no logró eliminar ninguno de los modelos virales.
Discusión General
79
CAPITULO V. DISCUSIÓN GENERAL.
A pesar de los beneficios que se han alcanzado con el desarrollo de la Biotecnología en el
campo de la Industria Biofarmacéutica, uno de los problemas fundamentales que ha creado
estado de reservas en las agencias regulatorias de medicamentos, es el hecho de que los
productos derivados de materiales biológicos y confinados al uso humano o veterinario,
tienen la potencialidad de ser portadores de agentes patógenos que puedan afectar la vida del
paciente157. Por esta razón, durante el desarrollo de un nuevo producto biofarmacéutico se
requieren establecer acciones de control necesarias en cada etapa del proceso productivo, que
permitan identificar y determinar los niveles de contaminación viral existentes en las mismas,
con la finalidad de poder diseñar un proceso capaz de eliminar dichos contaminantes del
producto final158.
En la actualidad no existe ninguna técnica que por sí sola sea capaz de detectar presencia de
virus, ya sea por la amplia variedad de los existentes, como por las diferentes características
que manifiestan frente a diversos métodos de aislamiento y diagnóstico.
Si bien las agencias regulatorias han sugerido que tipo de ensayos deben conformar los
programas de control virològico1'92'157, no dejan explícito cual es el camino a seguir y cómo
llegar a estos requerimientos de seguridad con una metodología racional y menos costosa.
Precisamente, porque cada proceso productivo en si es un caso particular, por los múltiples
factores que se combinan a la hora de su establecimiento productivo8.
Discusión General
80
Cuando se va a definir una estrategia para el control virològico en la producción de proteínas
recombinantes generadas a partir de células superiores, se deben considerar diferentes
aspectos relacionados con la naturaleza intrínseca del proceso productivo, tales como el tipo
y los tiempos de fermentación seleccionados, los medios de cultivo y sus suplementos, la
línea celular empleada, los contaminantes virales descritos para ella, las entidades virales
más frecuentes en el país (que pueden estar presentes de manera inaparente), el sistema de
purificación, etc. Estos aspectos son relevantes con el objetivo de lograr escoger aquellos
métodos capaces de detectar las contaminaciones virales y dar un margen amplio de
seguridad en el producto final de uso terapéutico159.
Tomando en cuenta estas consideraciones, quisiéramos discutir cuál fue nuestra estrategia
para la selección de los métodos empleados en nuestro programa, a medida que analicemos
los resultados alcanzados con su aplicación. Para ello, se tomaron dos productos que aunque
se derivan de líneas celulares de origen murino, presentan diferencias en cuanto a sus
comportamientos en cultivo de fermentación heterogénea y a las características físico-
químicas de sus moléculas.
La primera molécula terapéutica corresponde a la EPO-hr producida por la línea celular
CHO que crece en cultivo dependiente de anclaje. Es una proteína de bajo peso molecular,
cuya actividad in vivo depende extraordinariamente de que sus sitios de glicosilación estén
ocupados por ácido siálico, con un punto isoeléctrico (pl) en un rango de valor de pH entre
5.0-2.0.
Discusión General
81
La segunda molécula es el AcM h-R3, una inmunoglobulina humanizada de alto peso
molecular, con un pl en rango de pH alcalino entre 8.1-8.7, secretada por un mieloma
murino transfectado, que crece en suspensión. Por estas características, los sistemas de
purificación aún cuando tienen principios cromatográficos en común, difieren en cuanto a
la estrategia de purificación, soluciones del proceso, tamaño de las columnas y números
de pasos cromatográficos, permitiéndonos comparar el desempeño final de nuestro
programa en dos sistemas de producción diferentes.
Siguiendo un orden lógico de razonamiento, comenzaremos analizando los resultados
alcanzados durante las diferentes etapas de evaluación del programa.
La no existencia en Cuba de un ensayo para determinar retrovirus murinos y la necesidad
de la caracterización del principal contaminante endógeno de las líneas celulares murinas,
nos llevó a establecer, modificar y validar el ensayo de formación de placas XC para
determinar retrovirus murinos del tipo ecotrópico.
Los resultados alcanzados en la validación del ensayo de XC mostraron que los
parámetros en cuanto a exactitud, precisión, linealidad y límite de detección / cuantificación se
comportaron de acuerdo a lo reportado por otros autores, tal es el caso de Li y cois, en
1999149 , quienes reportaron una desviación estándar de ± 0.30 logio de la media del título
viral, con un coeficiente de variación de < 30 %, un valor de r2 de 0.95 y un límite de
cuantificación de 10 UFP/mL para un intervalo de confianza de 0.95 %.
Discusión General
82
Estos valores según el propio autor, cumplían con los requerimientos exigidos por la FDA.
Todo lo anteriormente expuesto, nos demuestra que la modificación realizada a la técnica
original tuvo un desempeño de acuerdo a los parámetros establecidos para este ensavo, lo
cual nos permitió emplearla como herramienta del programa en la caracterización de los
contaminantes virales endógenos en la diferentes etapas del proceso, así como en los estudios
de validación de los sistemas de purificación.
En cuanto a la caracterización de los contaminantes en las etapas de cultivo celular y
fermentación podemos decir que entre los métodos más utilizados para el aislamiento y
diagnóstico viral, se encuentran los ensayos in vitro empleando líneas de células susceptibles
al crecimiento de virus capaces de producir cambios celulares característicos de un proceso
de infección viral.
Aunque existe una gran variedad de cultivos celulares derivados de diferentes tejidos de una
o más especies animal, en nuestro caso, seleccionamos las más susceptibles para detectar los
virus que pudieran ser introducidos en nuestros procesos productivos.
La línea celular VERO tiene una larga historia de uso dentro de la virología y en ella se han
propagado un amplio rango de virus humanos, de primates no humano y otras especies
como son el SV-40, SV-5, Sarampión, Rubéola, Adenovirus, Citomegalovirus, Coxsackievirus,
Echovirus, Herpesvirus Simplex, Influenza, Parotiditis, Parainfluenza, Paramixovirus,
Poliovirus, Reovirus, Sincitial Respiratorio, Estomatitis vesicular, Rotavirus
Discusión General
83
murino y Sendai, entre otros160.
Una combinación de esta línea con la MRC-5, sensible aquellos virus humanos de los géneros
Coronavirus, Enterovirus, Papovavirus, Rinovirus y otros161, que no son susceptibles de
propagarse en la línea VERO, nos permitió detectar la mayoría de los virus humanos que
pudiera introducir el operario de forma adventicia por una violación de las buenas prácticas
de producción en cualquier nivel del proceso de manufactura.
El empleo de suero fetal bovino como suplemento principal de proteínas en los medios de
cultivo, nos hizo utilizar la línea turbinada bovina BT, para detectar los virus de esta especie
más frecuentemente encontrados en esta materia prima: la Diarrea bovina, la Rinotraquitis
infecciosa, algunas cepas de Parainfluenza y algunos tipos de Adenovirus y Enterovirus162. La
necesidad de disgregar las células CHO con tripsina porcina trajo como consecuencia la
inclusión de la línea celular de testículo fetal porcino, la cual permite el aislamiento y
propagación de diferentes virus porcino tales como, Parvovirus, Coronavirus, Enterovirus,
Pseudorabia y la Gastroenteritis transmisible del cerdo163'164. La incorporación de estas líneas
dentro de la estrategia de los ensayos está dada porque se desconoce si estos virus puedan ser
capaces de cruzar la barrera3 entre especies.
