DNR IR RNR DNR IR RNR MOLEKULINĖ MOLEKULINĖ STRUKTŪRASTRUKTŪRA

ĮVADAS

Genetikos kursą pradėsime nuo molekulinės genetikos Molekulinė genetika tyrinėja DNR struktūrą ir funkcijas

molekulių lygmenyje Pastarųjų metų mokslo pasiekimai, tobulinant

tyrimo metodus ir kuriant naujas koncepcijas, labai išplėtė molekulinės genetikos žinias Šis progresas palietė ne tik molekulinę, tačiau ir

požymių perdavimo bei populiacijų genetikas Didžiaja dalimi genetikos žinios yra sukauptos

tiriant DNR ir RNR

2-2

Savo funkciją genetinė medžiaga atlieka tik tada, kai ji pasižymi tam tikromis savybėmis 1. Informacija: Ji privalo turėti informaciją, būtiną visam

organizmui sukurti 2. Paveldėjimu: Ji privalo būti perduodama iš tėvų

vaikams 3. Replikacija: Ji turi būti kopijuojama

Tada ji gali būti perduodama iš tėvų vaikams 4. Kintamumu: Ji privalo gebėti keistis

Toks kintamumas užtikrina plačiai stebima fenotpinę variaciją kiekvienos rūšies viduje

2-3

2.1 DNR KAIP GENETINĖ MEDŽIAGA

Daugelio genetikų, tarp jų ir Mendelio, duomenys atitiko šias keturias savybes Tačiau genetinės medžiagos cheminė prigimtis

negalėjo būti nustatyta vien tik kryžminant organizmus

Iš tikrųjų, DNR kaip genetinės medžiagos identifikavimas pareikalavo naujoviško požiūrio į eksperimentinę biologiją

2-4

2.1 DNR KAIP GENETINĖ MEDŽIAGA

Griffithas tyrė bakteriją (Diplococcus pneumoniae), kuri dabar vadinama Streptococcus pneumoniae

Yra aptinkami du S. pneumoniae kamienai S Smooth (lygus)

Sekretuoja polisacharidinę kapsulę Ši apsaugo bakteriją nuo gyvūnų imuninės sistemos

Auginamos ant kietos terpės suformuoja lygias kolonijas

R Rough (šiurkštus) Nesugeba sekretuoti kapsulės Kolonijų kraštai nelygūs

2-5

Fredericko Griffitho eksperimentai su Streptococcus pneumoniae

Be to, dviejų S kamienų kapsulės gali reikšmingai skirtis pagal savo cheminę sudėtį

2-6

Retos mutacijos gali paversti S kamienus R kamienais ir atvirkščiai

Tačiau mutacjos nekeičia kamienų tipų

2-7

1928 m. Griffithas atliko eksperimentus naudodamas du S. pneumoniae kamienus: IIIS tipo ir IIR tipo 1. Pelėms suleistos gyvos IIIS tipo bakterijos

Pelės žuvo IIIS tipo bakterijos buvo išskirtos iš pelių kraujo

2. Pelėms suleistos gyvos IIR tipo bakterijos Pelės išgyveno Iš pelių kraujo nebuvo išskirta gyvų bakterijų

3. Pelėms suleistos aukšta temperatūra užmuštos IIIS tipo bakterijos

Pelės išgyveno Iš pelių kraujo nebuvo išskirta gyvų bakterijų

4. Pelėms suleistos gyvos IIR tipo aukšta temperatūra užmuštos IIIS tipo bakterijos

Pelės žuvo IIIS tipo bakterijos buvo išskirtos iš pelių kraujo

2-8

2-9

Griffithas nusprendė, kad kažkokia medžiaga iš žuvusių IIIS tipo bakterijų transformavo IIR tipo bakterijas į IIIS tipą Jis pavadino šį procesą transformacija

