33
ANALIZE DREVNE DNK ANALIZE DREVNE DNK Jelena Jovanović Jelena Jovanović Božana Kardaš Božana Kardaš

Dnk Prezentacija

Embed Size (px)

DESCRIPTION

prezentacija o dnk

Citation preview

ANALIZE DREVNE DNKANALIZE DREVNE DNK

Jelena JovanovićJelena Jovanović

Božana KardašBožana Kardaš

- molekularno genetičke analize DNK - molekularno genetičke analize DNK izolovane iz drevnih ostataka predstavljaju izolovane iz drevnih ostataka predstavljaju novu oblast istraživanjanovu oblast istraživanja

- ogroman potencijal u pružanju odgovora na - ogroman potencijal u pružanju odgovora na neka od ključnih pitanja o prošlosti ljudskog neka od ključnih pitanja o prošlosti ljudskog rodaroda

- i- izolacijom drevne DNK omoguzolacijom drevne DNK omoguććeno je eno je izuizuččavanje molekula koji leavanje molekula koji ležže u osnovi e u osnovi evolucije evolucije žživog sveta, u praktiivog sveta, u praktiččno no neogranineograniččenoj vremenskoj skalienoj vremenskoj skali

ŠTA JE DNK?ŠTA JE DNK?

- - Dezoksiribonukleinska Dezoksiribonukleinska kiselina ( skrakiselina ( skraććeno DNK) je eno DNK) je nukleinska kiselina koja nukleinska kiselina koja sadrsadržži uputstva za razvoj i i uputstva za razvoj i pravilno funkcionisanje svih pravilno funkcionisanje svih žživih organizamaivih organizama

- - DNK izolovana iz drevnih DNK izolovana iz drevnih uzoraka označava se uzoraka označava se terminom drevna DNKterminom drevna DNK (dDNK)(dDNK)

- DNK je dugaDNK je dugaččak polimer sastavljen od manjih ak polimer sastavljen od manjih jedinica koje se nazivaju nukleotidi. Mejedinica koje se nazivaju nukleotidi. Međđusobno usobno povezani nukleotidi čine skeleton DNK molekula, povezani nukleotidi čine skeleton DNK molekula, koji je sagrakoji je sagrađđen od šeen od šeććera i fosfatnih grupa. era i fosfatnih grupa. Ovaj skeleton se takoOvaj skeleton se takođđe sadre sadržži i od i i od ččetiri razlietiri različčita ita molekula, baza i sekvenca, a redosled ovih baza molekula, baza i sekvenca, a redosled ovih baza je ono što kodira genetski materijal. je ono što kodira genetski materijal.

- U U žživim organizmima, DNK molekul je sastavljen ivim organizmima, DNK molekul je sastavljen od dva polinukleotidna lanca koji su spiralno od dva polinukleotidna lanca koji su spiralno uvijeni jedan oko drugog. U DNK molekulu uvijeni jedan oko drugog. U DNK molekulu postoje postoje ččetiri meetiri međđusobno komplementarne baze: usobno komplementarne baze: adenin (A), citozin (C), guanin (G) i timin (T). adenin (A), citozin (C), guanin (G) i timin (T).

- mitohondrijalna DNK (mtDNK) sisara se mitohondrijalna DNK (mtDNK) sisara se nasleđuje preko majčine linijenasleđuje preko majčine linije

- izolovanje mtDNK je više verovatno nego izolovanje mtDNK je više verovatno nego pronalaženje DNK iz nukleusapronalaženje DNK iz nukleusa

- aanaliza mikrosatelitskih ili STR lokusa (engl.: naliza mikrosatelitskih ili STR lokusa (engl.: “Short Tandem Repeat“) “Short Tandem Repeat“) primenljiva je primenljiva je u u humanoj identifikaciji, rekonstruisanju humanoj identifikaciji, rekonstruisanju geneoloških stabala, populacionoj genetici, geneoloških stabala, populacionoj genetici, analizama vezanosti itd.analizama vezanosti itd.