Particular atención se tuvo en cuenta al seleccionar una línea que fuera capaz de detectar uno
de los contaminantes virales más frecuentes de origen murino. Nos referimos al virus
diminuto de ratón (MVM), el cual ha sido encontrado en producciones de
Discusión General
84
importantes firmas biotecnológicas como es el caso de Genentech83. Sin embargo, para estos
fines se han descrito solamente dos líneas celulares altamente susceptibles a la infección por
MVM con un ECP marcado. La línea celular 324K derivada de tejido embrionario humano y
la A9 obtenida de tejido conectivo de ratón, igualmente susceptible a la replicación de virus
de origen murino. El empleo de la línea A9 como parte de nuestro diseño, nos permitió poner
de manifiesto que tanto la línea celular productora de EPO-hr (CHO) así como la del AcM h-
R3 (NSO) se encuentran libres de virus murinos y específicamente del MVM, hasta el
momento, el único agente viral no endógeno de esta especie, reportado como el contaminante
más frecuente en cultivos celulares continuos de origen murino (CHO, BHK-21 y NSO)83'118.
La incorporación de esta línea nos permitió tener un método sencillo y reproducible, útil en
la caracterización primaria de los bancos celulares que provengan de ratón, rata o hámster,
así como en el control sistemático de los sobrenadantes de las cosechas de fermentación.
Los ensayos in vitro conjuntamente con los realizados en animales de laboratorio, demostró la
ausencia de contaminantes endógenos o adventicios en la línea celular productora de la EPO-
hr, aún cuando existen evidencias referidas por otros autores de que la línea celular CHO,
puede ser portadora de algunos virus como el MVM83 y retrovirus endógenos112165, los cuales
pueden ser detectados o no por los ensayos desarrollados para estos fines. Nosotros
consideramos que en nuestro caso, la línea productora de la EPO-hr puede tener elementos
retrovirales insertados en su genoma y
Discusión General
85
que no son expresados por regulaciones intrínsecas de la célula hospedera y/o por pérdida
de algunas secuencias del genoma viral necesarias para la expresión de los mismos166. Si a
esto unimos que durante el proceso de fermentación no se generó la producción de virus
infectivos, pues ninguno de los ensayos realizados a las células al límite de la corrida dio
signo de contaminación viral, podemos entonces corroborar lo referido en las guías de
seguridad viral del ICH, donde se plantea que a pesar de que esta línea celular es
ampliamente empleada en las producciones de proteínas recombinantes, hasta la fecha no se
ha reportado ningún accidente fatal de contaminación viral, por lo cual se encuentra
catalogada dentro del caso B, en términos de evaluación de un proceso, lo que significa estar
considerada de bajo riesgo con relación a presencia de estos contaminantes virales1.
Aún cuando no se pusieron de manifiesto virus adventicios para el mieloma productor del
AcM h-R3, sí se observaron partículas semejantes a virus cuyas características morfológicas
fueron descrita por Kuff y Lueder en 198897, como elementos retrovirales del tipo A, no
infectivo. Apoyando a este planteamiento se encuentran los resultados negativos de los
ensayos de formación de placas XC y la ausencia de virus en el espacio extracelular y en los
sobrenadantes de los cultivos de los bancos celulares.
El hecho de encontrar uno de los sobrenadantes de las cosechas de fermentación contaminado
con retrovirus infectivo del tipo C, nos llamó la atención, pues no existe en la literatura
reporte de que las partículas A hayan adquirido su capacidad de
Discusión General
86
infectividad, durante un proceso de fermentación prolongado en fibra hueca de un mieloma
murino, productor de un anticuerpo monoclonal humanizado.
Para explicamos este resultado, debemos hacer algunas consideraciones sobre el hallazgo
encontrado y lo reportado por otros autores. Primeramente se conoce que los retrovirus
murinos se insertan en el ADN celular de forma estable genéticamente y se transcriben tal
como si fuera un gen propio de la célula hospedera16", expuestos a todos los eventos de
mutación, translocación, etc168., que pueden ocurrir durante la replicación de la información
genética de la misma. Otra información importante es la obtenida a partir de estudios
realizados con sondas específicas para la detección de genes que codifican las partículas del
tipo A, los cuales demostraron que existen alrededor de 1000 genes de estos elementos
dispersos por todo el genoma celular97'169. Incluso pueden encontrarse diferentes tipos de
elementos retrovirales170-173.
En el caso de los bancos celulares del mieloma murino NSO productor del AcM h-R3 las
partículas encontradas, eran del tipo A no infectivas, las cuales perdieron la capacidad de
transcripción del gen env que codifica para las proteínas de la envoltura viral174. Sin embargo,
se sabe que esta función puede recuperarse, mediante la entrada de otro retrovirus a la célula
receptora, el cual aporta la información necesaria para la expresión del mismo, mediante la
recombinación con los elementos retrovirales ya existentes en el ADN celular175.
Discusión General
87
Aún cuando este es el evento de mayor probabilidad para que se produzca un nuevo virus
infectivo, también se ha planteado por Marcus-Sekura176, que pueden existir otros fenómenos
de recombinación entre los elementos retrovirales internos que den lugar a un genoma
integro capaz de codificar todas las proteínas necesarias para que se lleven a cabo todas las
funciones virales, aunque el propio autor planteó, que este es un evento de muy baja
probabilidad, con una frecuencia de aparición de 108.
Si se analizan las condiciones y el tiempo de fermentación del proceso del AcM h-R3,
pudiéramos decir que en nuestro caso, fue la ocurrencia de recombinaciones al azar de los
elementos retrovirales endógenos, las que dieron lugar a la aparición de partículas
retrovirales de tipo C infectivas. Para plantear esto, nos apoyamos en que para iniciar una
corrida de fermentación, se requiere partir de un inóculo con 5 x 108 células totales. Si
tomamos en cuenta que el tiempo de doblaje de la NSO transfectada, es de 18 a 24 horas,
estimamos que a los 15 días de fermentación, el cartucho tiene aproximadamente un total de
3xl018 células, momento donde se alcanza el máximo valor de densidad celular. Entonces
pudiéramos pensar que a partir de este momento puede darse la posibilidad de que este
evento de recombinación ocurra de forma aleatoria, con lo cual se explicaría la presencia de
estos contaminantes virales en solo uno de los lotes de sobrenadantes evaluados. Es
importante destacar que esta es la primera vez que se describe este fenómeno en un mieloma
murino transfectado con un anticuerpo monoclonal humanizado y producido en un
termentador de fibra hueca.
Discusión General
88
Aunque en nuestro caso, el virus detectado resultó un retrovirus del tipo Ecotrópico, capaz
solo de infectar líneas celulares de origen murino, debemos considerar que tales
recombinaciones pueden dar lugar a otros tipos de virus, como son los casos de los tipos
Xenotrópicos, Anfotrópicos y Politrópicos, con posibilidades potenciales de infectar líneas
celulares de origen humano177-178. Por ser estos contaminantes, retrovirus murinos y por las
mismas razones expuestas para la línea celular CHO, los mielomas murinos están clasificados
dentro del grupo B de las guías ICH, considerándose como línea de baja peligrosidad con
relación a los contaminantes virales179.
Ningún ensayo virològico es capaz de demostrar la presencia de todos los tipos conocidos de
virus, algunos sólo se hacen positivos tiempo después de la infección, todos requieren de un
nivel mínimo de partículas virales que puedan ser detectadas y siempre existen limitaciones
estadísticas en su muestreo. Es por eso que en muchas ocasiones, la seguridad de no tener
una contaminación viral probable en un biológico, no se alcanza por la sola demostración de
que los ensayos sean negativos si no porque el proceso productivo es capaz de eliminar o
inactivar a los mismos.
Los estudios de validación viral de los sistemas de purificación como evaluación del proceso
productivo, dan una medida de confianza de que un amplio rango de virus incluidos los no
sospechados o conocidos, pueden ser eliminados. El diseño de los estudios de validación en
nuestro trabajo incluyó experimentos de inactivación y de remoción viral, empleando un sistema
cromatográfico automático de baja presión que
Discusión General
89
reprodujera a menor escala el proceso industrial establecido, el cual fue retado con cuatro
virus modelos.
