Embed Size (px)
Citation preview
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
245
O R V O S K É P Z É SA graduális és posztgraduálisképzés folyóirataAlapítva 1911-benKülönszám2011; LXXXVI. évfolyam,S3:245-292.
Orvosképzés Szerkesztõség:1086 Budapest, Nagyvárad tér 4.
Kiadja és terjeszti:Semmelweis Kiadó1086 Budapest, Nagyvárad tér 4.Telefon: 210-4403Fax: 210-0914, 459-1500/56471Internet honlap:www.semmelweiskiado.huE-mail: [email protected]@semmelweiskiado.hu
Szerkesztõ:VINCZE JUDIT
Kiadásért felel:TÁNCOS LÁSZLÓ
Hirdetésszervezõ:KOVÁCS VERONIKA
Telefon: 215-1401, 06 20/ [email protected]
Nyomdai elõállítás:Avaloni Kft.
ISSN 0030-6037
FELELÕS SZERKESZTÕ
Merkely Bé[email protected]
FÕSZERKESZTÕK
Gál Já[email protected]
Langer Ró[email protected]
SZERKESZTÕBIZOTTSÁG
Graduális képzésMatolcsy Andrá[email protected]
PhD-képzésSzél Á[email protected]
Szakorvos-továbbképzésSzathmári Mikló[email protected]
Rezidens- és szakorvosképzésPréda Istvá[email protected]
TagokÁdám Veronika, Bereczki Dániel, Bitter István, Csermely Péter, de Châtel Rudolf,Dobozy Attila, Eckhardt Sándor, Édes István, Fazekas Árpád, Fejérdy Pál,Fekete György, Halász Béla, Karádi István, Kárpáti Sarolta, Kásler Miklós, Keller Éva,Kollai Márk, Kopper László, Ligeti Erzsébet, Losonczy György, Magyar Kálmán,Mandl József, Muszbek László, Nagy Károly, Nardai Sándor, Nemes Attila,Németh János, Noszál Béla, Palkovits Miklós, Papp Gyula, Papp Zoltán,Petrányi Gyõzõ, Répássy Gábor, Rigó János, Réthelyi Miklós, Romics Imre,Romics László, Rosivall László, Sótonyi Péter, Szendrõi Miklós, Szirmai Imre,Szollár Lajos, Telegdy Gyula, Tompa Anna, Tóth Miklós, Tulassay Zsolt,Tulassay Tivadar, Vasas Lívia, Vincze Zoltán, Zelles Tivadar
Szerkesztõségi titkárSzelid [email protected]
Az O R V O S K É P Z É S megjelenik negyedévente. Megrendelhetõ a Kiadótól.
Semmelweis Kiadó
www.semmelweiskiado.huSzerzõi jog és másolás: minden jog fenntartva. A folyóiratban valamennyi írásos és képi anyag közlési jogaa szerkesztõséget illeti. A megjelent anyag, illetve annak egy részének bármilyen formában történõ másolá-sához, ismételt megjelentetéséhez a szerkesztõség hozzájárulása szükséges.
O R V O S K É P Z É S LXXXVI. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
246
O R V O S K É P Z É SA graduális és posztgraduálisképzés folyóirataalapítva 1911-benKülönszám2011; LXXXVI. évfolyam, S3: -.
E - O R V O S K É P Z É S
Töltse le a folyóiratot awww.semmelweiskiado.huoldaláról!
Semmelweis Egyetem
Laboratóriumi Medicina kötelezõ szintentartó tanfolyamÚjabb laboratóriumi eljárások (OFTEX)
Budapest, Elméleti Oktatási Központ(1094 Budapest, Tûzoltó utca 37-47.)2011. április 18-21.
A TANFOLYAM ELNÖKEDr. Szabó Antal, az MTA doktoraegyetemi tanár, mb. igazgatóSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet1085 Budapest, Bókay utca 54.E-mail: [email protected]
TANFOLYAMSZERVEZÉSDr. Vásárhelyi Barna, az MTA doktoratudományos fõmunkatárs, igazgató helyettesSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet1085 Budapest, Bókay utca 54.E-mail: vasbar @gyer1.sote.hu
Dr. Szombath Dezsõ, szaktanácsadó, titkárságvezetõSemmelweis Egyetem Továbbképzési KözpontE-mail: [email protected]
TOVÁBBKÉPZÉSI INFORMÁCIÓKAkkreditáció:Dr. Szathmári Miklós, az MTA doktora, egyetemi tanárÁOK Szakmai Tanácsadó Testület elnökeTel.: 459-1500/52535E-mail: [email protected]
Kedves Munkatársak! Kedves Olvasók!
O R V O S K É P Z É S
247
S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
Szeretettel és tisztelettel köszöntjük Önöket a 2011. évi Laboratóriumi medicina kötelezõ szinten tartó továbbképzõ tanfo-lyamon, melyre három év után ismét sor kerül az új továbbképzési ciklus kezdetén.
A laboratóriumi medicinában világszerte az elmúlt évtizedekben alapvetõ változások történtek. A munka mind nagyobb há-nyadát automatizálják, a humán tényezõ a mérések végzésében egyre kisebb szerepet kap. Ráadásul a korábban csak a kutatásraszorítkozó eljárások fokozatosan megjelennek a mindennapok gyakorlatában, azaz az eddig csak tudományos közleményekbenbemutatott vizsgálatok egyre inkább a modern diagnosztika részét képezik.
A laboratóriumi medicina gyors ütemû fejlõdését nem egyszerû nyomon követni. A többnapos továbbképzõ rendezvényegyik célkitûzése az újdonságokban való eligazodás segítése. Ezért kerül sor olyan korszerû technológiák, mint a tömeg-spektrometria, az áramlási citometriás vizsgálatok vagy molekuláris biológiai technikák bemutatására, melyek már most egyesmagyar laboratóriumokban hozzátartoznak a metodikai fegyvertárhoz.
Ez volt az egyik oka annak, hogy az elõadások a szakma széles és változatos területét érintik. A másik ok, hogy az elõadásokegy része néhány kiválasztott betegség, kórkép, így a vesebetegségek, gastrointestinalis kórképek, autoimmun betegségek eseté-ben a kivizsgálásra alkalmazott algoritmussal, ezen belül az újabb diagnosztikus tesztek helyével és szerepével kíván foglalkoz-ni. Szó lesz néhány olyan speciális problémáról, amivel a gyakorló orvosok – és a munkájukat támogató laboratóriumi szakem-berek – a gyermekek ellátása során szembesülnek. Népegészségügyi szerepük, valamint a preanalitikai hibák fokozott kockázatamiatt kitüntetett szerepet kapnak a hemosztázissal kapcsolatos kérdések is.
A szakvizsga megújításához szükséges és elõírt kötelezõ szinten tartó továbbképzõ tanfolyamot idén Budapesten a Semmel-weis Egyetem Laboratóriumi Medicina Intézet koordinálja. Az Intézet megalapítása óta eltelt kevesebb mint egy év alatt több te-rületen is minõségi változás következett be az egyetemen végzett laboratóriumi diagnosztikus munka és a laboratóriumi medici-na oktatása terén. A graduális képzés keretében sor került egyetemi jegyzet elkészítésére, illetve a Laboratóriumi medicina tárgyoktatására is. A posztgraduális képzés része a jelen továbbképzõ elõadás is.
Az elõadások rövid összefoglalója az „Orvosképzés” folyóiratban is megjelenik (mely a Semmelweis Kiadó honlapjáról isletölthetõ: www.semmelweiskiado.hu/folyóiratok) ; a vetített ábraanyag várhatóan a Magyar Laboratóriumi Diagnosztikai Tár-saság (MLDT) honlapján (www.mldt.hu) is hozzáférhetõ lesz. Reméljük, hogy az összefoglalók az olvasók számára hasznosaklesznek és segítik további munkájukat, szakmai tájékozottságukat.
Tisztelettel:
BESZKENNELT ALÁÍRÁST KÉREK
Dr. Vásárhelyi Barnatudományos fõmunkatárs
a tanfolyam titkára
Dr. Szabó Antalegyetemi tanár
a tanfolyam elnöke
DR. VÁSÁRHELYI BARNA
tudományos fõmunkatársDR. SZABÓ ANTAL
egyetemi tanár
FOTÓT kérek háttérrel
ORVOSKÉPZÉS folyóirat szerzõi útmutatója
A folyóirat célja: Az 1911-óta megjelenõ Orvosképzés legfontosabbcélja a hazai orvoskollégák folyamatos graduális és posztgraduálisképzésének támogatása. A lap elsõsorban olyan munkák közléséttartja feladatának, amelyek az orvostudomány egy-egy ágánakújabb és leszûrt eredményeit foglalják össze magas színvonalon úgy,hogy azok a gyakorló orvoshoz, szakorvoshoz, klinikushoz és elméle-ti orvoshoz egyaránt szóljanak. Emellett lehetõség van eredeti közle-mények és esetismertetések benyújtására, és az újság a SemmelweisEgyetem szakmai kötelezõ szinten tartó tanfolyamok elõadási össze-foglalóinak is teret ad. Az eredeti közlemények a rendszeres lap-számokban, vagy a témához kapcsolódó tematikus lapszámokbankapnak helyet. Fontos feladatunknak tartjuk, hogy rezidens kollégáktollából származó esetismertetéseket is közöljünk, melyeket mentoriajánlással kérünk benyújtani. A beadott dolgozatokat a szerkesztõbi-zottság elõzetes bírálatra adja ki, és a kézirat közlésére a bírálat ered-ményének függvényében kerül sor. Tudományos dolgozat benyúj-tására az alábbiak szerint van lehetõség:• Esetismertetés (case report)• Fiatal doktorok (PhD) tudományos beszámolója, új eredményei-
nek összefoglalása (nem tézisek vagy doktori értekezések!)• Klasszikus összefoglaló közlemény az elméleti és klinikai orvostu-
domány bármely területérõl, a legújabb irodalmi eredmények fel-használásával
• „Update” jellegû közlemény, azaz nem egy téma kidolgozása, ha-nem adott szakterület legújabb tudományos eredményeinekösszefoglalása
• Elõadási összefoglaló (a tanfolyamszervezõk felkérése alapján)
A kézirat: A tudományos közleményeket elektronikusan, Word do-kumentum formátumban kérjük eljuttatni a szerkesztõségbe. Az il-lusztrációkat, ábrákat és táblázatokat külön file-ként kérjük elküldeni.Az ábrák címeit és az ábramagyarázatokat a Word dokumentumbankülön oldalon kell feltüntetni, az ábra/táblázat számának egyértelmûmegjelölésével. A digitális képeket minimum 300 dpi felbontásbankérjük, elfogadunk tif, eps, illetve cdr kiterjesztésû file-okat. A kéziratelfogadása esetén az ábrákat a szerkesztõség nyomtatott formábanis kéri elküldeni. Az orvosi szavak helyesírásában az Akadémia állás-foglalásának megfelelõen, a latinos írásmód következetes alkalmazá-sát tekintjük elfogadottnak. Magyarosan kérjük írni a tudományágakés szakterületek, a technikai eljárások, mûszerek, a kémiai vegyületekneveit. A szerkesztõk fenntartják maguknak a stiláris javítás jogát. Amértékegységeket SI mértékrendszerben kérjük megadni.
A kézirat felépítése a következõ: (1) címoldal, (2) magyar összefog-lalás, kulcsszavakkal, (3) angol összefoglalás (angol címmel), angolkulcsszavakkal, (sorrendben): magyar cím, angol cím, (4) rövidítésekjegyzéke (ha van), (5) szöveg, (6) irodalomjegyzék, (7) ábrajegyzék, (8)táblázatok, (9) ábrák. Az oldalszámozást a címoldaltól kezdve kellmegadni és az egyes felsorolt tételeket külön lapon kell kezdeni.(1) A címoldalon sorrendben a következõk szerepeljenek: a kézirat cí-me, a szerzõk neve, valamint a szerzõk munkahelye, a kapcsolattartószerzõ pontos elektronikus és postai címének megjelölésével. (2–3)Az összefoglalást magyar és angol nyelven kell beküldeni, külön ol-dalakon, a következõ szerkezet szerint: „Bevezetés” („Introduction”),„Célkitûzés” („Aim”), „Módszer” („Methods”), „Eredmények”(„Results”) és „Következtetések” („Conclusions”) lényegre törõ meg-fogalmazása történjék. A magyar és az angol összefoglalások terje-delme – külön-külön – ne haladja meg a 200 szót (kulcsszavak nél-kül). A témához kapcsolódó, maximum 5 kulcsszót az összefoglalókoldalán, azokat követõen kérjük feltüntetni magyar és angol nyel-ven. (4) A kéziratban elõforduló, nem általánosan elfogadott rövidí-tésekrõl külön jegyzéket kell készíteni abc-sorrendben. (5) A szöveg-törzs szerkezete világos és az olvasó számára átlátható legyen. Ere-deti közlemények esetén a „Bevezetõ”-ben röviden meg kell jelölni aproblémafelvetést, és az irodalmi hivatkozásokat a legújabb eredeti
közleményekre és összefoglalókra kell szûkíteni. A „Módszer” rész-ben világosan és pontosan kell leírni azokat a módszereket, amelyekalapján a közölt eredmények születtek. Korábban közölt módszere-ket esetén csak a metodika alapelveit kell megjelölni, megfelelõ iro-dalmi hivatkozással. Klinikai vizsgálatoknál a kézirathoz csatolni kellaz illetékes etikai bizottság állásfoglalását. Állatkísérletek esetén aMagyar Tudományos Akadémia – Egészségügyi Tudományos Tanács– állatkísérletekre vonatkozó etikai kódexe érvényes, melyre a meto-dikai részben utalni kell. A statisztikai módszereket és azok irodalmátis meg kell adni. Az „Eredmények” és a „Megbeszélés” részeket vilá-gosan kell megszerkeszteni. Referáló közlemények benyújtása ese-tén a szövegtörzs altémákra osztható, melyeket alcímek vezessenekbe. Összefoglaló referátumoknál a szövegtörzs terjedelme ne halad-ja meg a 30 000 karaktert (szóközzel), eredeti közleménynél (klinikai,vagy kísérletes) ne haladja meg a 20 000 karaktert (szóközzel), esetis-mertetésnél ne haladja meg a 10.000 karaktert (szóközzel), elõadásiösszefoglaló esetén pedig ne haladja meg a 8000 karaktert (szóköz-zel).Irodalom: a hivatkozásokat (maximum 50, elõadási összefoglalónálmaximum 10) a szövegben való megjelenés sorrendjében tüntessékfel. A szövegben a hivatkozást a sorszáma jelöli.Hivatkozás cikkre: sorrendben: szerzõk neve (6 szerzõ felett et al./ésmtsai), cikk címe, folyóirat neve (Index Medicus szerint rövidítve), év;kötetszám:elsõ-utolsó oldal. Példa: 1. Kelly PJ, Eisman JA, SambrookPN. Interaction of genetic and environmental influences on peakbone density. Osteoporosis Int 1990; 1:56-60. Hivatkozás könyvfeje-zetre, sorrendben: a fejezet szerzõi. A fejezet címe. In: szerkesztõk(editors). A könyv címe. A kiadás helye, kiadó, megjelenés éve; feje-zet elsõ-utolsó oldala. Példa: 2. Delange FM, Ermans AM. Iodidedeficiency. In: Braverman LE, Utiger RD, eds. Werner and Ingbar’s thethyroid. 7th ed. Philadelphia, Lipincott-Raven, 1996; 296 316.Ábrajegyzék: a megjelenés sorrendjében, arab számmal sorszámozvaegymás alatt tartalmazza az ábra címét és alatta rövid és lényegre tö-rõ ábramagyarázatotTáblázatok: külön-külön lapokon kérjük, címmel ellátva és arabszámmal sorszámozva. Törekedjenek arra, hogy a táblázat könnyenáttekinthetõ legyen, ne tartalmazzon zavaróan sok adatot.Ábrák: külön-külön lapokon kérjük. Csak reprodukálható minõségûábrákat, fényképek küldését kérjük (min. 300 dpi felbontásban), a ko-rábban megjelölt file formátumokban. A kézirat elfogadása esetén anyomtatott ábrát kérjük beküldeni a szerkesztõségbe és az ábra hát-oldalán puha ceruzával kérjük jelölni a szerzõ nevét, arab számmal azábra sorszámát és a vertikális irányát.
A formai hiányossággal beküldött kéziratokat nem tudjuk elfogadni.A gyors lektori és korrektúrafordulók érdekében kérjük a legbizto-sabb levelezési, illetve e-mail címet, telefon- és faxszámot megadni.Elfogadás esetén külön levélben kérjük jelezni, hogy a szerzõk a köz-leménnyel egyetértenek (és ezt aláírásukkal igazolják), valamint le-mondanak a folyóirat javára a kiadási jogról. Írásbeli engedélyt ké-rünk mellékelni a már közölt adat/ábra felhasználása, felismerhetõszemély ábrázolása, szerzõnek nem minõsülõ személy nevének em-lítése/feltüntetése esetén. A szerkesztõség az általa felkért szakértõkszemélyét titkossággal kezeli. A kézirat tulajdonjoga a megjelenésiga szerzõt illeti meg, a megjelenés napján tulajdonjoga a kiadóra száll.A megjelent kéziratok megõrzésére szerkesztõségünk nem tud vál-lalkozni.
A kéziratok benyújtását a következõ címre várjuk:
Dr. Szelid Zsolt szerkesztõségi titkárSemmelweis Egyetem, Kardiológiai Központ1122 Budapest, Városmajor u. 68Tel: (06-1) 458-6810E-mail: [email protected]
2011; S1:1-168. O R V O S K É P Z É S
A Tanfolyam programja / Tartalom / Contents
S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM / TARTALOM / CONTENTS
249
2011. ÁPRILIS 18, HÉTFÕ
09:00 – 09:45 Dr. Szabó AntalSemmelweis Egyetem,Laboratóriumi Medicina Inté[email protected]
Speciális feladatok gyermekek laboratóriumi vizsgálatánálSpecial tasks of pediatric laboratory investigation
251.oldal
09:55 – 10:40 Dr. Vásárhelyi BarnaSemmelweis Egyetem,Laboratóriumi Medicina Inté[email protected]
Mintavételi technikák; preanalitikai megfontolások gyermekkorbanSampling techniques in pediatrics; preanalytical issues
253oldal
10:45 – 11:30 Dr. Halász ZitaSemmelweis Egyetem,I. Sz. Gyermekgyógyászati [email protected]
Hormonvizsgálatok eredményeinek értékelése a csecsemõ- és gyer-mekkorbanInterpreting hormone results in infancy and childhood
254.oldal
11:30 – 12:30 Szünet
12:30 – 13:15 Dr. Szabó MiklósSemmelweis Egyetem,I. Sz. Gyermekgyógyászati [email protected]
Ágymelletti laboratóriumi vizsgálatok (POCT) a neonatológiai osztá-lyokonPOCT in neonatal intesive care
256.oldal
13:25 – 14:10 Dr. Takáts ZoltánSemmelweis Egyetem,I. Sz. Gyermekgyógyászati [email protected]
Anyagcsere-betegségek szûrése és diagnosztikájaScreening and diagnostics of metabolic diseases
257.oldal
14:15 – 15:00 Dr. Takáts ZoltánSemmelweis Egyetem,I. sz. Gyermekgyógyászati [email protected]
Tömegspektrometria a klinikai laboratóriumi diagnosztikábanMass spectrometry in laboratory diagnostics
258.oldal
2011. ÁPRILIS 19. , KEDD
09:00 – 09:45 Dr. Sátori AnnaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi MedicinaIntézet, Központi Laboratórium (Pest)[email protected]
Preanalitika a speciális hemosztázisbanPreanalytics in special hemostasis
260.oldal
09:55 – 10:40 Dr. Várnai KatalinSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi MedicinaIntézet, Központi Laboratórium (Pest)[email protected]
Feladatok a hemosztázis alaptesztek kóros eredménye eseténTasks in case of abnormal results of haemostatic screening tests
262.oldal
10:45 – 11:30 Dr. Domján Gyula, Dr. Gadó KláraSemmelweis Egyetem,I. Sz. Belgyógyászati [email protected]
A thrombosishajlam vizsgálati algoritmusaANGOL CÍM
263.oldal
11:30 – 12:30 Szünet
12:30 – 13:15 Dr. Nemes LászlóOrszágos Haemophilia Központ ésHaemostasis Szakrendelés, Honvédkórház –Állami egészségügyi Központ, [email protected]
A veleszületett vérzékenység vizsgálati algoritmusaEvaluation of congenital bleeding disorders
265.oldal
13:25 – 14:10 Dr. Várnai KatalinSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi MedicinaIntézet, Központi Laboratórium (Pest)[email protected]
Új speciális hemosztázis tesztekNew special tests of hemostasis
267.oldal
14:15 – 15:00 Dr. Prohászka ZoltánSemmelweis Egyetem, III. Sz. BelgyógyászatiKlinika, Kutatólaborató[email protected]
A komplementrendszer laboratóriumi vizsgálatának indikációiIndications to perform laboratory tests of complement system
269.oldal
O R V O S K É P Z É S LXXXVI. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM / TARTALOM / CONTENTS
250
2011. ÁPRILIS 20. , SZERDA
09:00 – 09:45 Dr. Kocsis IbolyaSemmelweis Egyetem, Labormedicina Intézet,Központi Laboratórium (Pest)[email protected]
Újabb labordiagnosztikai paraméterek szerepe a vesefunkció vizsgá-latábanDiagnostical role of new biomarkers in monitoring of renal function
271.oldal
09:55 – 10:40 Dr. Hamar PéterSemmelweis Egyetem, Kórélettani Inté[email protected]
A tápcsatorna betegségeinek laboratóriumi diagnosztikájaLaboratory diagnostics of gastrointestinal diseases
272.oldal
10:45 – 11:30 Dr. Patócs AttilaSemmelweis Egyetem,Laboratóriumi Medicina Inté[email protected]
Neuroendokrin daganatok diagnosztikájaLaboratory diagnosis of neuroendocrine tumors
274.oldal
11:30 – 12:30 Szünet
12:30 – 13:15 Dr. Gergely PéterSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi MedicinaIntézet, Immunológiai Laborató[email protected]
Autoimmun betegségek laboratóriumi diagnosztikájaLaboratory Diagnosis of Autoimmune Diseases
275.oldal
13:25 – 14:10 Dr. Bekõ GabriellaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi MedicinaIntézet, Központi Laboratórium (Pest)[email protected]
CitokinszintmérésekCytokine level measurements
277.oldal
14:15 – 15:00 Dr. Vásárhelyi Barna, Dr. Mészáros GergõSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi MedicinaIntézet
Áramlási citométerek klinikai alkalmazásaClinical application of flow cytometry
278.oldal
15:15 – 16:00 Dr. Bekõ GabriellaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi MedicinaIntézet, Központi Laboratórium (Pest)[email protected]
Újabb típusú hematológiai automatákNew series of hematology analyzers
279.oldal
2011. ÁPRILIS 21. , CSÜTÖRTÖK
09:00 – 09:45 Dr. Patócs AttilaSemmelweis Egyetem,Laboratóriumi Medicina Inté[email protected]
Molekuláris biológiai módszerek I.Mintavétel, PCR technikák, polimorfizmus-detektálásMolecular biological methods I. Sampling, PCR tequenics, detection ofpolymorphisms
281.oldal
09:55 – 10:40 Dr. Tordai AttilaOVSZ Molekuláris Diagnosztikai Laborató[email protected]
Molekuláris biológiai módszerek II.Közvetlen szekvenciaanalízis, hibridizációs technikákMolecular biological methods II. Direct sequencing, hybridizationtechniques
283.oldal
10:45 – 11:30 Dr. Tordai AttilaOVSZ Molekuláris Diagnosztikai Laborató[email protected]
Molekuláris diagnosztika örökletes betegségekbenMolecular diagnostics of inherited disorders
284.oldal
11:30 – 12:30 Szünet
12:30 – 13:15 Dr. Andrikovics HajnalkaOrszágos Vérellátó Szolgálat,Molekuláris Diagnosztikai Laborató[email protected]
Genetikai kockázati tényezõk rosszindulatú hematológiaikórképekbenGenetic risk factors in hematological malignancies
286.oldal
13:25 – 14:10 Dr. Szõnyi LászlóSemmelweis Egyetem,I. Sz. Gyermekgyógyászati [email protected]
Öröklõdõ anyagcsere-betegségek diagnosztikája gyermekkorbanDiagnosis of inborn error of metabolism in childhood
287.oldal
14:15 – 15:00 Dr. Inczédy-Farkas Gabriella,Dr. Molnár Mária JuditSemmelweis Egyetem, Molekuláris NeurológiaiKlinikai és Kutatási Kö[email protected]
A biobankokBiobanks
289.oldal
Speciális feladatok gyermekek laboratóriumi vizsgálatánál
Special tasks of pediatric laboratory investigation
Dr. Szabó AntalSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet
Kulcsszavak: pediátriai laboratórium sajátosságai, referencia tartományokKey-words: peculiarites of laboratory diagnostics in pediatrics, reference ranges
A címben jelölt továbbképzõ elõadás aktualitása
Magyarországon körülbelül 3 millió gyermek él.Számos esetben a felnõttektõl eltérõ betegségekkel, meg-
jelenési formákkal lehet találkozni, azonban az általános kór-házi és rendelõintézeti laboratóriumok ritkán felkészültek asajátságos csecsemõ- és gyermekgyógyászati igényekre ésfeladatokra.
Felnõttektõl különbözik a folyadékterek megoszlása, má-sok a referenciatartományok, különösen újszülött- és csecse-mõkorban.
Referenciatartományok kérdése
Elsõ közelítésben, a mintegy 50–70 féle „általános” labo-ratóriumi paraméterek harmadában az életkorfüggést nemszükséges külön figyelembe venni, a születést követõ 1–2 hétután közel azonos értékûek a felnõttek referenciatartományá-val. Ilyen, az életkorral nem változó laboratóriumi paramétera szérum-nátriumszint, kloridszint, ozmolalitás, karbamid-szint, ammóniaszint, thrombocytaszám. A laboratóriumivizsgálatok másik harmadában az életkorral a laboratóriumiparaméter értéke szignifikánsan nõ vagy csökken.
A hematológiai paraméterek esetében szintén dinamiku-san változnak a referencia tartományok az életkortól függõen.
Több esetben komoly félreértésre ad okot az immunglo-bulinok értékelése. Gyermekeknél különösen 1–3 év között, afelnõttekhez viszonyítva jelentõsen alacsonyabb az immun-globulinok szintje a szérumban: IgA 0,3–1,0 g/l, IgG 4–9 g/l,IgM 0,6–1,8 g/l. A laboratóriumi analizátor, illetve annakprogramja általában a felnõttkori értékhez hasonlít, így szinteminden kisgyermektõl vett minta esetén, a leleten megjelöltreferencia tartományhoz képest eltérést észlel az orvos és aszülõ. Ezért alaptalanul arra gondolnak, hogy a gyermek im-munhiányos és további, felesleges vizsgálatot indikálnak.
Néhány példa olyan laboratóriumi vizsgálatokra,melyek jelentõsége újszülött- éscsecsemõkorban kiemelkedõ
Újszülöttkori icterus vizsgálataFiziológiás icterus figyelhetõ meg az újszülöttek mintegy
50%-ánál a születést követõ 48 órában. Okai: a fetalis-hemoglobin-tartalmú vörösvérsejtek csökkent élettartalma,lassabb a máj bilirubin felvétele és kisebb a glükuronil-transzferáz enzimaktivitás. A szérum-összbilirubinkoncent-ráció többnyire 200 µmol/l alatt van és érett újszülötteknél a10–14. napon normalizálódik (<20 µmol/l). A direkt (konju-gált) bilirubin frakció szintje minimális: <10%-a az összesbilirubinszintnek.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
251
1. táblázat
Példák az életkorral jelentõsen változó referencia tartományokra
PARAMÉTER ÚJSZÜLÖTT CSECSEMÕ GYERMEK FELNÕTT
Életkorral növekvõ laboratóriumi értékek (példák)
Szérum-összfehérjeszint g/l 45–55 50–70 60–80 60–80
Szérum-albuminszint g/l 30–40 32–45 35–50 35–55
Fibrinogénszint g/l 1,0–3,0 1,5–4,0 2,0–4,5 2,0–4,5
Szérum-koleszterinszint mmol/l 1,5–3,0 2,0–4,0 3,0–5,0 4,0–6,0
Szérum-trigliceridszint mmol/l 0,2–0,6 0,5–1,5 0,6–1,8 1,0–2,0
Vizelet-kreatininürítés mmol/nap 0,16–0,40 0,50–3,0 3,0–5,0 5,0–10,0
Vizelet-adrenalinürítés nmol/nap 1–10 5–22 10–60 15–80
Életkorral csökkenõ laboratóriumi értékek (példák)
Szérum-AP U/l 100–960 100–960 100–960 50–400
Szérum-LDH U/l 200–800 200–600 200–400 150–300
Szérum-ferritinszint mg/l 200–600 50–200 10–140 10–140
Szérum-bilirubinszint µmol/l 5–100 3–20 3–17 3–17
Szérum-káliumszint mmol/l 4,0–6,0 3,8–5,5 3,5–5,5 3,5–5,0
Szérum-foszfátszint mmol/l 1,4–2,9 1,4–2,4 1,2–2,0 1,0–1,2
Szérum-TSH mU/l 0,6–12 0,5–7 0,4–5 0,3–4
A laboratóriumban a szérum-bilirubin- és hematokritér-ték 2–3 csepp vérmintából elvégezhetõ kapilláris bilirubinmérõvel. A klinikusok különbözõ táblázatokat, formulákathasználnak a fototerápia / vércsere indikáció eldöntéséhez.
Amikor a sárgaság a születést követõen15–20 napon át el-húzódó és egyéb tünetek (láz, görcsök, bágyadtság, nagyobbmáj, színtelen széklet) is jelentkeznek, a patológiás icterusgyakoribb okainak kizárására – infekció, szepszis, epeút-atresia, anyagcsere-betegség (galactosaemia, tyrosinaemia,karbamidciklus zavarai, glükóz-6-P-dehidrogenáz-defektusstb.) – kiegészítõ laboratóriumi vizsgálatok szükségesek. Ki-emelendõ a vércukorszint, az ammóniaszint, a májenzimek(GOT, GPT, ã-GT), a vérkép, az akut fázis fehérjék, aTORCH- és a hepatitis szerológia.
Vércukor, glükóz vizsgálataA hypoglykaemia (szérum-glükózszint <2 mmol/l) gya-
kori oka újszülöttkorban: anyai diabetes, galactosaemia, ami-nosav, szervessav-anyagcserezavarok, hormonhiányok (con-genitalis glukagonhiány, congenitalis adrenális hyperplasia),Gierke-kór (glukagontárolási betegség). Alapvetõ a vizeletketontestek vizsgálata is! Pozitív vizelet ketontesteknél ki-egészítõ teszt a kortizolszint, a TSH-analízis és az aminosav-vizsgálat. Ha a vizeletben nincs ketontest, hyperinsulinaemiagyanúja merül fel – szükséges az anyában és a csecsemõbenaz inzulinszint mérése.
Hyperglykaemia és a diabeteses ketoacidosis esetén agyakori vércukorszint-ellenõrzés mellett nélkülözhetetlen avér-pH, a szérumelektrolitok és ha lehet, az ozmolalitás méré-se az intenzív kezelés folyamán.
A szérum-elektrolitok és sav-bázis háztartás vizsgálataErrõl külön elõadás szól.
Vér-ammóniaszint méréseAz ammóniaszint az endogén és exogén májkóma (hepa-
titis, mérgezések, daganatok) igen jó indikátora. 100–150µmol/l koncentráció felett súlyos idegrendszeri tünetek lép-nek fel: görcsrohamok, aluszékonyság, eszméletvesztés. Afulmináns májelégtelenség és a hepatikus encefalopathia ke-zelésének monitorozásához elengedhetetlen a vér ammónia-koncentrációjának ismételt mérése. Hatféle anyagcserezavarismert az urea-cikluson belül. A definitív diagnózist gyakranaz enzimvizsgálat adja meg májbiopsiás mintából. Néhányszervessav-anyagcserebetegség jelentõs ammóniaszint-emel-
kedéssel jár (200–500 µmol/l). Ilyen esetekben a sav-bázisstátus és a vizelet-szervessavanalízis kiemelt fontosságú.
Örökletes anyagcsere-betegségek gyanúja esetén elsõdle-ges laboratóriumi vizsgálatok
A klinikai tüneteket a vérben, a sejtekben, a szövetekben,a szervekben felhalmozódó anyagok (ammónia, fenilalanin,galaktóz stb.), sokszor a vizelettel ürülõ szubsztrátok (muko-poliszacharidok, cisztein stb.), máskor a végtermék hiánya(tiroxin, tirozin stb.) okozzák. Energiahiány, szintézis-,transzport- és tárolási zavarok jelentkeznek különbözõ sú-lyossággal. Neurológiai tünetek (görcsrohamok, ataxia, kórosEEG), szervrendszerek (légzés, keringés, máj, vese) mûködé-sének zavara, jellegzetes testváladék, vizelet szag (aceton,jávorfaszörp, káposzta), sápadtság, aluszékonyság, hányás, aszem, vázrendszer, nemi szervek rendellenességei, bõrelvál-tozások figyelhetõk meg (2. táblázat).
Amikor a klinikai kép, családi anamnézis és elsõdlegeslaboratóriumi vizsgálatok felhívják a figyelmet anyagcse-re-betegség fennállására, a következõ, egymást megerõsítõ,vizsgálati stratégiát alkalmazzák:1. Az enzimblokk elõtt felszaporodott anyagok mérése,
vagy végtermékhiány elemzése.2. Enzimdiagnosztika biopsziás anyagokból.3. Génmutációk, DNS vizsgálatok.
Ezeket külön elõadások mutatják be.
Laboratóriumi vizsgálatok görcstevékenység, kómaesetén
Neurológiai tüneteket számos kórkép (központi idegrend-szeri betegségek, sérülés, belgyógyászati kórképek, gyógy-szerek) okozhat. Az akut ügyeleti ellátás kapcsán sokszor alaboratóriumi vizsgálat alapján lehet a tudatzavar, az eszmé-letvesztés kiváltó okát azonosítani a 3. táblázatban jelölt sé-ma szerint.
Alapvizsgálatok gyermekkori mérgezések eseténKisdedkorban gyógyszerek, tisztítószerek, rovaritró sze-
rek, mérgezõ növények, festékek, késõbbi életkorban kábító-szerek és/vagy alkohol okozhat mérgezést. Az 1‰ alkohol-szint 21 mmol/l etilalkohol koncentrációnak felel meg, ez �21mOsmol/kg-nyi ozmolalitásemelkedést okoz a vérplazmá-ban. Speciális, enzimatikus mérési elven alapuló laboratóriu-mi teszt is rendelkezésre áll a véralkoholszint vizsgálatára.Sürgõs, általános laboratóriumi feladatok mérgezése esetén:
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
252
2. táblázat
Legfontosabb eltérések örökletes anyagcsere-betegségek esetén
ELSÕDLEGES LABORATÓRIUMI LELET LEHETSÉGES KÓRKÉP
Alacsony szérum-glükózszint Szénhidrát-anyagcsere zavarai, galactosaemia, fruktózintolarencia,glycogenosisok, piruvátanyagcsere-defektusok, thyrosinaemia,karnitinhiány
Metabolikus acidosis Aminoaciduriák, organikus aciduriák
Emelkedett szérum-bilirubinszint és magas GOT-, GPT-értékek Karbamid-ciklus zavarai, glycogenosisok, fruktózintolarencia, galactosaemia
Magas vér ammóniaszint Karbamidciklus zavarai, karboxilázdefektusok, karnitindefektus,hyperlysinaemia
Thrombocytopenia, anaemia Organikus aciduria, thyrosinaemia, metilmalonsav-acidaemia
Redukáló összetevõk a vizeletben, ketonuria Oligoszacharidák lebontási zavara, aminoaciduria, nonketotikushyperglycinaemia
Alacsony szérum-nátriumionkoncentráció Congenitalis adrenal hyperplasia
vérgázanalízis, vérkép és methemoglobinszint, vércukor, szé-rum ionok, ozmolalitás, pszeudokolinészteráz aktivitás, máj-és vesefunkció vizsgálata, valamint drug gyorsteszt. A késõb-
bi igazságügyi toxikológiai vizsgálatokhoz szakszerû minta-tárolás szükséges.