- Analize Y vezanih STR lokusa primenljive su u Analize Y vezanih STR lokusa primenljive su u praćenju migracija i genetičke srodnosti praćenju migracija i genetičke srodnosti populacijapopulacija

Istorijat istraživanjaIstorijat istraživanja

- Kineska princeza iz Mawangtui-ja Kineska princeza iz Mawangtui-ja - 1984. dDNK iz kože zebre1984. dDNK iz kože zebre- 1985. dDNK iz egipatske mumije1985. dDNK iz egipatske mumije- Kraj ’80-ih godina XX veka razvijen metod PCRKraj ’80-ih godina XX veka razvijen metod PCR- 1990. god. dDNK iz čvrstih tkiva1990. god. dDNK iz čvrstih tkiva

Stanje očuvanosti drevne DNKStanje očuvanosti drevne DNK

- prirodna mumifikacijaprirodna mumifikacija- veštačka mumifikacijaveštačka mumifikacija

Ledena mumija sa Alpa

Grob,Lepenski Vir

različiti materijali za uzorkovanje

Uzimanje uzorakaUzimanje uzoraka

- U idealnim uslovima, uzorci bi trebalo da budu U idealnim uslovima, uzorci bi trebalo da budu svesvežže iskopani i neopranie iskopani i neoprani

- Prilikom proučavanja ljudskih kostiju poželjno je Prilikom proučavanja ljudskih kostiju poželjno je radi provere kontaminacije uzeti i nekoliko radi provere kontaminacije uzeti i nekoliko uzoraka životinjskih kostiju iz istog arheološkog uzoraka životinjskih kostiju iz istog arheološkog sloja odnosno kontekstasloja odnosno konteksta

- Rad sa drevnom DNK nosi veliki rizik od Rad sa drevnom DNK nosi veliki rizik od kontaminacije uzoraka savremenom DNK kontaminacije uzoraka savremenom DNK

uzimanje uzorka

čišćenje uzorka

- Mere predostrožnosti da do kontaminacije ne dođe:- Mere predostrožnosti da do kontaminacije ne dođe: • koristiti sterilne instrumente u toku obrade kostiju • koristiti sterilne instrumente u toku obrade kostiju • pre mlevenja treba skinuti površinski sloj kostiju (1- • pre mlevenja treba skinuti površinski sloj kostiju (1-2mm) i nakon toga kosti izlo2mm) i nakon toga kosti izložžiti UV svetlu oko 30 miniti UV svetlu oko 30 min • koristiti sterilne nastavke za pipete sa barijerom , • koristiti sterilne nastavke za pipete sa barijerom , sterilne epruvete za jednokratnu upotrebu, sterilne sterilne epruvete za jednokratnu upotrebu, sterilne reagense i rastvore namenjene samo za rad s drevnom reagense i rastvore namenjene samo za rad s drevnom DNKDNK • sve rastvore koji se koriste sterilisati filter sterilizacijom • sve rastvore koji se koriste sterilisati filter sterilizacijom i autoklaviranjem, a nakon toga izložiti UV svetlu i autoklaviranjem, a nakon toga izložiti UV svetlu najmanje 30 minnajmanje 30 min • uvek koristiti sterilne rukavice i što • uvek koristiti sterilne rukavice i što češćčešće ih pratie ih prati • uvek raditi negativnu, slepu i kontrolu bez DNK pri PCR • uvek raditi negativnu, slepu i kontrolu bez DNK pri PCR amplifikacijiamplifikaciji

Izvlačenje DNKIzvlačenje DNK

- - OOvaj proces sluvaj proces služži da se oslobode nukleinske i da se oslobode nukleinske kiseline iz ćelija u rastvor. kiseline iz ćelija u rastvor. KKoriste oriste se se Tris-HCl i Tris-HCl i EDTA (etilendiaminotetraacetat) da se razbiju EDTA (etilendiaminotetraacetat) da se razbiju ćelijske membrane uz jone kalcijuma koji ćelijske membrane uz jone kalcijuma koji stabilišu DNK, natrijumova ili kalijumova so za stabilišu DNK, natrijumova ili kalijumova so za stvaranje izotopske sredine koja će stabilisati stvaranje izotopske sredine koja će stabilisati slobodne nukleinske kiseline, proteinaza K za slobodne nukleinske kiseline, proteinaza K za rastvaranje proteinskog delarastvaranje proteinskog dela