Dado que los experimentos de inactivación viral no aportaron valores significativos de
eliminación, centraremos nuestra atención en el análisis de los resultados encontrados en la
remoción de las columnas cromatográficas.
Cualquier aproximación cromatográfica relacionada con la remoción viral debe ser tratada de
forma crítica y cuidadosa, teniendo en cuenta la gran variedad de especies de virus y la
composición de proteínas heterogéneas en sus cápsidas y/o envolturas156. Sin embargo, no se
puede pensar que los mecanismos de separación y resolución de los procesos cromatográficos
para las proteínas pueden ser aplicados de igual forma a las partículas virales por la
complejidad de sus estructuras. La separación y resolución no solo se basan en la
dependencia de las condiciones físico-químicas de las soluciones, las cuales han sido
determinadas como el desarrollo de esta unidad de operación, si no también, dependen de
resolver la separación del producto teniendo en cuenta la relación de este con respecto a sus
contaminantes.
La cromatografía de afinidad como primer paso para purificar un producto, es la más
atractiva, pues se logran productos con niveles altos de pureza180. Este tipo de cromatografía
se fundamenta sobre la base de interacciones bioespecíficas entre la molécula y un ligando
dedicado, pero sin excluir la ocurrencia de interacciones no
Discusión General
90
especificas de la matriz con impurezas, como pueden ser ADN residual, lípidos, proteínas
contaminantes presentes en el medio donde se encuentra el producto a purificar y también
los posibles virus que pudieran haberse introducido durante el desempeño del proceso
productivo.
Nuestros resultados mostraron que la matriz de Pro teína A, fue la más eficiente para
remover virus al lograr los valores más altos, en los cuatro modelos empleados debido a la
alta especificidad de su ligando por la porción Fe de las inmunoglobulinas. Con la reducción
de la bioespecificidad del ligando, se incrementa significativamente, la probabilidad de
ocurrencia de interacciones de la matriz con las impurezas del medio, ya que las mismas
están dadas por las características de carga e hidrofobicidad de las proteínas a purificar, así
como de sus contaminantes. Este comportamiento pudiera explicar porque para las matrices
de afinidad de tipo grupal de Blue y Quelato, los niveles de reducción viral alcanzados en
nuestros experimentos son inferiores a los de Proteína A, tal como ha sido referido por
Roberts y cois en 1994 181, pues en la estrategia de purificación de la EPO-hr en ambas
columnas, lo que se busca es pegar esta proteína, la que posteriormente se eluye con
soluciones de diferentes fuerzas iónicas, con la cual pudiera co-purificarse con los virus si los
mismos tuvieran puntos isoeléctricos cercanos al de la EPO-hr.
Este fenómeno se hace más evidente cuando aplicamos otros principios cromatográficos
(hidrofobicidad o intercambio iónico), donde la falta de un ligando apropiado no nos
Discusión General
91
permite comprender claramente el comportamiento de los virus bajo las mismas condiciones
de purificación de una proteína específica. Solamente podemos especular que un conjunto de
parámetros estaría influyendo en las interacciones iónicas de los virus con la matriz, por lo
que la evaluación del comportamiento en un ambiente de intercambio iónico resulta
realmente complicada. Precisamente, esa fue la realidad que encontramos en las diferentes
matrices de intercambio iónico que utilizamos en nuestros sistemas de purificación.
Al analizar los resultados alcanzados, observamos cómo los virus con presencia de
numerosas glicoproteínas en sus envolturas (VHS-1 y E-MuLV), le confieren cargas negativas
en las superficies de los mismos y son removidos más eficientemente en las matrices de
intercambio aniónico de DEAE y Q, que los virus no envueltos (Polio 2 y PVP). Este hecho,
unido a que la matriz de intercambio catiónico (SP) no logró remover ninguno de los modelos
virales empleados, nos demuestra que en nuestras condiciones, estos virus presentan
diferentes puntos isoeléctricos que pueden explicar estos comportamientos.
Balayán y Más en 1970182, plantearon que la estructura primaria de las proteínas virales se
caracterizan por tener un carácter ácido, debido a que en ellas predominan los radicales de
los aminoácidos dicarboxílicos y los que tienen grupos sulfidrilos (SH-), por lo que se
considera que la mayoría de los virus presentan su pl en la zona de pH ácido. Esto explicaría
por qué ocurren interacciones entre las proteínas de la membrana viral y
Discusión General
92
estas matrices. Sin embargo, los resultados de estos autores, no dan respuesta a lo que ocurre
con los virus Polio 2 y PVP en nuestro caso. En trabajos más recientes, Camerón y cois, en
1997156 encontraron que la observación realizada por los autores antes referidos no era
generalizable a todos los virus. En su artículo, ellos demostraron que preparaciones puras de
los virus Polio tipo 1 y del Parvovirus Canino, enfocaban en la zona de pH neutro, lo cual
pudiera ser similar a lo que ocurre con los puntos isoeléctricos de las cepas de Polio tipo 2 y
Parvovirus Porcino empleadas por nosotros. Pero, ¿cómo explicaríamos que ellos lograran
mayores factores de reducción con la misma matriz de DEAE que los encontrados en nuestro estudio
para virus parecidos? y ¿Cuales factores podían estar influyendo, para que esto ocurriera? Con estas
dos interrogantes, nos dimos a la tarea de analizar la estrategia y las soluciones de su proceso
de purificación y compararlo con los nuestros. La finalidad de ellos era determinar, como los
virus podían ser removidos por la columna DEAE en la purificación de la albúmina humana,
proteína de pl ácido. Al revisar las soluciones que emplearon encontramos, que el pH de las
mismas fluctuaba entre 4.5 y 5.5. Tal vez estas condiciones, facilitaron que aparecieran grupos
cargados en las proteínas de las cápsidas de ambos virus, y que los mismos interactuaran con
la matriz dando lugar a los valores de remoción viral alcanzados por Camerón y sus
colaboradores156 en 1997.
Un caso muy diferente corresponde a la estrategia de purificación del AcM h-R3, concebida
para purificar una inmunoglobulina de pH alcalino y donde la matriz de
Discusión General
93
DEAE esta destinada a la eliminación de las impurezas como el ADN y las proteínas
contaminantes de la célula. Por estas razones, la solución con que se aplica en nuestro
proceso de purificación tiene pH cercano a 7.0. Suponiendo que las cepas de los virus Polio 2
y PVP, utilizadas en nuestro estudio, tuvieran iguales pl que las referidas en el trabajo antes
mencionado160. Entonces podíamos explicar no solo lo encontrado para DEAE, sino para
todas las matrices de intercambio iónico de ambos procesos productivos, pues las soluciones
de aplicación empleadas en cada una de ellas tenían pH alrededor de 7.0, con los cuales no se
modificarían las cargas netas de las partículas virales, lo que proporciona que no existan
interacciones entre ellas y las matrices empleadas.
A pesar de que nos inclinamos a pensar que en nuestras condiciones, lo anterior explicaría
este comportamiento de los virus, sabemos que se ha demostrado que la cromatografía puede
reducir cargas virales de forma reproducible, pero aún falta una comprensión total del
comportamiento cromatográfico de estos agentes patógenos.
Existen muchos factores que pueden influir en las diferentes interacciones que ocurren entre
los virus y las resinas cromatográficas como son el tamaño, la forma y la estructura del
virión, la naturaleza bioquímica de la envoltura, propiedades de la matriz y la tendencia de
algunos virus a formar agregados, bajo determinadas condiciones de un proceso dado183.