Mintavételi technikák; preanalitikai megfontolások gyermekkorban
Sampling techniques in pediatrics; preanalytical issues
Dr. Vásárhelyi BarnaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet
Kulcsszavak: vérvétel, fiziológiai változás, preanalitika, kapilláris vérmintaKey-words: blood sampling, physiological change, preanalytics, capillary blood sample
Az Egyesült Államokban becslések szerint az egészség-ügyi ellátás hibájából évente 50–100 ezer haláleset követke-zik be: ez a nyolcadik leggyakoribb halálok. Több az áldoza-ta, mint a közúti vagy egyéb baleseteknek összesen. Az esetekjelentõs hányadában ennek hátterében diagnosztikus hibákállnak. A diagnózis felállítása érdekében végzett vizsgálatok70%-a laboratóriumi teszt. A hibás eredmény gyakorisága alaboratóriumi vizsgálatokon belül 1,5 – 3 ezrelék. A hibák túl-nyomó többsége (egyes felmérések szerint 84%-a) a preana-litikai szakban következik be.
A preanalitikai hibákért számos tényezõ a felelõs, melyekjelentõs hányada újszülötteknél/gyermekeknél még kifejezet-tebben van jelen. (Erre vonatkozóan felmérés nem történt, devalószínûleg nagyobb arányban kell számolni velük, mint fel-nõtteknél).
Vérminták esetében az eredményt befolyásoló pre-analitikai tényezõk közül a legfontosabbak:
1. Vizsgált személyek esetében fennálló fiziológiai különb-ségek / változó körülmények.� Számos paraméter egészséges referenciaértéke életkortól
függ.� Nem (elsõsorban a hormonszintek, illetve a nemi hormo-
nok által szabályozott paraméterek).� Vérvételt megelõzõ fizikai aktivitás. Anyagcsere fokozott.
Erõteljes fizikai aktivitás esetén szérum káliumszint,CK-érték emelkedik. (Ha a gyermek általános állapotanem rossz, ezzel fokozottan kell számolni.) Húgysavszintje jõ. Katekolamin glükagon kortizol növekedési-hormon-szintek emelkednek, inzuliné csökken.
� Testhelyzet. Ülõ testhelyzetû betegnél a legtöbb nagy mo-lekula és a sejtes komponensek szintje nõ; gyógyszerek,
hormonok kötött frakciója is emelkedik. Szabad gyógy-szerszintek nem változnak. Csökkent plazmavolumenesetében kifejezetten nagy a hatás (újszülöttek, gyerme-kek esetében a vízterek gyors változása, dehidráció miattszámolni kell vele).
� Napszak. Kortizol nappali ingadozása miatt akut fázis fe-hérjék egy része (proinflammatorikus citokinszintek)fluktuálnak. (A napszaki ritmus kora- és újszülöttek ese-tében még nem alakul ki.) Napszaki ritmust mutatnakmég: csontmarkerek, kálium, vas, TSH, növekedési hor-mon szintek.
� Korábbi étkezés idõpontja. Testtömegtõl függõ hatás;gyermekeknél nem várható el, hogy éhomra menjenekvérvételre; lehetõleg zsírmentes, nem cukros folyadékotigyanak. Szoptatott csecsemõt próbáljanak teáztatni,egyébként ilyenkor különösen gyakori a lipaemiás savó.
� Stressz. Hormonszintek, fehérvérsejtszám átmeneti emel-kedése (kisgyermeknél különösen fontos)
� Láz. Kortizolszint emelkedése, diurnális változás meg-szûnhet. Átmeneti hypoglykaemia.
2. Vérvételt érintõ problémák.A preanalitikai hibák döntõ hányadáért ez a felelõs.Kórházban bentfekvõ betegek esetében akár tízszer na-
gyobb a vérvételt érintõ preanalitikai hiba gyakorisága ajáróbetegekhez képest; ennek oka, hogy járóbetegektõl általá-ban gyakorlottabb asszisztens veszi le a mintát.
Leggyakoribb hibák:� Hosszú ideig tartó érleszorítás. Egy percnél hosszabb ide-
ig tartó érleszorítás esetén nagymolekulák szintje nõ; ko-leszterin-, kálium-, laktát-, ionizált kalcium- és magnézi-umszintek emelkednek, piruvát szintje csökken. (Gyer-mekek esetében vérvételi nehézségek gyakoribbak a ko-
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
253
3. táblázat
A kóma fõbb típusaiban végzendõ sürgõségi laboratóriumi vizsgálatok
LEHETSÉGES KÓRKÉPEK LABORATÓRIUMI VIZSGÁLATOK
Fokális neurológiai tünetekkelnem járó kóma
Metabolikus encephalopathia, diabeteses kóma,máj- vagy veseelégtelenség, mérgezés (gyógyszer,kábítószer, alkohol), hypoxia (szívmegállás, fulladás)
Vércukorszint, szérumelektrolitok, ozmolalitás,sav-bázis elemzés, ammónia-, laktát-, kreatininszint.Amikor nem egyértelmû az ok, toxikológiai vizsgá-lat is szükséges
Meningitis szindróma Központi idegrendszeri fertõzés CSF vizsgálata, vérkép és akut fázis fehérjék elemzé-se
Focalis tünetekkel járó kórképek Trauma, stroke, epilepsia Általában nincs specifikus laboratóriumi eltérés
operáció hiánya és az anatómiai sajátosságok miatt.)Hemolízis is gyakoribb!
� Infúzióhoz közeli (ill. attól proximalisan) vett vérminták.� Nem megfelelõ arányban tartalmazza az antikoagulánst a
minta (vérvételi nehézségek esetén gyakoribb a vér-rög-képzõdés).
� Túlságosan erõsen rázzák össze a mintát az adalékanyag-gal; centrifugálási problémák (kis mennyiségeknél külö-nösen nagy a hatás).
� Hemolizált vérminta. (Probléma: sokszor nincs makrosz-kópos hemolízis).
� Interferencia léphet fel az adalékanyag és egyes tesztekesetében (amennyiben nincs elég vérminta és pl. plazmá-ból szeretnének mérni egyébként szérumból mért ana-litot).
� Nem a megfelelõ sorrendben történik a vérvétel (vénásvérminta esetén: vér hemokultúra csövek (ha van anaerobpalack is, akkor abba vegyünk elõbb); natív csõ ; citrátoscsõ véralvadás vizsgálatához; heparin; EDTA; egyéb ada-lékanyagot tartalmazó csövek). (A hemokultúra vételénélnagyon kell figyelni a megfelelõ és megfelelõ ideig tartóbõrfertõtlenítésre.)
3. BetegazonosításA betegazonosítás elmaradása a felelõs a preanalitikai hi-
bák 10–15%-áért.� A beteget / hozzátartozót mindig azonosítani kell. Egyes
helyeken ennek a tényét is dokumentálják. Gyermekek,újszülöttek esetében hozzátartozót kell megkérdezni.
� Csöveket jelölni kell; a mikrocsövek / kapillárisok jelölé-se gondot okozhat.
Kora- és újszülöttek esetében külön problémát jelent,hogy a keringõ vérmennyiség kicsi (80 ml/ttkg); emiattmikromódszereket kell alkalmazni a laboratóriumi vizsgála-tok során, illetve, hogy a vénás vérvételre nincs mindig lehe-tõség. Ezekben az esetekben kapilláris vérminta vételére ke-rülhet sor, amit sokszor POCT kapcsán elemeznek. (Fontos:bizonyos analitok, pl. glükóz szintje magasabb; kálium,összfehérje, kalcium szintje alacsonyabb a kapilláris vérben).Kapilláris vérvétel
Két típusa: szúrás és metszés. Utóbbira zárt vérvételirendszereket fejlesztettek ki. Metszés elõnyei: fájdalom a szú-ráshoz képest kisebb, gyorsabban nagyobb mennyiségû vérnyerhetõ, nincs hemolízis. Hátránya a nagyobb invazivitás.
Kapilláris vérvételnél fontos figyelembe venni:1. Csecsemõ / kisgyermek megnyugtatása. A vérvételt meg-
elõzõen glükóz / szacharóz oldat itatása vagy a szoptatásnyugtató hatású. A kisgyermek lehetõleg a szülõ ölébenlegyen (ha a szülõ is ezt kívánja és alkalmas rá).
2. A kapilláris vérvétel helye csecsemõknél a talp oldala(NEM az ujj vagy a sarok oldala). 1 éves kor felett a kö-zépsõ vagy a gyûrûs ujj (kerülendõ: a hüvelyk, a mutatóés a kisujj!). Véraláfutásos, ödémás területet kerülni kell.Újszülöttnél a vérvétel során nem szabad az eszközt erõ-sen a bõrre nyomni, mivel súlyos sérülést okozhat (véko-nyak a szövetek).
3. A terület maximum melegítése (különösen magas he-matokritértékek esetén hasznos); 38 �C-os vízzel néhánypercig. Területet izopropil-alkohollal kell fertõtleníteni;az alkohol károsíthatja csecsemõknél a bõrt. Ha a vérvételelõtt nem szárad fel a fertõtlenítõszer, csípõ érzés léphetfel, illetve hemolizálhat a minta.
4. A vérminta vétele során nem szabad masszírozni a szöve-teket, mivel szövetközti folyadék kerülhet a mintába(hemolízis léphet fel).
5. A vérvételhez használt testrész a szív szintje alatt legyen,gyorsabban jön le a vér.
6. Kapilláris vérminta esetén a vérvétel sorrendje: EDTA-ttartalmazó csövek; egyéb adalékanyagot tartalmazó csö-vek; szérumvizsgálatok. Többnyire 10%-os eltérés a csö-vön jelzett értékhez képest elfogadható. Alvadásgátoltminták esetében a levett vérmintát 5–10-szer át kell for-gatni. Ha bealvadt, ismételni kell az eljárást.
7. A beteg jelenlétében kell jelölni a csöveket (elõre felcím-kézés kerülendõ).
8. Laboratóriumba transzport vagy POCT mérés.9. A mintaszállítás körülményei és idõtartama nagyon fon-
tos.
Preanalitikai hibák megelõzése érdekében javasolt: vér-vételi körülmények standardizálása, eltérések dokumentálá-sa, a vérvételt végzõ (többnyire nem laboratóriumi) személy-zet képzése és a munkafolyamat ellenõrzése.
Hormonvizsgálatok eredményeinek értékelése a csecsemõ- és gyermekkorban
Interpreting hormone results in infancy and childhood
Dr. Halász ZitaSemmelweis Egyetem, I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika
Kulcsszavak: hormon, referencia tartomány, szekvenciális mintavételKey-words: hormone, reference range, sequential hormone measurement
A hormonális diszfunkciók diagnosztizálásának fontoseszköze a szervezet pillanatnyi állapotát tükrözõ hormonvizs-gálatok elvégzése. A napjainkban alkalmazott módszerek ér-zékenysége nagy, 10 6–1018 mol/l.
Legfontosabb módszerek:� fehérjekötésen alapuló eljárások
� kromatográfiás módszerek� tömegspektrometriás módszerek� molekuláris biológiai módszerek.
A hormonmeghatározások kivitelezésénél fontos a meg-felelõ mintavételi körülmények biztosítása, mivel ezek befo-
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
254
lyásolhatják az eredményt. Általánosan éhomi mintavétel ja-vasolt.
Az alimentáris állapot ismerete különösen fontos pl. azinzulin, C peptid, GH (növekedési hormon) szintek értékelé-sénél. A folyadék- és sóbevitelt az aldoszteron, PRA (plazma-reninaktivitás), renin, ACTH (adrenokortikotrop hormon)eredmények értékelésénél kell figyelembe venni.
A laboratóriumi vizsgálati eredményeket a mintavételkorfennálló stresszreakció jelentõsen befolyásolja. Törekednikell a fizikai és pszichés stressz hatás lehetõség szerinti mér-séklésére, különösen ACTH-, TSH- (thyreoideastimulálóhormon), kortizol-, prolaktin-, aldoszteron-, vazopresszin-meghatározások során. Sok esetben ismételni kell a mérése-ket a megfelelõ információ érdekében.
A hormonszintek meghatározásra leggyakrabban szé-rumból vagy plazmából kerül sor. Az újszülöttkori kötelezõszûrõvizsgálat kapcsán a mintavétel speciális szûrõpapírratörténik. A szûrõpapír alkalmas egyes hormonok napszakiprofil vizsgálatára is (17OH-progeszteron).
A kortizol szabad frakciójának meghatározása 24 órásgyûjtött vizeletbõl a hypercortisolismus elfogadott szûrõ-módszerévé vált (vizeletvizsgálat esetén fontos a megfelelõenhidrált állapot biztosítása és az ürített kreatininre történõ kor-rigálás). Az éjszakai nyálmintából meghatározott kortizol-szint a Cushing-szindróma diagnosztikájának könnyû minta-vételt biztosító és hasznos módszere. A vizsgálatokat azintraindividuális változások miatt minden esetben ismételtmintából is el kell végezni!
A klinikai tünetek hátterében álló hormonális diszfunkcióvizsgálata kapcsán értékelhetõ információt a szabad hormon-szintek meghatározása biztosíthatna. A pajzsmirigyfunkciótnapjainkban általánosan a TSH, szüksége esetén a szabad tri-és tetrajódthyronin értékek alapján ítéljük meg. (A TSH-szintmérését használjuk a hypothyreosis szûrésére is). A fehérje-kötésen alapuló metodikák esetén számolni kell azzal, hogy ameghatározás nem feltétlenül a biológiailag aktív, a klinikaitünetekkel arányos hormontermelést tükrözi, hanem arra ahormontermelésre utal, ami reakcióba lép az immunanaliti-kán alapuló teszttel (pl. LH, prolaktin), Ugyancsak ellent-mondást eredményez az úgynevezett „high-dose-hook” ef-fektus. A mért szérumban annak ellenére, hogy a vizsgált hor-mon szintje nagyon emelkedett, az eredmény normális vagycsökkent hormonszintre utal. A jelenség oka, hogy a mintá-ban jelen lévõ nagy mennyiségû antigén nemcsak az elsõ, ha-nem a második, a jelet adó antitestet is telíti. A jelenség ese-tenként magyarázatot adhat a klinikai tünetek és a laboratóri-umi eredmény közötti ellentmondásra. Hígított mintából is-mételten végzett vizsgálattal a jelenség igazolható.
Csecsemõ és gyermekkorban a hormonvizsgálatok ered-ményeinek értékelésénél elsõként kell említeni az életkor ésnem szerinti referenciaértékek használatát. A referenciaérté-kek metodikától is függenek. Vigyázni kell arra, hogy a mód-szerek metodika leírása kapcsán megadott referenciaértékeksok esetben igen kis esetszámra vonatkoznak csak (pl. újszü-löttkori, csecsemõkori normáltartomány megadásánál).
A megszületést követõ napokban jelentõs változás figyel-hetõ meg szinte valamennyi trophormon és perifériás hormonszekréciója vonatkozásában. Külön körültekintést igényel akoraszülöttek és a gesztációs korukhoz képest kis súllyal éshosszal született gyermekek vizsgálati eredményeinek érté-kelése. Ezekben az esetekben gyakran észlelhetjük a megszü-letést követõ élettani hormonális változás idõbeli eltolódásátés a hormonszekréció változását. Jelentõs az endokrin rend-szer funkciójának változása a pubertás során. Egyes vizsgálati
eredmények értékelésénél a Tanner-stádiumok figyelembe-vétele is szükséges.
Az endokrin funkciók megítélése céljából a bazális hor-monszintek nem mindig biztosítanak megfelelõ információt.Jellemzõ példa a növekedési hormonszekréció megítélése.Egyszeri mintavételbõl történõ GH-szint-meghatározás nemalkalmas a GH-hiány diagnózisának felállítására vagy kizárá-sára. Ezekben az esetekben dinamikus tesztek elvégzése so-rán, úgynevezett szekvenciális minták eredményei alapjánkapunk képet az endokrin rendszer funkciós kapacitásáról.Legjellemzõbb példa a növekedési hormon termelõdés meg-ítélése céljából végzett stimulációs próbák, például arginin-teszt, l-DOPA-teszt, inzulin hypoglykaemiás teszt, a hypo-thalamo-hypophysis-gonad tengely aktiválódását jelzõGnRH-próba, a mellékvesekéreg szekréciós kapacitását iga-zoló ACTH-teszt. A 12–24 órán át megfelelõ idõközökkel (pl.GH esetében 20 percenként) vett mintavétel és hormon meg-határozás alkalmas a szekréció pontosabb megítélésére, azon-ban a technikai nehézség és a módszer költségessége miatt in-kább elméleti jelentõségû. Szuppressziós próbák elvégzésérea gyermekendokrinológiában ritkábban kerül sor (hypercor-tisolismus esetén dexamethason szuppressziós próba).
A hormoneredmények értékelése a beteg állapotának fé-nyében történhet. A kritikus állapotban lévõ beteg esetébenkülön körültekintésre van szükség. Ilyenkor az endokrin rend-szert érintõ változások a releasing hormonok és a perifériaszintjén is megnyilvánulnak. Megváltozik a releasing éstrophormon-szekréció jellege (így a pulzatilitás, diurnalis rit-mus) és mértéke is. Módosul a perifériás hormontermelésmértéke, a kötött és szabad frakciók aránya, a receptorszám, ahormon-receptor kötés és hormon metabolizmus is. A kritikusállapot két fázisában, az akut és krónikus fázisban a hormoná-lis változások különböznek. Az akut fázisra elsõsorban a re-guláció, adaptáció jellemzõ (így a stresszhormonok fokozotttermelése, a GH-, az ACTH-, a kortizol- és a prolaktinszintemelkedése, relatív GH-rezisztencia, emelkedett TSH-,fT4-szint). A krónikus fázis diszregulációs mechanizmusnaktekinthetõ, melyet a stresszhormon csökkent termelése jelle-mez (csökkent GH-, ACTH-, kortizol-, prolaktinszint, a GH-rezisztencia megszûnése, alacsony szérum TSH-, fT4-szint).Az intenzív ellátás kapcsán alkalmazott gyógyszerek az en-dokrin rendszer vizsgálatát jelentõsen korlátozhatják. Általá-nos szempontnak kell tekinteni, hogy az intenzív ellátástigénylõ állapotokban elvégzett hormonvizsgálatok a pillanat-nyi helyzetet jellemzik, definitív diagnózis felállítására nemalkalmasak. A vizsgálatok ismételt elvégzése egyensúlyi álla-potban feltétlenül szükséges!
A szervezet hormonháztartásának vizsgálata kapcsán fi-gyelembe kell venni a hormonok, neuropeptidek, neuro-transzmitterek élettani változásait. Pulzatilis jellegû termelõ-dés jellemzi az LH- (pubertás stádiumától függõen), a pro-laktin-, GH-szekréciót. A kortizol-, ACTH-, csontanyagcse-re-markerek, 17OH-progeszteron-szint meghatározásánál adiurnális ritmust kell figyelembe venni.
Az alvás és az ébrenléti állapot a prolaktin-, GH-szekré-ciót módosítja. Aldoszteron-, PRA-, renin-, normetanefrin-meghatározás értékelésénél a testhelyzet ismerete fontos, akülönbözõ testhelyzetekben végzett mintavételi eredményeka rendszer mûködésére vonatkozóan további ismerete nyújta-nak. Ismeretes a prolaktin, DHEA-S, tesztoszteron termelõ-dés szezonális változása is, bár ennek mértéke az eredménye-ket általában klinikailag releváns mértékben nem befolyásol-ják.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
255
A hormonháztartás megítélése, az endokrin rendszervizsgálata kapcsán nyert laboratóriumi eredmények értékelé-se fokozott körültekintést és mérlegelést kíván a klinikus ré-szérõl. Az eredményt közlõ leleteken megadott értékelés csaktájékoztató jellegû és erre a tényre a szülõ figyelmét is fontosfelhívni. A téves diagnózisok elkerülése érdekében elenged-
hetetlenül fontos a beteg alapos vizsgálata, valamennyi klini-kai körülmény (társbetegségek, gyógyszerelés, képalkotóvizsgálatok stb.) figyelembe vétele, és nem utolsó sorban abeteg kezelését végzõ orvos és a laboratóriumi meghatározás-sal foglalkozó szakemberek szoros együttmûködése.
Ágymelletti laboratóriumi vizsgálatok (POCT) a neonatológiai osztályokon
POCT in neonatal intesive care
Dr. Szabó MiklósSemmelweis Egyetem, I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika
Kulcsszavak: POCT, koraszülött, preanalitikai hibaKey-words: POCT, preterm infant, preanalytical errors
A magyarországi gyermekgyógyászati gyakorlatban tra-díciója van a POCT-vizsgálatoknak.
A gyermekosztályokon korábban jellemzõen elterjedtvolt az ún. „kislabor”, amelyben a klinikus gyermekgyógyászsaját kezûleg végzett kvalitatív vérkép, vizelet üledék vagyliquor vizsgálatot. A neonatológiai intenzív ellátás az a klini-kai szakterület, ahol talán a legerõsebb motiváció jelenik megaz ágy melletti laboratóriumi „POCT”-vizsgálatok iránt. Aklinikai probléma – diagnózis – laboratóriumi vizsgálat –vizsgálati eredmény – terápiás döntéshozatal folyamat lerövi-dítésén túl a neonatológiában különös hangsúly esik a vizsgá-latokhoz szükséges vérminta minimalizálására, amely igényta mikrometodikát alkalmazó POCT-rendszerek többsége ál-talában jó közelítéssel teljesítik. A mintamennyiség redukció-ja azért is különösen fontos, mert szoros egyenes arányosságáll fenn egy kis súlyú koraszülött transzfúziós igénye és a la-boratóriumi vizsgálatok céljára levett vérmennyiség között.Jelenleg a POCT-vizsgálatok iránti lelkesedés annak ellenérenövekvõben van a neonatológiai intenzív osztályokon (NIC),hogy a betegellátó személyzetnek újabb és újabb vizsgálómûszerek használatát kell begyakorolnia. Ugyanakkor a vizs-gálatok ellenõrzöttsége, az eredmények validálása, dokumen-tációja továbbra sem megoldott.
A neonatológiai osztályokon leggyakoribb vérvizsgálat-ok a vércukorszint-, a szérum- (vér-) bilirubin-, vérgázok, vi-tális ionok, laktát-, Htk- vagy Hgb-meghatározás. Egyesneonatológiai osztályokon ma már elérhetõ egyes gyulladá-sos fehérjék POCT-rendszerben történõ kimutatása, mint aCRP, IL6 vagy prokalcitonin.
A vércukorszint kóros ingadozása az egyik legjelentõ-sebb neonatológiai morbiditási tényezõ, amely maradandóidegrendszeri károsodást okozhat. A vércukorszint gyakori ésprecíz meghatározása ezért elengedhetetlen a neonatológiaiosztályokon. A neonatológiában a vércukorszint meghatáro-zását nehezíti, hogy változékony, olykor nagyon magas ahematokrit értéke és a normoglykaemia határai szûkek, azalacsony vércukortartományban történõ mérés pontosságairánti igény magas. A különbözõ gyártmányú POCT-esz-közök változékonyan teljesítenek a NIC kívánalmak közepet-
te. A napi rutin vizsgálatokra való alkalmazás bevezetéseelõtt a referencialaborban mért értékekkel történõ egybevetés„bevizsgálás”, a limitációk feltárása feltétlenül szükséges.
Az összbilirubin-meghatározás a vércukorszintméréshezképest valamivel ritkábban, kisebb sürgõsséggel és kisebb vi-tális jelentõséggel történik NIC-osztályokon, ugyanakkoregészséges újszülöttek körében nagy számban van szükség avizsgálatra. Egyre gyakoribb a vérgáz analizátorokba integ-rált bilirubin meghatározási opció. A biliribun POCT-eszkö-zök precizitása sok kívánni valót hagy maga után. A meghatá-rozást befolyásolja az épen alkalmazott fototerápia. Éppenezért a komolyabb klinikai döntéseket (pl. vércserekezelés)kizárólag referencialaboratóriumban történt vizsgálatokra le-het csak alapozni.
A vérgázvizsgálatok tradicionálisan és kizárólag POCT-rendszerben történnek. A vérgázvizsgálatokkal kapcsolatbana preanalitikai hibák eliminálása rendszeres továbbképzésttesz szükségessé. Ezek kapillárisminta esetén a mintavétel ésa mintabehelyezés során a gázbuborék szennyezõdés, és avéralvadék kontamináció elkerülése. Artériás vagy vénásmintavétel esetén az infúziós vagy flush oldattal történõ keve-redés a leggyakoribb hiba.
Vérgáz-meghatározáshoz kapcsoltan leggyakrabban aNa-, K-, Ca-ionok szintjét mérik. Újszülöttek esetében a leg-gyakrabban elõforduló probléma a kifejezetten alacsony Na-és magas K-szintek mérése. A preanalitikai hibák szereperendkívül nagy, elsõsorban a kapillárisminták esetén. A jel-lemzõ preanalitikai probléma a rossz perifériás keringés, avégtag, elõmelegítésének elmaradása, préselése a mintavételsorán.
Az elmúlt évtizedben a POCT-meghatározások bõvülõlehetõsége miatt a laboratóriumi vizsgálatok száma és a költ-ségek folyamatosan nõtt a közelmúltig. Mivel azonban egyreszélesebb körben ismerik fel, hogy a (diagnosztikus célú vér-vétel miatt bekövetkezõ) vérveszteség, a mintavétellel járóstressz, valamint a nozokomiális fertõzés kockázat csökken-tése rendkívül fontos, napjainkban törekednek arra, hogy aPOCT-vizsgálatokat racionálisan és megfelelõ indikációalapján végezzék.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
256
Anyagcsere-betegségek szûrése és diagnosztikája
Screening and diagnostics of metabolic diseases
Dr. Takáts ZoltánSemmelweis Egyetem, I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika
Kulcsszavak: .................................Key-words: inborn errors of metabolism, population screening, mass spectrometry, targeted diagnostics
A tandem tömegspektrometriát az anyagcsere-betegsé-gek diagnosztikájában mintegy 20 éve alkalmazzák, aminosa-vak és acilkarnitinek kimutatására szárított vércsepp (DBS)mintából. A módszer technikai elõnyei, a jó automatizálható-ság, illetve, hogy a vérben elõforduló különbözõ metabolitokegyidejû detektálásra ad lehetõséget, miáltal az anyagcsere-rendellenességek párhuzamosan, egyszerûen és gyorsan ki-mutathatók. A technológia a megjelenése forradalmasította aszûrési eljárást, megnõtt a diagnosztizálható betegségek szá-ma (mintegy 30–40 betegség kimutatható a módszerrel). Vi-lágszerte létesültek szûrést végzõ laborok és számos újszülöttéletét menti meg az újszülött kori anyagcsere-betegségek szû-rése.
Az újszülöttkori anyagcsere-betegségek vizsgálata sorántöbb tömegspektrometriásan vizsgálható vegyületcsoportotkülöníthetünk el: acilkarnitineket, aminosavakat, szénhidrá-tokat, szerves savakat, zsírsavakat, szteroidokat.
Az elsõ két csoport vegyületeinek rutinszerû analízisébenma a tandem tömegspektrometriát alkalmazzák. Az acil-karnitinek és aminosavak kimutatása DBS mintából történik.A mintaelõkészítés elsõ lépése a szárított vércsepp extrak-ciója, melyhez szerves oldószert alkalmaznak, elkerülve így afehérjék és sók beoldódását a vizsgálandó mintába, melyekzavarnák a tömegspektrometriás mérési folyamatot. A szer-ves oldószer tartalmazza a stabil izotópjelzett acilkarnitin, il-letve aminosav vegyületeket, melyek belsõ standardként szol-gálnak a vizsgálandó metabolitok kvantitatív meghatározás-hoz. A szerves extraktumhoz ezután származékképzõ rea-genst adnak, sósavas butanolt, melynek segítségével a vegyü-letekbõl butil-észter-származékokat képeznek. A származék-képzés szerepe a tömegspektrometriás kimutatás érzékenysé-gének és specifikusságának növelése. A mintaelõkészítésutolsó lépése az oldószercsere, melynek során a vizsgálandómintát olyan oldószerben veszik fel, amely megfelelõ azelektrospray ionizáció megvalósításához.
A tömegspektrometriás analízis a legtöbb szûrést végzõlaboratóriumban úgynevezett triple quadrupol típusú tömeg-spektrométerrel valósul meg. Ebben a készüléktípusban amintát alkotó összes metabolit egyidejû fragmentációja(collision induced dissociation – CID) és a molekulaspe-cifikus fragmensek detektálása ideálisan megvalósítható. Astabil izotópjelzett belsõ standard vegyületek segítségével pe-dig a metabolitok lényegében szemikvantitatív meghatározá-sa történik. A mért koncentráció érték segítségével egy meg-bízható, de elõzetes diagnózis felállítására nyílik lehetõség.Amennyiben egy minta pozitív eredményt ad a tandem szûréssorán, további vizsgálatok szükségesek a végsõ diagnózishoz.
Az aminosavak meghatározása tandem tömegspektro-metriásan úgynevezett neutral loss detektálási technikávaltörténik, melynek során az alfa-aminosavak fragmentációja-kor keletkezõ 102 molekulatömegû semleges butil-formiátvesztés intenzitását mérik. A cisztein és homocisztein kivéte-
lével az összes aminosav meghatározása megvalósítható ez-zel az eljárással. Azoknak a betegségeknek a jelentõs részé-ben, melyeket a cisztein, illetve homocisztein koncentrációjá-nak rendellenes értéke jellemez, egyéb, ilyen módon mérhetõvegyület szintje is megváltozik. Például a jávorfaszörp-beteg-ség vagy a homocystinuria kimutatható a metionin megnöve-kedett koncentráció értékének segítségével is.
Az acilkarnitinek meghatározása párhuzamosan, ugyan-abból a mintából történik, mint az aminosavaké, azonban elté-rõ detektálási technikával. Az acilkarnitinek esetén az úgyne-vezett prekurzor-ion scan technikát alkalmazzák, mivel afragmentáció során az összes kölönbözõ oldalláncot tartalma-zó acilkarnitin ugyanazt az egyszeresen töltött, 85 molekula-tömegû iont adja.
Tandem tömegspektrometriás vizsgálattal történik aszukcinilaceton nevû vegyület meghatározása is (laboratóri-umtól függõen minden mintából vagy csak a pozitív minták-ból, másodlagos tesztként). Ennek a metabolitnak I-es típusúthyrosinaemia esetén nõ meg a koncentrációja a vérben. Agalaktóz-1-foszfát és a konjugált epesavak meghatározásáhozis különbözõ ESI-MS/MS módszereket alkalmaznak, melye-ket másodlagos (second-tier) tesztként végeznek a laboratóri-umokban.
A szerves savak anyagcseréjének a zavarát vagy más né-ven organikus acidaemiákat mitokondriális enzimek defektu-sai okozzák, melyek az elágazó láncú aminosavak (leucin,izoleucin, valin) katabolizmusáért és mitokondriális zsírsa-vak oxidációjáért felelõsek. Az organikus acidaemiák közétöbb mint 20 betegség tartozik, melyek esetében különbözõtípusú acil-koenzimA-észterek halmozódnak fel a mitokond-riumban. Ezekben a rendellenességekben kulcsszerepet ját-szik az L-karnitin, amely lebontja a toxikus hatású acil-koen-zim-A-észtereket, így acil-karnitin-észterek képzõdnek, fel-szabadul a koenzim-A és visszaáll a mitokondriális homeo-sztázis. Ez a folyamat tehát az acilkarnitinek keringésbelikoncentrációjának növekedését, illetve a vizeletbe történõ na-gyobb mennyiségû kiválasztódását és a karnitin másodlagoshiányát okozza. Tehát a szabad karnitin és a különbözõ acil-karnitinek koncentrációjának meghatározása akár plazmából,szárított vércsepp mintából vagy vizeletbõl, közvetettenugyan, de specifikus és hatékony módszer az organikus acid-aemiák kimutatására.
A rutin szûrõvizsgálat vagyis a tandem tömegspektro-metria mellett fontos szerepet töltenek be a kromatográfiávalkapcsolt tömegspektrometriás módszerek is az anyagcserebetegségek diagnosztikájában: a gázkromatográfia-tömeg-spektrometria (GC-MS, illetve GC-MS/MS) és a nagy haté-konyságú folyadékkromatográfia tömegspektrometria(HPLC-MS, illetve HPLC-MS/MS). Rendkívül összetett ésviszonylag kis tömegû molekulákat tartalmazó minták esetén,mint amilyen például egy vérminta is, a mai napig a GC-MSmódszer az ideális analitikai eszköz. A szerves sav, zsírsav és
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
257
szteroidprofil meghatározása vizelet-, szérum- vagy liquor-mintákból GC-MS módszerrel történik a szûrõlaborokban.Ezt a vizsgálatot azonban csak akkor végzik el, ha a tandemszûrés eredménye valamilyen rendellenességre utal. A mód-szer hátránya ugyanis, hogy a megfelelõ szelektivitás, szepa-ráció érdekében egy minta analízise nagyjából 30 percig tart,ellentétben a tandem vizsgálattal, amely 1–2 percet veszigénybe. Ráadásul a mintaelõkészítés során szintén szükségesszármazékképzés (általában trialkilszililezés) alkalmazása,hogy a vizsgálandó vegyületek illékonysága megfelelõ le-gyen az analízishez. A módszer alkalmazásával azonban többmint 200 metabolit párhuzamos, kvantitatív meghatározásáravan lehetõség.
A HPLC-MS és a HPLC-MS/MS technika alkalmazásiköre fokozatosan növekszik az anyagcsere-betegségek diag-nosztikájában, noha a módszer szelektivitása még mindignem tudta elérni a GC-MS által nyújtott szintet. Azonban a
technika alkalmazása az analízisidõ jelentõs csökkenését je-lenti a legtöbb esetben a GC-MS-hez képest, valamit lehetõ-séget nyújt kevésbé illékony vegyületek analízisére is. Atechnika alkalmazási területe ma tipikusan a pontos, megbíz-ható kvantitatív meghatározás, melyet másodlagos vizsgálat-ként végeznek el különbözõ vegyületekre, a pozitív mintákesetében. Ilyen típusú mérések az aminosav-kromatográfia,az acilkarnitin-kromatográfia, a cisztein és homociszteinmeghatározása szérum-, vizelet- vagy liquormintából, illetveaz enzim-assay módszerek. Ezek lényege, hogy a fehérjéhezkötõdni képes szubsztráttal való inkubálás után a szubsztrátvagy a termék visszamérése történik HPLC-MS módszerrel.Az anyagcsere-betegségek diagnosztikájában alkalmazottenzim-assay módszerek között szerepelnek például a külön-bözõ zsírsav oxidációs zavarokat okozó enzimek, a biotini-dáz, a gamma-glutamil-transzpeptidáz (GGT), valamintgalaktóz-1-foszfát-uridil-transzferáz vizsgálatai.
