DNA ARRAYS

• Hasta el momento se conocen los genomas completos de 800 organismos, se conocen billones de secuencias

Qué hacen todos esos genes?Cuándo se expresan ? Qué genes no se expresan o se sobrexpresan en una determinada enfermedad? Cómo funciona una droga?

Genómica Funcional: Entendendimiento de los procesos biológicos a través de la identificación de los genes y sus funciones

Técnicas: Arrays de Acidos Nucléicos

Trabajan explotando la habilidad de los RNA o DNA marcados en solución a hibridizar con secuencias complementarias de DNA unidas sobre un soporte sólido en un sitio específico

Los fragmentos de DNA unidos pueden provenir de cDNA, DNA genómico u oligonucleótidos.

“array”

Ubicar en un forma ordenada. Es importante que las secuencias de los genes estén ubicadas de manera fija y ordenada para que se pueda utilizar la ubicación de un spot para identificar una secuencia particular de un gen

Array de DNA: soportes sólidos pequeños en los cuales secuencias de miles de genes diferentes están unidas a lugares fijos.

Macroarray spot mayor de 300 m (se pueden hacer a mano)

Microarray spot menor de 200 m (requieren de robótica)

Términos: DNA microarray, DNA chip, Biochips, Gene chip, genoma chip

Los microarray pueden contener un gran número de genes en una superficie pequeña, pueden contener un genoma completo.

ESQUEMA DE MICROARRAY

PASOS BASICOS

1) Procesamiento del DNA (material a fijar)

2) Fijación DNA a soporte

3) Probes marcados

4) Hibridización

5) Adquisición de Imagen y análisis

TIPOS DE ARRAY:

según tipo de DNA fijado

Forma I: cDNA o DNA genómico de 500 a 5000 bases de largo

Forma II: array de oligonucleótidos (10-50 mer) . Pueden sintetizarse in situ.

SOPORTES:

nitrocelulosa

- MEMBRANAS

(cargadas) nylon

- VIDRIO Slides microscópicos (tratados con polilisina, grupos cargados aminas)

- PLASTICO

Fijación a matriz por cross-linking con UV

DNA A FIJAR EN ARRAY

- Secuencias elegidas de bases como Gene Bank, dbEST, UniGene.

- cDNAs full-length, colecciones de ESTs, o cDNAs de cualquier library de interés

Arrays de: - eucariotas superiores: basados típicamente en EST

- levaduras y procariotas: preparados amplificando DNA genómico con pares específicos de primers.

El material para generar los spots : - Productos de PCR (0.6-2.4 kb) generados a partir de cDNA libraries o colecciones de clones

- Oligonucleótidos (hasta 80 bases)

Pueden sintetizarse directamente unidos al soporte (20-25 bases)

Array slides:

2.5 cm X 7.6 cm

12 pens, cada pen es una grilla con 22 X 22 spots de 200 m de diámetro 5800 spots .

1cm X 1cm 100.000 spots

Ejemplos:

PROBES

Hibridización con probes marcados.

Probes : mPNA de las muestras a testear.

Marcación: Rdioactiva con P 32 o P 33

Fluorescentes Cy3 o Cy5

Métodos de marcación: RT en presencia de nucleótido marcado

P 32 o P 33

HIBRIDIZACIÓN

Cy3 detección por excitación con =Cy5 laser y medición de luz emitida con

microscopio scanning con focal

Nylon Plástico

Vidrio

DATOS

Macroarray

Nylon 22cm X 22 cm

Revelado: 32 P, 33 P

Mouse slide : 8734 clones en = 10.000 spots , 225 u$D

Yeast Genome Array: 6000 , ORF, 225 u$D.

Microarray

glass-slides 2 X 2 cm

1 X 1 cm

7,5 X 2,5 cm

2,5 X 2,5 cm

Revelado: 33 P, Cy3-Cy5

spots: 40.000-80.000 cm2

75 - 120 m

APLICACIONES

1) Monitoreo de la expresión de genes( mRNA abundancia) .

TRANCRIPTOMA dinámico , cambios en respuesta a perturbacioneso durante eventos celulares ( reclinación de DNA , división celular)

2) Enfermedades y expresión génica : determinar genes marcadores deciertos tipos de enfermedades, se determinan genes up -regulados o down-regulados

3)Análisis de genomas completos: Para organismos con genomacompletamente secuenciados (ej . Levaduras) , existen arrays completos. Ejgenes involucrados en maquinaria de iniciación de la transcripción.

4) Expresión y función : Genes con funciones iguales tienen expresión similar,aumentan o disminuyen juntos ante una determinada situación.Clusters de expresión . Levaduras

5)Análisis de Genotipos: Sobre una secuencia determinada de DNA , seanalizan pesencia de mutaciones puntuales.

SNPs ,(2000) han sido seleccionados y se prepararon sets de oligonucleotidospara arrays . Genotyping de HIV

Messenger RNA abundance levels in differentcells, tissues and organisms. a, Human HIV-infected T lymphocytes; b, mouse olfactory epithelium; c, rat brain; d, S. cerevisiaestrain RY136 grown at 25 7C in rich medium.Levels of gene expression were measured using Affymetrixoligonucleotide arrays are represented in the histograms. Data from multiple arrays containing probes for a different subset of genes and ESTs were combined to generate the plots for human (five arrays),mouse (five arrays) and rat (three arrays).

Figure 3 Methods for analysing geneexpression data shown for measurements of expression in the cell cycle of S. cerevisiae. a, Yeast cells were synchronized and cells were collected every ten minutes throughout two complete synchronous cycles (18 timepoints in total are shown). Expression data were collected by hybridizing labelled cDNA samples to high-density oligonucleotide arrays. Transcript levels were determined for almost every gene in the genome for every time point24. A sample of 409 genes (from a total of 6,000) that showed both a significant(more than twofold) fluctuation in transcript levels during the time course and cell cycledependent periodicity were selected for further analysis.