Esto hace el análisis mucho más complejo, por lo que se plantea que los procesos de
purificación basados en sistemas de cromatografías líquidas, no se
Discusión General
94
consideran pasos robustos para la eliminación de virus, sobre todo para los de mayor
resistencia físico-química153. No obstante, nuestros resultados nos llevan a considerar que
tanto el sistema de purificación de la EPO-hr, como, del AcM h-R3, son capaces de eliminar
satisfactoriamente los contaminantes virales endógenos encontrados en los procesos
productivos derivados de líneas celulares de origen murino, al lograrse valores de reducción
viral superiores a la carga teórica asumida de 106 partículas/mL, según las recomendaciones
de la FDA150, pues la carga real encontrada en uno de los lotes de sobrenadante de 1038 fue
considerada como un hecho azaroso no sistemático en nuestro proceso. Aun teniendo en
cuenta este hecho, los valores de remoción alcanzados para ambos productos se encuentran
entre 3-6 logaritmos superior a los títulos virales reales o teóricos de los contaminantes
encontrados en nuestros procesos, lo que significa un rango de seguridad adecuado según lo
reportado por Poiley y cois, en 1994122, refiriéndose a lo establecido en los documentos
regulatorios de la FDA92'150,
Por todo lo anteriormente expuesto llegamos a las siguientes conclusiones.
Conclusiones y Recomendaciones
95
CONCLUSIONES.
1. Se estableció la metodología del programa, definiéndose tres etapas
fundamentales para el mismo y los ensayos correspondientes a cada una de
ellas.
2. Se validó el ensayo de formación de placas XC modificado, demostrándose
que el mismo cumple con los requisitos de desempeño establecidos
intemacionalmente.
3. Los Bancos Celulares de las líneas productoras de la Eritropoyetina humana
recombinante y del Anticuerpo Monoclonal humanizado h-R3, no presentan
contaminación de virus adventicios clasificándose en el grupo B de baja
peligrosidad según las Guías ICH.
4. Los períodos de fermentación prolongados en bioreactores heterogéneos de
fibra hueca, pueden ocasionan de manera no sistemática, la aparición de
retrovirus murinos infectivos del tipo C en las cosechas de sobrenadantes del
AcM h-R3.
5. Los desescalados de los sistemas cromatográficos validados representan una
réplica de los procesos de purificación de la EPO-hr y del AcM h-R3.
Conclusiones y Recomendaciones
96
6. Los procesos de purificación de la EPO-hr y del AcM h-R3 son capaces de eliminar
virus con diferentes características físico-químicas, demostrándose la seguridad de
los mismos.
7. Aun cuando los valores de los factores de reducción de los virus Polio tipo 2 y
Parvovirus Porcino, cumplieron con los requerimientos regulatorios, se hace
necesario aumentar la remoción de los mismos, con la finalidad de tener un rango
mayor de seguridad.
8. En las condiciones establecidas para nuestros procesos de purificación los virus
envueltos se comportaron como partículas cargadas negativamente, mientras que
los no envueltos no tienen interacción activa con las matrices de intercambio iónico.
9. La aplicación del programa de control virològico a los procesos productivos de la
Eritropoyetina-hr y del AcM humanizado h-R3, demostró la utilidad del mismo
para el control de los contaminantes virales en los procesos de producción de
proteínas recombinantes expresadas en células superiores de origen murino, de
acuerdo a las exigencias regulatorias de la ICH.
Conclusiones y Recomendaciones
97
RECOMENDACIONES.
1. Aplicar de forma sistemática los ensayos in vitro con las líneas seleccionadas,
en todos los lotes de sobrenadantes de las corridas de fermentación con
tiempos prolongados.
2. Evaluar la inclusión de pasos que permitan aumentar los factores de reducción
de los virus no envueltos, con la finalidad de dar un margen de seguridad
mayor a los futuros procesos de purificación.
3. Desarrollar e implementar el ensayo de formación de focos S+L- para la
detección de retrovirus murinos del tipo Politrópicos, así como la técnica de
reverso trascriptasa y de reacción en cadena de la polimerasa.
4. Implementar la metodología de este programa en todos los nuevos procesos
de producción de proteínas recombinantes expresadas en células superiores de
origen murino.
Referencias Bibliográficas
99
CAPITULO VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.
1. ICH Viral Safety Document: "Viral Safety Evaluation of Biotechnology
Products Derived From Cell Lines of Human or Animal Origin", FDA 21: 881-
891,1996.
2. ICH Topic Q5A. Step 4 Consensus Guideline. Quality of Biotechnological Products:
Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or
Animal Origin. CPMP/ICH/295/95. Canary Wharf, London: The European Agency
for the Evaluation of Medicinal Products, Human Medicines Evaluation Unit, 1997.
3. Darling A.J., Validation of purification process for viral clearance evaluation.
Biopharmaceutical Process Validation Chapter 9:157-196 Eds M. Dekker, Inc., 2000.
4. Hollow fibber bioreactor technology gets boost from injectable antibody approval.
Gen. Engine. News 1,1996.
5. Notes to applicants for marketing authorizations on the pre-clinical biological safety
testing of medicinal products derived from biotechnology (and comparable products
derived from chemical synthesis). Committee for Proprietary Medicinal Products:
Ad Hoc Working Party on Biotechnology/Pharmacy and Working Party on Safety of
Medicines. Journal of Biological Standardization 17: 203-212,1989
6. Patente de EPO: "Procedimiento de obtención de la Eritropoyetina humana
recombinante". CU: 826/2001.
7. Patente de h-R3: "Humanized and Chimeric monoclonal antibodies that recognize
Epidermal Growth Factor (EGF-R); diagnostic and therapeutic use". US: 5.891,996.
8. Guidance on viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell
lines of human or animal origin. FDA, Fed Reg. 63 (185) 51074-51084,1998.
9. Sasson A.,"Las biotecnologías: desafíos y promesas". La Habana, 1984.
10. Kurtz A., "EPO: Structure, function and origin". Nephrol. 16: 371-378,1987.
11. Choi D. y cols., "Erythropoietin: Physic-biochemical analysis". J. of Chromatography
B: Biomedical applications, Amsterdam 687(L): 189-199,1996.
Referencias Bibliográficas
100
12. Spivack J.L., "The in vivo metabolism of recombinant human erythropoietin".
Contrib. Nephrol. 76: 67-76,1989.
13. Dowling P., "Erythropoietin: Structure, control of production and function". Physiol.
Rev. 72: 449-489,1992.
14. Paganini E., "Recombinant human erythropoietin in patients with anaemia due to
end stage renal disease". Nephrology. 2: 36-39,1988.
15. Diana F. y cols., "EPOETIN (Recombinant human erythropoietin). A reviews of its
pharmacodinamics and pharmacokinetics properties and therapeutically potential in
anaemia and the stimulations of eritropoyesis". Drugs 38(6): 863-899,1989.
16. Akizawa T. y cols., "Clinical effect of recombinant human erythropoietin on anaemia
associated with chronic renal failure: a multi-institutional study in Japan". Int. J.
Artif. Organs. 11: 343-50,1988
17. Jensen J.D., y cols., "Pharmacokinetics of EPOETIN in dialysis patient before and
after correction of the anemia". Drugs Invest. 8(5): 278-287,1994.
18. MacDougall I.C., y cols., "Pharmacokinetics of recombinant human erythropoietin in
patients on continuous ambulatory peritoneal dialysis". Lancet 1: 425-427,1989.
19. Neumayer H.H., y cols., "Pharmacokinetics of rh-erythropoietin after SC
administration and in long term IV treatment in patient on maintenance
haemodialysis". Contr. Nephrol. 76:131-142,1989.
20. Kindler J. y cols., "Single dose pharmacokinetics of recombinant human
erythropoietin in patients with various degrees of renal failure". Nephrol. Dialysis
and Transplantation 4: 345-349,1989.