Tömegspektrometria a klinikai laboratóriumi diagnosztikában
Mass spectrometry in laboratory diagnostics
Dr. Takáts ZoltánSemmelweis Egyetem, I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika
Kulcsszavak: tömegspektrométer, kromatográfia, terápiás gyógyszerszint-monitorozás, szteroid hormonok, proteomikaKey-words: mass spectrometry, chromatography, therapeutic drug monitoring, steroid hormones, proteomics
A tömegspektrometria olyan analitikai módszer, mellyelionokat lehet elválasztása és detektálása valósítható meg m/z,azaz molekulatömeg/töltés alapján. Ehhez az eljáráshoz gáz-fázisú ionok létrehozására van szükség. Mivel a vizsgálandóanyagok leggyakrabban kondenzált formában fordulnak elõ,ezért a tömegspektrometriás analízis elsõ lépése a gázfázisúionok elõállítása. Ez a folyamat az úgynevezett ionizáció,mely tipikusan proton vagy elektron addíciójával vagy abszt-rakciójával valósul meg.
Kis molekulák esetében a z értéke általában 1, nagyobbmolekulák esetében többszörösen töltött ionok is elõfordul-nak. Az ionizáció során létrejött ionpopulációt a tömeganalí-zis során választjuk szét. A tömeganalízis célja, hogy a detek-tort egy idõpillanatban csak egy bizonyos m/z értékkel bíróion érje el. A tömegspektrumot ilyen módon általában idõfüggvényében vesszük fel, periodikusan. A periódus idõ azúgynevezett scan time. Sok ionizációs módszer esetében amolekulákból csak egyféle molekulaion keletkezik. Mivelszámos különbözõ vegyületnek lehet ugyanaz a molekulatö-mege, ezért a molekulaion detektálása nem elég szelektív.Ezen olyan módon lehet segíteni, hogy a molekulaiont semle-ges gázmolekulákkal történõ ütköztetés során fragmentáljuk(tandem tömegspektrometria). A fragmens ionok m/z értékeiés eloszlásuk szerkezeti információt hordoz, így egy adottmolekulaionból keletkezõ adott fragmens monitorálása mármegfelelõen szelektív detektálást biztosít. Ismeretlen mole-kulák esetén a tandem tömegspektrum felhasználható a mole-kula szerkezetének felderítésére is.
A tömegspektrometriát alapvetõen szerkezetkutatásra ésanalitikára használjuk. Az elsõ esetben egy ismeretlen szer-kezetû molekula szerkezetének a felderítése a feladat. Ehhezáltalában nem elégséges a tömegspektrometria használata,
hanem szükséges egyéb spektroszkópiai módszerek alkalma-zása is (NMR, IR). Fontos megjegyezni ennél az alkalmazás-nál, hogy az ionok pontos tömegébõl egyértelmûen lehet azösszegképletükre következtetni, így a nagy felbontású tömeg-spektrometria kiváltja az elemanalízist. A tömegspektromet-ria különösen alkalmas analitikai meghatározásokra, ugyanisa kapott jel arányos a készülékbe bevitt anyagmennyiséggel,valamint a módszer érzékenysége nagyságrendekkel megha-ladja egyéb spektroszkópiai módszerek érzékenységét. Bártömegspektrometriásan lényegében bármilyen molekulárisszerkezetû anyag vizsgálható, a készülék ionforrásába csakmegfelelõen elõkészített mintát tudunk beereszteni, így amintaelõkészítés az egyik legkritikusabb része a tömegspekt-rometrián alapuló analitikai sémáknak. A tömegspektromet-ria szempontjából elõkészítésnek számít minden folyamat azextrakciótól az oldószercserén át a kromatográfiás vagy elekt-roforetikus módszerekig.
A tömegspektrometriás módszereket az ionizáció típusaszerint oszthatjuk három nagy csoportra: a hagyományos(elektronütközéses ionizáció, illetve kémiai ionizáció), a de-szorpciós, illetve a spray ionizációs módszerekre. A hagyo-mányos módszerek esetében az elpárologtatás megelõzi az io-nizációt, azaz a módszerek csak gázfázisban levõ molekulákionizációjára alkalmasak. Ezek a módszerek ideálisak tehátgázkromatográfia-tömegspektrometria (GC-MS) csatolásesetében.
A GC-MS alkalmazási területe ma már viszonylag szûk, amódszer idõigényessége miatt fokozatosan átveszi a helyét aHPLC-MS technika. Néhány vegyületcsoport esetén azonbanmég ma is jellemzõ a GC-MS használata, például egyes szte-roidoknál, lipid jellegû komponenseknél. A doppinganalitikamáig is elterjedten alkalmazott eszköze.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
258
A deszorpciós ionizációs technikák lényege, hogy a vizs-gálandó molekulákat valamilyen analitikai nyaláb (lézer, ion,atom) segítségével kiszakítjuk a kondenzált felületrõl. A fo-lyamat során egy lépésben történik a molekulák ionizációja ésgázfázisba vitele. Így tehát elkerülhetõ a minták gáz- vagy fo-lyadékfázisba vitele, és ilyen módon a keresztszennyezõdésis, mivel a minták nem haladnak át ugyanazon a térrészen. Adeszorpciós technikák tehát kiválóan alkalmasak nagy sebes-ségû analitikai meghatározásokra, mivel a keresztszennyezõ-dés kiküszöbölése által megszûnik a várakozási idõ, míg azelõzõ minta kiürül a rendszerbõl.
A MALDI (mátrixszal segített lézer-deszorpciós ionizá-ció) a legelterjedtebben alkalmazott deszorpciós ionizációstechnika. A mintákat ebben az esetben elkeverjük az úgyne-vezett mátrix oldatával, és ezt a keveréket szárítjuk a felületre.A felületet ezután lézer-deszorpciós eljárással vizsgáljuk. Atechnika megvalósítható atmoszférikus nyomáson is és vá-kuumban is. Elõnyei közé tartozik a gyorsaság, automatizál-hatóság, valamint az, hogy az analízisnek nincs felsõ tömeg-határa. Hátránya, hogy egyszeresen töltött ionokat eredmé-nyez, amelyek nem adnak minden esetben megfelelõ MS/MSspektrumot. A módszert elsõsorban a bottom-up proteomiká-ban alkalmazzák, de intakt fehérjék vizsgálatában is egyre el-terjedtebben használt technika.
A spray ionizációs módszerek esetében a folyadék hal-mazállapotú mintában oldott analit-molekulákat ionizáljukegy lépésben. Két fõ formája van, az elektrospray (ESI) és azatmoszférikus nyomású kémiai ionizáció (APCI). Az elektro-spray alkalmas minden olyan speciesz ionizálására, amely ol-datfázisban legalábbis részlegesen ionokat képez. Tipikuspéldák az aminok pozitív ion módban és a karbonsavak nega-tív ion módban. Ionosan disszociáló csoportot nem tartalmazómolekulák is ionizálhatóak esetenként, amennyiben pl. stabilfémion komplexet képeznek. Ilyenek pl. a szénhidrátok alká-lifémion komplexei. Ionosan nem disszociáló vegyületeketAPCI ionizációval tudunk ionizálni, azonban ennek elõfelté-tele valamilyen szintû termikus stabilitás. APCI-ban az ami-doktól az aromás szénhidrogénekig sok különbözõ típusú mo-lekula ionizálható. Ezt a két módszert (ESI és APCI) alkal-mazzák HPLC-MS csatolásnál. A gyakran használt módsze-rek mellett számos kevésbé használt, egzotikus ionizációsmódszer is létezik.
A HPLC-MS módszert széles körben alkalmazzák a klini-kai kémiában, általában kis molekulák (MW<5 kDa) megha-tározására. A kimutatási módszerek kidolgozásában a minta-elõkészítés megtervezése fontos szerepet játszik. A mintaelõ-készítés célja tehát, hogy megszabaduljunk azoktól a kompo-nensektõl, amelyek zavarják az analitikai meghatározást, il-letve hogy az analitmolekula átkerüljön olyan oldószerrend-szerbe, amely injektálható a HPLC-re. A legfontosabb zavarótényezõk a fehérjék és a lipidek. A fehérjék ugyanis kicsapód-nak az oszlopon és eltömítik, továbbá mind ESI, mind APCIesetén zavarják az ionizációs folyamatot. A lipidek irreverzí-bilisen kötõdnek a leggyakrabban alkalmazott C18-as HPLCállófázison, megváltoztatva így az elválasztási folyamatot. Aleggyakrabban alkalmazott mintatisztítási eljárások a kicsa-pás (fehérjék eltávolítására), a szilárd fázisú extrakció, illetvea folyadék (vagy oldószeres) extrakció.
A HPLC-MS egyik legfontosabb alkalmazási területe agyógyszeranalitika, ezen belül is két területet különíthetünkel, az ADME (absorption, distribution, metabolism,excretion), illetve a terápiás gyógyszerszint meghatározáso-kat (therapeutic drug monitoring). Mindkét esetben a ható-anyag kvantitatív meghatározására van szükség, melyben
kulcsszerepet kap a kalibrációs folyamat. Általában az analiti-kai módszerek esetében két különbözõ típusú kalibrációt le-het végezni a kvantitatív meghatározásokhoz. Külsõ kalibrá-ciónak nevezik, amikor hígítási sort készítenek a mérendõkomponensbõl az eredeti mátrixban, majd a mintákkal azonosmintaelõkészítés után végzik a méréseket. A másik kalibráci-ós módszer a belsõ standard alkalmazása. A belsõ standard amérendõ molekulához kémiailag hasonló vegyület, ideálisanstabil izotóp (2H, 13C, 15N stb.) jelzett originális vegyület, me-lyet ismert mennyiségben adunk hozzá a mérendõ mintához.Kvantitatív meghatározás esetén mindkét módszer alkalma-zása szükséges, tehát minden esetben el kell végezni a külsõkalibrációt, valamit a belsõ standard vegyületet a mintaelõ-készítés során hozzá kell adni a vizsgálandó anyag oldatához.A gyógyszermolekulák mennyiségi meghatározása HPLC-MS módszerrel történhet szérum, teljes vér, vizelet, illetveliquor mintából is. Különösen fontos ennek az érzékeny ésmegbízható kimutatási módszernek az alkalmazása olyangyógyszermolekuláknál, ahol a toxikus és a hatékony dózisközel van egymáshoz. Mivel számos gyógyszermolekula to-xikus már a terápiás tartományban is, ezért cél a dózis mini-malizálása. Ehhez szükséges tudni, hogy az egyén esetébenadott dózis milyen plazmaszintet eredményez, így optimali-zálható a dózis.
Izolált, ismeretlen fehérjék azonosítására napjainkbanszinte kizárólag tömegspektrometriás technikákat használ-nak. Bár az intakt fehérjemolekulák közvetlen tömegspektro-metriás vizsgálata már megoldott, a rutinszerû módszerek ál-talában tripszinnel emésztett fehérjék vizsgálatán alapulnak.A tripszines emésztés során ugyanis olyan peptidek keletkez-nek, amelyek mindegyike tartalmaz legalább egy könnyen io-nizálható csoportot, így a triptikus peptidek vizsgálatával el-méletben csaknem teljes szekvencialefedettség érhetõ el. Atriptikus fragmensek aminosavsorrendje MS/MS módban fel-deríthetõ, így akár a fehérjék teljes szekvencia analízise is el-végezhetõ. Az intakt fehérje tömegspektrometria információtad a fehérje molekulatömegérõl, valamint elektrospray ioni-zációt használva, a megjelenõ többszörösen töltött ionok el-oszlásából lehet következtetni a fehérje térszerkezetére.
Proteomikai alkalmazások esetében két alapvetõ megkö-zelítés létezik. Az úgynevezett bottom-up megközelítés eseté-ben a fehérjét tripszinnel emésztjük, majd a triptikus emészt-ményt vizsgáljuk tömegspektrometriásan. A módszer általá-ban tartalmaz valamilyen elválasztástechnikát is, az emész-tést megelõzõen vagy az követõen. Hagyományosan a 2Delektroforézissel elválasztott fehérjéket extraháljuk ki a gél-bõl, emésztjük, és peptideket vizsgáljuk MALDI (esetlegESI) MS-sel. A közelmúltban azonban megjelentek olyanmódszerek is, amelyeknél egy fehérjeelegyet emésztünk,majd az így keletkezõ triptikus fragmenselegyet választjuk el2D HPLC-vel és a peptideket nanoelektrospray-MS/MSmódszerrel azonosítjuk. Az úgynevezett top-down megköze-lítés esetében az izolált fehérjét intakt állapotban ionizáljuk,majd a sokszorosan töltött fehérjeionokat fragmentáljukelektronbefogásos, elektrontranszfer vagy egyéb disszociáci-ós módszerrel, és a keletkezett fragmensekbõl következtetünka fehérje aminosav-szekvenciájára.
Az úgynevezett enzim-assay módszerek olyan speciálisfehérjevizsgálati módszerek, melyekkel a fehérjék funkcioná-lis elemzése végezhetõ el, ezt leggyakrabban enzimek eseté-ben alkalmazzák. A fehérjéhez kötõdni képes szubsztráttalvaló inkubálás után a szubsztrát vagy a termék visszamérésetörténik HPLC-MS módszerrel.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
259
Preanalitika a speciális hemosztázisban
Preanalytics in special hemostasis
Dr. Sátori AnnaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest)
Kulcsszavak: centrifugálás, citrát, mintagyûjtés, mintaszállítás, mintatárolásKey-words: centrifugation, citrate, sample collection, sample storage, sample transport
A hemosztázis diagnosztikájában általában plazmát hasz-nálunk. Ez alól kivételt képez az antifoszfolipid antitestekvizsgálata (szérum) és a genetikai vizsgálatok, PFA-100 (tel-jes vér).
A mintavétel ennek megfelelõen különbözõ csõtípusokbatörténik: citrátos (világoskék kupakos csõ); EDTA-s (lila ku-pakos csõ); natív (piros kupakos csõ).
A véralvadás vizsgálatára használt mintavételi csövekantikoagulánsként 3,2%-os Na-citrát-oldatot tartalmaznak.Egyéb véralvadásgátló nem elfogadható. A citrátos vérmintá-ból centrifugálás által jutunk citrátos plazmához.
� Thrombocytadús plazma (PRP): (Plt >10 G/l): 37 �C-on800 rpm, 5 perc centrifugálással nyerjük, thrombocyta-funkciós mérésekhez használjuk.
� Thrombocytaszegény plazma (PPP): (Plt <10 G/l): szoba-hõmérsékleten 3000 rpm, 10–15 perc centrifugálássalkapjuk, a rutin hemosztázisvizsgálatokhoz ezt használ-juk.
� Thrombocytamentes plazma (PFP): 4000 rpm, 20–30perc centrifugálással nyerjük, és a PPP-hez hasonlóanhasználhatjuk. Különösen alkalmas olyan tesztekhez,ahol a vérlemezkék zavarhatják a meghatározást (throm-bocytafaktorok, heparinmonitorozás, LA, egyéb antifosz-folipid antitestek, fibrinolízis elemei). Felhasználásig fa-gyasztva tárolandó.
A beteg elõkészítése a vizsgálathozThrombophylia kivizsgálásakor a vérvételt megelõzõen
az esetleges kumarin terápiát fel kell függeszteni, és ha azantikoagulálás nem hagyható el, a beteget alacsony molekula-tömegû heparinra át kell állítani. Ennek az az oka, hogy akumarin a K-vitamin-függõ protein-S és -C aktivitás megítél-hetõségét zavarja.
Véralvadási vizsgálatokhoz történõ vérvétel elõtt könnyû,alacsony kalóriatartalmú reggeli fogyasztható, valamint a be-teg igyon bõven folyadékot. Annak érdekében, hogy összeha-sonlítható eredményeket kapjunk, a vérmintákat adott beteg-tõl mindig ugyanabban a testhelyzetben vegyük le. (Egészsé-ges egyénekben egyes értékek akár 20%-kal alacsonyabbakfekvõ helyzetben, mint függõlegesben, ödémásokban ez azarány még nagyobb lehet).
Vérvételi technikaVérvétel helye: valamely perifériás véna, többnyire a vena
cubitalis.Nem megengedett a vérvétel heparinnal átmosott állandó
kanülbõl. Ilyen esetben a mintavétel a másik kar vénájábóltörténjen, vagy a kanül fiziológiás sóval történõ átmosását ésaz elsõ 5 ml vér leengedését követõen.
Kompresszió: vérvétel során ne tartson tovább 1 percnél,és csak az éppen szükséges erejû legyen. A túl sokáig/túl nagy
erõvel történõ véna okkluzió a fibrinolízis lokális aktivációjá-hoz, megnövekedett faktorkoncentrációkhoz/-aktivitáshozvezet. 3 percnél tovább tartó leszorítás esetén a PI, APTI és TImegrövidül, míg az AT, fibrinogén-szint kb. 10%-kal növek-szik.
Vérvétel sorrendje: a véralvadásra szánt vérminta soha neközvetlenül a szúrás utáni elsõ minta legyen. Abban az eset-ben, ha csak koagulációs tesztek végzésére van szükség, acitrátos minta elõtt EDTA-s vér vétele történjen, ugyanis aszúrás után nyert elsõ mintában levõ szöveti tromboplasztintéves eredményeket okozhat. Bármely (indokolatlanul) kóroseredmény esetén, új mintavétel javasolt és a vizsgálatot megkell ismételni.
Fontos, hogy a vér zavartalanul (örvénylést okozó megtö-rés nélkül), rövid idõ alatt a mintavételi csõbe jusson. Túlgyors áramlás esetén a thrombocyták/vörösvértestek káro-sodhatnak. Túl lassú áramlás esetén pedig a vérminta alvadá-sa beindul, akár látható formában alvadékképzõdéssel, akárláthatatlanul, az alvadási faktorok aktivációjával. Figyelnikell, hogy elegendõ vér kerüljön a csõbe (jel!), a helyescitrát:vér arány (1:10) elérése érdekében. Ha a vérmennyiségkevesebb a szükségesnél, a plazma magas citrátkoncentrá-ciója megnyúlt alvadási idõket (fõként APTI) okoz. A jelen-leg használatos vákuumos csövekben a vákuum biztosítja amegfelelõ citrát:vér arány elérését. (Megjegyzés: a fentiaránytól kb. 10%-os eltérés még elfogadható.)
Összeforgatás: a minta levétele után a csövet azonnal,legalább négyszer, lassú és könnyed mozdulattal forgassukössze. Rázogatás kerülendõ, mert hemolízishez és/vagythrombocytaaktivációhoz vezethet, ezzel téves eredményeketokozva. Ha túl késõn vagy nem eléggé forgatjuk össze a min-tát, alvadékképzõdés indulhat meg.
MintakezelésAz általános laboratóriumi szabályok (csövek jelölése a
beteg jelenlétében, mintavételkor, legalább két különbözõazonosítóval) betartása mellett a minták gondos ellenõrzése atovábbi feldolgozás elõtt rendkívül fontos ahhoz, hogy a dur-va hibákat kiküszöböljük. Melyek lehetnek ezek a hibák?
Nem megfelelõ vérvételi csõ: Na-citrát oldat helyett más-féle antikoagulánst (pl. EDTA, heparin) tartalmaz.
Nem megfelelõ citrát:vér arány: a szükségesnél kevesebbvérmintát látunk a csõben.
Alvadékos minta: a vérmintát óvatosan összeforgatva el-lenõrizzük, hogy nincs-e benne alvadék. Alvadékképzõdésesetén, annak nagyságától függõen, a koagulációs idõk falsmegrövidülése, normalizációja, illetve megnyúlása észlelhe-tõ.
Hemolízis: a minta álló helyzetben, hosszú ideig tartó tá-rolása után, vagy még inkább centrifugálás után figyelhetõmeg. Ha a hemolízis in vivo is fennáll (ezt megerõsíthetjük is-mételt vérvétellel), a mintát vizsgáljuk a hemosztazeológiai
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
260
állapot felmérése céljából. Ha a hemolízis helytelen vérvételitechnika eredménye (pl. excesszív aspiráció, erõs rázogatás),a mintát nem szabad hemosztázis-vizsgálatra felhasználni.
MintaszállításÁlló helyzetû, lezárt csövekben történik. Kerülendõ a
minták rázatása (hemolízis, alvadás aktiváció megelõzése).Centrifugálatlan minták szállítása 15–20 oC-on történjék.
MintatárolásSzobahõmérsékleten a PI stabilabb, mint az APTI, de a
hõfok emelkedésével mindkettõ értéke kifejezetten csökken(%), illetve nõ (sec). Ezen változások az alvadási faktorokcsökkent aktivitása miatt alakulnak ki. A leglabilisabb faktora FVIII.
Hõmérséklet. Ha a minta pár órán belül lemérésre kerül,tárolható szobahõn (15–25 �C). Ebben az esetben nincs szük-ség a plazmát a sejtes elemektõl a centrifugálást követõen el-távolítani.
A magas hõmérséklet (beleértve direkt napfény) minden-kor kerülendõ. Hûtõszekrényben (2–8 �C) tárolás nem ajánla-tos, mivel ez a FVII, valamint FXI, XII hidegaktivációjához,ezáltal a megfelelõ szûrõtesztek rövidült alvadási idejéhez ve-zet.
Ha a minta csak a késõbbiekben kerül felhasználásra, athrombocytamentes plazmát (PFP) a vérvétel után 1 órán be-lül külön választjuk a sejtes elemekrõl és zárt csövekben fa-gyasztva tároljuk. Rövid ideig tartó (<2 hét) tárolásra elegen-dõ a – 20 �C, de hosszabb idõ esetén (<6 hónap) legalább -70�C a megfelelõ tárolási hõmérséklet. A fagyasztott mintákat37 �C-os vízfürdõben engedjük fel, majd alaposan összeke-verjük. Ezután azonnal megkezdjük a mérést, mivel számta-lan faktor stabilitása csökken felolvasztás után. Az újrafa-gyasztás és –felengedés kerülendõ.
A tárolás idõtartama. PI esetén 24, egyéb vizsgálatok ese-tén pedig 4 órán belül végre kell hajtani a méréseket. Ha aminták csak a késõbbiekben kerülnek felhasználásra, a plaz-mákat le kell fagyasztanunk.
Thrombocytafunkciós vizsgálatok esetén a mintavételtkövetõen azonnal meg kell kezdeni a mérést és két órán belülbe kell fejezni.
Hematokrit és a véralvadási vizsgálatokA hematokrit 0,25–0,55 (25–55%) tartományban nem be-
folyásolja a véralvadási szûrõtesztek eredményét, így értékéttöbbnyire nem is kell számításba vennünk. Alacsony, illetvemagas hematokrit esetén viszont téves alvadási eredményeketkapunk.
Ha a hematokrit >0,55 (55%): fiziológiás újszülöttekben,illetve elõfordul olyan betegségekben, ahol a vörösvértest-szám nõ (polycithaemia vera, szívbetegségek), és így a plaz-ma aránya csökken. Ilyenkor nyitott, hagyományos vérvételesetén a szokásos citrát:vér arányt módosíthatjuk. A vénás vérmegfelelõ mennyisége kiszámítható a következõ képlet alap-ján:
vér (ml) = 9 � Na-citrát-oldat (ml) � 0,55 /(1,00 – hematokrit)
Ha a hematokrit <0,25 (25%): a fenti formula alapjánmódosítandó a helyes arány.
Cirkadián ritmusA véralvadási faktorok is mutatnak napszaki változáso-
kat. A legalacsonyabb értékeket többnyire a kora éjjeli órák-
ban figyelhetjük meg; a PAI-I aktivitása viszont a kora délutá-ni órákban minimális, hajnali 2 és 6 óra között maximális.
Számos esetben azonban nem figyelhetõ meg valódicirkadián ritmus (pl. antitrombin).
Annak tekintetében, hogy a napszaki változások esetlege-sen befolyásolhatják a kapott eredményeket, a véralvadásivizsgálatokhoz szükséges vérvétel reggel 7 és 9 óra közötttörténjék.
StresszA fizikai és mentális stressz változásokhoz vezet a hemo-
sztatikus rendszerben, melyek nagyban függenek a terhelésnagyságától és idõtartamától, valamint a beteg állóképességé-tõl. Stressz esetén hiperkoagulabilitás (APTI rövidül,vWF:Ag nõ), illetve hiperfibrinolízis (kóros fibrinolitikusszûrõteszt-eredmények) egyaránt bekövetkezhetnek.
Étkezés, stimulánsokA véralvadás folyamatait a szélsõségektõl mentes, ki-
egyensúlyozott étrend nem befolyásolja. Így a vérvételneknem szükséges éhgyomorra történnie, könnyû (alacsony zsír-tartalmú) reggeli elfogyasztható elõtte.
Néhány megfigyelés:1. Magas állati zsiradék tartalmú étrend a fibrinolitikus akti-
vitás csökkenéséhez vezet.2. Nagy mennyiségû gyümölcs és zöldség fogyasztása fo-
kozza a fibrinolízist, a PAI-szint csökkenésén keresztül.3. Haldiéta (makréla) csökkenti a vérlemezke számot és ala-
csonyabb fibrinogén-szintet mérhetünk a következõ párhétben. A thrombocyták aggregációja csökken a halolaj-ban levõ többszörösen telítetlen zsírsavak miatt.
4. Nagy mennyiségû C-, E-vitamin, gyömbér, hagyma fo-gyasztása zavarja a thrombocytaaggregációt.
5. K-vitamin: csak abban az esetben érinti a véralvadást, haaz étrend szélsõséges vagy egyik napról a másikra lénye-gesen megváltozik.
6. Krónikus alkoholizmus csökkent thrombocytaszámhozés aggregációhoz vezet.
7. Dohányzás: fokozza a thrombocytaaggregációt és adhézi-ót, növeli a fibrinogén szintjét.
GyógyszerekA véralvadás terápiás céllal történõ befolyásolására ad-
nak antikoagulánsokat és thrombocytagátló szereket. Számosmás gyógyszer mellékhatásaik révén hat a hemosztázisra.
Utóbbira néhány példa:1. NSAID: az acetilszalicilsav irreverzibilisen gátolja a
COX enzimet, ezzel csökkenti/megszünteti a throm-bocytaaggregációt.
2. Orális fogamzásgátlók: hatásukra a legtöbb alvadási fak-tor aktivitása nõ, fokozódik a thrombocytaaggregáció,míg az AT és PS szintje csökken.
3. Valproát: thrombocytopenia, fibrinogén-szint csökkenés.4. Aszparagináz: fibrinogén, AT, PC, PS, plazminogén,
K-vitamin-függõ alvadási faktorok szintje csökken.5. Széles spektrumú antibiotikumok K-vitamin-hiányt
okozhatnak a bélflóra károsítása által.
A korrekt eredményekhez elengedhetetlen feltétel a he-mosztázisvizsgálatok során a preanalitikai szak kontrollálása.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
261
Feladatok a hemosztázis alaptesztek kóros eredménye esetén
Tasks in case of abnormal results of haemostatic screening tests
Dr. Várnai KatalinSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest)
Kulcsszavak: PI, APTI, TI, fibrinogén, vérzékenység, thrombosiskészségKey-words: PT, APTT, TT, fibrinogen, haemorrhagic diathesis, thrombophilia
A hemosztázis bonyolultan szabályozott rendszer, amely-ben az érfal, a thrombocyták, a véralvadás és a fibrinolíziskomponenseinek összehangolt mûködésével egyensúlyi álla-pot valósul meg. A fiziológiás és a patológiás állapotok meg-értésére több teória született, kezdve a klasszikustól, a víz-esés” elméleten át a legátfogóbb képet adó, sejt alapú modellkialakításáig (Hoffmann 1998). A „vízesés” elmélet a diag-nosztikában még mindig nagyon jó eligazodást nyújt. Ennekaz elméletnek az alaptételei:� az alvadási faktorok a plazmában inaktív formában kerin-
genek;� az aktiváció két úton indul: az intrinsic és extrinsic úton;� a faktorok egymást követõ proteolízissel aktiválódnak
kötött sorrendben, és az exponenciálisan növekvõ számúfaktor trombin generációhoz vezet, amely hatására a fo-lyékony fibrinogén gél állapotú fibrinné alakul. A rutinvéralvadási vizsgálatok általában ennél a lépésnél vég-zõdnek.
A finoman hangolt egyensúly megbomlása vérzékeny-séghez (hipokoaguláció) vagy fokozott thrombosiskészség-hez (hiperkoaguláció) vezet. Bármely irányú eltérés kivizsgá-lása a rutin alaptesztekkel indul (zárójelben az alapteszt ne-ve):� thrombocytaszám (vérkép, kenet),� protrombinidõ (PI),� aktivált parciális tromboplasztinidõ (APTI),� trombinidõ (TI),� fibrinogén (Clauss-módszer).
A kóros értékek további vizsgálatokat indikálnak, amelyaz eltérés irányától függõen a hipo- vagy hiperkoaguláció ki-vizsgálását jelenti.
A beteg anamnézisének, klinikai tüneteinek és az alkal-mazott terápiának az ismerete lényeges segítséget nyújt a to-vábbi vizsgálatok sorrendjében.
Vérzékenység vizsgálata
ThrombocytaszámMérsékelten csökkent thrombocytaszám (50–100 G/l) és
klinikai tünetek megléte esetén thrombocytafunkciós tesztekvégezhetõk:� PFA100 (vérzési idõ standardizált változata) (Collagen/
Epinephrine és Collagen/ADP cartridge)� Hagyományos aggregométer (optikai elven alapuló).
Heparinterápia mellett (5–14. nap) fellépõ thrombocyto-penia (<100 G/l vagy a kiindulási érték felére csökkenése)esetén HIT-II szûrõ teszt beállítása indokolt.
Alacsony thrombocytaszám esetén ajánlott a kenet meg-tekintése, mikroaggregátumok vagy fragmentocyták (DIC)
felismerésére. Az alvadásgátló (EDTA) okozta pseudothrom-bocytopenia kizárása fontos, hogy elkerüljük a feleslegesvizsgálatokat.
Koagulációs vizsgálatokAz alvadási szûrõtesztek az aktiváció egy-egy fázisán be-
lüli eltérést jelzik az alvadási és fibrinolízis folyamatában. Azalaptesztek együttes elvégzése segít a további vizsgálatok ki-jelölésében.
Megnyúlt PI vagy APTI esetén az elsõ lépés a korrekciósvizsgálat elvégzése:� beteg plazma és normál plazma 1:1 arányú keveréke.
Ha a megismételt mérés értéke a normáléval megegyezõ,az egyes alvadási faktorokat kell meghatározni. Ha kóros ma-rad, gátlótest irányába (lupusz antikoaguláns, LA vagy alva-dási faktor ellenes gátló) végzünk meghatározásokat.
Korrekciót követõ eljárások:� Korrigálható PI és normál APTI esetén a VII. faktort,� korrigálható APTI és normál PI esetén VIII, IX, XI és XII
faktorokat (ha a betegnél nincs vérzés, a mérést a XII. fak-torral kezdjük) határozzuk meg.
� Csökkent VIII. faktor esetén von Willebrand-betegséggyanúja is felmerülhet. A kivizsgálási algoritmus a vonWillebrand-faktor (vWF) funkcionális és antigén méré-sét, a kollagén- és a VIII. faktor-kötõhely meghatározá-sát, a multimerek analízisét, esetenként thrombocyta-aggregációs mérést foglal magába.
� Korrigálható PI, APTI és normál TI mellett a közös akti-vációs út faktorait határozzuk meg (II., V., VII. és X. fak-torok). Ha májbetegség áll a megnyúlt értékek hátterében,az alvadási faktorok egyenkénti meghatározása felesle-ges. Kivételt képez a máj transzplantációja (V. faktor).
� Megnyúlt PI, APTI, és TI esetén a faktor meghatározásokelõtt a fibrinogén szintjének ellenõrzése szükséges, mertaz alacsony fibrinogénszint (0,3 g/l) vagy az elégtelenfunkció valamennyi mérést befolyásolja. Dysfibrinogen-aemia elkülönítésére a fibrinogén funkcionális meghatá-rozása mellett a kvantitatív meghatározás is szükséges.
� Megnyúlt TI-nél a nyomokban jelen lévõ heparin kizárá-sára reptilázidõt (RI) mérünk. A reptiláz fibrinogén hasí-tási pontja eltér a trombin támadáspontjától, és ezt nemgátolja a heparin.
Valamennyi szûrõteszt kórossá válhat DIC-ben, primerhiperfibrinolízisben; ilyenkor ismételt vizsgálatokkal követ-hetõ a folyamat, kiegészítve D-dimer, fibrin/fibrinogén deg-radációs produktum (fdp), fibrin monomer (FM) meghatáro-zással.
Sikertelen korrekció, gátlótest meghatározás:� Faktorellenes gátlótest esetén az inhibitor mennyiségi
meghatározására a Bethesda-módszert alkalmazzuk. A
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
262
beteg plazmájának tovafutó hígítási sorát ismert VIII.faktor koncentrációjú plazmával mérjük össze, mind-egyik hígításból VIII. faktor aktivitást mérünk azonnal éskét órás, 37 �C-on történõ inkubálás után (azonnali, illet-ve progresszív gátlótest elkülönítése). 1 Bethesda egység(BU) az a gátlás, amely az ismert VIII. faktor aktivitást afelére csökkenti. Amelyik hígítási lépésnél találjuk az50%-os csökkenést, annak a hígításnak a reciprok értékeadja a beteg gátlótest titerét.
� LA-pozitivitás foszfolipid-protein ellenes antitest, amelykimutatásához az antigén heterogenitása miatt két, külön-bözõ összetételû szûrõtesztet kell alkalmazni. Leggyak-rabban használt módszerek: a hígított Russell vipera mé-reggel végzett koaguláció és a lupusérzékeny APTI.
Pozitív eredménynél a bizonyító tesztet is be kell állítani(hígítatlan Russell vipera méreg, illetve hexagonális foszfo-lipid).
Vérzékenység körébe tartozhat a XIII. faktor defektusa,amelyet azonban a rutin tesztek nem érzékelnek.
Thrombosiskészség vizsgálata
ThrombocytaszámMagas, néha extrém thrombocytaszám (>1000 G/l, pl.
mieloproliferatív kórképek) járhat fokozott funkcióval, degyakrabban inkább csökkent mûködést jelent. Vizsgálatukracsak a hagyományos aggregométer ad lehetõséget, mivel aPFA 100 <500 G/l használható.
Koagulációs vizsgálatokRövidült PI, APTI, TI, emelkedett fibrinogénszint throm-
bosiskészségre hívhatják fel a figyelmet. Ennek kivizsgálásimenete:� Természetes inhibitorok: antitrombin (AT), protein C
(PC), protein S (PS) funkcionális meghatározása. Ha kó-ros, az antigén meghatározás is szükségessé válik az I.(mennyiségi) és II. (minõségi) típusú defektus elkülöníté-sére.
� APC rezisztencia az V. faktor Leiden-mutációjának funk-cionális meghatározása, de a jelenség mutáció nélkül,szerzetten is felléphet.
� Valamennyi alvadási faktor magas szintje (> 200%)thrombosisrizikót jelenthet, így a faktormeghatározások(elsõsorban VIII. faktor) is részei a kivizsgálásnak.