-RFLP (restriction fragment length polymorphism) analizom se seče lanac DNK-a pomoću restriktivnih enzima u kraće fragmente koji se lakše razdvajaju prilikom elektroforeze u želatinu od agaroze

-uzorak se stavlja na membranu i snimi rendgenskim filmom

-dobijeni DNK profil se zatim klonira

PCR (PCR (Polymerase Chain Reaction)Polymerase Chain Reaction)

- PCR je molekularno genetička tehnika kojom je PCR je molekularno genetička tehnika kojom je moguće umnožiti odeđeni segment DNK više od moguće umnožiti odeđeni segment DNK više od milijardu putamilijardu puta

- dovoljna je minimalna količina drevnog materijala dovoljna je minimalna količina drevnog materijala za izolaciju dDNKza izolaciju dDNK

Determinacija pola

- upotrebom molekularno bioloških metoda moguće je utvrditi pol individue, bez obzira na njenu arheološku starost

- primeri: lokalitet Aškelon

Prisustvo patogenih mikroogranizama

- moguće detektovati bolesti koje ne ostavljaju tragove na kostima, kao što su na primer malarija, kuga i kolera

Egipatska mumija i TBC

“Huanita”

Populacione analize

- primeri:

1)Neandertalci

2)stanovnici Pirinejskog poluostrva

Srodničke vezeSrodničke veze - primer: Romanovi- primer: Romanovi

primer: Pompejaprimer: Pompeja

Analize dDNK iz Analize dDNK iz životinjskih ostatakaživotinjskih ostataka

- ostaci riba sa lokaliteta - ostaci riba sa lokaliteta SagalasosSagalasos

Grčki manuskripti na Grčki manuskripti na pergamentupergamentu

-nalazi parazita u koprolitima

-Beringov moreuz kao “genetski muzej ledenog doba”

Ostaci dDNK iz biljnih ostatakaOstaci dDNK iz biljnih ostataka

- razlike između divljih i domestikovanih vrsta- razlike između divljih i domestikovanih vrsta

- geografsko poreklo- geografsko poreklo

Analize dDNK na našim prostorima

- U Srbiji je tokom 1999. i 2000. godine urađena komparativna analiza DNK iz kostiju humanog porekla sa 5 različitih arheoloških lokaliteta. Za izolovanje i analizu drevne DNK korišćeni su uzorci rebara skeletnih ostataka sa arheoloških lokaliteta: 34 uzorka sa mezolitsko-neolitskog lokaliteta Lepenski Vir, 25 uzoraka sa neolitske nekropole Gomolava, 31 uzorak sa srednjovekovne nekropole Gomolava, 21 uzorak sa srednjovekovne nekropole Horgoš-Crkvine i 1 uzorak sa srednjovekovne nekropole Perlez Svete Vodice

Lepenski VirLepenski Vir

- - od 34 infanata sa ovog lokaliteta, 22 pripada od 34 infanata sa ovog lokaliteta, 22 pripada muškom, a 12 ženskom polumuškom, a 12 ženskom polu

GomolavaGomolava

- neolit: - neolit: svih 25 individua pripadaju muškom polusvih 25 individua pripadaju muškom polu

- srednji vek: - srednji vek: 16 individua pripadalo je muškom 16 individua pripadalo je muškom polu a 15 ženskompolu a 15 ženskom

Horgoš-Crkvine

- 8 skeletnih individua dečjeg uzrasta bilo 5 individua muškog i 3 individue ženskog pola

Perlez-Svete vodicePerlez-Svete vodice

- skelet muške individue - skelet muške individue

Beogradska mumijaBeogradska mumija

- potvrđen pol mumificirane osobepotvrđen pol mumificirane osobe