21. Leonard I.Z., y cols., "Erythropoietin in clinical applications an international
perspective". N.Y, USA. Ed Marcel Dekker, Inc. 1990. Wolfgan Jelkmann.
Erythropoietin: Structure, control of production and function. Physiological reviews.
72(2), 1992.
22. Fishl M., y cols., "Recombinant human erythropoietin for patients with AIDS treated
with zidovudine". New England, Journal of Medicine 322:1488-1493,1990
Referencias Bibliográficas
101
23. Oster W., y cols., "Erythropoietin for treatment of anaemia of malignancy associated
with neoplastic bone marrow infiltration". J.Clin. One. 8: 956-962,1990.
24. Oster W. y cols., "Erythropoietin prevents chemotherapy-induced anaemia". Case
report. Blunt 60: 88-92,1990.
25. Schreiber G.B. y cols., "The risk of transfusion-transmitted viral infections". New.
Engl. J. Med. 334:1685-1690,1996.
26. Reviews: "Recombinant human erythropoietin decreases the need for blood
transfusional may delay dialysis in chronic renal failure". ACP Journal Club 136(3):
136-185, 2002.
27. Peter H.D., "ERYPO: r-HuEPO. Human erythropoietin, recombined". Janssen- Cilag,
3erd Edition pp 175,1997.
28. Lawrence T., y cols., "Erythropoietin therapy". New England, J.of Med. 336(13): 933-
938,1997.
29. Pincus T. y cols., "Multicenter study of recombinant human erythropoietin in
correction of anaemia in rheumatoid arthritis". Am. J. Med. 89:161-168,1990.
30. Kohler G. y Milstein C., "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefined specificity". Nature 256: 495-499,1975.
31. Gold P. y Freedman S.O., "Demonstration of tumor-specific antigens in human
colonic carcinoma by immunological tolerance and absorption techniques". J. Exp.
Med. 121: 439-462,1965.
32. Koprowski H., y cols., "Colorectal carcinoma antigens detected by hybridom
antibodies". Sornat. Cell. Genet. 5: 957-972,1979.
33. Johnson V.G., y cols., "Analysis of a human tumor-associated glycoprotein (TAG- 72)
identified by monoclonal antibody B72.3". Cancer Res. 46: 850-857,1986.
34. Sands H., "Experimental studies of radioinmunodetection of cancer". An overview.
Rev. Cancer Research. 50: 809-813,1990.
35. Zayas F.I. y cols., "Radiomarcaje del AcM ior-egf/r3 com "mTc para
inmunogammagrafia". Rev. Española Med. Nucl. 14:10-17,1997.
Referencias Bibliográficas
102
36. Bast R.C. y cols., " Reactivity of a monoclonal antibody with human ovarian
carcinoma". J. Clin. Invest. 68:1331-1337,1981.
37. Janimis J. y cols., "Immunohistochemical expression of EGF-R in malignant surface
epithelial ovarian neoplasm". Eur. J. Gynecol. Oncol. 15:19-23,1994.
38. Goldenberg D.M., y cols., "Imaging of Colorectal Carcinoma with radiolabeled
Antibodies". Semin. Nucl. Med. 19: 262-281,1989.
39. Ramos M. y cols., "ior-egf/r3: a murine monoclonal antibody for diagnosis of
epithelial tumors. J. Radioanalytical Chemistry. 240(2): 499-503.1999.
40. Siccardi A.G., y cols., "Immunoscintigraphy of adenocarcinomas by means of
radiolabeled F(ab')2 fragments of an anti-carcinoembrionic antigen monoclonal
antibody: a multicenter study". Cancer Res. 49: 3095-3103,1989.
41. Baum R.P., y cols., //99mTc-labeled anti-CEA antibody to tumor immunoscintigraphy,
first clinical results". Nucl. Med. Commun. 10: 345-352,1989.
42. Goldenberg D.M., "Future roll of radiolabeled monoclonal antibodies in oncological
diagnosis and therapy". Semin. Nucl. Med. 19: 332-339,1989.
43. Salk D., "Technetium-labeled monoclonal antibodies for imaging metastatic
melanoma: results of a multicenter clinical study". Sem. Oncol. 15: 608-618,1988.
44. Carpenter G. y Cohen S., "EGF receptors interaction and the stimulation of cell
growth". Receptor regulation, Vol. 3, Lekfkowitz, eds, Chapman and Hall, 41,1981.
45. Carpenter G., "Receptors for epidermal growth factor and other polypeptide
mitogens". Annual Review of Biochemistry. 56: 881-914,1987.
46. Cohen S. y Carpenter G., "Human epidermal growth factor. Isolation and chemical
and biological properties". Proc. Natl. Acad. Sci. 72:1317-1321,1975.
47. Savage C.R., y cols., "The primary structure of epidermal growth factor". J. Biol.
Chem. 247: 7612-7621,1972.
48. Ullrich A. y Schlessinger J., "Signal transduction by receptors with tyrosine kinase
activity". Cell 61:203-212,1990.
Referencias Bibliográficas
103
49. Yarden Y. y Ullrich A., "Growth factor receptor tyrosine kinases". Annu. Rev.
Biochem. 57: 443-478,1988.
50. Prigent A.S. y Lemoine R.N., "The type I (EGF-R related) family of growth factor
receptors and their ligands". Prog. Growth Factor Res. 4:1-24,1992.
51. Laurence D.J.R. y Gusterson B.A., "The Epidermal Growth Factor: A review of
structural and functional relationships in the normal organism and in cancer cells".
Tumor Biol. 11: 229-261,1990.
52. Mason S. y Gullick W.J., "Type I growth factor receptor: an overview of recent
development". Breast 4:11-18,1995.
53. Salomon D.S. y cols., "Epidermal growth factor-related peptides and their receptor in
human malignancies". Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19:183-232,1995.
54. Modjtahedi H. y cols., "Anti-EGFR monoclonal antibodies which act as EGF, TGFa,
HB-EGF and BTC antagonist block the binding of epiregulin to EGFR expressing
tumors". Int. J. Cancer 75: 310-316,1998.
55. Cohen S. y cols, "A native 170000 epidermal growth factor receptor- kinase complex
from shed membrane vesicle". J. Biol. Chem. 257:1523-1531,1982.
56. Merlino G.T. y cols., "Amplification and enhanced expression of the EGF-R gene in
A431 human carcinoma cells". Science 224: 417-419,1984.
57. Rush V. y cols., "Differential expression of the epidermal growth factor receptor and
its ligands in primary non-small cell lung cancers and adjacent benign lung". Cancer
Res. 53: 2379-2385,1993.
58. Veale D. y cols., "Epidermal growth factor receptors in non-small cell lung cancer".
Br. J. Cancer 55: 513-516,1987.
59. Ware J.L., "Growth factors and their receptors as determinants in the proliferation
and metastasis of human prostate cancer". Cancer Metastasis Rev. 12: 287-301,1993.
60. Dassonoville O., "Expression of epidermal growth factor receptor and survival in
upper aerodigestive". Tract. Cancer J. Clin. Oncol. 11: 873-878,1993.
Referencias Bibliográficas
104
61. Iida A. v cols., "Relationships among the expression of epidermal growth factor
receptor, proliferation cell nuclear antigen labeling index, and lymph node
metastasis in gastric cancer ". Oncology 52:189-195,1995.
62. Neal D.E. y cols., "Epidermal Growth Factor receptors in human bladder cancer.
Comparison of invasive and superficial tumors". Lancet 1: 346-348,1985.
63. Pérez R. y Lage A., "Los factores de crecimiento y su relación con la transformación
maligna". Interferon y Biotecnología 3:179-209,1986.