� Az akut fázis proteinek (fibrinogén, VIII. faktor, vonWillebrand Faktor) magas szintjét csak gyulladásos para-méter (CRP) egyidejû meghatározásával lehet értékelni.
� A D-dimer az alvadási és fibrinolitikus rendszer aktiváló-dását egyaránt jelzi.
� Protrombin G20210A polimorfizmusra csak molekulárisbiológiai módszer áll rendelkezésre.
A thrombosiskészség kivizsgálása azonban nem alapul-hat kizárólag a szûrõtesztek pozitivitásán. Szükséges a beteganamnézisének, a családi anamnézis, valamint a klinikai tü-netek ismerete.1. A kivizsgálást el kell indítani, ha: fiatal (<50 év) a beteg;
ismeretlen okból, szokatlan helyen, vagy ismétlõdõthrombosis alakul ki; 2 vagy több spontán magzatvesztésaz anamnézisben.
2. Az elõbb felsoroltakhoz ismert rizikók társulnak: trauma;mûtét; terhesség, gyermekágy; immobilizáció; ösztro-génterápia.
Ha a thrombosis csak a második csoportban felsoroltak-kal fordulnak elõ, nem indokolt a részletes kivizsgálás.Egészséges egyént, ahol a családban fiatalkori, halmozottthrombosis fordult elõ, gyermekvállalás, illetve fogamzásgát-ló szedése elõtt javasolt kivizsgálni.
A hemosztázis szûrõtesztjei általában sejtmentes plazmá-ban mérik a fibrinképzõdést, és csak korlátolt információt ad-nak a hemosztázis egészének mûködésérõl. A sejtes elemeketis tartalmazó globális tesztek, mint a trombin generációs teszt(endogén trombin potenciál) és a trombelasztográfia, köze-lebb visznek az in vivo folyamatokhoz. Nagyobb érzékenysé-get mutatnak mind hipo- mind hiperkoaguláció irányában. Astandardizáció javításával, minõségellenõrzési kontrollokbavaló bevonással helyük lehet a hemosztázis vizsgálatában.
A thrombosishajlam vizsgálati algoritmusa
???????????????
Dr. Domján Gyula, Dr. Gadó KláraSemmelweis Egyetem, I. Sz. Belgyógyászati Klinika
Kulcsszavak: thrombosis, thromboembolia, thrombophilia, antifoszfolipid szindrómaKey-words: thrombosis, thromboembolia, thrombophilia, antiphospholipid syndrome
Bevezetés
A vénás thromboembliás megbetegedések Magyarorszá-gon az egyik vezetõ morbiditási és mortalitási tényezõnekszámítanak annak ellenére, hogy hatékony eszközökkel ren-delkezünk mind a megelõzés, mind a diagnosztika, mind a ke-zelés területén. Ezért különösen fontos, hogy érvényt szerez-
zünk a rendelkezésre álló szakmai irányelveknek, amelyek je-lenleg is jól meghatározzák a diagnosztikus és terápiás teen-dõket. A gyors diagnózis alapján megkezdett hatékony terá-pia segít megelõzni a sokszor halálos vagy súlyos életminõ-ség-romlást okozó szövõdmények kialakulását.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
263
Fokozott thrombosishajlammal járó állapotok
A fokozott thrombosishajlamnak többféle oka ismert. Aveleszületett thrombophiliák heterogén csoportot alkotnak,amelyek különbözõ mértékben fokozzák a thrombosis-készséget és gyakran megtalálhatók a fiatalkorban kialakulóthrombosisok hátterében (1., 2., 3. táblázat).
Számos olyan állapot (terhesség, szülés, gyermekágy idõ-szaka, idõskor), illetve betegség ismert, amely szintén fokoz-za a thrombosishajlamot. Az utóbbiak közé tartozik azobesitas, diabetes, malignus betegségek, nephrosis szindró-ma, gyulladásos kórképek, varicositás, szívelégtelenség, a vér
viszkozitásának fokozódásával járó megbetegedések. Jelen-tõsége miatt külön említjük az antifoszfolipid szindrómát,amely az egyik legfontosabb thromboemboliás hajlamot fo-kozó megbetegedés, és hatása mind az artériás, mind a vénásrendszerben kifejezésre jut.
Egyes gyógyszerek (ösztrogéntartalmú gyógyszerek, da-ganatellenes szerek), a vénás kanülök, tartós immobilitásszintén thrombosis kockázat növelõ tényezõ.
A különbözõ veleszületett és szerzett tényezõk egyidejûjelenléte egymás hatását sokszorosára erõsítheti. Igen gyak-ran elõfordul, hogy egyes tényezõk önmagukban még nemokoznak klinikai tüneteket, a thromboembolia manifesztáló-dásához egy újabb tényezõ megjelenése vezet.
A sebészeti beavatkozás, a posztoperatív idõszak önma-gában is jelentõs thrombosishajlam fokozódással jár.
A belgyógyászati és mûtétes osztályokon kezelt betegekjelentõs aránya a fokozott thrombosishajlam miatt megelõzõkezelésre szorul.
A kivizsgálás elve
A thromboembolia kialakulásának megelõzésében nyújtsegítséget a fenti tényezõk ismerete. Ennek gyakorlati vonat-kozása, hogy a fokozott thrombosishajlammal járó állapotokfennállásának észlelése esetén tromboprofilaxisban részesít-jük a beteget.
A már kialakult thrombosis esetén a lehetséges okokszámbavétele, a szükséges vizsgálatok elvégzése ahhoz segí-tenek hozzá, hogy meghatározhassuk a megfelelõ terápiát,annak fajtáját, alkalmazásának idõtartamát. Fontos gyakorlatiszempont, hogy a kivizsgálás a thromboticus eseményt köve-tõen minimálisan három hónap elteltével történhet. A K vita-min antagonisták alkalmazása közben az alvadási vizsgálatoknem végezhetõk el.
Számos laboratóriumi vizsgálat áll rendelkezésre a foko-zott thrombosishajlam igazolására, azonban ezek elvégzéséttöbb körülmény befolyásolja. Célunk, hogy a vizsgálatok szá-ma és fajtája kellõen informatív, racionális és finanszírozhatólegyen (4. táblázat).
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
264
1. táblázat
Veleszületett thrombophiliák
GYAKORIBB ELTÉRÉSEK
� V. faktor heterozigóta Leiden-mutációja� aktivált protein-C rezisztencia� protrombin gén G20210A heterozigóta mutációja� hyperhomocysteinaemia� emelkedett VIII. faktor szint
RITKÁBB ELTÉRÉSEK
� antitrombin III defektus� a protein-C és protein-S defektus� az V. faktor homozigóta Leiden-mutációja� homozigóta protrombin gén G20210A mutáció
EGYÉB ELTÉRÉSEK
� emelkedett XI, IX, VII faktor szint� csökkent fXII, plazminogén� dysfibrinogenaemia� „sticky platelet” szindróma
2. táblázat
Az egyes genetikai tényezõk által okozottthrombosisrizikó-fokozódás
Heterozigóta FV Leiden 7x
Homozigóta FV Leiden 80x
Heterozigóta protein C deficiencia 10–15x
Homozigóta FII G20210A ��
Heterozigóta FII G20210A 3–6x
AT-hiány 20x
Homozigóta AT ���
(��� = nagyon jelentõs mértékben fokozza a thrombosisrizikót,gyakran csecsemõ-gyermekkorban halálhoz vezet�� = igen jelentõs mértékben fokozza a thrombosisrizikót)
3. táblázat
A veleszületett thrombophiliák klinikaijellegzetességei
� fiatal betegeken kialakuló thromboembolia� szokatlan helyen (felsõ végtagi mélyvénás thrombosis,
Budd–Chiari-szindróma)� enyhe provokáló tényezõ hatására kialakuló thromboembolia� recidiváló thrombosis
4. táblázat
Thrombophilia szûrõvizsgálat javallatai
THROMBOPHILIA SCREENING AJÁNLOTT
� recidív thrombosis� thrombosis <50 év� thrombosis kiváltó ok nélkül, bármely életkorban� thrombosis szokatlan helyen (felkar, agy, mesenterium, portalis,
máj)� thrombosis terhesség, gyermekágy, orális antikoncipiens szedés
közben� habituális vetélés
THROMBOPHILIA VIZSGÁLHATÓ
� Ismert thrombophiliás tünetmentes családtagja� Ismert thrombophiliás tünetmentes nõi családtagja, terhesség-
vállalást vagy orális antikoncipiens szedését megelõzõen
THROMBOPHILIA VIZSGÁLAT NEM AJÁNLOTT
� általános populáció szûrés� orális antikoncipiens terápia indítás elõtt vagy alatta� prenatális, újszülött vagy aszimptómás prepubertás rutin teszt
A veleszületett vérzékenység vizsgálati algoritmusa
Evaluation of congenital bleeding disorders
Dr. Nemes LászlóOrszágos Haemophilia Központ és Haemostasis Szakrendelés, Honvédkórház – Állami egészségügyi
Központ, Budapest
Kulcsszavak: von Willebrand-betegség, haemophilia A és BKey-words: von Willebrand disease, haemophilia A and B
Veleszületett vérzékenység gyanúja esetén a következõszûrõvizsgálatok elvégzését tartjuk indokoltnak:� Vérzési idõ (Ivy módszere szerint, lehetõleg standard esz-
közzel, pl. Simplate I-II) vagy PFA 100 záródási idõ,� Globális véralvadási tesztek: aktivált parciális trombo-
plasztinidõ (aPTI), protrombinidõ (PI), trombin idõ (TI) ,� Plazma-fibrinogénkoncentráció meghatározása
A vérzési idõ megnyúlása esetén a vizsgálatok a throm-bocytafunkciós mérésekkel is kiegészítendõk.
Az aktivált parciális tromboplasztinidõ (aPTI) a véralva-dás intrinszik és közös útjának vizsgáló módszere. Izoláltmegnyúlása esetén az esetleges inhibitorok (pl. heparin,antifoszfolipid ellenanyag, lupus antikoaguláns, specifikusfaktorellenes autoantitestek) keverési tesztekkel történõ kizá-rása után individuális faktorszint-mérések végzendõk:haemophilia A és B, XI-es faktor hiány, és a klinikai vérzé-kenységgel nem járó XII-es (Hagemann-) faktor deficiencialehetõsége jön szóba.
A protrombinidõ (PI) a véralvadás extrinsic és közös útjá-nak vizsgálatára alkalmas. Izolált megnyúlása esetén a VII- esfaktor hiányának lehetõsége vetõdik fEl, ezért FVII:C mérésindokolt.
Együttes aPTI és PI megnyúlás esetén, az inhibitorok ke-verési tesztekkel való kizárása után elsõsorban a véralvadásközös útja („common pathway”) faktorainak (X, V, II, fib-rinogén) defektusára kell gondolnunk. A vérzékeny állapotokdifferenciáldiagnosztikáját az 1. táblázat foglalja össze.
Haemophiliák laboratóriumi diagnosztikája
A haemophilia-A a VIII alvadási faktor X kromoszómáralokalizálódó génjében bekövetkezõ mutáció következtébenlétrejövõ veleszületett vérzékenység. A IX faktor génjeugyancsak az X kromoszómán helyezkedik el, mutációi okoz-zák az ún. B típusú haemophiliát. A VIII- (IX-) faktor gén he-terogén genetikai eltérései csökkent faktor-termelõdésselvagy diszfunkcionális faktor képzõdésével járnak.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
265
1. táblázat
A vérzékeny állapotok differenciáldiagnosztikája
ÁLLAPOT THROM-BOCYTA-SZÁM
PI aPTI TI VÉRZÉSIIDÕ
VII IF :C IXF:C ANTI-VI I IF-ELLEN-ANYAG
Vasopathia � � � � �(�) � � N
Thrombopenia �� �(�) �(�) � �� � � N
Thrombopathia �(�) � � � �� � � N
vWillebrand-szindróma �(�) � �(�) � � � � N
Afibrinogenaemia � � � �� � � � N
Szerzett haemophilia � � �� � � �� � P
Májbetegség �(�) � � �(�) � �(�) � N
DIC �� � � �� � �(�) � N/P
Massziv transzfúzió � � � � � �(�) �(�) N
Kumarinterápia � �� � � � � � N
UF-heparin �(�) �(�) �� �� �(�) � � N
FII, FV, FX def. � �� �� � � � � N
Haemophilia-A � � �� � � �� � N/P
Haemophilia B � � �� � � � �� N/(P)
LA �(�) �(�) � � � �(�) �(�) N/(P)
Trombolitikus kezelés � � �� �� �� � � n
Rövidítések: N: normál, P: pozitív, PI: protrombin idõ/ aPTI: aktivált tromboplasztin idõ/ TI: trombin idõ/ VIIIF:C: VIII faktor aktivitás/ IXF:C: IXfaktor aktivitás/ LA: lupus antikoaguláns/ anti-VIIIF-ellenanyag: VIIIF ellen ható inhibitor mennyisége Bethesda Egységben (BE)
A klinikumban a jellegzetes öröklésmenet valamint vér-zéses manifesztációk (családi és egyéni anamnézis) alapjánvetõdik fel a haemophilia lehetõsége. A megerõsítéshez (veri-fikálás), valamint a típus és súlyosság meghatározásához (abetegség klasszifikációja) speciális véralvadási laboratóriumivizsgálatok szükségesek. A legfontosabb, szûrõ jellegû „glo-bális” koagulációs vizsgálatok, a thrombocytaszám és a vér-zési idõ mérésével kiegészítve általában elegendõek a megfe-lelõ differenciáldiagnosztikához, a „csoportdiagnózis” meg-határozásához.
Az A és B haemophiliát az intrinsic út egyéb, ún. „kon-takt” faktor deficienciáitól (pl. XII-es faktor, Fletcher- ésFitzgerald-faktor, HMW kininogén, prekallikrein, XI-es fak-tor) a specifikus faktormeghatározásokkal lehet elkülöníteni.Vérzékenység szempontjából ezek közül egyedül a XI-es fak-tor hiány bír jelentõséggel. Az A haemophiliát ezen kívül méga ritka VIII-as faktor elleni kóros autoantitest termelõdésenalapuló, ún. szerzett, gátlótestes haemophiliától (APTI keve-rési tesztek és az inhibitor Bethesda-méréssel való meghatá-rozása) és a gyakori von Willebrand-betegségtõl kell elkülö-níteni. Más jellegû inhibitor hatások, mint például heparin je-lenléte vagy lupus antikoaguláns fals pozitív (csökkent)VIII-as faktor aktivitás (VIIIF:C) értéket okozhatnak, különö-sen az egylépcsõs meghatározás során. A VIII-as faktor fizio-lógiás carrier fehérjéje a von Willebrand-faktor (vWF), amelystabilizálja a keringésben, és megvédi a korai proteolízistõl.Így érthetõ, hogy a vWF hiányában a VIIIF:C is csökken. Aritka, súlyos, 3-as típusú von Willebrand-betegségben, amirea vWF teljes hiánya jellemzõ, a VIII-as faktor aktivitás is je-lentõsen csökken – általában 3% alatt van – és típusosanhaemophiliás vérzéses manifesztációk, pl. haemarthrosok,izomközti haematomák is elõfordulhatnak a megfelelõ moz-gásszervi következményekkel.
A von Willebrand-betegség ugyancsak ritka 2N (Nor-mandy-) variánsát különösen nehéz elkülöníteni a mérsékeltA haemophiliától. Ebben a variánsban a klassszikus vWF-paraméterek (Ristotecin Cofactor aktivitás – RiCof, Risto-cetin Indukálta Platelet Aggregáció – RIPA, CollagenBinding Aktivitás – CBA, standard Ivy vérzési idõ, PlateletFunction Analyzer – PFA 100 idõ, von Willebrand FaktorAntigén – vWF:Ag, vWF multimer mintázat) mind normáli-
sak, és csupán a specifikus vWF VIII-as faktor kötõképessé-gét vizsgáló teszttel lehet a diagnózishoz eljutni. A differenci-áldiagnózis elsõsorban a genetikai tanácsadás számára lehetfontos.
A B típusú haemophilia differenciáldiagnosztikájában aIX-es faktor csökkenés szerzett okait kell elsõsorban figye-lembe vennünk: K-vitamin-hiány, kumarin és indandion ke-zelés, májbetegséghez kapcsolódó komplex coagulopathia,DIC-jellegû állapotok, dilúciós coagulopathia, antifoszfoli-pid szindróma és a rendkívül ritka IX-es faktor elleni auto-antitest. A protrombinidõ mérése, a többi K-vitamin-depen-dens véralavadási faktor szintjének specifikus meghatározá-sa, APTI korrekciós és Bethesda inhibitor teszt alkalmazásalehet szükséges a korrekt diagnózis felállításához.
Von Willebrand-betegség laboratóriumidiagnosztikája
A von Willebrand-betegség (von Willebrand disease –vWD) a veleszületett vérzékenység leggyakoribb formája,prevalenciája világszerte kb. 0,8–1,3%. Altípusait a 2. táblá-zat mutatja.
Patofiziológiai alapja a von Willebrand faktor (vWF) hiá-nya vagy defektusa. A vWF plazmafehérje, melynek legfon-tosabb szerepe a véralvadásban a thrombocyták adhéziójánakés aggregációjának biztosítása. A vWF ezen kívül a VIII-asvéralvadási faktor (FVIII) carrier molekulája is a vérkeringés-ben, azaz a FVIII a vérpályában “FVIII:vWF komplex” for-májában kering; a hordozó molekula hiányában, vagy mûkö-dészavara esetén a szabad FVIII katabolizmusa fokozódik,koncentrációja csökken.
A szûrõvizsgálati tesztek pozitivitása esetén verifikációstesztként minden esetben el kell végeznünk a vWF mérésétfunkcionális (vWF aktivitás – RiCof vagy Collagénkötõ Akti-vitás – CBA) és immunológiai (vWF antigén – vWF:Ag)módszerrel, valamint a VIII-as faktor aktivitás (FVIII:C) és arisztocetin indukálta thrombocyta- (platelet) aggregáció(RIPA) mérését. Az altípusok meghatározása terápiás kon-zekvenciával jár, ezért a vWF multimerek meghatározásaSDS elektroforézissel szintén ajánlott.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
266
2. táblázat
A von Willebrand-betegség felosztása
ALTÍPUS ELÕFORDULÁS ÖRÖKLÕDÉS DIAGNOSZTIKA
1-es 70% Autoszomális domináns, inkomplettpenetrancia (60 %)
Csökkent vWF: Ag, RiCof és FVIII:C (20–50 %), normálismultimér-megoszlás
2A 10–15% Autoszomális domináns, ritkán recesszív Csökkent vWF:Ag, RiCof és FVIII:C, csökkent nagy és köze-pes molekulatömegû multimérek
2B <5% Autoszomális domináns Csökkent vWF: Ag, Ricof és FVIII:C; nagy molekulatömegûmultimérek hiánya, fokozott RIPA, thrombopenia
2M ritka Autoszomális domináns Csökkent vWF: Ag, RiCof és FVIII:C; normálismultimér-összetétel
2N ritka Autoszomális recesszív Változó vWF:Ag és RiCof; csökkent FVIII:C; csökkentFVIII-kötõ képesség
3-as 1–5:106 Autoszomális recesszív Mérhetetlen vWF: Ag, RiCof, FVIII: C < 10 %
Rövidítések: vWF:Ag : von Willebrand faktor antigén, RiCof : von Willebrand faktor aktivitás, FVIII:C : VIII-as faktor aktivitás,RIPA : risztocetin-indukálta thrombocyta- (platelet) agglutináció
Új speciális hemosztázis tesztek
New special tests of hemostasis
Dr. Várnai KatalinSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest)
Kulcsszavak: trombin generációs teszt (TGT), endogén trombin potenciál (ETP), trombelasztográfia (TEG), rotációs trombelaszto-metria (ROTEM), mikropartikulák (MPs), thrombocyta eredetû mikropartikulák (PMP)Key-words: endogenous thrombin potential (ETP), thrombin generation assay (TGA), thrombelastography (TEG), rotationalthrombelastometry (ROTEM), microparticles (MPs), platelet-derived MP (PMP)
A hemosztázis rutin tesztjei a diagnosztikus lépések alap-jait képezik. A vizsgálatok azonban thrombocytaszegény(PPP) vagy thrombocytamentes plazma (PFP) felhasználásá-val történnek, a hemosztázis elemeinek komplex hálózatátnem érzékelik. Ezt az igényt közelítik a globális tesztek, minta trombin generációs teszt (TGT) és a trombelasztográfia(TEG), illetve az utóbbi módosított változata, a rotációstrombelasztometria (ROTEM). Prokoaguláns aktivitásuk mi-att a keringõ mikropartikuláknak is egyre nagyobb a szerepe adiagnosztikában.
Trombin generációs teszt (TGT)
A hemosztázis kitüntetett faktora a trombin, keletkezésé-nek és gátlásának szabályozása kulcskérdés. Az endogéntrombin potenciál (ETP) a pro- és antikoagulációs folyamato-kat tükrözi, így alkalmas a hipo- és hiperkoagulabilitás kimu-tatására. Helye van a diagnosztikában, terápia követésében ésalkalmazható a hemosztázist érintõ genetikai eltérések (új va-riánsok, a thrombosis rizikó- vagy védõfaktorainak) felisme-résében.
A TGT elsõ metodikáját 1953-ban közölték le. A módszermanuális és idõigényes volta miatt azonban nem terjedt el.Számítógép vezérelte kromogén szubsztrátos változata nagyelõrelépést jelentett a nyolcvanas években. Fluorogénszubsztrát bevezetésével a trombin generáció fibrinogén/fib-rin tartalmú plazmában és thrombocytadús plazmában (PRP)is mérhetõvé vált. A módszer pontosságát fokozta az automa-ták alkalmazása, de a standardizálás, az eredmények normali-zálása napjainkban is zajlik.
A trombinképzõdés kinetikáját sok tényezõ befolyásolja,így az alvadási faktorok és inhibitorok mennyisége, jellege; aszöveti faktor és egyéb stimulánsok; valamint a thrombocytákmennyisége és funkcionális tulajdonságai.
Az automatizált metodika (Calibrated AutomatedThrombogram, CAT) trombinszubsztrát kinetikáját méri afelszabaduló kromofór vagy fluoreszcens jel alapján, és szoft-ver program segítségével számítja ki a trombin aktivitását. Azaktivációs görbe, a kromogén/fluorogén szubsztrát folyama-tos hasításából keletkezõ növekvõ abszorpció (mA) az elteltidõ (min) függvényében ábrázolva, magában foglalja aszubsztrátnak a szabad trombin mellett a trombin-alfa2–makroglobulin komplex általi hasítását is, amelyet a számító-gépes program matematikai algoritmus alkalmazásával korri-gál. Az így származtatott görbe deriváltja adja a trombin ge-neráció görbét, melynek jellemzõi:� lag fázis (t_lag): a plazma alvadási idejével egyezik,� trombin csúcs (C_max), csúcsig eltelt idõ (t-max): az al-
vadási folyamat kiterjesztését jelenti,
� görbe alatti terület (AUC), az endogén trombin potenciál:a trombinaktivitás ideje alatt képzõdött teljes trombinmennyiségét fejezi ki.
A TGT több variációja ismert, amelyek a reakcióban résztvevõ komponensektõl függõen eltérõ érzékenységet mutat-nak az alvadási faktorok, inhibitorok, thrombocyták mûködé-sére. Fibrinolízisre szenzitív reakcióelegy kialakítása még vá-rat magára.
Klinikai alkalmazási lehetõségek:1. Antikoaguláns terápia követése. A különbözõ támadás-
pontú antikoagulálás közös pontja a trombin generációcsökkentése. A K-vitamin antagonisták a protrombin-trombin átalakulást fékezik. A frakcionálatlan heparin azantitrombin-trombin gátlást fokozza több nagyságrend-del. A direkt trombin gátlók az aktív centrumot gátolják, adirekt anti-Xa-szerek pedig a tenáz komlexben levõ fak-tort blokkolják. A TGT globális teszttel ezek a különbözõtámadáspontú hatások egy rendszerben követhetõk.
2. Hiperkoagulabilitás meghatározása. Ha a TGT a szövetifaktort (TF) alacsony vagy magas koncentrációban tartal-mazza, és trombomodulinnal (TM) vagy aktivált proteinC-vel (APC) egészíti ki, a rendszer alkalmassá válik foko-zott alvadási készség kimutatására.
3. Fokozott vérzékenység kimutatása. A teszt érzékeny acsökkent alvadási kapacitás kimutatására, így alkalmaslehet szerzett hígulásos alvadászavar (mûtéti hemodilú-ció) vagy öröklött vérzékenység faktorpótlásának megha-tározásában.
Trombelasztográfia (TEG)
A Hartert (1948) által feltalált mûszerrel a teljes vérviszkoelasztikus tulajdonságai, az alvadék képzõdésének,stabilitásának és oldékonyságának dinamikája követhetõvéváltak. A vérben alacsony, a vénás áramlást imitáló nyírófe-szültség mellett zajlik az alvadás az indukciótól a fibrinolízisbekövetkeztéig. Az akár órákig is eltartó folyamat méréseilyen formában nem tudott a diagnosztika fegyvertárába be-kerülni. A technikai változtatások eredményeként ma már apoint-of-care diagnosztika részévé vált. A TEG fejlesztettváltozata a rotációs trombelasztometria (ROTEM). Teljes vér(natív vagy citrátos) vagy plazma kerül az egyszer használa-tos küvettába, amelybe egy függõleges tengely körül rotációsmozgást végzõ henger merül. Az alvadék képzõdése a rotáci-ós mozgást lefékezi. A mozgás változását a mûszer matemati-kai transzformációval alvadék erõsséggé számolja (amplitú-dó/mm) és az idõ (s) függvényében ábrázolja. A szoftver gra-
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
267
fikusan és számérték szerint is elemzi a trombelasztogramotés az alábbi paramétereket adja meg:R Indítástól az alapvonaltól 2 mm eltérésig eltelt idõ (al-
vadási idõ, CT; alvadási faktorok és inhibitorokegyensúlya)
K Alapvonaltól (2 mm) 20 mm-ig eltelt idõ (alvadékképzõdési idõ, CFT)
Á TEG kezdeti meredeksége (2 mm-nél levõ meredek-ség; az alvadék keletkezésének sebessége)
MA Maximális amplitúdó (MCF, az alvadék erõssége,stabilsága: thrombocyta-fibrinogén interakció, fibrinpolimerizáció)
G Az alvadék rugalmassága (MCE)CL30 Az alvadék lízise adott idõben.TTL A fibrinolízis elindulásához szükséges idõ (MA-tól 2
mm; fibrinolízis aktivitás, FXIII).
A natív mintát 3 percen belül kell mérni, a citrátos mintanégy óráig stabil. Aktivátor nélküli mérés 30–60 percig, mígaktivátorral kb.10 percen keresztül tart.
A ROTEM nemcsak globális képet ad a beteg hemosztati-kus állapotáról, hanem differenciáldiagnosztikai eszközkéntis használható a tesztek módosításával.
Az EXTEM alapteszt, amelyben rekombináns TF indítjaaz alvadást. A maximális alvadék erõssége (MCFEXTEM) fõ-ként a thrombocyták mûködésétõl és a fibrinogénszinttõlfügg, és ha a küvetta thrombocytagátlót (cytochalasin D) tar-talmaz, szerepük szétválasztható. MCFFIBTEM méri a fibrino-gén hatását az alvadék erõsségében. Az MCF kritikus értéke15 perc, e fölött fibrinogén koncentrátum adása jön szóba.Normál MCFFIBTEM (>12 mm) és alacsony MCFEXTEM (<5mm) thrombocytapótlást indikál.
CTEXTEM jelzi a csökkent alvadékonyságot is, a faktorpót-lás (FFP, PCC) küszöbértéke 100 s.
Az EXTEM alapteszt és fibrinolízis gátló (aprotinin) tar-talmú teszt (APTEM) együttes meghatározásával kisfokúhiperfibrinolízis is kideríthetõ, ha a két méréssel kapott érté-kek hányadosa <0,8 (CTAPTEM/ CT EXTEM ).
Egyéb speciális mérési lehetõségek: INTEM (APTI-hezhasonló kontakt aktiváció) általános alvadási státusz megíté-lésére, HEPTEM heparináz tartalommal heparin hatás,ecarinnal pedig speciális antikoaguláns mérésre (hirudin) al-kalmas.
A ROTEM masszív vérzéseknél segítséget jelenthet adöntések meghozatalában, terápia indításában. Sebészeti vér-zésnél elsõként az EXTEM és a FIBTEM szimultán végzéseajánlott. Az INTEM és a HEPTEM meghatározás elsõkéntheparinizált betegnél indokolt, második lépésként pedig bár-mely sebészeti betegnél, ahol a heparinizáció a vérzéshezhozzájárulhat.
A TEG alkalmassá tehetõ a thrombocytablokkolókra(aszpirin, clopidogrel) non-responder vagy hiper-responderegyedek kiszûrésére. A trombin a legerõsebb thrombocytaagonista, és ha gátoljuk, a többi agonista hatása megítélhetõvéválik. A mérõrendszerben a heparin gátolja a trombint, a hoz-záadott reptiláz és FXIIIa fibrinhálót képes kialakítani athrombocytákkal együttmûködve. Arachidonsav vagy ADPhozzáadásával az MA közel normális lesz, kivéve azoknál,akik aszpirinre vagy clopidogrelre megfelelõen reagálnak.
Mikropartikulák
A plazmában jelen lévõ mikropartikulák (MPs) évtizedekóta ismertek. Megfigyelték, hogy nagy fordulatszámú centri-fugálás után a plazma alvadási ideje megnyúlik, tehát a centri-
fugálással prokoaguláns részecskék távolítódnak el a plazmá-ból.
Az utóbbi években ráirányult a figyelem a sejtekbõl levá-ló mikropartikulák hemosztázisban játszott szerepére. Forrá-suk sokféle: a keringésben levõ elemek közül elsõsorban athrombocyták (70–90%), illetve a vörösvértestek, fehérvér-sejtek, a helyhez kötöttekbõl pedig az endotél.
A thrombocytákból származó MPs (PMPs) keletkezhet-nek a thrombocytaaktiváció során, a megakaryocytákból amegakariopoiezis során, vagy a vérlemezkék apoptózisa ese-tén. Egyéb sejtekbõl szintén aktiváció, interakció vagy apop-tózis eredményez MPs-képzõdést. A részecskék lefûzõdöttmembrándarabok, foszfolipid-tartalmú vezikulák, a forrásuk-nak megfelelõ sejtmarkereket hordoznak, ezért kínálják ma-gukat a kutatás és a diagnosztika számára. Méretük 0,1–1 ìm.Fõbb összetevõjük fehérje, foszfolipid, de emellett mRNS-tés priont is hordozhatnak.
Egyensúlyi állapotban a membrán-foszfolipidek aszim-metrikus elrendezõdést mutatnak, ez három enzim mûködésé-hez kötõdik: flipáz, flopáz és szkrambláz. A flipáz afoszfatidil-szerint (PS) és foszfetidil-etanolamint (PE) kívül-rõl beforgatja, a flopáz foszfolipideket mozgat kifelé. Aszkrambláz foszfolipid transzportot végez a membrán kétmonolayere között, egyensúlyi állapotban inaktív.
MPs feltételezett képzõdési mechanizmusa a sejt aktiváló-dásakor vagy apoptóziskor: a felszabaduló Ca2+ enzimeketaktivál, melyek membrán átrendezõdést okoznak. Emellettaktiválja a kalpain enzimet, amely a fehérjék és a citoszke-leton közötti kapcsolat megszûnéséhez, ezáltal a membránbólMPs lefûzõdéshez vezet.
A MPs foszfolipid-tartalmának nagy százalékát általábanPS és PE adja, kivéve, ha endothelsejtbõl apoptózissal kelet-keznek, ekkor az annexin V tartalom magas.
A MPs fehérje tartalma is változhat, pl. a PMPs trombinvagy kollagén aktiváció után GP IIb/IIIa komplexet tartal-maz, míg komplement aktiváció után nem.
Több módszert használnak a MPs meghatározására. Mé-résére csak módosított impedancia FlowCytometer használ-ható. Másik lehetõség szolid-fázishoz kötõdésen alapszik(annexin/antitest), ahol a mennyiség mellett a prokoagulánsaktivitás mérhetõ, de ez nem alkalmazható minden esetben.
A PMPs prokoaguláns aktivitása 50–100-szorosa azugyanakkora méretû aktivált thrombocytafelszínnek. Ennekmagyarázata a TF jelenléte. A sérülés helyén az aktiváltendothelsejtbõl és thrombocytából egy protein-diszulfid-izomeráz szabadul fel, amely konformáció változást okoz aszöveti faktorban, így felgyorsul a komplexképzõdés aTF-FVIIa-FXa között.
A TF-MPs monocytákból is származhat (MMPs), ame-lyek P-szelektin ligandot (PSL-1) is hordoznak.
A keringõ MPs mennyisége emelkedhet különbözõ pato-lógiás állapotokban:1. thrombosis (VTE, HIT-II, TTP, PNH, sarlósejtes beteg-
ség);2. cardiovascularis betegség (hypertensio, hyperlipidaemia,
atherosclerosis, akut coronariaszindróma);3. infekció (sepsis, HIV, prion-betegség).
Az MPs patológiai szerepe miatt szükséges keletkezésük,aktivitásuk behatóbb ismerete, és a metodikák standardizálá-sa.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
268
A komplementrendszer laboratóriumi vizsgálatának indikációi
Indications to perform laboratory tests of complement system
Dr. Prohászka ZoltánSemmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika, Kutatólaboratórium
Kulcsszavak: komplement, immundeficiencia, HANO, atípusos HUS, autoimmun betegségKey-words: complement, immundeficiency, HAE, atypical HUS, autoimmune disease
A komplementrendszert a vérplazmában és más testned-vekben található glikoproteinek alkotják. A rendszer alapvetõjellemzõje a gyulladást elõmozdító és a kórokozók ellen vé-delmet nyújtó hatás.
A komplementrendszer felfedezése a 19. sz. végére tehe-tõ, amikor felismerték, hogy a kórokozók ellen termelt anti-testek sejtölõ hatásához szükség van friss szérumra. A rend-szer elnevezése is erre a jelenségre utal: eredetileg azt a szé-rumösszetevõt definiálták komplementként (komplementer-ként), ami kiegészítette az antitestek védõ hatását. A fehérje-kémiai, immunológiai és molekuláris biológiai technikák fej-lõdésével nyilvánvalóvá vált, hogy egy összetett enzimrend-szer képezi a komplementrendszert, mely mûködésében leg-inkább a véralvadás folyamatára emlékeztet. A komplementinaktív, egymást láncreakciószerûen aktiváló enzimek és sza-bályozó faktorok összessége.
A rendszer mûködésének alapvetõ célja az immun-homeosztázis fenntartása, melynek során a káros és veszélyesidegen valamint a megváltozott saját struktúráktól óvja, védia gazdaszervezetet. A komplement aktiválódása nemantigénspecifikus. A védõ hatást a rendszer három módon fej-ti ki, melyekkel alapvetõen járul hozzá a hatásos immunvá-lasz kialakulásához:1. képes sejteket feloldani (lízis),2. képes felületeket komplementfehérjékkel kovalens mó-
don megjelölni és ezáltal a fagocitózis számára kijelölni(opszonizáció),
3. képes a károsodás helyszínére gyulladásos sejteket tobo-rozni és azokat aktiválni (gyulladásos reakció).