64. Aaronson S.A., "Growth factors and cancer". Science 254:1146-1153,1991.
65. Marías A. y cols., "Prognostic significance of the receptor of epidermal growth factor
in human mammary carcinomas". Anticancer Res. 7: 459-464,1987.
66. Pérez R. y cols., "Epidermal growth factor receptors in human breast cancer". Breast
Cancer Res. and Treatm. 4:189-193,1984.
67. Rios M.A. y cols., "Heterogeneous Expression of the EGF-receptor in human breast
carcinoma". Anticancer Res. 12: 205-208,1992.
68. Ichiyochi Y. y cols., "Epidermal growth factor in gastric carcinoma as a risk of
postoperative recurrence". Int. Surg. 78:196-199,1993.
69. Rude V.B. y cols., "Epidermal growth factor receptor (EGFR) and EGFR mutations,
function and possible role in clinical trials". Annals of Oncology 8:1197-1206,1997.
70. Mendelson J., "EGF receptor blockade as anticancer therapy". Proc. Amer. Ass.
Cancer. Res. 37: 647-748,1996.
71. Wikstrand C.J. y cols., "Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific
and react with breast and lung carcinoma and malignant gliomas". Cancer Res. 55:
3140-3148,1995.
72. Goldenberg D.M., "An introduction to the radio-immunodetection of cancer". Cancer
Res. 40, 2957-2959,1980.
73. Fernández A. y cols., "Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales
contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico". Interferon y Biotecnología 6:
289-298,1989.
Referencias Bibliográficas
105
74. Khazaeli M.B. y cols., "Human immune response to monoclonal antibodies". Journal
of Immunotherapy 15: 42-52,1994.
75. Mateo C. y cols., "Humanization of a mouse monoclonal antibody that blocks the
epidermal growth factor receptor: Recovery of antagonistic activity".
Immunothechnology 3: 71-81,1997.
76. Henzler H-J.y Kaiser K., "Avoiding viral contamination in biotechnological and
pharmaceutical processes". Nat. Biotechnol. 16:1077-1079,1998.
77. Biologicals Control Act of 1902,1902.
78. Fox J.P. y cols., "Observation on the occurrence of icterus in Brazil following
vaccination against yellow fever". Am. J. Hyg. 36: 68-76,1942.
79. Harris R.J.C. y cols., "Contaminant viruses in two live virus vaccines produced in
chick cells". J. Hyg. (Cambridge) 64:1-6,1966.
80. Murray R., "Contemporary problems in regulating the potency and safety of viral
vaccines". First International Conference on Vaccines against Viral and Rickettsial
Diseases of Man. Sci.Pub. 147. Washington, DC: PAHO, WHO, 577-580,1967.
81. Brown P. y cols., Potential epidemic of Creutzefeld-Jacob disease from human
growth hormone therapy. N. Engl. J. Med. 313: 728-731,1985.
82. Ben-Hur E. y Horowitz B., "Virus inactivation in blood". AIDS 10:1183-1190,1996.
83. Erickson G.A., y cols., Viral contaminants of foetal bovine serum for tissue culture:
risk and concern. Dev, Biol. Stand. 75:173-175,1991
84. Garnick R.L.," Experience with viral contamination in cell culture. Viral Safety and
Evaluation of Viral Clearance from Biopharmaceutical Products". Dev. Biol. Stand.
88: 49-56,1996.
85. Hay R.J., "Operator-induced contamination in cell culture system". Dev. Bio. Stand.
75:193-204,1991.
86. Kappeler A. y cols., "Detection of bovine polyomavirus contamination in fetal bovine
sera and modified live viral vaccines using polymerase chain reaction". Biologicals
24 (2): 131-135,1996.
Referencias Bibliográficas
106
87. Harasawa T. y Tomiyama T., "Evidence of pestivirus RNA in human virus vaccines".
J. Clin. Microbiol. 32(6): 1604-605,1994.
88. Harasawa R. y Mizusawa H., "Demonstration and genotyping of pestivirus RNA
from mammalian cell lines". Microbiol. Immunol. 39 (12): 979-985,1995.
89. O'Toole D. y cols., "Bluetongue virus: Contamination of vaccine". J. Am. Vet. Med.
Assoc. 205(3): 407-408,1994.
90. Rabenau H. y cols., "Contamination of genetically engineered CHO-cells by epizootic
haemorrhagic disease virus (EHDV)". Biologicals 21(3): 207-214,1993.
91. Senda M. y cols., "Detection by PCR of wild-type canine parvovirus which
contaminates dog vaccines". J. Clin. Microbiol. 33(1): 110-113,1995.
92. United States Pharmacopoeia XII. Mack Publishing., N.Y. Guideline for detection of
viruses in biotechnological products. European Union. 1986.
93. Points to Consider in the Characterisation of Cell Lines Used to Produce Biologicals"
issued by the Director, Office of Biologies Evaluation and Research, FDA, May 17
1993.
94. Liptrut C. y Gull K., "Detection of viruses in recombinant cells by electron
microscopy", In Animal cell technology developments, process and products. Spier
R.E. y cols., Eds pp 653-656, Butterworth Heinemann Ltd, Oxford, UK, 1991.
95. Losikoff A.M. y cols.," Industrial experience with the detection of retroviruses". Dev.
Biol. Stand. 76:187-200,1992.
96. Coffin J.M., "Retroviridae and their replication". In Virology Ed. B.N.Fileds et al. pp
1767-1848. Raven Press, New York, 1996.
97. Kuff E.L. y Lueders K.K., "The intracistemal A-particle family: structure and
functional aspects". Adv. Cancer. Res. 51:184-276,1988
98. Kozak C. y Ruscetti S., Retrovirus in Rodents. The Retroviridae, Vol 1, Chapter 7, pp
405-481, ed. Plenum Press, New York, 1992.
99. Rein A., "Interference grouping of murine leukemia viruses: A distinct receptor for
the MCF-recombinant viruses in mouse cells". Virology 136:144,1982.
Referencias Bibliográficas
107
100. Kozak C.A., "Genetic mapping of a mouse chromosomal locus required for mink cell
focus-forming virus replication". J. Virol. 48: 300,1983.
101. Levy J.A., "Xenotropic type C viruses". Curr. Top. Microb. Immunol. 79: 111, 1978.
102. Levy J.A., "Autoimmunity and neoplasia. The possible role of C-type viruses". Am. J.
Clin. Pathol. 62: 258,1974.
103. Hartly J.W. y cols., "Host-range restriction s of murine leukaemia viruses in mouse
embryo cell cultures". J. Virol. 5: 221,1970.
104. Kozak C.A., "Analysis of wild-derived mice for Fv-1 and Fv-2 murine leukaemia
virus restriction loci: A novel wild mouse Fv-1 allele responsible for lack of host
range restriction". J.Virol. 55: 281,1985.
105. Hartly J.W. y Rowe W.P., "Naturally occurring murine leukaemia viruses in wild
mice". Characterization of a new amphotropic class. J.Virol. 19:19,1976.
106. Hartly J.W. y cols., "A new class of murine leukaemia virus associated with
development of spontaneous lymphomas". Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 789,1977.
107. Cloyd M.W. y cols., "Host range of mink cell focus-inducing viruses". Virology 140:
239,1985.
108. Yang Y.L. y cols., "The receptors for polytropic and xenotropic murine leukaemia
viruses are encoded by a single gene that maps to Amcl". Nat. Genet. 21: 2106-
2119,1999.
109. Sherr C.J. y Todaro G.J., "Purification and assay of murine leukaemia viruses".
Methods Enzymol. LVII, 412-424,1979.
110. Moloney J.B., "Biological studies on a lymphoid-leukaemia virus extracted from
sarcoma 37.1. Origin and introductory investigations". J. Natl. Cancer Inst. Monogr.
24: 933,1960.