A komplementrendszer a veleszületett immunitás része,mûködését antitestek és T-sejtek nélkül is képes kifejteni. Fi-logenetikai értelemben õsi rendszer, egyes elemei messze ko-rábban megjelentek, mint az immunglobulin molekulák õsei.A komplement aktiválódása a veszélyes struktúrák megjele-nésekor azonnal bekövetkezik, és így ilyen a természetes im-munitás humorális (testfolyadékokban oldott formában talál-
ható) ágának legfõbb végrehajtó rendszerét jelenti. A komple-ment gyors aktiválódását az teszi lehetõvé, hogy a rendszerelemei inaktív formában a keringésben, egyéb testfolyadé-kokban és nyálkahártyákon nagy mennyiségben jelen vannak.Az aktiválódást beindító struktúra megjelenésére a rendszerkaszkádszerû reakcióval válaszol. A kaszkádreakció soránegymást csupán egy peptidkötésnél hasítva (limitált proteo-lízis), megszabott sorrendben aktiválódó proteáz enzimek ke-letkeznek. A reakció eredményeként az aktivációt beindítófelszínen pórus keletkezik, melyet kovalensen kötõdöttkomplementfehérjék és a környezetbe diffundálódó gyulla-dást keltõ molekulák vesznek körül. A rendszer szabályozottmûködését az aktivált termékek gátlószereinek (komplementregulátor fehérjék) jelenléte biztosítja.
Az utóbbi években nyilvánvalóvá vált, hogy a komple-mentrendszer a kórokozókkal szemben nyújtott hasznos (di-rekt és indirekt) védelmen túl számos más folyamatban isrészt vesz.
A komplementrendszer kóros mûködéséveljellemezhetõ klinikai állapotok
A komplementrendszer vizsgálatának a klinikai gyakor-latban alapvetõen két indikációs területe van. Bármely komp-lementfehérje szerzett vagy öröklött hiánya esetén a rendszeregésze vagy jellegzetes része károsodhat (kaszkádszerû mû-ködés), ezt leggyakrabban a fertõzések iránti fokozott fogé-konyság (terminális komponensek hiánya esetén tokos bakté-riumokkal történõ infekciók, gyakran meningitis) és ritka kór-képek (pl. CD59 hiánya esetén paroxysmalis nocturnalishaemoglobinuria) kialakulásával kapcsolatban tapasztalhat-juk.
A komplementrendszer vizsgálatára a differenciáldiag-nosztika céljára vagy a betegségaktivitás felmérésére elsõsor-ban szisztémás autoimmun betegségekben (immunkomplex-betegségek, úm. SLE, antifoszfolipid szindróma és vasculiti-
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
269
1. táblázat
A komplementhiányok detektálhatósága funkcionális ELISA rendszerrel
A FUNKCIONÁLIS TESZTBEN MÉRT AKTIVITÁS
A CSÖKKENT MÛKÖDÉSÛ VAGYHIÁNYZÓ KOMPONENSEK
KLASSZIKUS LEKTIN ALTERNATÍV
C1q, C1r, C1s Alacsony Normál Normál
C4, C2 Alacsony Alacsony Normál
MBL, MASP2 Normál Alacsony Normál
B, D, P Normál Normál Alacsony
C3, C5, C6, C7, C8, C9 Alacsony Alacsony Alacsony
sek) vagy infektív kórképekben (pl. sepsis) kerül sor. A C3komplement szintje az akut fázis reakció kezdetén emelke-dést, annak tartós fennállása vagy súlyos mértéke esetén kó-ros csökkenést mutat. Sepsist kísérõen (gyakran az alvadásirendszer fehérjéivel párhuzamosan) csökkenhet a C3 szintje.Ez utóbbi állapotokban jellegzetes, hogy a túlzott mértékûkomplementaktivációt a rendszer funkcionális hiánya, kon-szumpciója követi csökkent hemolitikus aktivitással, ala-csony faktorszintekel.
A komplementrendszer vizsgálata az orvosilaboratóriumi gyakrolatban
A rendszer orvosi vizsgálatára több lehetõség is adódik:funkcionális tesztekkel (melyek vörösvértest-lízist [CH50,vagy „összkomplement”] vagy a litikus komplex kialakulásátmérik [funkcionális ELISA]) általános benyomást nyerhe-tünk a rendszer aktiválhatóságáról és az esetleges hiányzókomponensrõl (funkcionális teszt hiányplazmákkal), össze-foglalva lásd 1. táblázat.
A komplementrendszer vizsgálatára további lehetõség azegyes fehérjék mérése turbidimetriával, nefelometriával vagy
specifikus immunassay-vel. A napi gyakorlatban a C3, a C4és a C1-inhibitor mérése terjedt el, a további mérések specia-lizált laborok feladatát jelentik. A komplementdeficienciákközül a C1-inhibitor hiány (örökletes angioödémás állapot,HANO) és a defektív komplement-reguláció (H faktor, I fak-tor hiány, hemolitikus uraemiás szindrómában) fordul elõgyakran. Aktív SLE vagy más szisztémás autoimmun beteg-ségben a C3 szintjének csökkenése alakul ki, amelyet gyakrana C1q és a C4 hiánya is kísér. A típusos és gyakori leleteket(komplement-profil) a 2. táblázat foglalja össze.
Ismerünk olyan klinikai állapotokat is, amelyekben vala-mely komplementfehérje ellen kialakuló (funkcionális gátlástokozó) antitestek jelentik a kórokot. Anti-C1–inhibitor anti-test esetén az angioödémás állapot szerzett formája, míganti-H faktor autoantitest mellett az atípusos HUS szerzett,autoimmun formája áll fenn. SLE-ben gyakran figyelhetõmeg anti-C1q autoantitest, ami gyakran aktív lupus neph-ritisszel jár együtt.
AppendixA komplementdiagnosztikai laboratóriumban elérhetõ
vizsgálatok listája és mintaküldés: www.kutlab.hu
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
270
2. táblázat
Típusos eltérések a komplementrendszer elemeiben
KLINIKAI ÁLLAPOT C3(0,7–1,8 g/l)
C4(0,15–0,55 g/l)
CH50(48–103 CH50/ml)
C1-INHIBITOR-SZINT(64–160%)
C1–INHIBITORAKTIVITÁS(70–130%)
EGYÉB
SLE (aktív) Csökkent Csökkent Csökkent Normál Normál APR nem magas
HANO I Normál/csökkent Csökkent Csökkent Csökkent Csökkent
HANO II Normál/csökkent Csökkent Csökkent Normál Csökkent
HUS Csökkent Normál Normál/csökkent - - I-, B- vagy H fak-tor eltérés
Akut gyulladás Emelkedett Normál Normál Emelkedett - APR emelkedett
Daganatos betegség Jelentõsen emel-kedett
- Jelentõsen emel-kedett
- -
HANO I: öröklött C1–INH hiány I-es típus, a mutáns fehérje nem jelenik meg a keringésben; HANO II: öröklött C1–INH hiány II-es típus, a mu-táns fehérje megjelenik a keringésben, de hibás; HUS: hemolitikus urémiás szindróma; APR: akut-fázis reaktáns
Újabb labordiagnosztikai paraméterek szerepe a vesefunkció vizsgálatában
Diagnostical role of new biomarkers in monitoring of renal function
Dr. Kocsis IbolyaSemmelweis Egyetem, Labormedicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest)
Kulcsszavak: akut veseelégtelenség, neutrofil gelatináz-asszociált lipokalin (NGAL), N-acetil-béta-D-glukózaminidáz (NAG),praerenalis azotaemia, tubularis károsodásKey-words: acute kidney injury, Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), N-acetyl beta-D- glucoseaminidase (NAG),prerenal azotaemia, tubular injury
Évtizedek óta kitartóan kutatnak olyan specifikus és meg-felelõen érzékeny markereket, amelyek segíthetik a vesebe-tegségek korai diagnózisát. A vesemûködést jellemzõ stan-dard klinikai kémiai vizsgálatok (szérumkreatinin, -karba-mid) azonban nem elég érzékenyek és specifikusak a vesebe-tegségek, különösen az akut veseelégtelenség korai diagnózi-sának felállításához. A biológiai mintákban (szérum, vizelet)mérhetõ koncentrációik változása a vesefunkció változásátcsak jelentõs mértékû késéssel követi, ez nagymértékben hát-ráltatja a megfelelõ vesevédõ terápia azonnali megkezdését.Ezért nagy az igény érzékenyebb, a vesemûködés kóros elvál-tozására gyorsabban reagáló paraméterekre, biomarkerekre.Segítségükkel egyrészt elkülöníthetõvé válhatna a korai akuttubuláris nekrózis az akut veseelégtelenség egyéb formáitól(praerenalis vesekárosodás, akut glomerularis, vascularis ésintestinalis vesekárosodások és obstruktív nephropathiák),másrészt könnyebbek lennének a dialízis alkalmazásával kap-csolatos döntések, elõre jelezhetõ lenne a vesevédõ terápiahosszú távú eredményessége vagy a betegség prognózisa,monitorozható a nefrotoxikus szerek mellékhatása.
Az utóbbi évtizedben több kis molekulasúlyú, a vizelet-ben megjelenõ fehérjemolekula szerepét vizsgálták abból aszempontból, hogy segítheti-e az akut veseelégtelenség koraidiagnózisát.
Cisztatin-CA 13 kDa molekulasúlyú fehérje, ami a glomerulusokban
szabadon filtrálódik, a tubulusokban reabszorbeálódik, kata-bolizálódik. Szérumszintje független az életkortól, a beteg ne-métõl vagy az izomzat tömegétõl. Klinikai vizsgálatok soránemelkedett volt a vizeletben a cisztatin-C szintje ismerttubuluskárosodás esetén. Az elmúlt évtizedben végzett vizs-gálatok igazolták, hogy a cisztatin-C segíthet a glomerularisfiltrációs ráta (GFR) megítélésében, valamint bizonyították,hogy kreatininnál jobban lehet segítségével elõre jelezni idõsbetegeknél a halálozást vagy valamely cardiovascularis ese-ményt.
N-acetyl-b-glukózaminidáz (NAG)A proximalis tubulusok lizoszómális enzime. Az utóbbi
években végzett vizsgálatok igazolták a paraméter jelentõsé-gét és kellõ érzékenységét a tubularis károsodás korai felis-merésében.
Béta2-mikroglobulinKis molekulasúlyú fehérje, az MHC I molekulák könnyû
láncú komponense, valamennyi maggal rendelkezõ sejt fel-színén megtalálható. A glomerulusokban filtrálódik, majd aproximalis tubulusokban részben reabszorbeálódik. Vérszint-
je myeloma multiplexben, CLL-ben megemelkedik. A tubu-luskárosodás lehetséges korai markere.
Alfa-1-mikroglobulinA 27–33 kDa molekulasúlyú fehérjét a máj szintetizálja.
A vérben 50%-ban az IgA-hoz kapcsolódik. A szabadon ke-ringõ molekulák a glomerulusokban filtrálódnak, a proxima-lis tubulusokban szívódnak vissza. A vizelettel ürülõ fehérjestabilitását a pH nem befolyásolja (szemben a béta-2-mikroglobulinnal), ezért megbízhatóbban mérhetõ klinikailaboratóriumi módszerekkel. Diagnosztikus értékét igazoltáka proximalis tubulusok károsodásának korai felismerésében,a károsodás azon fázisában, amikor hisztológiai vizsgálatok-ban az elváltozások még nem láthatóak. A fehérjeszintet im-munkémiai módszerekkel mérik, azonban ezeket nemzetköziszinten nem standardizálták.
Neutrofil gelatináz-asszociált lipokalin (NGAL)A neutrofil granulocytákban azonosították, 25 kDa mole-
kulasúlyú protein. Képzõdése nemcsak a neutrofilekhez köt-hetõ a csontvelõben, hanem epithelsejtekben, így a vesében aHenle-kacs vastag felszálló ágában és a gyûjtõcsatornákepitheljében is indukálódhat gyulladásos vagy egyéb malig-nus folyamatok hatására.
Az NGAL-t úgy azonosították, hogy az ezt kódoló génexpressziója az akut tubularis vesekárosodás állatmodelljé-ben tízszeresére nõtt. Gyermekeken, cardiopulmonalisbypass mûtét után, a vizeletben az NGAL szintje jelentõsen ésmár a korai fázisban nõtt, 1–3 nappal korábban, mint a szé-rum-kreatininszint. Több vizsgálat igazolta korai diagnoszti-kus szerepét akut veseelégtelenség esetén, a vizeletben mértkoncentrációi jól korreláltak a veseszövet károsodásánakmértékével. Jelentõs a prediktív értéke az alkalmazandó dialí-zis terápia szükségességének megítélésében, segítségévelmegítélhetõ vesemûködés adott szinten történõ regenerálódá-sát elõsegítõ klinikai terápia sikeressége. További vizsgálatokigazolták, hogy az NGAL vizeletben mérhetõ koncentrációijól tükrözték a szöveti károsodás mértékét és súlyosságánakfokát olyan krónikus vesebetegségekben is, mint az egyesautoimmun betegségekhez társuló vesebetegségek, glome-rularis károsodások, valamint autoszomális, dominánsanöröklõdõ polycystás vesebetegségek.
Interleukin-18Gyulladásos akut fázis reakcióban részt vevõ citokin. A
vesében a proximalis tubulusokban nagy mennyiségben kép-zõdhet. Vizeletben mérhetõ koncentrációja 6–12 órával a ve-seszövet akut károsodása után éri el maximumát. Akutischaemia esetén 24 órával megelõzi a szérum-kreatininszintjelentõs emelkedését. Differenciáldiagnosztikai jelentõsége,
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
271
hogy krónikus vesebetegségben, valamint praerenalis azot-aemiában koncentrációja nem változik szignifikánsan.
KIM-1 („vesekárosodást jelzõ molekula-1”)A molekula egy I. típusú sejtmembrán glikoprotein. Ál-
latkísérletekben, PCR vizsgálatokkal sikerült fokozott mérté-kû képzõdését igazolni, ischaemia/reperfúzió után regenerá-lódó veseszövetben. Ischaemiás károsodásban bizonyíthatóvolt korai diagnosztikus jelzõértéke, amely jelentõsen meg-elõzte a hagyományos paraméterek esetében mérhetõ kon-centrációemelkedést. Segítségével sikerült elkülöníteni a szö-veti károsodással járó akut vesebetegségeket a prerenálisazotaemiától és a krónikus veseelégtelenségtõl. Akut vese-elégtelenségben a KIM-1 fehérje szintje 12 órával a károso-dás után emelkedett meg. Segít elõre jelezni a dialízis-igényt.
Retinolkötõ fehérje (RBP)Ez a 21 kDa súlyú, az A-vitamin transzportjáért felelõs fe-
hérje a májban szintetizálódik. A vesében a glomerulusokbanszabadon filtrálódik, majd a proximalis tubulusokban reab-szorbeálódik, lebomlik. Különbözõ eredetû akut veseelégte-lenségben szenvedõknél igazolták, hogy a fehérje vizeletbenmért koncentrációja segít megítélni a renalis tubularisdiszfunkciót, egyes vizsgálatok bizonyították korai jelzõérté-két, mely megelõzte a NAG enzim mérhetõ, diagnosztikus ér-tékû aktivitásváltozását.
A fenti eredmények jelzik, hogy a rutin klinikai laborató-riumi diagnosztikában a vesefunkció vizsgálatára számos újparaméter megjelenése várható. Ezek diagnosztikus értéké-nek a felméréséhez azonban további széleskörû, jól megterve-zett prospektív klinikai vizsgálatok szükségesek.
A tápcsatorna betegségeinek laboratóriumi diagnosztikája
Laboratory diagnostics of gastrointestinal diseases
Dr. Hamar PéterSemmelweis Egyetem, Kórélettani Intézet
Kulcsszavak: kilégzési tesztek, széklet vizsgálatok, tápcsatorna malignitások, Helicobacter pyloriKey-words: breath tests, stool examinations, gastrointestinal malignant diseases, Helicobacter pylori
Kilégzési tesztek
A tápcsatorna mûködési zavarainak vizsgálatára funkcio-nális tesztek (kilégzési tesztek) alkalmasak; ezek csak POCTtörténhetnek (szakrendelõben, betegágy mellett).
Szénizotóp vizsgálatA H. pylori fertõzés diagnózisára a legelterjedtebb nem-
invazív vizsgálat. 13C-, illetve 14C-izotóppal jelzett urea (ureakilégzési tesztek (urea breath test: UBT) fogyasztás (p.o.)után a gyomorban H. pylori az ureából ureáz enzim aktivitásarévén jelzett szén-dioxidot szabadít fel, ami a kilélegzett leve-gõben detektálható.
A radioaktív 14C-izotópot szcintillációs (b-)számlálóvallehet kimutatni. A radioaktív 14C-gyel jelzett ureát a betegkapszulában lenyeli. A pozitivitás esetén a 14C-szén-dioxid 15percen belül megjelenik a kilélegzett levegõben, és kis célké-szülékkel a helyszínen kimutatható: a páciens egy kis tasakba(légzési kártya) fújja ki a levegõt, amíg a teszten látható szín-jelzés meg nem változik. Ezt követõen a légzési kártyát a mé-rõkészülékbe helyezzük, mely megméri a kilélegzett levegõ14CO2-izotóp aktivitását. A radioaktív (14C) vizsgálat sugár-terhelése jelentéktelen (1 Ci). Elõnye, hogy a kimutatás ol-csóbb technológiát igényel, ami szélesebb körû alkalmazásttesz lehetõvé.
A nem sugárzó 13C-izotópot tömegspektrofotométerrellehet kimutatni a kilégzett levegõben. Az eredmények alapjánmegadható a kilélegzett levegõ 12C/13C aránya, vagy a 13C el-fogyasztása elõtt és után kilélegzett levegõminta 13CO2-tartalmának különbsége. A 13C-izotóp-detektálás másik mód-ja speciális infravörös spektrofotométer (nem diszperzív inf-ravörös spektrofotométer – NDIR), melyben izotópszelektívmódon nyelõdik el az infravörös fény. A szén 13C-izotópdetektációjának ezen egyszerûsödésével alkalmazása terjed.
Az izotópvizsgálatok során az urea mellett egyéb jelölttesztanyagokat is lehet alkalmazni. A leggyakrabban vizsgáltbetegségek: laktózintolerancia (jelölt anyag: laktóz); króni-kus pancreatitis (jelölt anyag: zsír; triolein)þ; felszívódási za-var (jelölt anyag: glükóz); gyomorürülés zavara (jelölt anyag:acetát).
Egyéb izotópos vizsgálatokSzelén-homokólsav taurin konjugátuma (Seleno-homo-
cholic acid-taurin conjugate – SeHCAT) scan: epe-malabsorptio vizsgálat. Radioaktív szelénnel jelölt szinteti-kus epesavat fogyaszt a beteg intesztinosolvens kapszulában.A malabsorptio kimutatására a legpontosabb vizsgálóeljárás.
51Cr-EDTA: bélfal permeablitás vizsgálata: radioaktívkrómmal jelzett EDTA-t fogyaszt a beteg per os, majd vizs-gálják a 24 órán át gyûjtött vizelet radioaktivitását.
Hidrogénkilégzési teszt. A laktózintolerancia esetén alaktáz enzim örökletes, részleges vagy teljes hiánya van jelen.Ebben az esetben az elfogyasztott laktóz a vastagbélbe kerül,ott a baktériumok bontják – ennek eredményeként H2 keletke-zik. Egészséges szervezetben nincs a kilélegzett levegõbenH2. Megjelenése laktóztartalmú táplálék (pl. anyatej) fo-gyasztása után a diszacharid bakteriális fermentációját jelzi.A hidrogénkilégzési teszt során a betegnél kilégzett levegõ-ben vizsgálják tesztanyag fogyasztása után a H2-szint értékét.
Laboratóriumi tesztek
Székletvizsgálatok
Vérzés kimutatásaA gastrointestinalis vérzés mindig kivizsgálást igényel. A
székletben a vér kimutatására használt laboratóriumi módsze-rek kétféle elven alapulnak:
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
272
1. „Hagyományos” katalizált színreakciók. A reagensbenalkalmazott speciális festékszerû vegyületet (guajakgyanta, benzidin stb.) a hidrogén-peroxid igen lassan oxi-dálja, azonban vér jelenlétében a hem katalizálja a reakci-ót, és H2O2 hozzáadását követõen 1 percen belül intenzívszínes termék keletkezik. Az eljárások szenzitívek, deaspecifikusak. Álpozitivitást okoz: állati véres hús vagymás oxidáló anyagok: peroxidáztartalmú ételek, mint tor-ma, retek, répafélék, gyógyszerek, különösen redoxi tu-lajdonságú aszkorbinsav, vas és réz készítmények stb. fo-gyasztása. Pozitív teszteredmény esetén el kell végezni azimmunkémiai tesztet is.
2. Immunkémiai tesztek. Monoklonális ellenanyag-festékkonjugátumot tartalmaznak a humán hemoglobin specifi-kus immunológiai-módszerrel történõ kimutatására(hemoquant). Nem a hem, hanem a globin immunológiaikimutatásán alapszik, ezért álpozitivitással nem kell szá-molni. Ezeknél a teszteknél (immunkromatográfiás kivi-telben) a kis mennyiségû széklet vizes, vagy pufferes ext-raktumát használják mintaként, és színreakció, illetve szí-nes kromatográfiás sáv jelzi a pozitivitást.
Steatorrhoea vizsgálataSteatorrhoea: a széklet zsírtartalma >7 g/nap. Legtöbb-
ször fehérje és szénhidrát emésztési zavarok is kísérik. Azemésztetlen fehérje a vastagbélben bakteriálisan fermentáló-dik, aminek következtében a steatorrhoeás széklet bûzös.
Kimutatás. A széklet zsírtartalmának laboratóriumi meg-határozását kevés intézetben végzik. A széklettel ürített napizsírmennyiség meghatározására általában 72 órás gyûjtöttszékletminta tömegét és zsírkoncentrációját lehet meghatá-rozni. Még pontosabb, ha két szín indikátor (pl. kárminfesték)szájon történõ fogyasztását követõen, a színek székletben tör-ténõ megjelenésével jelöljük a széklet-mintagyûjtés kezdetétés végét.1. Szemikvantitatív mikroszkópos vizsgálat: a széklet sudan
festését követõen a látóterenkénti zsírcseppek számánakmeghatározása.
2. Kvantitatív meghatározások: a gyûjtött széklet tömegétmegmérik, majd egy kisebb részletét (5–10 gramm) szer-ves oldószerrel extrahálják, az oldószer elpárologtatásaután gravimetriásan mérhetõ a kioldott zsír tömege.Egyéb eljárással az extrakcióval együtt savas hidrolízistvégeznek és a keletkezõ zsírsavak mennyisége mérhetõ,például lúgos titrálással, vagy fotometriásan.
Újabb, Magyarországon nem alkalmazott eljárás a sztea-tokrit-érték meghatározása (0,5 g hígított székletet he-matokritcsõben perklórsavval centrifugálva a szárazanyagtartalom és a zsír elválik: százalékos arány meghatározható ahematokrithez hasonlóan), illetve az infravörös-közelispektrometriás analízis (near infrared spectrometric analysis– NIRA): a székletminta felszínérõl visszaverõdõ fény hul-lámhossza függ a széklet összetételétõl.
Egyéb székletvizsgálatokMikrobiológia vizsgálatok végezhetõek virális, bakteriá-
lis vagy parazita eredetû bélfertõzés gyanúja esetén.
Gyulladást kísérõ jelenségek a székletben, gastroente-ritisekben, autoimmun folyamatokban, tumor esetén: fehér-vérsejtek: lymphocyták, granulocyták kimutatása a széklet-bõl. Továbbá kimutathatók a székletbõl albumin, granulo-cytatermékek: laktoferrin, calprotectin, melyek alkalmasak agyulladásos bélbetegségek (IBD) diagnosztizálására, monito-rozására.
Colorectalis carcinoma kimutatásában új labordiagnosz-tika a tumor metabolizmusban részt vevõ fehérje: piruvát-kináz M2 (M2–PK) kimutatása székletbõl ELISAval.
Vér- és vizeletvizsgálat
Gastrointestinalis enzimek, hormonokElasztáz. A hasnyálmirigy exokrin enzimek megemész-
tõdnek a béltraktusban, csak kis hányaduk ürül a széklettel.Kivétel a pancreaticus elasztáz: a többi hasnyálmirigy enzim-mel azonos mennyiségben termelõdik, székletbõl enzim-immunassay (EIA)-vel mérhetõ mennyisége a hasnyálmirigyexokrin funkciójának jó mutatója. Az exokrin hasnyálmirigy-enzimek (lipáz, amiláz) megjelenése a vérben hasnyálmirigy-károsodásra (akut pancreatitis) utal.
Gasztrin. Enyhén emelkedett szintje antrum G-sejt hyper-plasiára, magasabb szint paraneoplasiás gasztrintermelésreutal. Amennyiben a szérum-gasztrinszint magas, szekretintesztet lehet végezni: a szekretin egészségesekben és antrumG-sejt-hyperplasiában gátolja az antrum G-sejtek gasztrin el-választását, míg Zollinger–Ellison-szindrómában (pancreasgastrinomában) a gasztrinelválasztás fokozódik (paradox vá-lasz).
Autoimmun betegségek, anemia perniciosa, gyulladásosbélbetegség és coeliakia
Feniek kimutatását külön elõadás mutatja be.
TumormarkerekSzámos gastrointestinalis tumormarker (CEA, CA 19–9,
TPA) ismert, azonban alacsony szenzitivitásuk és specifi-citásuk miatt elsõsorban kezelt pozitív tumorok utánköve-téses vizsgálatában alkalmazhatóak, szûrésre kevésbé.
Egyre több genetikai markert használnak a rizikóbecslé-sére (APC-teszt).
Felszívódási tesztekA cukorfelszívódási tesztek elõnye, hogy nincs radioaktív
terhelés. Általában egy mono- és egy diszacharid kombináci-óját adják (mannitol/laktóz vagy szacharóz) szájon át és vize-lettel történõ ürítést vizsgálják.
D-xilóz teszt: A xilóz növényi cukor, pentóz mono-szacharid, anyagcseréje hormonálisan nem szabályozott,jejunumból szívódik fel emésztés nélkül. A tesztanyag (5gramm 100–200 ml vízben oldva) elfogyasztása után 1 órávalmérik koncentrációját a vérben, esetenként 5 óra múlva a vi-zeletben. Normálisan a vér D-xilóz koncentrációja 1 óra múl-va >1,3–1,5 mmol/l (30–35 mg/dl), vizeletben 5 óra múlva >7mmol/l. Ennél kisebb mért koncentráció felszívódási zavarrautal, aminek a hátterében súlyos coeliakia és malabsorptiótokozó proximalis vékonybél-rendellenességek állnak.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
273
Neuroendokrin daganatok diagnosztikája
Laboratory diagnosis of neuroendocrine tumors
Dr. Patócs AttilaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet
Kulcsszavak: neuroendokrin daganat, hormontermelés, chromogranin AKey-words: neuroendocrine tumor, hormone secretion, chromogranin A
A neuroendokrin daganatok ritka, többnyire jóindulatúelváltozások, amelyeknek a morbiditása a tumorsejtek általtermelt hormonok fokozott elválasztásához köthetõ. Klasszi-kus értelemben neuroendokrin daganatok az enterochromaf-fin sejtekbõl kiinduló tumorok, a carcinoidok és a mellékve-sevelõ chromaffin sejtjeibõl kiinduló phaeochromocytoma.Tágabb értelemben a szervezet más szöveteiben találhatóneuroendokrin sejtekbõl kiinduló daganatok (a medullárispajzsmirigy carcinóma, mellékpajzsmirigy adenoma, hypo-physis adenoma, neuroblastoma) és más hormontermelõ da-ganatok (a kissejtes tüdõrák, prosztatarák, emlõdaganatok ésa pancreas szigetsejt tumorok) is ebbe a csoportba tartoznak.
Közös jellemzõjük, hogy intracitoplazmatikus (szekre-toros) granulumokat tartalmaznak, különbözõ biogén amino-kat, peptideket termelnek. A daganatok gyakran tünetmente-sek, máskor carcinoid vagy egyéb endokrin szindrómák képé-ben jelentkezik. Felismerésük sokszor nehéz, a pontos diag-nózis felállításához a klinikai megjelenés, a laboratóriumi, aképalkotó és újabban a molekuláris biológiai vizsgálatokeredményeinek együttes értékélése alapján lehetséges.
A laboratóriumi diagnosztikában egyre nagyobb szerepetkap a chromogranin-A (CgA). A CgA a chromogranin/sec-retogranin család tagja a mellékvesevelõben, valamint agastrointestinalis rendszer és a pancreas endokrin sejtjeibenképzõdik. Fiziológiai szerepe kevésbé ismert enzimatikus ha-sításával egy aktív peptid, a pancreastatin képzõdik. A CgA-ból származó pancreastatin állatkísérletben hyperglykaemiátokoz, gátolja a glükóz indukált inzulinfelszabadulast a panc-reas béta-sejtjeibõl. Szintén a CgA hasításából származóvasostatinnak vasoconstrictiót gátló hatása van. Klinikai je-lentõség szempontjából a legjelentõsebb lehet a catestatin,amely a sympathicoadrenalis rendszer katecholaminelválasz-tásának egyik szabályozója, és egyes adatok szerint az ala-csony catestatinszint összefügg a növekedett adrenalinterme-léssel, ami hypertoniához vezethet.
A szöveti és szérum-CgA vizsgálatára alkalmas új labora-tóriumi módszereknek köszönhetõen a szöveti és szérum-CgA-szint a carcinoid tumorok specifikus általános markeré-vé vált. Az 5-HIAA-vizsgálattal szemben elõnye, hogy mígaz 5-HIAA-vizsgálat a középbél, ritkábban az elõbél eredetûcarcinoid daganatok biokémiai kimutatására alkalmas, a szé-rum-CgA-koncentráció az elõ-, közép- és utóbél eredetû da-ganatos betegekben egyaránt emelkedett. A CgA-meghatá-rozás klinikai indikációi közé tartozik a neuroendokrin daga-natok diagnosztikája és a betegek nyomonkövetése. Rosszin-dulatú áttétes daganatok esetében extrém CgA-értékeket iga-zolhatunk. A vizeletbõl mérhetõ 5-hidroxi-indolecetsavval(5-HIAA) szemben jelentõs elõnye, hogy a hormonálisaninaktív daganatok esetében is emelkedett lehet a szinjte; aszérum-CgA érzékenysége felülmúlja a vizelet-5-HIAA vizs-gálat érzékenységét, különösen elõbél és utóbél eredetûcarcinoid tumorokban, melyek ritkán vagy nem okoznak fo-kozott 5-HIAA-ürítést. Carcinoid tumoros betegekben a szé-
rum-CgA-szint növekedésének mértéke a tumoros folyamatkiterjedtségét is jelezheti. A szérum-CgA-szint értékelésekorugyanakkor figyelembe kell venni, hogy a carcinoid tumoro-kon kívül egyéb neuroendokrin daganatok, phaeochromo-cytoma, illetve mellékvesekéreg-carcinoma esetén is magasszérum CgA-koncentráció mérhetõ. A neuroendokrin daga-natok mellett szerepe a prosztatarák diagnosztikájában és al-kalmazható és akár normális prostatspecifikus antigén (PSA)szint esetén is jelezhet. Emlõrák esetében alkalmazhatóságá-ról az eredmények ellentmondásosak. Az endokrin mirigy da-ganatai közül mellekpajzsmirigy hyperplasia, a pajzsmirigyC-sejtes hyperplasiaja is CgA növekedést okozhat. Emelke-dett értékeket találhatunk veseelégtelenségben, májelégtelen-ség és súlyos szívelégtelenségben is.
Fontos megjegyezni, hogy egyes neuroendokrin dagana-tokban a CgA-t hasító enzim hiánya miatt a CgA-ból nemképzõdik pancreastatin, ezért a szérum pancreastatin kimuta-tásán alapuló vizsgálatok érzékenysége kisebb lehet. A carci-noid tumorok diagnózisára a többi újabb marker, mint pl. aszérum neuronspecifikus enoláz (NSE) vagy a tumorM2-piruvát-kináz izoenzim (TM2-PK) diagnosztikus értéke isalulmarad a szérum-CgA-vizsgálat értékéhez képes.
A hypaciditás, atrophiás gastritis, valamint a savszekré-ció-gátlás (pl. protonpumpagátló kezelés) során a másodlagoshypergastrinaemia és a gyomor enterochromoffin-szerû sejt-jeinek aktivációja miatt nõ a szérum CgA-szint. A CgA-szintmérése elõtt gyógyszertípustól függõen legalább három fele-zési idõ hosszáig az ilyen kezelés felfüggesztése javasolt. Azétrendi tényezõk kevésbé befolyásolják szérum szintjét, tehátolyan az megszorításoktól, mint amilyeneket a vizelet5-HIAA vagy a vizelet-katecholamin meghatározásakor ér-vényesítünk, a CgA-méréskor eltekinthetünk.
A CgA-meghatározás 2009-ig kizárólag radioimmuno-assay-vel történt, jelenleg a nemzetközi ajánlásoknak megfe-lelõen a CisBio cég kettõs, monoklonális antitestet használóreagenseivel is végezhetõ. Ez ugyanazokat az antitestekethasználja, mint amelyeket a RIA is használt, a két módszerközött mind érzékenységben, mind pedig a referenciatarto-mány vonatkozásában is nagyfokú a hasonlóság.
A CgA-szint mérése mellett továbbra is fontos a gyûjtöttvizelet 5-HIAA-szint meghatározása neuroendokrin daganatgyanúja esetén. Az 5-HIAA a szerotoninlebomlás végtermé-ke, szerotonint termelõ daganatok eseten a specificitása rend-kívül magas (100%), de az érzékenysége valamivel kisebb(73%). Sajnos a hormonálisan inaktív daganatok során értékenormális is lehet. Hangsúlyozzuk, hogy a szerotoninnak isvan napszaki ritmusa, ezért mindenképpen javasolt a 24 órásvizeletgyûjtés. Fals emelkedést coeliakia, Whipple-kór és bi-zonyos ételek (banán, kiwi, földimogyoró, kakaó, avokádó),gyógyszerek (acetaminophen, naproxen) tapasztalhatunk.
Neuroendokrin daganatok tumormarkere a neuronspeci-fikus enoláz, ami a neuroectodermalis eredetû sejtekre jellem-zõ. Elsõdlegesen a neuroblastoma diagnosztikájában használ-
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
274
ják, de kissejtes tüdõrákban, prostatarákban és pajzsmirigy-rák esetén is fontos diagnosztikus eszköz.
A neuroendokrin daganatok sejtspecificitása miatt agastrinomák vagy a vazoaktív intestinalis peptidet (VIPoma)termelõ daganatok diagnosztikájában fokozott jelentõségevan a gasztrin-, illetve a VIP-koncentráció meghatározásá-nak. A gasztrin a gyomor, duodenum és hasnyálmirigybentermelõdõ peptidhormon, amely a gyomorsav-elválasztáststimulálja. Emelkedett értékeket Zollinger–Elison-szindró-mában, multiplex endokrin neoplasia 1-es típusához (MEN1)társult gastrinoma, esetében, G-sejtes hyperplasia, súlyos
májbetegség, chirrosis, veseelégtelenség, rövid bél-szindró-ma, pylorusstenosis, vagotomia utáni állapot, autoimmungasztritis, savcsökkentõ szerek adása során mérhetünk.
A neuroendokrin daganatok közül számos, öröklõdõ en-dokrin tumorszindróma részeként léphet fel. Ezek közé tarto-zik a MEN1 mellett a de Carney-komplex, von Hippel–Lindau-szindróma és MEN2, amelyeknél szintén is elõfordul-hatnak neuroendokrin daganatok. Ezeknek a szindrómáknakjól ismert a genetikai háttere, molekuláris genetikai eljárások-kal a felelõs géneltérések beazonosíthatóak. A mutáció-szûrésnek jelentõsége van a még tünetmentes, de mutációthordozó egyének a korai diagnózisa során.
Autoimmun betegségek laboratóriumi diagnosztikája
Laboratory Diagnosis of Autoimmune Diseases
Dr. Gergely PéterSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Immunológiai Laboratórium
Kulcsszavak: autoimmun betegségek, laboratórium, diagnózis, autoantitest, komplementKey-words: autoimmune disease, laboratory, diagnosis, autoantibody, complement
Az autoimmun betegség klinikai diagnózisNincs általában vett autoimmunitást igazoló laboratóriu-
mi vizsgálat vagy vizsgálati panel. A kezelõorvosnak a beteg-ség tünetei alapján munkadiagnózist kell felállítani, s ennekmegerõsítését vagy kizárását szolgáló laboratóriumi teszteketkell kérnie. A legfontosabb tesztek e tekintetben az auto-antitest-vizsgálatok.
Antinukleáris antitest (ANA)Az antinukleáris antitest (ANA) gyûjtõfogalom, mely na-
gyon sokféle specificitású antitestet jelent. Az ANA „screen”a legtöbb szisztémás (és nem szisztémás) autoimmun beteg-ségben, de tumorokban, gyulladásokban is pozitív lehet. Apozitív lelet további diagnosztikai lépéseket indokol. AzANA-vizsgálat elvégzendõ szisztémás autoimmun betegsé-gek, systemás lupus erythematosus (SLE) és rokon kórképek,illetve autoimmun hepatitis gyanúja esetén, valamint juve-nilis idiopathiás arthritis (JIA) diagnózisa esetén differenciál-diagnosztikai és prognosztikai céllal. Az ANA számos külön-bözõ antitestet foglal magába:1. Centromer antitest: elsõsorban limitált cutan scleroder-
mában, ritkábban primer biliaris cirrhosisban (PBC) for-dul elõ. Diagnosztikai jelentõsége: scleroderma gyanúja,differenciáldiagnózisa, Raynaud-szindróma differenciál-diagnózisa – a pozitivitás a scleroderma késõbbi kialaku-lását jelzi, illetve PBC prognosztikája – a pozitív lelet ascleroderma egyidejû fennállására utal.
2. ENA (extrahálható nukleáris antigének elleni antitestek):szintén gyûjtõnév. Az Sm, majd U1–RNP, SS-A és SS-B,késõbb a PCNA, Scl-70, Ku, Mi-2, Jo-1 és PM-1 antites-teket szokás ebbe a csoportba sorolni. A fentiek közül azalábbiakat vizsgáljuk:a) SS-A (Ro) és SS-B (La) antitestek: diagnosztikai je-
lentõsége primer vagy szekunder Sjögren-szindróma(SS), SLE , subacut cutan lupus (SCLE), valamintneonatalis lupus gyanúja, illetve diagnózisa eseténvan. Az SS-A és B nagyon gyakran együtt fordul elõ.
b) Scl-70 antitest: (a DNS topoizomeráz I elleni antitest)diffúz sclerodermában (PSS-ben) fordul elõ, és rossz
prognózisra utal. A Raynaud-betegek egy része pozi-tív, ezekben a PSS kockázata nagy.
c) Jo-1 (aminoacil-tRNS-szintetáz) antitest: polymyo-sitis/dermatomyositisben (annak is egy alcsoportjá-ban, az anti-szintetáz szindrómában) fordul elõ. Diag-nosztikai jelentõsége: polymyositis-dermatomyositisdiagnózisa/differenciáldiagnosztikája, ismeretleneredetû fibrotizáló alveolitis differenciáldiagnoszti-kája.
d) (U1)-RNP antitest: Kevert kötõszöveti betegségben(MCTD-ben) diagnosztikai kritérium, SLE-bengyakran pozitív és elsõsorban a bõr-nyálkahártyalaesiokkal függ össze, diffúz sclerodermában kevésbégyakori és a tüdõfibrosissal kapcsolatos.
e) Sm antitest: SLE-ben diagnosztikai kritérium. Másautoimmun betegségben nem észlelhetõ.
3. Hiszton antitest: nagyon sok szisztémás autoimmun be-tegségben (SLE, gyógyszerindukált lupus, RA, JIA , PSSstb.), elõfordul. Diagnosztikai jelentõsége a ritka gyógy-szerindukált lupus diagnózisa (ilyenkor ANA és hisztonantitest pozitivitást észlelünk, de a DNS antitest negatív).
4. Anti-(natív) DNS antitest: az SLE diagnózisához szüksé-ges, de a betegség monitorozására is alkalmas. Negati-vitása gyakorlatilag kizárja az aktív SLE-t. A jelentõsenmagasabb érték nagyon nagy valószínûséggel SLE-t je-lez. A növekvõ érték betegségaktivitás mellett szól.
Szervspecifikus antitestek1. Antimitokondriális antitest (AMA) – pozitivitása primer
biliaris cirrhosisban diagnosztikus értékû, de ritkán a tesztpozitív lehet egyéb autoimmun (ún. overlap) hepatitisbenis.
2. A simaizom elleni antitest (SMA) primer biliaris cirrhosis-ban, autoimmun hepatitisben szinte mindig pozitív, deszámos (vírusos, alkoholos) májbetegségben is lehet po-zitív, ezért diagnosztikus értéke csekély. Az ANA-valegyütt az autoimmun hepatitis osztályozására használha-tó: az 1. típusban pozitív.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
275
3. Az antimikroszomális antitest (LKM-1) krónikus hepatiti-sekben fordul elõ, a 2. típusú autoimmun hepatitisre jel-lemzõ.
4. A májspecifikus proteinek (LSP) elleni antitestek a 2. típu-sú autoimmun hepatitisre jellemzõk.
5. Coeliakia (gluténszenzitivitás) diagnosztika: ezek az anti-testek a coeliakia és a vele rokon bõrbetegségek (derma-titis herpetiformis) diagnózisára szolgálnak. Az antireti-kulin antitest elsõsorban szûrõvizsgálatra alkalmas, szen-zitivitása kicsi. A gliadin, endomysium és szöveti transz-glutamináz (tTG) elleni antitestek közül az utóbbiak a leg-inkább specifikusak, de csak az IgA típusú tTG antitest-nek van diagnosztikus jelentõsége (az IgG csak definitívIgA hiány esetén!)
6. A parietalis sejt elleni antitestek autoimmun eredetû kró-nikus atrophiás gastritisre (illetve idiopathiás anaemiaperniciosára) jellemzõek.
7. A pajzsmirigy elleni antitestek: az antithyreoglobulin ésantimikroszomális antitestek (más néven antiperoxidáz,TPO antitestek) autoimmun pajzsmirigy betegségekben(Hashimoto-thyreoiditisben és idiopathiás myxoedemá-ban) diagnosztikus értékûek. Gyakran pozitívak, habármennyiségük kisebb Graves-kórban és néha pajzsmirigy-adenocarcinomában is.
8. A mellékvese (kéreg) elleni antitestek autoimmun (idio-pathiás) Addison-kórban mutathatók ki. A diagnózishoznem szükségesek, csak a betegség kóreredetére utalnak.
9. Az antiglomerularis basalis membrán (GBM) antitestGoodpasture-szindrómában (illetve anti-GBM nephriti-sekben) pozitív és egyben diagnosztikus értékû.
10. Acetilkolin-receptor elleni antitestek: myasthenia gravis-ban, illetve Lambert–Eaton-szindrómában és néha májbe-tegségekben is pozitív eredményt kaphatunk.
11. Hámantigének elleni antitestek: A desmosoma (desmo-glein-1 és -3) elleni antitestek pemphigus vulgarisban ésfoliaceusban fordulnak elõ. Az epidermalis basalismembrán elleni antitestek bullosus pemphigoidban és avele rokon betegségekben (pl. dermatitis herpetifor-misban) észlelhetõk.
12. Diabetesre jellemzõ antitestek: autoimmun diabetesben –alcsoporttól függõen – több autoantitest is kimutatható:inzulin-, glutaminsav-dehidrogenáz (GAD), proteintirozin-foszfatáz IA-2 (IA-2Ab), illetve egyéb antitestek– diagnosztikus jelentõségük csekély.
13. Saccharomyces cerevisiae (SA) antitest: az IgG és IgAosztályba tartozó SA antitest a gyulladásos bélbetegsé-gekre, ezen belül is a Crohn-betegségre jellemzõ (szenzi-tivitása >90%), s bár diagnosztikai haszna (még az egyi-dejûleg végzett p-ANCA teszttel is, mely viszont inkábbcolitis ulcerosában pozitív) nem túl nagy, az SA-poziti-vitás rosszabb prognózist jelent.
14. Gangliozid, aszialogangliozid antitestek (GQ 1b, GD1bés GM1 elleni antitestek): autoimmun eredetû perifériásneuropathiákban fordulnak elõ.
15. Antineutrofil citoplazma antitestek (ANCA): neutrofilekcitoplazmájában lévõ antigének („antineutrofil citoplaz-ma antitest”) gyûjtõneve. Fontosabb formái: proteináz-3(PR3), mieloperoxidáz (MPO), elasztáz, laktoferrin, bak-tericid permeabilitást fokozó protein (BPI). A festõdésmintázata háromféle: citoplazma (c), perinuclearis (p) ésatípusos lehet. A c-ANCA mintázat leggyakrabban a PR3és BPI, a p-ANCA mintázat pedig leggyakrabban a MPOjelenlétére utal, de ilyet ad az elasztáz és laktoferrin is. ABPI gyakran atípusos festõdést ad. Az ANCA screen indi-
kációi: ANCA pozitív vasculitisek (Wegener-granulo-matosis, mikroszkopikus polyangiitis) gyanúja, nephriti-sek differenciáldiagnosztikája, krónikus gyulladásos bél-betegség (IBD) gyanúja, primer sclerotizáló cholangitisgyanúja, vérzéses alveolitis differenciáldiagnosztikája.
16. Proteináz-3 (PR3) antitest: nagyon specifikus Wegener-granulomatosisra (>95%), még az atípusos formákra (pl.izolált perifériás neuritis, idiopathiás necrotizáló neph-ritis stb.) is. Elõfordul még egyéb vasculitisekben is.
17. Myeloperoxidáz (MPO) antitest: Elõfordulás: mikro-szkopikus polyangiitisben (60–80%), egyéb eredetûfocalis nekrotizáló glomerulonephritisben, gyors prog-ressziójú glomerulonephritisekben, ritkán Wegener-granulomatosisban, Churg–Strauss-szindrómában.Goodpasture-szindrómában (30–40%), illetve a sziszté-más autoimmun betegségek, pl. RA, SLE bizonyos száza-lékában.
Antifoszfolipid antitestekSzintén gyûjtõfogalom, különféle anionos és neutrális
foszfolipidek, illetve az ezeket kötõ különféle glikoproteinekelleni antitestek tartoznak ide. Legfontosabb formái: akardiolipin (ACA), illetve a foszfatitidilszerin elleni antites-tek, valamint a â2-glikoprotein I (b2GPI) és a protrombin el-leni antitestek – melyeket enzim immunoassay-vel (EIA) mé-rünk, illetve a lupus anticoagulans (LA), valamint a hexago-nális foszfolipid-teszt, melyeket funkcionális teszttel mérünk.
Az antitestek a primer és szekunder antifoszfolipid szind-rómában (APS) fordulnak elõ. A teszt (ACA és â2GPI EIA +LA) elvégzendõ: primer vagy szekunder APS gyanúja esetén,SLE-ben a thrombosisveszély rizikójának felmérésére, vala-mint ismeretlen thrombocytopeniában, SLE gyanúja esetén(diagnosztikai kritérium), illetve az APS kezelés monitorozá-sára.
Rheumatoid faktor (RF)A rheumatoid faktor (RF) pozitív rheumatoid arthritisben
(RA-ban) (pontosabban a betegek nagyobb részében), ésegyúttal az RA-ban diagnosztikai kritérium is. Igen gyakranpozitív Sjögren-szindrómában és esszenciális kevert cryo-globulinaemiában, azonban nem szenzitív. Az RF számos be-tegségben (autoimmun betegségekben, infekciókban stb.) le-het pozitív, specificitása nagyon alacsony.
Ciklikus citrullinált protein elleni antitest (anti-CCP)A citrullinált protein antitestek (ACPA) közül a ciklikus
citrullinált protein elleni antitest (anti-CCP) vizsgálata terjedtel. Ez sokkal specifikusabb az RA-ra, mint az RF. Korai stádi-umban már gyakran kimutatható és rossz prognosztikai té-nyezõ. A RA új klasszifikációs kritériumrendszerében márszerepel.
Az autoantitestek mellett a komplementrendszer és agyulladást jelzõ akut fázisfehérjék vizsgálata is fontos részeaz autoimmun betegségek vizsgálatának.
C-reaktív protein (CRP)A mindennapi gyakorlatban az akut fázis reakció mérté-
két a C-reaktív protein (CRP) szintjével jellemezzük. Bár alegtöbb autoimmun betegségben az SLE kivételével a beteg-ség aktivitása és a CRP-szint között szoros a kapcsolat, aCRP-szintet elsõsorban a RA aktivitásának megítélésérehasználjuk. A CRP-szint mérése (a SLE kivételével) a beteg-ségekben fennálló gyulladás monitorozására alkalmas.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
276
Citokinszintmérések
Cytokine level measurements
Dr. Bekõ GabriellaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest)
Kulcsszavak: áramlási citometria, ELISA, elektrokemilumineszcens immunteszt, biochip, bioplexKey-words: flow cytometry, ELISA, elektrochemilumineszcens immunoassay, biochip, bioplex
Az immunrendszer sejtjei között a kommunikáció cito-kineken, kis, 8–40 kDa nagyságú fehérjemolekulákon keresz-tül valósul meg. A legtöbb citokint egészséges körülményekközött nem termelik a sejtek, csak speciális hatásokra, melyekgyakorlatilag azonosak a „sejt stresszorokkal” (például UVfény, hõhatás, hiperozmolalitás vagy az idegen felszín). Aszintézis után a citokinek azonnal kiválasztódnak a sejtbõl,ezáltal biztosítva a gyors hatás kialakulását.
A citokinek fokozzák vagy gátolják az immunkompetenssejtek aktiválását, proliferációját és differenciálódását, ezáltalszabályozzák az immunfolyamatokat, az immunválasz inten-zitását, tartamát, az ellenanyagok szintézisét és továbbicitokinek termelését. Valamennyi immunsejt képes citokinektermelésére, illetve rendelkezik citokinreceptorokkal. Im-munmoduláló hatásuk autokrin, parakrin, pleiotrop és ritkánendokrin. Autokrin hatásuk révén maga a termelõ sejt a cél-pont. Parakrin módon közvetlen környezetükben találhatósejteket késztetik citokin termelésre. Az endokrin hatás pedigtávoli sejtcsoportok aktiválását is eredményezheti. Pleiotropsajátságuk következtében egyszerre sokféle hatást válthatnakki a különbözõ targetsejteken. Ugyanakkor redundásak is,mert többféle citokin képes azonos választ kiváltani. Ismert acitokinek közötti szinergista és antagonista kölcsönhatás is.
Citokinszint-mérési módszerek
A citokinek élettani folyamatokban és betegségekben ját-szott szerepére vonatkozóan több mint két évtizede gyûlnekaz adatok. Ezek azonban sokszor nem egyértelmûek vagy el-lentmondásosak, amiben a metodikai problémák kulcsszere-pet játszanak.
A citokinszintek és növekedési faktorok meghatározásáttöbb tényezõ nehezíti. A legfontosabbak:1. Az ugyanolyan néven, jellel jelzett citokin a szervezetben
monomer és polimer formában is jelen lehet; többféle al-egységbõl áll, melynél az egyes alegységeket külön sejttí-pusok termelik; illetve kémiailag sem mindig jól karakte-rizáltak. Mivel fehérjékrõl van szó, amelyek sokszor többepitóppal rendelkeznek, a szintek mérése során alkalma-zott immunanalitikai módszerek szenzitivitását és speci-ficitását, de a referenciatartományt is alapvetõen megha-tározza a gyártás technológiája, a vegyszer sorozatszáma.
2. Nyugalmi állapotban a citokinszintek a plazmában igenalacsony (pmol/l) koncentrációban vannak jelen, azaz je-lentõs hányaduk nem is detektálható.
3. Stimulus hatására a citokinszint többszörösére emelke-dik, de ez a változás átmeneti, citokinenként különbözõkinetikát mutat.
4. Mivel a citokinek hatásukat egy komplex rendszer része-ként fejtik ki, sok esetben az 1–1 citokin klinikai jelentõ-ségére korlátozódó mérések eredménye nem informatív.
A fenti problémák figyelembevétele mellett az alábbi mé-rési technikák terjedtek el.
Intracelluláris citokinek és kemokinek kimutatásaáramlási citometriával
A T-lymphocyták aktivációját követõen a citokinek/ke-mokinek a citoplazmában feldúsulnak, és csak ezután válasz-tódnak ki. Az intracelluláris citokinek a citoplazmában fluo-reszcens festékekkel jelzett specifikus ellenanyagokkal,áramlási citofluorimetriával, immunhisztokémiai módszerek-kel vagy immunfluoreszcens mikroszkópos technikákkalvizsgálhatók. A sejtfelszíni markerek egyidejû kimutatásávalaz adott citokintermelõ sejt típusa is azonosítható, és a cito-kint termelõ sejtek aránya is megadható. A mikroszkóposelemzés a sejten belüli lokalizáció meghatározására alkalmas.
ELISA módszerA citokinek klasszikus ELISA-val való kimutatásakor a
kettõs szendvics módszert alkalmazzák, melynek fajlagossá-ga igen nagy. Ezzel a módszerrel a citokinek mennyisége a bi-ológiai aktivitásuktól függetlenül mérhetõ, ezért – fõként arövid életidejû fehérjék esetében – az eredmény nem mindigjelzi a tényleges biológiai aktivitást. A mérést az is befolyá-solhatja, hogy a különbözõ citokinek oldott formájú recepto-rokhoz vagy inhibitorokhoz kötött formában is elõfordulhat-nak.
Az utóbbi években immunkémiai automatákra is fejlesz-tettek citokin teszteket. Az „ECLIA” (elektrochemiluminesz-cens immunoassay) Elecsys és Cobas E immunológiai anali-zátorokon alkalmazható módszer. Ezt leginkább interleukin-6(IL6) mérésére használják, ami az akut gyulladás korai indi-kátora, koraszülött és újszülöttkori szepszisben jól használha-tó marker. Immunolyte automatára IL6, IL8 és TNFá teszte-ket fejlesztettek. Ezek a proinflamatorikus citokinek akutgyulladásban, sepsisben segíthetik a korai diagnózist. Az au-tomatákon mért citokinszinteknek óriási elõnye, hogy egy-kétórán belül, ügyeleti idõben is elkészül az eredmény.
Biochip és bioplex módszerekA citokinfunkciók komplexek, így egy citokinprofil na-
gyon értékes információt jelenthet egy adott immunválasz-ban. Nagy elõrelépést jelentett a citokin biochip panelek és amikrogyöngyökhöz kötött citokin antitestek, a BioPlex pane-lek megjelenése, amikor egyszerre tudunk 12 vagy akár 27citokint, növekedési faktort vizsgálni.
Biochip technika citokinek, kemokinek és növekedésifaktorok kimutatására. Ez a protein array a nagyon kis kon-centráció (pg/ml), és a zavaró tényezõk kizárása végett há-romféle immunoassay-t alkalmaz egyszerre:
1. kompetitív immunoassay (enzimmel jelölt analitothasznál)
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
277
2. sandwich immunoassay (enzimmel jelölt antitestethasznál)
3. antibody capture immunoassay
Randox Biochip módszert (Randox Laboratories Ltd,Crumlin, United Kingdom) használva a kemilumineszcens je-leket egyszerre méri egy készülék egy hûtött CCD kamerávalés standard kalibrációs görbékhez hasonlítva kiértékeli egyspeciális programmal a teljes arrayn. Egy chip mérete, melyrea beteg 100 ìl mintáját pipettázzuk, mindössze 9 mm � 9 mm.Ezzel a módszerrel 3–4 óra alatt 42 beteg 12 pro- és anti-inflammatorikus citokinjét és növekedési faktorát (három-szintû kontrollálást használva) tudjuk lemérni. A Randox tel-jes automata (EVIDENCE) készülékkel is rendelkezik abiocipek méréséhez. Ebben a rendszerben egy chip felületéremaximum 23 analit (antitest) köthetõ. A citokinek mellettszámos panelt fejlesztettek ki.
Bio-Plex technika citokinek, kemokinek és növekedésifaktorok kimutatására. A Bio-Plex technika az xMAP(x(number) Multi – Analyte Profiling/Multiplexing) techno-lógián alapul, melyet a Luminex (Luminex Corporation; Aus-tin, USA) multiplex assay-vé fejlesztett az elmúlt néhány év-ben. A megoldás a chiptechnikán (szendvics és kompetitívimmunoassayt használva) és a flowcytometrián alapul.
Mikrogyöngyöket (5 ìm átmérõjû, polisztirén) vörös ésinfravörös festékkel színezik. A két festék aránya 100 külön-bözõ gyöngytípust eredményez, így egy plexen egyszerre el-méletileg százféle vizsgálat is mérhetõ. A gyöngyökhöz kü-lönbözõ monoklonális antitesteket kötnek, melyek összeke-verhetõk és a microplate lyukaiból a chiphez hasonlóan egy-szerre mérhetõk. A szendvics ELISA utolsó lépéseként fluo-reszcens jelölést használnak. A készülék kapillárisán áthaladóvalamennyi gyöngyöt 2 színû lézer világítja meg. A piros
fény a gyöngy típusát érzékeli, a zöld, pedig a fluoreszcens jelintenzitását méri. A speciális software összerendezi a jeleket,és a standard görbékhez hasonlítva kiírja a plexben mértcitokinek értékeit. A módszer szenzitivitása és érzékenységeaz ELISA tesztekhez hasonló. A dinamikus range citoki-neknél lényegesen szélesebb (1,95–32 000 pg/ml), mint azELISA és a Biochip mérések esetén.
A módszer elõnyei közül ki kell emelni a flexibilitást.Citokinek esetén ez azt jelenti, hogy egy plexen tetszõlegesválogatásban és számban (akár 27 féle) citokin, kemokin, nö-vekedési faktor mérhetõ (biochip módszernél mindig ugyan-azt a 12 félét mérjük). A minta a szérumon, plazmán és szöve-ti felülúszón kívül, bármely testnedv vagy szöveti homogeni-zátum lehet. A szükséges mintamennyiség 50 ìl. A vizsgála-tok költsége harmada az ELISA módszerrel mért tesztekének,ráadásul minél több tesztet mérünk egy plexben, a fajlagosköltség annál kisebb.
A flexibilis multiplexek nemcsak a citokinek mérésénélnyújtanak segítséget, hanem más fehérje és génexpressziósprofilok, autoimmun betegségek, genetikai betegségek ésHLA vizsgálatok terén is gyors, pontos, átfogó eredmények-hez juthatunk.
A labordiagnosztika mai színvonala tehát lehetõvé tesziazt, hogy ne izoláltan, egy-két citokinre vonatkozóan lehes-sen adatokat gyûjteni, hanem meg lehessen határozni az egyadott betegre, betegségre jellemzõ citokinprofilt. Az eredmé-nyek értékelését azonban megnehezíti az a tény, hogy1. nem ismert, hogy a különbözõ multiplex rendszerek által
mért adatok mennyire állnak összhangban;2. kevés az arra vonatkozó adat, hogy az egy adott multiplex
rendszerben mért értékek mennyire reprodukálhatóak;3. a nagyszámú adat feldolgozása, az egy adott betegbõl is-
mételten végzett mérések eredményének az értékelése újstatisztikai megközelítéseket indokolnak.
Áramlási citométerek klinikai alkalmazása
Clinical application of flow cytometry
Dr. Vásárhelyi Barna, Dr. Mészáros GergõSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet
Kulcsszavak: fluoreszcencia, sejtfelszíni antigén, festék, antitestKey-words: fluorescence, surface antigen, dye, antibody
Az áramlási citométerek (FCM) lézerfény által gerjesztettszórt- és fluoreszcens fényjelek alapján azonosítják a kívántsejtet, fehérjét.
PreanalitikaKlinikai minták (vérsejtek vizsgálata) esetén optimális a
heparinnal alvadásgátolt vérminta használata. A vérmintátfeldolgozásig szobahõmérsékleten kell tartani. Az izolált sej-tek a mérésig fagyaszthatóak, a fagyasztás protokollja alapve-tõen befolyásolja a késõbbi mérés minõségét. Szérumban ol-dott antigének (pl. citokinek) esetében tárolási hõmérsékletmeghatározza a reprodukálhatóságot.
Mérés elveAz FCM sejt- vagy mikrogyöngy-szuszpenzióból folya-
matosan vesz ki mintát, majd egy-egy sejtszélességû folya-dékoszlopot alakít ki. A folyadékoszlop lézerfényen keresztülhalad át. A lézer hullámhossza különbözõ lehet, leggyakrab-ban kék (488 nm-es) és vörös (633 nm-es) lézert használnak.Amikor a vizsgálandó 0,2–150 mikron méretû részecske a lé-zerfény fókuszpontjába ér, a ráesõ fény oldalirányba (sidescatter) és elõrefelé (forward scatter) szóródik. Az elõre szó-ródó fény a sejt (részecske) méretérõl ad információt, és to-vábbi módosítás nélkül külön csatornán (FSC) detektálható.Az oldalra szóródó fény a sejt granuláltságának, méretének,morfológiai tulajdonságainak detektálására szolgál (side
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
278
scatter, SCC). E két paraméter segítségével például az egyesfehérvérsejtcsoportok elkülöníthetõk.
A szórt fényjelek mellett az FCM a lézerfénnyel való ger-jesztés hatására kialakuló fluoreszcens fényt is detektálni tud-ja meghatározott hullámhosszokon. Ezt a lehetõséget hasz-nálják ki akkor, amikor fluorokróm festékkel, pl. jelzett anti-testtel megjelölt sejteket vagy részecskéket vizsgálnak.
A fluoreszcens jeleket a készülék optikai szûrõk segítsé-gével elkülöníti egymástól, és fotoelektron-sokszorozók éserõsítõk segítségével felerõsíti azokat. A különbözõ hullám-hosszúságú fényjeleknek megfelelõ csatornák segítségével azegyes fluorokrómok által kibocsátott jelek elkülöníthetõek éskülön értékelhetõk. (A fluorokrómok spektrumai részben át-fedhetik egymást. Ez ahhoz vezethet, hogy két fluorokrómegyidejû alkalmazása esetén az egyik fluorokróm fluoresz-cens jele hozzáadódik a másik jeléhez. A mérések beállítása-kor a kompenzáció során ezt figyelembe veszik és így csök-kentik ezt a hatást.)
A szórt fénybõl és a fluoreszcens fénybõl kapott jelek kü-lönbözõ kombinációit használva lehet információt kapni arravonatkozóan, hogy az egyes fluorokrómok az adott sejten / ré-szecskén milyen mértékben vannak jelen.
A mérési eredmények ábrázolása dot-plot és hisztogramsegítségével történik. A dot-ploton az egyes sejtekrõl/részecs-kékrõl kapott fényjelek ábrázolhatóak intenzitásuk függvé-nyében. A hisztogram egy paraméter jelintenzitása alapjánmutatja a sejtek megoszlását. A készülék lehetõséget ad arra,hogy a megfelelõ fluoreszcencia-intenzitás értékek alapján azegyes sejt/részecske populációkat ki lehessen válogatni (ka-puzás vagy „gate”-elés) és arányukat az összes sejt/részecskepopulációhoz viszonyítva meg lehessen adni. Ezen túl egyesmûszerek kapcsán a meghatározott intenzitást mutató sejtekkiválogathatóak („sorting”).
Alkalmazási területekAz FCM-t kutatási célra és a diagnosztikában egyaránt
széles körben alkalmazzák. FCM-mel vizsgálhatóak az aláb-biak paraméterek:1. sejtmorfológia;2. sejtciklus;3. apoptózis (DNS-degradáció, mitokindrium membrán po-
tenciál, kaszpáz aktivitás);4. kromoszómaszám;
5. fehérje-expresszió és -lokalizáció;6. transzgén modellekben a transzfekció eredményessége;7. sejtfelszíni antigének (cluster of differentiation (CD)
markerek);8. intracelluláris antigének (különbözõ citokinek, másodla-
gos jelátvivõk);9. sejtmag antigének (transzkripciós faktorok);10. sejtfunkciók (ionizált kalciumszint, membránpotenciál,
membrán fluiditás);11. oxidatív burst;12. mikropartikulum-vizsgálatok.
A klinikai munkában már alkalmazzák:� leukaemia és lymphoma immunfenotipizálása;� immundeficiencia (immunsejtek prevalenciájának a mo-
nitorozása);� RNS-tartalom (retikulocita-szám);� multiplex citokinszint-mérés mikrogyöngyökkel;� multidrog-rezisztencia vizsgálat (rák kemoterápia); sej-
tek túlélésének vizsgálata;� anyai vérben magzati vörösvérsejtek kimutatása;� vérkészítmények minõségellenõrzése;� HLA-tipizálás;� õssejtek prevalenciájának a meghatározása;� transzplantációt megelõzõen: a graftban ex vivo T-sejt
depléció mérése;� transzplantáció után: immunfolyamatok monitorozása;� mikrobiológiai vizsgálatok: kórokozók identifikálása, az
antimikrobiális érzékenység mérése;� IVF esetén spermiumok kiválogatása.
Az FCM elõnye a nagy sebesség (másodpercenként akár70ezer esemény detekciója); egyedi sejtek vizsgálata rendkí-vül nagy számban; ugyanazon sejt esetében többféle paramé-ter egyidejû elemzése. A nagy eseményszámnak köszönhetõ-en kis sejtpopulációkat (ritka eseményeket) is lehet detektál-ni. Egyes, a sejtek életképességét nem befolyásoló festékeketalkalmazó mérések során (pl. az intracelluláris kalciumszintvizsgálatakor) egyidejûleg többféle sejtben lehet a bekövet-kezõ idõbeli változásokat nyomon követni.
Az FCM hátránya az ára; az intracelluláris struktúrák ál-talában nem vizualizálhatóak vele; szövetek esetében a sejtekszolubilizálni kell (szöveti szerkezet elveszik).
Újabb típusú hematológiai automaták
New series of hematology analyzers
Dr. Bekõ GabriellaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet, Központi Laboratórium (Pest)
Kulcsszavak: automaták mûködési elve, festési módszer, NRBC, MCVr, CHr, IRF, FRBC, IPFKey-words: principles of operation and staining of automated analyzers, NRBC, MCVr, CHr, IRF, FRBC, IPFy
A vérsejtek automatával történõ számolása alig több mint50 éves múltra tekint vissza. A módszer harmonizációja, stan-dardizációja, a számolt paraméterek elfogadása az 1990-esévek végén történt. A XXI. század modern komputer ésnetwork technikái hozzájárultak a mechanikai és algoritmu-sokon alapuló kontrol rendszerek kifejlesztéséhez. Így a he-
matológiai automaták napjainkban már képesek részletekbemenõ, pontos eredményközlésre.
Hematológiai automatákA hematológiai automaták teljesen megbízható értékeket
adnak: fehérvérsejtszám, vörösvérsejtszám, hemoglobin kon-
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
279
centráció és MCV (mean cell volume) tekintetében. Ezek amérések referens módszerre visszavezethetõk, a készülékekkalibrációjánál az elsõdleges vagy másodlagos kalibrátorthasználják a gyártó cégek.
Nagyobb odafigyelést kíván a kvalitatív fehérvérsejt-el-oszlás és thrombocytaszám (fõként az alacsony thrombocyta-szám vagy az óriás thrombocyták jelenlétekor). A hematoló-giai automata mûködési elvétõl függ a szétválasztás lehetõsé-ge és a thrombocytaszámlálás módja.
A standardizáció hiánya miatt a készülék típusától függ azRDW (RBC distribution width), az MPV (mean plateletvolume) és a PDW (platelet distribution width) referenciaér-téke.
A hematológiai automata mérési elvébõl és a készülék ál-tal használt festésbõl adódó különbségek a következõk.
� Advia 120, 2120 típusú hematológiai automatákA Magyarországon jelentõs számban használt automaták
kis és nagyszögû lézerdetektorral, valamint mieloperoxidázfestéssel dolgoznak. A monocyták citoplazmáját a peroxidáznarancssárgára festi, a neutrophil sejtek granulumai szürkérefestõdnek, míg az eosinophil punktátumok feketék. Ha a fe-hérvérsejt peroxidáz aktivitása csökken, akkor a készülékkelszámolt kvalitativ vérkép nem értékelhetõ. Erre az eltérésre akészülék egy hibajelzessel, „flag”-gel (MPO index) is figyel-meztet. Ezen automatával való mérésnél egy hatodik part.differential is megjelenik, a LUCs (large unstained cells).Ezek a nagy nem festõdõ sejtek lehetnek aktivált lympho-cyták, plazmasejtek, hajas sejtek, gyermekkori nagy lympho-cyták, mieloperoxidáz negatív blastok vagy mieloperoxidáznegatív neutrophil granulocyták. Így ezek a készülékek segí-tenek az infekciók differenciáldiagnosztikájában, a vírusbe-tegségek esetén az aktivált lymphociták megszaporodásával anagy nem festõdõ sejtek száma 10–20%-ot is elérhet. Továb-bá felhívhatják a figyelmet blastok jelenlétére, ilyenkor erreBLASTS morfológiai flag is figyelmeztet.
� A Sysmex automaták (XE-2100, XT-2000i, XT-2100d,XE-5000, XT-4000i)Fluoreszcens festést használnak. A sejtek emelkedett
nukleinsav (DNS vagy RNS) tartalmával arányos a fluoresz-cens jel nagysága. Ezért ezeken a készülékeken az éretlengranulocytákat különíthetjük el. A metamyelocyták, a myelo-cyták és a promyelocyták kerülnek az IG (Immature granu-locytes) frakcióba. A legújabb típusú készülékeken már nem-csak szemikvantitatív jelzést (+, ++, +++), hanem számszerû-en %-ban megkapjuk ezt az ún. 6. part. differentialt.
Az éretlen granulocyták száma emelkedhet: bakteriális in-fekció; akut gyulladás; tumor (csontvelõ metastasis); szövetinecrosis; akut transzplantátum rejekció; sebészeti, ortopédiaitrauma; mieloproliferatív betegség; szteroidkezelés; terhes-ség (harmadik trimeszter). Nagyobb a jelentõsége akkor, haidõsek, újszülöttek, koraszülöttek akut infekciójakor a fehér-vérsejt- vagy granulocytaszám változás nem jellegzetes(ilyen esetben ez lesz az elsõ balratolódásra utaló jel a vérkép-ben). Fontos lehet myeloszupresszált betegek akut infekciója-kor, vagy neutropeniával járó szepsis esetén is.