111. Lieber M.M. y cols., "Mammalian cells in culture frequently release type C viruses".
Science 182: 56-59,1973.
112. Anderson K.P. y cols., "Endogenous origin of defective retrovirus like-particles from
Referencias Bibliográficas
108
a recombinant Chinese hamster ovary cell line". Virology 181: 305-311,1991.
113. Bartal A.H. y cols., "Detection of retroviral particles in hybridomas secreting
monoclonal antibodies". Med. Microbiol. Immunol. 174: 325-332,1986.
114. Fields B. y cols., eds. Fields Virology. Berns K.I., Parvoviridae and their replication.
3rd Edition, 1996.
115. Jacoby R.O. y Ball-Goodrich L.J., "Parvovirus infections of mice and rats". Virology
6:329-337,1995.
116. Besselsen D.G. y cols., "Molecular characterization of newly recognized rodent
parvoviruses". J. Gen. Virol. 77: 889-911,1996.
117. Smith AL., "Serological tests for detection of antibodies to rodent viruses". Viral and
Micoplasmal Infections of Laboratory Rodents. Pp 731-750. Eds PN Blatt, RO Jacoby, MC
Morse. Academic Press Inc. Orlando.
118. Nettleton P.F., "The association of calf serum with the contamination of BHK-21
clones 13 suspension cells by parvoviruses serologically related to the minute virus
of mice (MVM)". Archives of Virology. 64: 359-374,1980.
119. Havakawa T., "Issues related to harmonization of testing requirements for viral
safety". Dev. Biol. Stand. 88:15-18,1996.
120. Lubiniecki A.S.," Current issues in viral assays and viral clearance evaluation". Dev.
Biol. Stand. 88: 9-11,1996.
121. Walter J.K. y cols., "Process scale considerations in evaluation studies and scale- up".
Dev. Biol. Stand. 88: 99-108,1996.
122. Poiley J.A. y cols., "Methods for estimating retroviral burden". BioPharmn 7(4): 32-
37,1994.
123. Wivel N.A. y Smith G.H., "Distribution of intracistemal A-particles in a variety of
normal and neoplastic tissues". Int. J. Cancer 7:167,1971.
124. Moloney J.B., "The history of retroviruses". In: Microbe Hunters: then and now,
Koprowski H., y cols., Eds. Medi-Ed Press, 1996.
125. CPMP Note for Guidance. The design, contribution and interpretation of studies
validating the inactivation and removal of virus. CPMP/BWP/268,1995.
Referencias Bibliográficas
109
126. Minor P.D., "Ensuring safety and consistency in cell culture production processes:
Viral screening and inactivation". Trends Biotechnol. 12: 257-261,1994.
127. Walter J.K., y cols., Bioseparation and bioprocessing. Vol I, Chapter 16 "Validation of
viral safety for pharmaceutical proteins". Wiley-VCH Verlag GmbH 465-496, 1998.
128. Aranha-Creado H. y Peterson J., "Clearance of murine leukemia virus from
monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane
filters". Biologicals 26(2): 167-172,1998.
129. Brandwein H. y Aranha-Creado H., "Membrane filtration for virus removal". Dev.
Biol. Stand. 102:157-163., 2000.
130. Azari M., "Evaluation and validation of virus removal by ultrafiltration during the
production of diaspirin cross-linked hemoglobin". Biologicals. 28: 81-94, 2000.
131. DiLeo A.J. y cols., "Size exclusion removal of model mammalian viruses using a
unique membrane system, Part II: module qualification and process simulation".
Biologicals. 21: 287-296,1993.
132. Validation of Virus Removal and Inactivation Procedures. EEC Note for Guidance-
Ad Hoc Working Party on Biotechnology/Pharmacy and Working Party on Safety
Medicines. Biologicals 19, 247-251 (1991).
133. Minor P.D., "Criteria for the choice of viruses in validation studies". Dev.Biol. Stand.
81: 215-219,1993.
134. Walter J.K. y cols., "Viral safety and evaluation of viral clearance from
biopharmaceutical products". Dev. Biol. Stand. 88: 99-108,1996.
135. Darling A.J., "Considerations in performing virus spiking experiments and process
validation studies". Dev. Biol. Stand. 81: 221-229,1993.
136. White M.E. y cols., "Process Validation for Virus Removal and Inactivation".
BioPharm 4(5): 34-39,1991.
137. American Type Culture Collection (ATCC) Catalogue of Cell Lines and
Hybridomas,^111 Edition, 1994. Maryland, USA.
Referencias Bibliográficas
110
138. American Tvpe Culture Collection (ATCC) Catalogue of Animal Viruses and
Antisera, Chlamydiae and Rickettsiae, Seven Editions, 1996. Maryland, USA.
139. Centro Internacional de Referencia para la Ciencia de Animales de Laboratorio
(ICLAS) Hospital Universitario de Nijmejen, Holanda.
140. Hierholzer J.C. y Suggs M.T., "Standardized viral hemagglutination and
hemagglutination-inhibition test: I, Standardization of erythrocyte suspensions".
App. Microbiol. 18: 816-923,1969.
141. Poilev J.A., "Methods for the detection of adventitious viruses in cell cultures used in
the production of biotechnology products". Technology, 1990.
142. Rodríguez T. y cols., Acción del virus de la Rubéola sobre macrófagos peritoneales
de rata. Estudio ultraestructural. CENIC11: 2,1980.
143. Reynolds E.S. "The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in
electron microscopy". J. Cell. Biol. 17: 208,1963.
144. Rowe P.W. y cols., "Plaque assay techniques for murine leukaemia viruses". Virology
42,1136-11391970.
145. ICH Guideline on Validation of Analytical Procedures: definitions and Terminology;
Availability7. Fed Reg 4:11259-11262,1995.
146. Fields B.N. y cols., eds. Fields Virology. Third Edition, 1996.
147. Reed L.J. y Muench H., "A simple method for estimating fifty percent endpoints".
Am. J. Hyg. 27:493-497,1938.
148. Darling A.J. y Spaltro J., "Virus Assay Methods: Accuracy and Validation."
Biologicals 26:105-110,1998.
149. Li Z. y cols., "PG-4 cell plaque assay for xenotropic murine leukaemia virus". J Virol
Methods 81: 47-53,1999.
150. Center for Biologies Evaluation and Research. Point to Consider in the Manufacture
and Testing of Monoclonal Antibody products for Human Use. Bethesda, MD: FDA,
1997.
Referencias Bibliográficas
111
151. Brunetti C.R. y cols., "Rote of mannose-6-phosphate receptors in Herpes Simplex!
Virus entry into cells and cell-to-cell transmission". J.Virol 69: 3517-3528.
152. Dingwell K.S. y cols., "Herpes Simplex Virus glycoproteins E and I facilitate cëll-te-
cell spread in vivo and aeross functions of cultured cells". J Virol. 68: 834-845,Jl994.
153. Grun J.B. y cols., "Viral removal/inactivation by I purification .Oof
biopharmaceuticals". BioPharm 22-30,1992.
154. Morgenthaler J.J., "Effect of ethanol on viruses". In: Morgentales JJ (ed); Basel,
Karger. Virus inactivation in plasma products. Curr Stud Haematology Blood
Tranfus 56:109-1201,1989.
155. Fields B. y cols., eds. Fields Virology. Chapter 21-23, 69-70.Third Edition, 1996.
156. Cameron R. y cols., "The removal of model virus, Polio type 1 and Canine
Parvovirus, during purification of human albumin using- ion-exchange
chromatographic procedures". Biologicals 25: 391-401,1997.
157. Point to consider in the production and testing of a new drugs and biologicals
produced by recombinant DNA technology. FDA. April, 1994.
158. Larzul D., "Viral Validation design of manufacturing process". Dev: Biol. Stand.
99:139-150,1999.