� Beckman Coulter DXH-800-as automataEzen a fehérvérsejt differenciálás festés nélkül történik. A
sejteken, a sejtek magjain és granulumain szóródott lézerfényt 7 detektor segítségével szedi össze, és egy számítógépesprogram háromdimenziós felhõdiagramot készít. Ezen látha-tóak az éretlen granulocyták, lymphocyták és monocyták is.
� Coulter és a Sysmex automaták, Advia 2120-as automataA mai modern hematológiai automaták a magvas vörös-
vérsejteket is képesek abszolút számban és 100 fehérvérsejtrevonatkoztatva százalékban is megadni. Így a Coulter és aSysmex automaták ezt külön csatornán mérik.
Az Advia 2120-as automata egy szoftvert segítségével, afehérvérsejt (perox és baso) csatornákon kapott információk-ból adja meg az abszolút és számolja a %-os értéket. Mindhá-rom típusú automata a fehérvérsejtszámban korrekciót is vé-gez, ha a perifériás vérben emelkedett arányban talál magvasvörösvérsejtet.
Magvas vörösvérsejtek aránya nagyobb:1. Újszülöttkorban (nagymértékben emelkedett magvas vö-
rösvérsejt szám): koraszülöttek, újszülöttek (pár %),újszülöttkori hemolitikus betegség; hipoxiás károsodásesetén.
2. Felnõttkorban: thalassemia; mieloproliferatív betegség(myelofibrosis); solid tumor csontvelõi metasztázissal;extramedullaris haematopoiesis; haematopoieticusstressz (septikaemia, masszív haemorrhagia, súlyos hyp-oxia) alkalmával.
A klinikai gyakorlatban, a következõ esetekben ajánlottvizsgálata: hematológiai betegségek diagnosztikája; súlyoskardiothoracalis mûtéten átesett, egyéb sebészet intenzív ellá-tást igénylõ nem hematológiai betegségben, csontvelõ transz-plantáció utáni prognozis megitélésben, thalasszémia szind-rómában transzfúziós terápia hatékonyságának monitorozá-sára.� A XE-2100 Sysmex automata
IMI (Immature Myeloid Information) csatornáján ahematopoietikus progrenitor sejtek (CD 34+) száma is meg-határozható a perifériás vérben.
Nagy dózisú, kolóniastimuláló-faktor (CSF) elõkezeléshatására a csontvelõbõl nagy mennyiségû õssejt és korai vér-képzõ elõdsejt kerül a perifériás vérbe. A alkalmas õssejtekgyûjtése a kezelést követõen a keringõ vérbõl történik. Agyûjtéskor nagyon fontos tudni, hogy hol tart a stimuláció,mikor kerül ki a perifériára annyi õssejt, amit már érdemes le-venni. Ehhez a monitorozáshoz nyújthat segítséget a Sysmexautomata, ahol a flowcytometer-en történõ CD34+ sejt meg-határozásnál egyszerûbben és olcsóbban lehet a progrenitorsejtek számát megadni.
Újabb hematológiai paraméterek� Az MCVr (Mean reticulocyte volume) paraméter a követ-
kezõ klinikai helyzetekben lehet fontos: vashiányoserythropoesis; táplálkozással kapcsolatos anémiák eseténa terápia korai hatásának monitorozása; csontvelõ-transz-plantáció után az erythropoesis helyreállásának követése;sportolóknál az erythropoetin használatának észlelése.
� CHr (mean reticulocyte hemoglobin content) (Advia au-tomaták); Ret-He (reticulocyte hemoglobin equivalent)(Sysmex automaták); RSf (Red blood cell size factor)(Coulter automaták) a leggyakrabban használtreticulocyta paraméter: abszolút vagy funkcionális vashi-ányos eritropoesis diagnózisára (vashiány korai kimutatá-sa gyermekekben); orális és intravénás vasterápia moni-torozására; dialízis alatt az erythropoetin terápia monito-rozására.
� IRF-M+H-t (a közepes és nagy abszorbanciájú éretlenreticulocyták aránya %-ban) vagy röviden IRF (Imma-ture reticulocyte fraction): anaemiák differenciáldiag-nosztikájára; táplálkozással kapcsolatos anémiák terápiá-
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
280
jának monitorozására; csontvelõ-regeneráció korai moni-torozására (csontvelõ-transzplantáció vagy kemoterápiaután); aplasztikus anaemia verifikálására; csontvelõsejtekgyûjtésének idõzítésére, leukaemiák differenciáldiag-nosztikájának segítésére.
� A fragmentált vörösvérsejtek, FRBC (fragmented RBC) amicroangiopathiák diagnosztikája és monitorozása eseténszinte nélkülözhetetlen. A mérés negatív prediktív értékeközel 100%. Mindhárom típusú automata méri.
� A thrombocyták számolt paraméterei közül az IPF(immature platelet fraction), azaz a retikulált throm-bocytafrakció érdemel említést: ezt a paramétert csak aSysmex automaták tudják szolgáltatni. A következõ ese-
tekben hasznos: thrombocytopenia differenciáldiagnosz-tikája; kemoterápia és csontvelõátültetés után a throm-bocytatermelés helyreállásának jelzõje; thrombocyto-sisban a thrombosis rizikóindexe; profilaktikus thrombo-cytatranszfúzió szükségének megítélése; thrombocyta-turnover becslése.
Az automatával történõ vérsejtszámolás lehetõvé tette,hogy standardizált módon, napi kontrollálással, korrekt mértés számolt paraméterek segítsék a gyors diagnózist vagy a be-teg monitorozását. De a modern technika mögött ott kell állnia laboratóriumi szakembernek és a laboratóriumi eredménytjól értelmezõ klinikusnak is.
Molekuláris biológiai módszerek I.Mintavétel, PCR technikák, polimorfizmus-detektálás
Molecular biological methods I. Sampling, PCR tequenics, detection of polymorphisms
Dr. Patócs AttilaSemmelweis Egyetem, Laboratóriumi Medicina Intézet
Kulcsszavak: gén, mutáció, mutáció szûrés, PCRKey-words: gene, mutation, mutation screening, PCR
A genetikai vizsgálat során DNS-re van szükség.Amennyiben csírasejtes mutációt kívánunk azonosítani, aDNS nyerésre legalkalmasabb az alvadásgátolt vér (leggyak-rabban citráttal vagy EDTA-val). Szomatikus mutációk azo-nosításához szükséges az adott szövetbõl DNS-t izolálni.Mindkét esetben többféle DNS-izoláló kit áll rendelkezésre.Mintaforrástól függetlenül a DNS vizsgálata elõtt ellenõriznikell az izolált DNS mennyiségét és minõségét. A DNS kvali-tatív tulajdonságait agaróz-gélelektroforézissel ellenõrizzük.A DNS kvantitatív meghatározása spektrofotométerrel, azoptikai denzitás alapján történik.
A molekuláris biológiai vizsgáló módszerek alapját apolimeráz láncreakció (PCR) jelenti. PCR során a hõstabilDNS-polimeráz segítségével a vizsgálni kívánt DNS mennyi-ségének sokszorozása történik. Kivitelezése során a reakció-elegyben jelen van a felsokszorozandó DNS (templát), a kí-vánt DNS szakaszra specifikus primerek (a vizsgálni kívántDNS-szakaszokra specifikus oilgonukleotidok), DNS-poli-meráz enzim (leggyakran Taq-polimeráz), a négy dezoxi-ribonukleozid-trifoszfát és puffer (vizes alapú, sókat ésMgCl2-ot tartalmazó oldat). A PCR reakciót alapvetõen atemplát DNS kvalitatív és kvantitatív tulajdonságai határoz-zák meg. Az optimális PCR reakciók feltétele az oligonuk-leotid primerek gondos megtervezése. Ezek a DNS két szálaközé egymás felé a 3’ végükkel kapcsolódnak, ezáltal bizto-sítják a közöttük levõ szakasz felsokszorozódását. A primerektervezése során számos tulajdonságukat kell figyelembe ven-nünk; ezek közül a legfontosabb a primerek olvadáspontja(melting hõmérséklete). Valós idejû kvantitatív PCR(RT-PCR, Q-PCR) során a képzõdött termék mennyiséget va-lós idõben tudjuk nyomon követni, majd a reakció után azamplifikációs görbe lineáris szakaszán összehasonlító méré-seket végezhetünk.
A PCR reakció során kapott terméket agaróz-gélelektro-forézissel vizualizáljuk. A gélfestést a kettõs szálú DNS-lánc-ba interkaládó festékek (etidium-bromidot, újabban nem toxi-kus festékeket) használatával végezzük el. Vizualizálás utánellenõrizzük a PCR-termék méretét, az aspecifikus termékek,illetve amennyiben vannak, láthatóvá válhatnak a fölöslegbenjelenlevõ primerek és templát DNS. A termék további feldol-gozásához (DNS-szekvenálás, klónozás) a PCR-termékektisztítására van szükség, amely folyamat során a különbözõfölöslegben levõ reakciótermékeket (be nem épült nukleo-tidok, primerek) eltávolítjuk. A következõ lépés a génmutáci-ók/polimorfizmusok azonosítása. Számos molekuláris bioló-giai vizsgálómódszer használatos a különbözõ eltérések be-azonosításához. Ezeket a módszereket két nagy csoportbaoszthatjuk: az elsõ csoportba tartoznak az ún. szûrõmódszerek(restrikciós fragment analízis – RFLP; egyláncú konformáci-ós polimorfizmus analízis – single strand conformation analí-zis – SSCP; allélspecifikus PCR és Taqman allél diszkriminá-ciós assay; denaturáló gradiens gél electrophoresis – DDGE;hõmérséklet gradiens gél-elektroforézis – TTGE; denaturálónagy felbontóképességû folyadék kromatográfia – DHPLC),míg a második csoportot a DNS-szekvencia direkt meghatá-rozása jelenti, ami DNS-szekvenálással valósítunk meg.
A szûrõmódszerek közös jellemzõje, hogy definitív ered-mény ezek alapján (az alléldiszkriminációs assay és RFLP ki-vételével) nem adható ki, minden esetben szükséges az adotteltérés megerõsítése egy másik módszerrel, ami a gyakorlat-ban a DNS-szekvenálást jelenti.
Az RFLP során restrikciós enzimeket használunk, me-lyek polinukleotidokban a foszfodiészter kötéseket bontják.Hatásuk helyétõl függõen kétféle típust különböztethetünkmeg; az endonukleázokat, amelyek a láncon belüli kötésekethasítják, és az exonukleázokat, amelyek a láncvégi nukleo-tidokat hasítják le. Ezek az enzimek speciális szekvenciákat
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
281
ismernek fel. Ezek olyan szekvenciák, amelyek egy pont kö-rül kétszeres szimmetriát mutatnak, pl. AAG CTT / TTCGAA. Ezeket a szekvenciákat ún. palidrom szerkezetekneknevezzük. Mivel ugyanaz a szekvencia (ellenkezõ irányban)mindkét szálon megtalálható ezek az enzimek mindkét láncothasítják. A DNS eltérések vagy egy új restrikciós helyet hoz-nak létre, vagy pedig egy restrikciós hely elvesztéséhez vezet-nek
Ismert mutációk eseteiben a mutációknak megfelelõ rest-rikciós enzimekkel történõ emésztés után a mutáció meglé-te/vagy meg nem léte alapján különbözõ hosszúságú hasításitermékeket (fragmenteket) kapunk, amelyek elektroforézisselelkülöníthetõek. A restrikciós enzimeket baktériumtörzsek-bõl izolálják. Jelenleg több ezer ilyen restrikciós enzim közülválogathatunk, a különbözõ mutációknak, polimorfizmusok-nak megfelelõen egy templát vizsgálata során több DNS-elté-rést is azonosíthatunk. Tömegszûrésre is bevezethetõ vizsgá-lati módszerrõl van szó, melynek segítségével ismert geneti-kai eltérések viszonylag olcsón kimutathatóak.
Az SSCP azon alapul, hogy egy nukleotideltérés is olyankonformációváltozást okoz, amely nem denaturáló poliakril-amid-gélben történõ elektroforézis során a PCR-termékekfuttatási mintázat eltérõ. A futtatás során szükség van egy is-mert szekvenciájú negatív kontrollra. Ugyanazt a futási min-tázatot mutató minták szekvenciája megegyezik a kontroll-szekvenciájával, míg az ettõl eltérõ futási mintázatot adó min-ták szekvenciája is eltérõ. Az SSCP analízis nagyon érzékenya futtatás során biztosított hõmérsékletre, ezért és a reprodu-kálhatóság érdekében olyan metodikákat dolgoznak ki, ame-lyek során a 4–6 �C-on történõ elektroforézist részesítikelõnyben. Jól beállított módszer esetén SSCP-vel az adottgénszakaszon belül elõforduló DNS variánsok 92–95%-a ki-mutatható. Az SSCP módszer kiválóan alkalmas egy-egygénszakasz szûrésére, azonban szenzitivitása nem 100%-os.Alkalmazási területét olyan ismert mutáció detektálása jelen-ti, amelyet már sikerült kimutatni és amihez pozitív és negatívkontrollok állnak rendelkezésre.
Allélspecifikus PCR és Taqman allél diszkriminációsassay. Az elõbbiekben ismertetett módszerekkel ellentétbenallélspecifikus PCR esetén már a PCR reakció önmagában is amutáció azonosítását biztosítja.
Azt a folyamatot, amelynek során egy mutáció vagy poli-morfizmus azonosítása történik genotipizálásnak nevezzük.Ismert mutációk eseteiben a normál (vad) allélnak, valamint amutációnak megfelelõ (mutáns) primerekkel végzett PCR-módszerrel az ismert eltérést azonosíthatjuk, mivel mutációesetén a mutáns allélokkal végzett PCR-ben, míg vad típusesetén csak a vad típusra specifikus primerekkel végzett reak-cióban lesz termék. Hagyományos esetben a mutációnakmegfelelõen a két különbözõ primerrel végzett reakciót kétkülön csõben, de napjainkban real-time PCR esetén egyazoncsõben, de különbözõ fluoreszcens festékkel jelölt próbákkal
(Taqman-assay) végzett PCR reakcióval a genotipizálás egy-szerûen, gyorsan kivitelezhetõ. Az eredmények értékeléséthagyományos PCR során agaróz-gélelektroforézis után,RT-PCR során az amplifikációs görbe vizsgálatával értékel-hetjük. Hagyományos PCR esetén a reakcióelegynek tartal-maznia kell egy harmadik (ún. belsõ standard) primert, ami agénen belül a mutációtól eltérõ helyen tapad, ezzel ellenõriz-zük, hogy a PCR reakció végbement, és nem technikai hibaokozta a negatív eredményt.
A denaturáló gradiens (DDGE) és a hõmérséklet gradi-ens gél-elektroforézis (TTGE) alapelve, hogy, a mutációt tar-talmazó DNS olvadási profilja eltér a vad típusétól, denaturá-ló ágenst (urea, hõmérséklet) tartalmazó gélben történõelektroforézis során ezek egymástól jól elkülöníthetõek. ATTGE és DGGE során használt PCR termékeket olyan prime-rekkel készítjük, melyek egy GC-gazdag (30 bázispár) végettartalmaz. Azt, hogy ez a vég melyik primerre kerüljön aDNS-szekvencia olvadási profiljának számítógépes elemezé-se után állapítjuk meg. A denaturálást követõ renaturálás so-rán négyféle termék keletkezik; két vad típusú DNS-szál hib-ridizációjából normál homoduplexek, két mutáns szál össze-tapadásából mutáns homoduplexek képzõdnek, továbbá egynormál és egy mutáns DNS-szál kapcsolódásából hetero-duplexek képzõdnek, melyek denaturálódása (a mutáció terü-letén kialakuló mismatch miatt) korábban megkezdõdik, minta homoduplexeké. Elektroforézis során a minták a gélben elõ-ször csak részlegesen, majd egyre nagyobb mértékben dena-turálódnak. Mivel azonban a mesterséges GC-vég nem válikszét a futtatás alatt, a részleges „faágszerû” kettéválás meg-lassítja a minták futását. A homozigóta normál allélek egyet-len csík formájában ábrázolódnak a gélen, ez felel meg a nor-mál homoduplexnek. A fentieknek megfelelõen a gélen hete-rozigóta mutációk esetén kettõnél több csík jelenik meg. Agél elõhívása ethidium-bromidos festéssel vagy ezüstözésseltörténik.
A fent említett módszer automatizált változata a denatu-ráló nagy felbontóképességû folyadékkromatográfia(DHPLC). A mutációk következtében bekövetkezõ olvadásipont megváltozását kihasználó automatizált mutáció detektá-ló rendszer alkalmas fluoreszcens jelölés nélküli PCR termé-kek hatékony elkülönítésére. Reverz fázisú HPLC során a de-naturált PCR-termekét nagy nyomáson, egy, az elválasztástbiztosító oszlopon áramoltatják át. Ehhez az oszlophoz a PCRa homo- és heteroduplexek különbözõ affinitással kötõdnek,ami lehetõvé teszi, hogy a folyamatos mosás mellett az osz-lopról különbözõ idõpontban leváló termékeket egy detektor-ral (leggyakrabban spektrofotométer) vizsgálják. A különbö-zõ minták kromatogrammjait a kontrollmintákhoz hasonlít-juk. Ez a módszer a különösen nagy, több exonból álló gének(BRCA1, BRCA2, NF1) mutációszûrésére alkalmazható.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
282
Molekuláris biológiai módszerek II.Közvetlen szekvenciaanalízis, hibridizációs technikák
Molecular biological methods II. Direct sequencing, hybridization techniques
Dr. Tordai AttilaOVSZ Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium
Kulcsszavak: ????????????????????Key-words: ????????????????????
A DNS bázissorrend közvetlen meghatározásának, aszekvenálásnak az elve az amplifikációs módszerekhez köt-hetõ. Az 1975-ben leírt Sanger-féle láncterminációs technikalényege, hogy didezoxi-ribózt (a 3’ helyzetben nem tartalmazhidroxil [OH] csoportot) tartalmazó, jelölt nukleotidokat isadunk a korábban PCR-rel felsokszorozott, primerektõl ésdNTP-tõl megtisztított DNS mintához. Ezeket a nukleotido-kat a DNS-polimeráz véletlenszerûen építi be a szintetizálódóDNS-lánc különbözõ pozícióiba, a kémiai módosítás miattazonban a lánc ettõl a ponttól nem hosszabbítható tovább, aszintézis megakad (termináció). Kezdetben radioaktív jelö-lést alkalmaztak, így négy különbözõ reakciót kellett párhu-zamosan végezni az egyes bázisoknak megfelelõ didezoxi-nukleotidokat külön-külön adva a reakciókhoz. A jelenleg el-terjedt módszer már négy különbözõ fluoreszcens festékkeljelölt didezoxi-nukleotidot alkalmaz, ezért egy csõben hajtha-tó végre. A végeredmény tehát különbözõ hosszúságú, azegyik végen a nukleotid típusának megfelelõ színnel jelölt,didezoxi-nukleotidot tartalmazó oligonukleotid-keverékekkeletkezése. A szekvencia megismeréséhez a fragmentumokméretét kell meghatározni 1 bázispár pontossággal, hiszen azutolsó pozícióban levõ nukleotid típusa a színbõl azonosítha-tó. Az elválasztást korábban nagy felbontású poliakrilamidgélelektroforézissel, ma már automatizált kapilláris-elektro-forézissel hajtják végre.
A DNS-hipermetiláció vizsgálatára alkalmas módszer abiszulfitos kezelés után végzett szekvenálás. A kezelés hatá-sára a nem metilált citozin bázisok uracillá alakulnak, ame-lyek a biszulfitos kezelést követõ PCR során timinkéntamplifikálódnak, a metilált citozinok változatlanok maradnakés a késõbbi PCR során citozinként amplifikálódnak.
Piro-szekvenálásAz 1996-ban leírt piro-szekvenálás a Sanger-féle
láncterminációs szekvencia analízishez képest alternatív, má-sodik generációs (next generation sequencing – NGS) techno-lógia. Lényege az immobilizált templáton megvalósulóDNS-polimeráz aktivitás kimutatása kemilumineszcenciával(a luciferáz enzim által katalizált luciferin-oxi-luciferin átala-kulást kísérõ fényjelenséggel), ahogy az enzim a komplemen-taritás elve alapján egyesével beépíti a megfelelõ nukleoti-dokat a szintetizálódó DNS-láncba. Az elnevezés a bázis-be-építés során keletkezõ pirofoszfát vegyületre utal, ami a ki-mutatási reakciósorozat alapját képezi. A piroszekvenálás so-rán egyszerre csak egy nukleotidot (dCTP, dGTP, dTTP, ésdATP helyett dATP-alfaS) adnak a reakcióba, és érzékenydetektorral rögzítik, hogy történt-e nukleotidbeépülés, azazkeletkezett-e pirofoszfát, és ennek következtében fényjelen-ség. A be nem épült nukleotidokat a piráz enzim bontja, majdkövetkezik az újabb nukleotidot tartalmazó elegy hozzáadása.A keletkezett pirofoszfát, illetve fény mennyisége arányos a
beépült nukleotid mennyiségével, így ha egymást követõentöbb azonos nukleotid épül be, az észlelt szignál az egynukleotidnak megfelelõ többszöröse lesz. A miniatürizáció ésa nagyfokú automatizáció révén ugyanakkor hatalmas nyersszekvencia-mennyiség (20–100 millió bázis) állítható elõ amintegy 6–7 órás folyamat alatt. További elõny, hogy a tech-nológia emulziós PCR technikát követõen kifejezetten alkal-mas kevert DNS-minták (mozaikosság, heterogén genetikaiállományú daganatos minták) szekvenálására. Az emulziósPCR eljárás részét képezõ gyöngyös immobilizáció és az egylyukban csak egy gyöngy jelenlétét lehetõvé tevõ méretviszo-nyok révén a szekvenálási eredmények egyetlen DNS-szálravonatkoztathatók, így szükségtelenné válik a fáradságos ésidõigényes klónozási eljárás. További NGS technikák közöttemlítendõ a reverzíbilis lánctermináció és a ligálásos szek-venálás.
HibridizációA nukleinsavak biokémiájának egyik legalapvetõbb je-
lensége a hibridizáció. Ezen azt a folyamatot értjük, amely-nek során két egyszálú nukleinsav molekula egy kettõs szálúmolekulát hoz létre a bázis-komplementaritás (A-T illetveG-C) elve alapján. A hibridizáció fiziológiás körülményekközött mindig létrejön. A folyamat megvalósulhat a DNS il-letve az RNS molekulák bármilyen kombinációjában. A ket-tõs szálú molekula stabilitását jelentõsen befolyásolja a bázis-összetétel, hiszen a G-C bázisok között 3, az A-T bázisok kö-zött pedig csak 2 hidrogén kötés alakul ki. A kettõs szálú mo-lekula szétkapcsolása (denaturáció) történhet a hõmérsékletemelésével vagy az oldat összetételének változtatásával (pl. asó koncentráció csökkentésével illetve formamid hozzáadá-sával). Ha két nem jelölt DNS-lánc kapcsolódik a bázis-komplementaritás elve alapján anellációról, ha pedig egy je-lölt lánc (szonda, az angol terminológiában „probe”) kapcso-lódik egy nem jelölt molekulához, hibridizációról beszélünk.A hibridizáció bekövetkezését a jelölt szondától függõenegyéb laboratóriumi módszerekhez hasonlóan radioaktív izo-tópos (autoradiográfia, szcintillációs számlálás), illetve nemizotópos módszerekkel (fluoreszcencia, kemilumineszcencia,kolorimetria) követhetjük. A hibridizáció lejátszódhat oldat-ban, vagy szilárd hordozón. A folyékony fázisú hibridizációkönnyen automatizálható, kvantitatív meghatározást tesz le-hetõvé, azonban a reakció során kimutatott DNS-szakasz mé-rete nem határozható meg, és viszonylag alacsony a módszerérzékenysége. A szilárd hordozón végzett hibridizáció jelen-ségén a nukleinsav-kimutatás számos alapvetõ módszere(Southern és Northern blotting, dot-blot, in situ hibridizáció,array/chip technológia) alapul.
A Southern blot (az azt elsõként 1975-ben leíró, EMSouthern-rõl elnevezve) a restrikciós endonukleázzal történõhasítás, az elektroforetikus elválasztás és a hibridizáció mód-
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
283
szereit kombinálja. A DNS-molekulát egy vagy több, elõremegválasztott restrikciós endonukleázzal emésztjük, és a ke-letkezett DNS-darabokat agaróz-gélelektroforézissel választ-juk el méret szerint. Denaturálást követõen, az egyszálúemésztett DNS-darabokat, a futási sorrendet megõrizvepasszív diffúzióval (esetleg elektromos feszültség vagy vá-kuum transzfer segítségével) szilárd hordozóra (nylon vagynitrocellulóz membránra) visszük át (blottoljuk), rögzítjük(hevítés, keresztkötés UV-fényben), és a membránhoz rögzí-tett DNS-t hibridizáltatjuk egy olyan DNS-szondával(„probe”), amely a vizsgálni kívánt szakaszra specifikus. Aszonda radioaktív izotópos vagy nem radioaktív jelölést tar-talmaz, így a kérdéses régiót tartalmazó DNS fragmen-tum(ok) megjeleníthetõ(ek), és méretük meghatározható.
Az RNS molekulák vizsgálatára szolgáló Northern blotelve hasonló. Mivel az mRNS szálak mérete megfelelõ, nincsszükség restrikciós hasításra. A méret szerinti elválasztástazonban denaturáló körülmények között végezzük, hogy amolekulák alakja ne befolyásolja a méret szerinti elválasztást.A blottolás elõtt nem szükséges további denaturációs lépés,míg a hibridizálás és a detektálás módja hasonló.
A blottolási technika gyorsítható, ha kihagyjuk a méretszerinti szeparáció lépését és a nukleinsavakat közvetlenül amembránra cseppentjük fel. A felcseppentés alakjától függõ-en dot-blot, illetve slot-blot technika ismert. A hibridizációkülönbözõ jelölésû, génspecifikus szondával történhet.Reverz dot-blot eljárásnál génspecifikus szondákat rögzítünkszilárd hordozóhoz és jelölt teljes RNS/DNS-sel történik ahibridizáció.
Az utóbbi néhány évben igen látványos fejlõdésen mentkeresztül az array/chip technológia, és napjainkra elérhetõ
közelségbe került a módszer rutin diagnosztikai alkalmazásais. A magyarul egy szóval nehezen kifejezhetõ array alattmakromolekulák térben rendezett, kisméretû szilárd hordozó-hoz (szilikon lapka, azaz „chip”) rögzített sorozatát értjük,amely eszközhöz különbözõ reagens-elegyeket hibridizálta-tunk és a reakció létrejöttét, illetve intenzitását fluoreszcensfestékek segítségével követjük. Macro-array esetén a nitro-cellulóz membrán néhány száz, legfeljebb ezer gén-specifi-kus mintát tartalmaz, és a felcseppentett minták átmérõje na-gyobb, mint 300 mm. Micro-array esetén a felcseppentett min-ták mérete kisebb, mint 300 mm, és a felvitt mintaszám többezer, akár több tízezer.
Mindehhez óriási technológiai fejlesztésekre volt szük-ség, amely a számítástechnikai eszközfejlesztés és miniatü-rizáció, a robottechnika, illetve a bioinformatika együtteseredményeinek köszönhetõ. A micro-array esetében a hordo-zó a számítástechnikai iparból átvett szilikon lapka, és a mo-lekula-rögzítés, illetve szintézis különbözõ módszerei (me-chanikus felcseppentés nagy precizitású cseppentõrobot se-gítségével, ink-jet technológiával, vagy in situ oligo-nukleotid-szintézis fotolitográfiai eljárással) szintén a számí-tástechnika területérõl származnak. A chiphez rögzített anyagtermészete szerint megkülönböztetünk oligonukleotid array-ket és cDNS array-ket. Az oligonukleotidok vagy a felületenin situ készülnek el, vagy az elõre megszintetizált oligo-nukleotidokat a cDNS-hez hasonlóan robot viszi fel. A fluo-reszcens jel leolvasása nagy felbontású CCD-kamerával tör-ténik, amely mennyiségi meghatározást is lehetõvé tesz. Achip-technológia révén óriási adatmennyiséghez juthatunkviszonylag rövid idõn belül, külön megoldandó feladat tehátennek az információtömegnek az átalakítása klinikai, illetvekutatási szempontból hasznosítható információvá.
Molekuláris diagnosztika örökletes betegségekben
Molecular diagnostics of inherited disorders
Dr. Tordai AttilaOVSZ Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium
Kulcsszavak: ????????????????????Key-words: ????????????????????
Az örökletes betegségek, illetve kockázati tényezõk ki-mutatására irányuló laboratóriumi diagnosztika hatalmas fej-lõdésen ment keresztül az utóbbi években, amelynek hátteré-ben a területtel kapcsolatos kutatómunka (például a humángenom projekt) robbanásszerû forradalma áll. A vizsgálatokrévén lehetõvé válik egyre több ismert génmutáció/kockázatitényezõ jelenlétének preszimptomatikus, illetve praenataliskimutatása, amely alapvetõ hatást gyakorol a rutin betegellá-tásra, és sok esetben erõsíti a prevenciós tevékenységeket.Igen gyakran új kihívást jelent azonban a genetikai tesztekeredményeinek értelmezése, hiszen sok esetben a rendelke-zésre álló tudományos információ alapján csak egy vagy többkockázati tényezõ jelenléte mutatható ki, amely egy bizonyosbetegség kialakulását valószínûsítheti. Ezt az információtigen körültekintõen kell az érintett tudomására hozni, ami kü-lönleges felkészültséget és többlet idõ ráfordítást igényel (ge-netikai tanácsadás). Ezért szoros kapcsolattartásra van szük-ség a laboratórium szakképzett személyzete és a vizsgálatotkérõ klinikus között.
Gyorsan nõ azon betegségek száma, amelyekben már is-mert a molekuláris patomechanizmus, azaz ismert a DNS-el-térés (mutáció) természete, gyakorisága, és ismert a betegséghátterében álló gén által kódolt fehérje mennyiségi, illetveminõségi eltérése és az ebbõl következõ funkciózavar. A mu-tációk típusaik szerint csoportosíthatók nagyméretû szerkeze-ti eltérésekre (deléciók, inszerciók, inverziók) illetve kis szer-kezeti eltérésekre (aminosavcserével járó [missense] pont-mutációk, stop-kodon kialakulásával járó [nonsense] pont-mutációk, olvasási keret eltolódással [frameshift] járódeléciók vagy inszerciók). A kódoló régiók mellett a mutációérintheti az mRNS érési (splicing) folyamatát befolyásolószakaszokat, illetve az expresszió szabályozásáért felelõspromoter régiókat is. Egyre fontosabbá válnak az egyének kö-zött mintegy 1000 bázispáronként kimutatható, egy nukleo-tidot érintõ variánsok (single nucleotide polymorphisms –SNP), amelyek konkrét jelentõsége intenzív kutatások tárgyátképezi.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
284
Bizonyos esetekben az SNP-k örökletes kockázati ténye-zõt (pl. Leiden mutáció), illetve betegségokozó mutációt (pl.sarlósejtes anaemia, Wilson-kór, örökletes haemochromato-sis) is jelenthetnek. Ezeknek az SNP-knek a diagnosztikai ki-mutatása ma már rutin laboratóriumi feladat.
A már ismert SNP kimutatására gyakran alkalmazottmódszerek:a) PCR-RFLP: az ismert DNS-szakasz amplifikációja egy-
szerû PCR-rel, restrikciós hasítás, és a vad típusú, illetveSNP-t hordozó alléllek elkülönítése az emésztésbõl kelet-kezõ különbözõ fragmentumok alapján agaróz gél-elektroforézissel;
b) PCR-SSP (szekvenciaspecifikus primerek, más névenallélspecifikus PCR): több párhuzamos PCR-reakcióolyan primerekkel, amelyek 3’ végeiken a vad típusú, il-letve SNP-specifikus nukleotidokat tartalmazzák, ésmegfelelõ körülmények mellett csak teljes egyezés eseténadnak PCR-terméket;
c) valós idejû (real time) PCR.
Monogénes betegség esetében, ha a mutáció nem ismertelõre, nem minden esetben gazdaságos a közvetlen mutá-ció-azonosítás, sõt, korábban erre még lehetõség sem volt.Ezért indirekt családvizsgálatot alkalmaztak a hordozó, illet-ve érintett személyek azonosítására. Ennek lényege, hogy abetegséget okozó gén nem kódoló régióiban (intra- vagyextragenikusan) elhelyezkedõ polimorf, kapcsolt markerek(di- tri- tetra-nukleotid ismétlõdõ szakaszok, mikroszatelli-ták) öröklésmenetét hasonlítják össze a betegségben szenve-dõ, az obligát hordozó és a vizsgálandó személy esetében. Amódszer elõnye, hogy nem kell jelentõs erõfeszítéseket tennia konkrét betegségokozó mutáció kimutatására, hátránya,hogy több családtagtól kell mintát venni, illetve, hogy azeredmény itt is valószínûség jellegû, hiszen nem zárható ki arekombináció lehetõsége.
A közvetlen szekvencia-elemzés gépesítése és egyrecsökkenõ költségei hatására terjedõben van a közvetlen mutá-ciókimutatás (szekvenálás), mivel definitív eredményt ad, éskésõbb az információ birtokában több családtag esetében márelegendõ célzott elemzéseket végezni.
Ismert örökletes eltérések preszimptomatikusan is kimu-tathatók. Ez kezelhetõ/megelõzhetõ kórképeknél (pl. örökle-tes haemochromatosis) kifejezett elõnyt jelenthet a tünetmen-tes állapotban elkezdett kezelés/gondozás révén. Súlyosab-bak a preszimptomatikus DNS-vizsgálatok következményeiolyan esetben, amikor gyógyíthatatlan kórkép korai kimutatá-sát teszik lehetõvé, pl. Huntington-chorea, valamint az örök-letes daganatos betegségek esetén, ahol gyakran a mutációkpenetranciája nem teljes. Ezekben az esetekben kell a legna-gyobb körültekintést tanúsítani és képzett genetikai tanácsadóorvos, esetenként pszichológus segítségét is bevonni az ered-ményközlés és interpretáció folyamatába.
Súlyos kórképek esetén indokolt örökletes eltérésekpraenatalis diagnosztikáját elvégezni. A magzati mintavétel-nek hagyományosan két fõbb módja terjedt el:a) a 16. terhességi hét táján végzett amniocentézis során az
amnion folyadékból centrifugált sejtek jelentik a magzatiszövetet,
b) chorionboholy-biopsia (chorion villus sample – CVS),amikor a 10–12. terhességi héten a placenta magzati olda-lából nyernek magzati szövetet.Újabb lehetõség a preimplantációs genetikai diagnosztika
(PGD), amelynek során a mesterségesen megtermékenyítettembrió egy-két sejtjének felhasználásával végeznek DNS-
vizsgálatot. Az eltávolított, igen kis mennyiségû anyagbólPCR-technikával végeznek nemmeghatározást, keresnek egygént érintõ rendellenességeket, illetve FISH technikával ke-resnek kromoszóma-rendellenességeket. Az egy sejtben talál-ható genetikai anyagból kiinduló meghatározások azonbanszámos technikai nehézséget rejtenek, és jelentõs elõkészí-tést, illetve szakmai tapasztalatot igényelnek. A születés elõttigenetikai diagnosztika legújabb, még minimálisan invazív le-hetõsége az anyai vérben keringõ, kis mennyiségû magzatieredetû DNS felhasználása. A magzati és az anyai DNS a je-lenlegi technikákkal nem választható el teljes mértékben, ígya technika felhasználása azoknak a genetikai eltérések vizsgá-latára korlátozódik, amelyek nem fordulnak elõ az anyaigenomban (pl. magzati nem meghatározás, magzati Rh vér-csoport meghatározás Rh negatív anya esetén, apai génmutá-ció kimutatása).
A praenatalis diagnosztikával a terhesség korai szakábannagy biztonsággal állapítható meg, hogy a magzat hordozza-ea betegséget. A laboratóriumi eredményt ebben az esetben isrészletes és szakszerû genetikai tanácsadás keretében kell azérintettel közölni, és minden információval el kell látni ahhoz,hogy felelõs döntést hozhasson terhessége sorsáról.
Az örökletes nukleinsaveltérések vizsgálata felhasznál-ható az egyén (illetve a minta) azonosítására is. E célból kétkülönbözõ szakterületen kérhetnek a laboratóriumtól segítsé-get: (i) apasági vizsgálatok, (ii) bûnügyi alkalmazások. Bár akonkrét problémák esetenként igen eltérõek lehetnek, a labo-ratóriumi módszerek elvei sok hasonlóságot mutatnak. Típu-sos esetben a kérdés az, hogy kizárható-e két minta (egy felté-telezett apa és fiú vagy egy helyszíni emberi anyag és egygyanúsítottól származó minta) közötti kapcsolat, illetve azo-nosság. Ehhez olyan polimorf tulajdonságok (markerek) vizs-gálata használható fel, amelyek öröklésmenete a mendeli sza-bályokat követi, illetve amelyek nagy valószínûséggel vélet-lenszerû eltérést mutatnak az egyes személyek között. A ko-rábban használt polimorf markerrendszereket (vércsoport an-tigének, HLA-szerotípusok, vörösvérsejt enzimek, szérumfe-hérjék) napjainkra jórészt kiszorították a DNS-alapú mar-kerek. Ennek fõ oka a DNS-markerek nagyfokú informativi-tása és a kényelmes anyagvétel, illetve feldolgozhatóság.DNS-markereknek olyan nem kódoló DNS-szakaszokat ne-vezünk, amelyek nagyfokú eltéréseket mutatnak egyes egyé-nek között. Ezek a leggyakrabban ismétlõdõ szekvenciák(short tandem repeat – STR – vagy mikroszatellita, ha az is-métlõdõ nukleotidok száma 2–9 bp; illetve variable numberof tandem repeat – VNTR – ha 10–60 bp), amelyek az ismét-lõdések számától függõ nagyságú PCR-terméket adnak, éstöbb gyakori alléllal (variánssal) rendelkeznek.
Öröklésmenetük a mendeli szabályokat követi, azaz egyeltérõ anyai és egy eltérõ apai alléllal rendelkezõ személyheterozigóta mintázatot ad, és a szülõk genotípusának ismere-tében azonosítható egy adott marker öröklésmenete. A mar-kervizsgálatok során korábban radioaktívan jelölték a PCR-termékeket és nagy felbontású poliakrilamid gélelektroforé-zist, illetve autoradiográfiát végeztek. Ezt a módszert máraszinte teljes mértékben felváltotta a fluoreszcens jelölés és azautomatizált kapilláris elektroforetikus elemzés. A használtmarkerek tekintetében is nemzetközi konszenzus kezd kiala-kulni és a reagens gyártók már 8–16 marker egyidejû elemzé-sére alkalmas, teljes reagens készleteket forgalmaznak. ADNS-markerekkel végzett egyénazonosítás rutin diagnoszti-kai alkalmazása a haematopoeticus õssejt-transzplantációtkövetõ donor-recipiens kimérizmus nyomon követése.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
285
Genetikai kockázati tényezõk rosszindulatú hematológiai kórképekben
Genetic risk factors in hematological malignancies
Dr. Andrikovics HajnalkaOrszágos Vérellátó Szolgálat, Molekuláris Diagnosztikai Laboratórium
Kulcsszavak: BCR-ABL, 2–es típusú Janus kináz V617F, core binding factor, nucleophosmin, FLT3, immunglobulin nehéz láncKey-words: BCR-ABL, Janus kinase 2 V617F, core binding factor, nucleophosmin, FLT3 immunoglobulin heavy chain
Jelenlegi ismereteink szerint a testi sejtek rosszindulatúdaganatsejtté való átalakulásában a sejtfunkciókat irányítógenetikai állományban bekövetkezõ mutációk sorozata tehetõfelelõssé. A rosszindulatú hematológiai betegségben szenve-dõ betegek individuális genetikai hátterének felderítése nap-jainkban már nemcsak tudományos jelentõségû, és a betegségelméleti hátterét segít feltárni, hanem a szerzett mutációk ki-mutatása a diagnosztikai rutineljárások közé tartozik. A gene-tikai információ diagnosztikai vagy prognosztikai szereppelbírhat; célzott, egyénre szabott terápiás lehetõségeket bizto-síthat; valamint a betegség követése során a diagnóziskorvagy a relapszuskor azonosított genetikai eltérés minimálisreziduális betegség (MRD) követési markerként szolgálhat.Az onkohematológiai genetikai diagnosztikában alkalmazottlaboratóriumi módszerek palettája széles, citogenetikai(kariotípus-vizsgálat, fluoreszcencia in situ hibridizáció), va-lamint DNS és RNS alapú molekuláris genetikai vizsgálatok-ra oszthatóak. A molekuláris genetikai módszerek közül areverz transzkripció (RT), a polimeráz láncreakció (PCR) kü-lönbözõ típusai (allélspecifikus, multiplex, nested, valós-ide-jû mennyiségi PCR) és a szekvenálás terjedtek el. A PCR ter-mék agaróz gél-, ill. kapilláris-elektroforézissel vagy külön-bözõ fluoreszcens jelölési technikákkal (hibridizációs vagyhidrolízis szondával) vizsgálható. A megfelelõ detektálásimódszer kiválasztásával akár 10–3–10–6 szintû érzékenység iselérhetõ molekuláris genetikai módszerekkel az MRD kimu-tatásakor. Mutációs forrópont hiányában, a direkt szekvenciaanalízis elõtt egyre elterjedtebben használják az ún. mutáció-szûrõ módszereket (pl. a denaturáló, nagyfelbontású folya-dék-kromatográfiát – dHPLC – vagy a nagyfelbontású olva-dási görbe analízist – HRM). Egyes onkohematológiai beteg-ségek genetikai háttere annyira heterogén, hogy a molekulárismarkerhalászat eszköztárába a különbözõ array és következõgenerációs szekvenálási technikák is bevonultak.
A krónikus myeloid leukaemia (CML) egységes genetikaihátterû betegség. A Philadelphia (Ph) kromoszóma [a t(9;22)reciprok transzlokáció következtében megrövidült 22. kro-moszóma] vagy a fúziós kromoszómáról átíródó BCR-ABLtranszkriptum kimutatása a betegség diagnosztikus kritériu-ma. A BCR-ABL fúzió szabályozatlan ABL tirozin-kináz-ak-tivitást eredményez, amely a proliferáció fokozódásához ve-zet. A célzott tirozin kináz inhibitorok (TKI) közül, aBCR-ABL specifikus imatinib jelenleg az elsõ választandókezelési mód CML-ben. A betegség követése során a TKI te-rápia megfelelõ hatékonyságát kariotipizálással, valamint aBCR-ABL transzkriptum mennyiségi követésével (valós ide-jû, reverz transzkripciót követõ PCR-rel) monitorozhatjuk.Terápiás kudarc esetén nagyobb hatáserõsségû, második ge-nerációs TKI-ok, valamint a csontvelõ transzplantációs keze-lés közül lehet választani. A TKI terápiára adott nem megfele-lõ terápiás válasz hátterében az esetek jelentõs százalékában aBCR-ABL gén tirozin-kináz doménjében rezisztencia mutá-
ciók mutathatók ki szekvenálással, amely egy rutin molekulá-ris genetikai vizsgálat a második generációs TKI kiválasztásaelõtt.
A BCR-ABL negatív myeloproliferatív neoplasiák eseténa 2-es típusú Janus kináz (JAK2) aktiváló pontmutációja (a617. valin aminosav fenilalaninra történõ cseréje, azazV617F) a leggyakoribb genetikai eltérés. A JAK2 V617Fpolycytaemia verában a betegek >95%-nál, essentialis throm-bocytaemiában és primer myelofibrosisban a betegek mint-egy 50%-ánál mutatható ki. A JAK2 tirozin-kináz különbözõreceptorok (pl. interleukin-3, erythropoietin és thrombopoie-tin) liganddal történõ kapcsolódásakor aktiválódik, és számosproliferációt közvetítõ jelátviteli útvonalat aktivál. A JAK2V617F pontmutáció jelenlétében ligand kapcsolódás hiányá-ban is JAK2 aktiváció figyelhetõ meg. A JAK2 V617F kimu-tatására egyszerû allélspecifikus PCR módszerek terjedtek ela rutin diagnosztikában. A JAK2 inhibitorok forgalomba ke-rülésével párhuzamosan várható a valós idejû kvantitatívV617F mutáció kimutatási módszerekre történõ váltás.
Az akut myeloid leukaemia (AML) nemcsak morfológiai-lag, hanem genetikai háttér tekintetében is heterogén: eddigtöbb száz, ismétlõdõ kromoszómaeltérést és számos szub-mikroszkópikus méretû, csak molekuláris genetikai módsze-rekkel azonosítható DNS/RNS szintû eltérést mutattak ki akórkép hátterében. A klinikai, illetve a morfológiai kép mel-lett a citogenetikai és molekuláris genetikai eltérések fontosprognosztikai tényezõknek bizonyultak. Az AML fenotípusá-nak megjelenéséhez több mutáció egyidejû jelenléte szüksé-ges az érintett sejtklónban. Az õssejteket érintõ mutációkegyik csoportja a differenciálódás gátlásához, míg a másikcsoportja a daganatos sejtek proliferációs elõnyéhez a vezet.Az elsõ csoportba a haematopoiesist szabályozó, transzkrip-ciós faktorok többnyire inaktiváló, szabályozást módosítómutációi, míg a második csoportba a növekedési faktor recep-torok, valamint az azokból kiinduló jelátviteli mechanizmu-sok molekuláinak aktiváló mutációi tartoznak. Az azonoscsoportba tartozó mutációk egy AML klónban egyidejûlegnem vagy alig fordulnak elõ és a különbözõ kooperáló mutá-ciók sem társulnak véletlenszerûen.
A core binding faktor (CBF) két alegységbõl álló transz-kripciós faktor komplex. Az alegységet a hematopoietikussejtvonalban a RUNX1, a alegységet a CBFB gének kódol-ják. AML-ben a két gén érintettsége közel 30%-ra tehetõ: afunkcióvesztéses mutációk lehetnek kiegyensúlyozott kro-moszómaátrendezõdések következtében létrejövõ fúziós gé-nek [t(8;21) esetén az RUNX1–RUNX1T1, t(16;16) vagyinv(16) esetén a CBFB-MYH11 gének fúziója], vagy szerzettRUNX1 gént érintõ pontmutációk. A CBF leukaemiák prog-nózisa kedvezõ, célzott terápiájuk nem ismert. Az akut pro-myelocytás leukaemia (APL, AML-M3) jellemzõ genetikaieltérése a retinsavreceptor (RARA) gén (17q12) transzloká-ciói, amelyek közül a promyelocytás leukaemia (PML) gén
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
286
érintettségével járó t(15;17) transzlokáció a leggyakoribb. Amolekuláris háttér felfedezése vezetett a hatékony célzott te-rápia kialakításához. A csupa-transz-retinsav hozzáadása akemoterápiás protokollhoz a kedvezõ prognosztikai csoport-ba helyezte a korábban rossz prognózisú APL-t. A NPM1 gén12. exonjában található, 4 bázispár inszercióval járó mutációijelenlétében a fehérje kóros citoplazmatikus lokalizációjaészlelhetõ. A mutáció gyakorisága a teljes AML populáció-ban 25–35%, normál karyotípusú AML-ben viszont 45–60%,így jelenlegi ismeretek szerint az egyik leggyakoribb geneti-kai eltérés AML-ban. A NPM1 mutáció kedvezõ prognoszti-kai faktor.
Az FLT3 (fms-szerû tirozin kináz 3) receptor tirozin-kináz ligandjával történõ kapcsolódása a progenitor sejtekproliferációját fokozza. Az FLT3 gén két különbözõ típusúaktiváló mutációja ligandfüggetlen receptordimerizációt ésszámos sejten belüli jelátviteli útvonal aktiválódását eredmé-nyezi. Az FLT3 juxtamembrán domén különbözõ méretû éselhelyezkedésû, de az olvasási keretet mindig megtartó ún.internal tandem duplikációi (ITD) a betegek 10–40%-ánál, atirozin kináz domén (TKD) 835. kodon pontmutációk pedig abetegek 5–10%-ánál mutathatók ki. Az FLT3 mutációk leg-gyakrabban a normális kariotípusú, NPM1 mutációt hordozó(40%), valamint a PML-RARA (40%) transzlokációt hordozóbetegeknél fordulnak elõ. Az FLT3 mutációk emelkedettrelapszus-aránnyal és csökkent átlagos túléléssel társulnak.Jelenleg számos FLT3-specifikus kis molekulasúlyú tirozin-kináz inhibitor (TKI) vegyület van a klinikai kipróbálás fázi-sában, de önálló kezelésként a CML blastos fázisában alkal-mazott imatinib kezeléshez hasonlóan a hatásuk átmeneti. AKIT receptor tirozin kináz aktiváló pontmutációi CBF
leukaemiában szenvedõ AML betegek 10–40%-ánál fordul-nak elõ és rossz prognózissal járnak. TKI kezelés kemoterápi-ával kombinálva célzott terápiás protokollok részét képezhetiKIT mutációk esetén. A RAS proteinek membrán-asszociáltGTP-kötõ fehérjék. Mûködõképességük eléréséhez számosposzt-transzlációs módosításon kell átesniük. A RAS fehérjé-ket számos citokin receptor (FLT3, KIT) aktiválja a megfele-lõ liganddal történõ kapcsolódást követõen. Onkogén hatásúNRAS illetve KRAS mutációk az AML-ben szenvedõ bete-gek mintegy 25%-ánál mutathatók ki. A RAS mutációknaknincs prognosztikai jelentõsége AML-ben, viszont a fokozottaktivitású RAS blokkolása a farnesyl transzferáz inhibitorok-kal logikus terápiás célpont.
Az AML molekuláris genetikai diagnosztikája magábafoglalja a transzlokációk reverz transzkripciót követõ minõ-ségi és mennyiségi PCR-rel történõ vizsgálatát, az inszerció-val járó NPM és FLT3 mutációk PCR követõ kapilláris-elektroforetikus kimutatását diagnóziskor és remisszióbanMRD követésére. Az érzékeny molekuláris genetikai mód-szerekkel a relapszus gyakran a klinikai tünetek elõtt kimutat-ható.
Lymphoproliferatív kórképek esetén az immunglobulinnehéz lánc (IgH) és a T-sejt-receptorok génátrendezõdés vizs-gálatával elkülöníthetõ a mono-, illetve poliklonális lymphoidsejtszaporulat. Krónikus lymphoid leukaemiában az átrende-zõdött IgH gén hipermutációs státusza a legjobb prognoszti-kai marker. ALL-ben a BCR-ABL kimutatása diagnosztikusés prognosztikus. A gyermekkori ALL MRD követésében el-terjedt módszer az érintett daganatos sejtklón IgH génátren-dezõdésre specifikus egyéni szonda tervezése.
Öröklõdõ anyagcsere-betegségek diagnosztikája gyermekkorban
Diagnosis of inborn error of metabolism in childhood
Dr. Szõnyi LászlóSemmelweis Egyetem, I. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika
Kulcsszavak: öröklõdõ anyagcsere-betegségKey-words: inborn error of metabolism
Az öröklõdõ anyagcsere-betegségek a genetikai kórképekcsoportjába tartoznak; hátterükben egy gén mutációja áll. Azegy gén hibájából eredõ betegségek (single gene disorders)számát 4000–5000-re becsülik, ezek 15%-a tartozik az örök-lõdõ anyagcsere-betegségek közé. Az öröklõdõ anyagcse-re-betegségek számát 600–1000 körülinek tartják, de ez aszám a tudomány fejlõdésével folyamatosan nõ. Ezek a be-tegségek becslések szerint minden 1500–4000. újszülöttetérintik, azaz Magyarországon évente 25 és 70 közötti esettelkell számolni. Az újszülöttkori görcsállapotok 30%-át, a nyil-vánvaló ok nélkül kialakult újszülöttkori sepsisek 20%-át, abölcsõhalál 10%-át öröklõdõ anyagcsere-betegségek okoz-hatják.
A betegek anamnézisében jellemzõ lehet a szülõk rokon-házassága testvér korai; ismeretlen okú halála; spontán abor-tusz; a gyermekáldás évekig tartó várakozási idõ után érkezik;lombikbébi programban való részvétel.
A kórképek diagnosztikájának négy különbözõ szintjevan: a kórkép fenotípusa (klinikai tünetek), metaboliteltérés,enzimaktivitás és molekuláris genetikai eltérés kimutatása.
A kórképek döntõ többségében mérgezõ vagy a normálisanyagcsere-funkciót megváltoztató metabolitok akkumulá-lódnak vagy alapvetõen fontos molekulák szintézisét, lebon-tását módosítják kóros irányba.
A betegségek bármelyéletkorban jelentkezhetnek. Ennekoka részben az érintett enzim „maradék” aktivitásának mérté-ke, valamint a betegséget okozó mutáció (genotípus-feno-típus összefüggés). A maradék enzim aktivitás a kórképeknagy részében 0%-nál nagyobb. Mégis, az öröklõdõ anyag-csere-betegségek (a dysmorphiával járó kórképek kivételé-vel) többnyire akkor okoznak tüneteket, amikor a szervezetetvalamilyen megterhelés éri. Ilyen az éhezés, fokozott táplálékfelvétel, stresszhelyzet, újszülöttkor, szoptatás elhagyása,interkurrens betegség, elsõ életév vége, pubertás.
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
287
A laboratóriumi eltérések lehetnek átmenetiek, ezért anormális laboratóriumi érték nem zárja ki anyagcsere-beteg-ség létét. A tünetek jelentkezésekor, fennállásakor kell a vizs-gálatokat elvégezni, mert az akkor levett minta diagnosztikusértéke nagy.
Klinikai tekintetben az öröklõdõ anyagcsere-betegségek4 csoportba oszthatók: (1) akut vagy progresszív „intoxiká-ció” típusú betegségek, (2) energiatermelés vagy felhasználászavarai, (3) komplex, nagy molekulák szintézisének vagykatabolizmusának zavarai, (4) egyéb kórképek.
Akut vagy progresszív „intoxikáció” típusúbetegségek
Ezek a kórképek életveszéllyel járó anyagcsere krízis ál-lapottal jelentkezhetnek. A betegek megelõzõen egészsége-sek, fejlõdésük és gyarapodásuk koruknak megfelelõ.
Klinikai jellemzõk:� tünetmentes idõszakok,� „mérgezésre” utaló akut tünetek (hányás, viselkedés
megváltozása, kóma),� „mérgezésre” utaló krónikus tünetek (progresszív
fejlõdésbeni elmaradás),� gyakori laboratóriumi eltérések (acidosis, ketosis,
hyperammonaemia, hypoglykaemia),� gyakran késõi kezdet, intermittáló jelleg,� diagnózis alapja plazma- és vizelet-aminosav, -szer-
vessav vizsgálata,� a kórképek nagy része kezelhetõ, akut, krízis helyzet-
ben a toxikus anyagok minél elõbbi, gyors kivonása(vércsere, plazmaferezis), a fenntartó kezelés lényegeelimináló diéta, hiány állapot kialakulásának meg-akadályozása.
Jellemzõ kórképek:� aminosav-anyagcsere zavarai (tyrosinaemia I. típus,
PKU, jávorfaszörp betegség,)� karbamid-ciklus zavarai,� organikus aciduriák,� cukorintoleranciák (galactosaemia, fructózintoleran-
cia),� rézanyagcsere zavarai (Wilson-kór).
Laboratóriumi diagnosztikájukban a következõ eltérésekjellemzõek:� Metabolikus acidosis: többnyire emelkedett plazma
anion gap-pel jár. AG = [Na+] + [K+] – [Cl–] –[HCO3
–] (mmol/liter). Normálérték 8–16 mmol/liter.A kóros érték organikus aciduriákra jellemzõ. Rend-szerint tachypnoe, hányás, bágyadtság tüneteivel jár.
� Hypoglykaemia: (vércukor <3 mmol/l) azújszülöttkortól eltekintve, ritka eltérés gyermekkor-ban csökkent enteralis táplálékbevitel esetén is.
� Hyperammonaemia. Sajnos, számos laboratóriumbannem végzik az ammóniumszint mérését. A következõklinikai tünetek esetén kell gondolni rá: anorexia,hasfájás, fejfájás, irritábilitás, bágyadtság, tachypnoe,hányás, görcs, kóma, halál. Újszülöttkorban a nor-málérték felsõ határa 100 µmol/l, késõbbi életkorok-ban ez 50 µmol/l. Karbamidciklus zavaraiban >1000µmol/l, respiratorikus alkalosist okoz. Organikusaciduriák esetében csak ritkán >500 µmol/l. Zsír-sav-oxidáció zavaraiban ez az érték rendszerint <250µmol/l.
Fontos kivételek: (1) nonketotikus hyperglicinaemia(görcs, kóma, hypotonia, apnoe) és a (2) piridoxinhiány(encephalopathia, görcsök).
Energiatermelés vagy -felhasználás zavarai
Klinikai jellemzõk:� máj, myocardium, agy és izom érintett;� hypoglykaemia, lactacidosis;� generalizált izomhypotonia;� fejlõdési elmaradás;� keringés összeomlása;� bölcsõhalál;� a kórképek jelentõs része kezelhetõ, amennyiben az
éhezést kerülik.
Jellemzõ kórképek:� glycogenosisok� rövid távú éhezés (3–6 órán túl) alkalmával okoz
tüneteket.� zsírsavoxidáció zavarai� hosszú távú éhezés (12 órán túl) alkalmával okoz
tüneteket.� mitokondriális encephalopathiák� légzési lánc betegségek,� piruvátdehidrogenáz-hiány,� piruvátkarboxiláz-hiány.
A laboratóriumi diagnosztika során a következõ vizsgála-tok fontosak:� vércukorszint (hypoglykaemia kimutatására),� szérum-laktát- és piruvátszint,� acilkarnitin-szint eltérés: szárított vércseppbõl.
Komplex, nagy molekulák szintézisének vagykatabolizmusának zavarai
Klinikai jellemzõk:� táplálkozás, éhezés, heveny betegség nem befolyásol-
ja;� a tünetek állandóak és progresszívek;� a központi idegrendszer sokszor érintett;� társuló diszmorfiás jelek;� a felnõttkorban diagnosztizált öröklõdõ anyagcse-
re-betegségek 25–30%-a tartozik ebbe a csoportba;� fejlõdési elmaradás;� kezelésükben jelentõs elõrelépés.
Jellemzõ kórképek:� lizoszomális raktározási betegségek,� peroxiszomalis raktározási betegségek,� glikozláció öröklõdõ zavarai (változatos tünetekkel,
bármely életkorban jelentkezhet. Szûrõvizsgálatra al-kalmas a transzferrin vizsgálata);
� kreatin-bioszintézis zavara,� szterol-bioszintézis zavarai,� purinanyagcsere zavarai.
Laboratóriumi diagnosztikában a következõ vizsgálatokfontosak:� Kóros metabolit kimutatása: mucopoliszaccharidosi-
sok.� Szövettani vizsgálat: raktározott anyag kimutatása.� Enzimaktivitás mérés: lizoszomális betegségek diag-
nosztikája.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
288
� Mutációanalízis.� Transzferrin izoelektromos fókuszálás: glikoziláció
zavarainál.
Kezelésükben jelentõs elõrelépés történt az utóbbi idõbenkülönösen enzimpótló (Fabry-betegség, Popme-kór, muco-polysaccharidosisok, Gauchre-kór) kezelés vonatkozásában.Figyelemreméltó eredmények szubsztrátredukció tekinteté-ben (Niemann–Pick C típus, Gaucher-kór). Csontvelõ-transz-plantáció és enzimpótló kezelés kombinációja sikeresnek lát-szik.
Egyéb kórképek
Neurotranszmitterek betegségei.� Nonketotikus hyperglicinaemia.
� Biogén aminok metabolizmusának zavarai.� GABA anyagcsere zavarai.� Puridoxin/folsav adásra jól reagáló görcsök.� Glükóztranszporter-hiány.
A kórképek idõben történõ felismerése az egyre több be-tegség esetében alkalmazható hatékony kezelés miatt nagyonlényeges. A pontos diagnosztikában a laboratóriumi vizsgála-toknak döntõ és pótolhatatlan szerepe van.
Egy ország orvostudományának az öröklõdõ anyagcse-re-betegségek terén szerzett tapasztalatainak mennyisége ésminõsége alapvetõen a laboratóriumi diagnosztikát mûvelõkúj iránti érzékenységén és szakmai érdeklõdésén múlik. Ezena téren az öröklõdõ anyagcsere-betegségek 2007. október1-tõl 26 kórképre történõ kiterjesztése nagy elõre lépést jelen-tett Magyarországon.
A biobankok
Biobanks
Dr. Inczédy-Farkas Gabriella, Dr. Molnár Mária JuditSemmelweis Egyetem, Molekuláris Neurológiai Klinikai és Kutatási Központ
Kulcsszavak: biobank, adatbázis, személyre szabott orvoslásKey-words: biobank, database, personalized medicine
A posztgenomiális érában az orvosi kutatások egyik nagyfeladata a multifaktoriális betegségek etiológiájának vizsgá-lata, melyben megkerülhetetlen szerepet játszanak a bio-bankok. Ezek létrehozása során a legkülönfélébb biológiaiminták – vér, liquor, sejtek, szövetek, illetve az ezekbõl nyertDNS, RNS, fehérjék, metabolitok és egyéb makromolekulák– kerülnek nagyszámú klinikai (fenotípusos, szocio-demográfiai, genetikai) adattal való összekötésre és hosszútávú tárolásra.
A biobankok típusai
A biobankokat több szempont szerint csoportosíthatjuk.Forrásukat tekintve vannak klinikai, terápiás, kutatási és
igazságügyi biobankok. A klinikai biobankok a klinikai diag-nosztika és terápiás követés során összegyûlt mintagyûjtemé-nyeket foglalják magukba. A terápiás biobankok terapeutiku-mokat, például vérkészítményeket tartalmaznak. A kutatástszolgáló biobankok a klinikai gyógyszervizsgálatok, gyógy-szerfejlesztések, célzott projektek mintáit foglalják magukba,az igazságügyi biobankok pedig az igazságügyi orvostan te-rületén keletkezõ mintákat tárolják.
Metodikájukat tekintve a biobankok lehetnek populáció-,illetve a betegségalapú biobankok.� A betegségalapú biobankok egy adott betegség egyes stá-
diumainak és a különbözõ kezelési formák hatásainakmolekuláris szinten történõ meghatározásával teszik le-hetõvé a biomarkerek azonosítását. A nemzetközileg leg-ismertebb betegségalapú biobankok a deCODE Genetics(Izland) és a Wellcome Trust Case Control Consortium
(Egyesült Királyság). Hazai betegségalapú biobankra pél-da a schizophren betegek mintáit tároló SCHIZOBANK.
� A populációalapú biobankok az átlagnépességbõl vélet-lenszerûen kiválasztott egyének biológiai mintáinak ésklinikai adatainak gyûjtõhelyei, melyek lehetõséget ad-nak a gyakori betegségek prevalenciájának és lefolyásá-nak prospektív vizsgálatára, illetve a betegségek kialaku-lására prediktív biomarkerek azonosítására. Jelentõségükaz epidemiológiai kutatásokban, illetve a preventív medi-cinában van. Európában nagy populáció alapú biobank atöbb mint 500 000 fõt 30 éven át követõ, 60 millió fontbólmegvalósuló UK Biobank (www.ukbiobank.ac.uk). En-nél is nagyobb szabású a Danish Newborn Screening(NBS-) Biobank, melybe 1982 óta az összes dán újszülöttrutinszûrésre levett mintáját gyûjtik: a mintaszám máramegközelítette a 2 milliót. A populációalapú biobankokkülönleges alcsoportját jelentik az ikerregiszterek, melye-ket az 1,6 millió mintát számláló GenomEUtwin (GEUT)projekt harmonizál (www.genomeutwin.org).
A biobankok felhasználása a kutatásban
A biobankokból végzett kutatások fõ irányelvei az adottbetegség molekuláris hátterének, rizikó faktorainak, a gén-gén, illetve gén-környezet interakciók („genetikai epidemio-lógia”) felderítése, transzkriptomikai, metabolomikai ésproteomikai vizsgálatok segítségével a betegség jelátvitel út-jainak megismerése. A proteomikai kutatások során fehérje-mintázat-változásokból következtethetünk az állapot kialaku-lásának a mechanizmusára, az állapotot indexáló biomarke-rekre és egyes fehérjék szerepére a pathogenezis során. A kli-
2011; S3:245-292. O R V O S K É P Z É S
ÚJABB LABORATÓRIUMI ELJÁRÁSOK
289
nikailag validált genomikai, proteomikai és metabolomikaibiomarkerek felhasználhatók a szûrésben, a diagnózis megal-kotásában, a rizikó, a kezelésre adott válasz és a prognózisbecslésében. A biobankok betegellátásban betöltött szerepe adiagnosztikai folyamat megkönnyítése, a leghatékonyabb,személyre szabott terápia kiválasztásának lehetõvé tételeugyanazon beteg különbözõ mintáinak, illetve több hasonlóklinikai profilú beteg mintáinak összehasonlítása által. A bio-bankok tehát kulcsszereplõi a személyre szabott orvoslás fej-lõdésének.
A személyre szabott orvoslás célja a megelõzés és a be-tegség korai felismerése, illetve célzott terápia, a fenotípus-alapú morfológiai diagnózis helyett a genotípuson, a betegségkialakulási útjainak molekuláris szintû megismerésén alapulódiagnosztizálás. A ma elterjedt generikus, részleges haté-konyságú és sok mellékhatást jelentõ terápia helyett afarmakogenomika módszereivel a gyógyszerre adott válasz,illetve a mellékhatások kialakulásának valószínûsége elõrebejósolható lesz. A biobankok lehetõvé teszik a gyógyszer-biztonság és -hatásosság preklinikai fázisban való szövet-specifikus vizsgálatát, a farmakogenomikai kutatásokat. Ez-által a biobankok fontos szerepet játszanak a gyógyszerfej-lesztés hatékonyságának növelésében, illetve költségénekcsökkentésében is.
A sikeres biobanképítés
A biobanképítés sikerességét meghatározó négy fõ ténye-zõ az adatok biztonsága, a minták követhetõsége, a folyamatintegritása és a gyûjtemények harmonizálhatósága. Az adat-biztonság fõ tényezõje a személyes adatok bizalmas kezelése,melynek megléte meghatározó szerepet játszik a részvételihajlandóság szempontjából is. A legtöbb biobank azonosítókódok által anonimizált mintákkal dolgozik. Számos ország-ban született a biobankokat szabályozó törvény, Magyaror-szágon ez a 2008. évi XXI. törvény a humángenetikai adatokvédelmérõl, a humángenetikai vizsgálatok és kutatások, vala-mint a biobankok mûködésének szabályairól. A minták kö-vethetõségét befolyásolja a mintavétel módja, a minta feldol-gozása, továbbküldése és tárolása. A minta hosszú távú stabi-litása kulcsszerepet játszik a biobank értékmegõrzése szem-pontjából. Nagy kihívás, hogy a jelen mintagyûjtési módsze-rei lehetõvé tegyék a jövõ kutatásainak elvégzését a gyûjte-ményen (például microRNS-vizsgálatok). A minta gyûjtéséreés stabilizálására kidolgozott módszereket folyamatosan fej-leszteni kell. A biobanképítés egységessége a kérdõívekre ésa mintakezelésre vonatkozó protokollok megtervezését, stan-dardizálását és ezek hasonló minõségi szintjét jelentik. Abiobankok harmonizációja, összevonása az elemszám és ezál-tal a kutatás hatékonysága növelésének legkézenfekvõbbmódja.
Biobankok koordinálása
Az utóbbi években ezért számos szervezet jött létre kü-lönbözõ országok biobankjainak összehangolása céljából. Azeurópai országok ilyen jellegû tevékenységét koordinálószervezet a BBMRI (Biobanking and BiomolecularResources Research Infrastructure). Magyarországon a bio-lógiai mintagyûjteményeket fenntartó intézmények számáraaz együttmûködés és az információáramlás elõsegítésére ala-kult meg a Nemzeti Biobank Hálózat (www.biobanks.hu). AGenomikai Nemzeti Technológiai Platform (GNTP) a bio-bankok rövid és hosszútávú stratégiájának kidolgozásáraönálló munkacsoportot hozott létre „Genomikai Kincs,Biobanking” néven. A GNTP tevékenységével egyidejûleg ésahhoz kapcsolódva indította el Nemzeti Kutatási és Techno-lógiai Hivatal (NKTH) Nemzeti Kutatási Infrastruktúra Fel-mérés és Útiterv (NEKIFUT) projektjét, melynek célja átfogónemzeti kutatási infrastruktúrafejlesztési stratégia megalkotá-sa. Ennek keretén belül 19 hazai orvosi génbank szervezõdötthálózatba.
Szoftver
A biobankok webfelülete a közvélemény és a betegek tá-jékoztatásán kívül az adatok bevitelének helye. A biobankszoftver biztosítja a vizsgálatba bevont személyek adatainakés biológiai mintáinak nyomon követését a projekt teljes élet-ciklusa alatt az adatgyûjtéstõl, a minták feldolgozásától és tá-rolásától, a projekt során zajló kísérletek támogatásán keresz-tül az adatok analíziséig (adatbányászat). A biobank rendszeraz adatok védelmében nagy megbízhatóságú és magas át-eresztõképességû szerverszámítógépeket használ, amelyekvédett szerverfarmon kerültek elhelyezésre.
Ipari és akadémiai szereplõk együttmûködése
A biobankokban megvalósuló ipari és akadémiai együtt-mûködés mindkét résztvevõ fél számára elõnyös; az ipar sze-replõi számára a klinikai gyógyszervizsgálatokénál jóval szé-lesebb betegpopuláció és módszertan érhetõ el, lehetõvé válika prompt feldolgozást igénylõ mintákkal való munka, longitu-dinális kutatások segítségével pedig az adott betegség prog-ressziójának nyomon követése. Az akadémiai szereplõk szá-mára pedig nagy mennyiségû adatot feldolgozó módszerekválnak elérhetõvé (teljes genom asszociációs, illetve proteo-mikai vizsgálatok). Mindezek által közelebb kerülhetünk ah-hoz a közös célhoz, hogy a beteg mintáját a betegség minéljobb megértése érdekében tudjuk felhasználni.
O R V O S K É P Z É S LXXXIII. ÉVFOLYAM / 2011. KÜLÖNSZÁM
LABORATÓRIUMI MEDICINA KÖTELEZÕ SZINTEN TARTÓ TANFOLYAM
290