159. Stem M.D., "Viral Safety of Biotech Products". Gen. Eng. News. 18(10), 1998.
160. American Type Culture Collection (ATCC) Catalogue of Cell Lines and
Hybridomas,.8th Edition. Maryland, USA. pp 48,1994.
161. American Type Culture Collection (ATCC) Catalogue of Cell ; Lines and
Hybridomas. 8th Edition. Maryland, USA. pp 98,1994.
162. Budnick M.O. y cols., "Clearance of Adventitious Virus during Bovine-Albumin
Manufacture". BioPharm 7 (8): 32-37,1994.
163. Potts B.J. y Kivens W.J., "Detecting and removing porcine viruses to prevent
contamination of biopharmaceutical raw material". BioPharm 13(15): 26-31, 2000.
164. Hodde J. y Hiles M., "Virus safety of a porcine-derived medical device: Evaluation
of a viral inactivation method". Biotechnol. Bioeng. 79(2): 211-216, 2002.
Referencias Bibliográficas
112
165. Lie Y. y cols., "Chinese hamster ovary cells contain transcriptional active full-length
type C proviruses". J. Virol. 68: 7840-7849,1994.
166. Anderson K.P., "Presence and transcription of intracisternal A particle-related
sequences in CHO cells". J. Virol. 64: 2021-2032,1990.
167. Coffin J.M. y cols., Retroviruses Chapter 1 Historical introduction to the general
properties of retroviruses. National Centre for Biotechnology Information. CSHL
Press, 1997.
168. Gray K.D. y Roth M., "Mutational analysis of the enveloped gene of Moloney murine
virus”. J. Virol. 64: 3489-3496,1993.
169. Frankel W.N. y cols., "A genetic linkage map of endogenous murine leukaemia
viruses". Genetics 124: 221-236,1990.
170. Keshet E. y cols., "Mouse retro transposons: A cellular reservoir of long terminal
repeat (LTR) elements with diverse transcriptional specificities". Adv. Cancer Res. 56:
215-251,1991.
171. Frankel W.N. y cols., "Characterization of the endogenous non-ecotropic murine
leukaemia viruses of NZB/BINJ and SM/J inbred strains mice". Mamma. Genome
2110-122,1992.
172. Coffin J.M., "Genetic diversity and evolution of retroviruses". Curr. Top. Microbiol.
Inmunol. 176:143-164.1992
173. Tristem M., "Characterization of a novel murine leukaemia virus related subgroup
within mammals". ]. Virol. 70:8241-8246,1996.
174. Meitz J.A. y cols., "Nucleotide sequence of a complete mouse intracisternal A-
particle genome: Relationship to known
175. Stoye J.P. y Coffin J.M., "The four classes of endogenous murine leukaemia virus:
structural relationships
176. Marcus-Sekura C.J., "Introduction to the issues: Detection of retroviruses and
associated risks". Dev. Biol. Stand. 76:137-140,1992.
177. O.H.D. y cols., "Sequence analysis of amphotropic and 10A1 murine leukaemia
Referencias Bibliográficas
113
viruses: close relationship to mink cell focus-inducing viruses". J.Virol. 61: 2659f
2669,1990.
178. Morgan R.A. y cols., "Analysis of the functional and host ranger-detérmining
regions of the virion ecotropic and amphotropic retrovirus'envelope proteins". J.
Virol. 67:4712-4721,1993.
179. Cosset J. y cols., "Retroviral retargeting by envelopes expressing an N-terminal
binding terminal domain". J.Virol. 69: 6314-63221995
180. Lyer H. y cols., "Considerations during development of Protein A-based antibody
purification process". BioPharm (1): 14-18, 2002.
181. Roberts P.L. y cols., "Removal and inactivation of enveloped and non-enveloped
viruses during the purification of a high-purity factor IX by metal chelate affinity
chromatography". Vox Sang 67 Suppl 1: 69-71,1994.
182. Balayán M.z y Más P., Nociones de Virología General. Cap 2 "Bioquímica de los
virus". Instituto del libro, Habana. 61-92,1970.
183. Floyd R. y Sharp D.G., "Viral aggregation: buffer effects in the aggregation of
poliovirus and Reovirus at low and high' pH". Appl. Environ. Microbiol. 38(3): 395-
401,1979.
With this latter we would like to acknowledge that the research activities carried out by Aymara Nieto, a researcher from the Center of Molecular Immunology, Havana, Cuba, concerning Viral Validation Studies of the manufacturing process for humanized Monoclonal Antibody TheraCIM h-R3 were not previously published In Indexed Serial Publications. This was necessary to protect the confidentiality of the information which has been submitted to and accepted in 1999 by the Health Regulatory Authority of the Government of Canada, the Health Protection and Food Branch (HPFB), as part of an Investigational New Drug (Clinical Trlaj Application) submission package.
Con fundamento legal en el Artículo 102 de la Ley No. 41 de 1983 de la Salud Pública y una vez cumplidas las exigencias prescritas en los Requisitos, aprobados y puestos en vigor por la Resolución Ministerial No. 31 del 17 de Marzo de 1995, Reglamento para el Registro de Medicamentos de Uso Humano, se otorga el presente:
Condiciones de almacenamiento: Temperatura de 2 a 8 ° C. Protegido de la luz.
Plazo de validez: 12 meses.
Titular: Centro de Inmunología Molecular.
Productor: Centro de Inmunología Molecular.
Indicaciones: Pacientes con anemia crónica sometidos a régimen terapéutico de hemodiálisis. diálisis peritoneal o pacientes prediabéticos, Raóientes oncológicós con anemia crónica sometidos a régimen de quimioterapia. Pacientes con SEDA, que presenten anemia crónica, sometidos a régimen terapéutico con zidovudina.
Contraindicaciones: Hipertensión no controlada. Hipersensibilidad a productos derivados de células superiores o a la albúmina humana. Embarazo y leucemia eritoide.
Precauciones: Pacientes con enfermedad renal crónica. Hipertensión. Convulsiones. Eventos trombóticos.
Advertencias: No congelar.
Lic. Raúl Morejón Sub-Director Técnico
Con fundamento legal en el Artículo 102 de la Ley No. 41 de 1983 de la Salud Pública y una vez cumplidas las exigencias prescritas en los Requisito, aprobadas y puestos en vigor por la Resolución Ministerial No. 31 del 17 de Marzo de 1995, Reglamento para el Registro de Medicamentos de Uso Humano, se otorga el presente:
Condiciones de almacenamiento: Temperatura de 2 a 8 ° C, protegido de la luz. Plazo de validez: 12 dias T i tu l ar : Centro de Inmunología Molecular Productor: Centro de Inmunología Molecular Indicaciones: Pacientes con anemia crónica sometidos a régimen terapéutico de
hemodiálisis, diálisis peritoneal o pacientes prediabéticos. Pacientes oncológicos con anemia crónica sometidos a régimen de quimioterapia. Pacientes con SIDA, que presenten anemia crónica. sometidos a régimen terapéutico con zidovadina.
Contraindicaciones: Hipertensión no controlada. Hipersensibilidad a productos derivados de células superiores o a la albúmina humana. Embarazo y leucemia eritoide.
Precauciones: Pacientes con enfermedad renal crónica. Hipertensión. Convulsiones. Eventos trombóticos.
Advertencias: No congelar.
Apto Postal 16065, Ciudad de la Habana, CP 11600, CUBA. Tel: 218823-218645. FAX 214023. Correo E. [email protected] cu
Registro de la Secretarla del CECMED/
Tomo 02 Folio 000016 No. 26/11001 Fecha:202.02.20 Firma
Apto Postal*. 16065, Ciudad de la Habana, CP 11600, CUBA. Tel: 218823-218645. FAX 214023. Correo E. cccmcdfficccmed.sId,cu