Medžiaga, kuri tai padarė, buvo pavadinta transformuojančiąja priežastimi Griffithui nepavyko nustatyti, kokia tai medžiaga

Transformuojančiosios priežasties prigimtis buvo nustatyta gerokai vėliau, naudojant įvairius biocheminius metodus

Avery, MacLeod ir McCarty suprato, kad Griffitho tyrimų rezultatai gali būti panaudoti genetinei medžiagai nustatyti

Jie atliko savo eksperimentus penktame XX a. dešimtmetyje Tuo metu jau buvo žinoma, kad pagrindiniai ląstelių

makrokomponentai yra DNR, RNR, baltymai ir angliavandeniai

Iš IIIS tipo bakterijų jie paruošė ląstelių ekstraktus, turinčius kiekvieną iš šių makromolekulių Tiktai ekstraktai, turintys išgrynintą DNR, galėjo

transformuoti IIR tipo bakterijas į IIIS tipo bakterijas

Avery, MacLeod ir McCarty eksperimentai

2-10

2-11

Avery et al taip pat atliko ir kitą eksperimentą Jo reikėjo norint įrodyti, kad būtent DNR, o ne koks nors kitas

ekstrakto komponentas (RNR ar baltymas) yra genetinė medžiaga

1952 m. Alfred Hershey ir Marsha Chase pateikė papildomų įrodymų, kad genetinė medžiaga yra DNR

Hershey ir Chase eksperimentai su bakteriofagu T2

2-12

Jie tyrė bakteriofagą T2 Jo sandara yra palyginti

paprasta, nes jį sudaro tik dvi makromolekulės

DNR ir baltymai

Padaryti iš baltymo

Kapsidės viduje

2-13

Bakteriofago T2 gyvenimo ciklas

Hershey and Chase eksperimentų santrauka:

Naudojo radioizotopus, norėdami atskirti DNR nuo baltymų

32P specifiškai pažymi DNR 35S specifiškai pažymi baltymus

Radioaktyviai pažymėtais fagais buvo užkrečiamos neradioaktyvios Escherichia coli ląstelės

Po tam tikro laiko, reikalingo infekcijai įvykti, likusios fagų dalelės buvo pašalinamos

=> Fagų liekanos ir E. coli ląstelės buvo atskiriamos Radioaktyvumas buvo vertinamas scintiliaciniu skaitikliu

2-14

Hipotezė Tik fago genetinė medžiaga yra injekuojama į

bakterijas Radioaktyvi žymė turi parodyti, ar tai yra baltymas, ar

DNR

2-15

Rezultatai

2-16

Duomenų interpretacija

2-17

Šie rezultatai rodo, kad infekcijos metu fago DNR buvo injekuota į bakterijų citoplazmą

Tai yra tas rezultatas, kurio buvo galima tikėtis, jei būtent DNR yra genetinė medžiaga

Dauguma radioaktyvios sieros rasta

supernatanteTačiau tik maža dalis radioaktyvaus fosforo

2-18

1956 m. A. Gierer ir G. Schramm išskyrė RNR iš augalų viruso – tabako mozaikos viruso (TMV) Išvalyta RNR sukeldavo tas pačias pažaidas, kaip ir

intaktinis TMV Taigi, šių virusų genomą sudaro RNR

Dabar aptikta nemažai RNR virusų

Kai kuriuose virusuose genetinės medžiagos funkciją atlieka RNR

DNR ir RNR virusų pavyzdžiai

Virusas Šeimininkas

Nukleino rūgštis

Tabako mozaikos virusas

Tabakas RNR

Gripo virusas Žmogus RNR

HIV (ŽIV) Žmogus RNR

f2 E.coli RNR

Kalafiorų mozaikos virusas

Kalafiorai DNR

Herpes virusas Žmogus DNR

SV40 Primatai DNR

Epstein-Barr virusas Žmogus DNR

T2 E.coli DNR

2-19

DNR ir RNR yra stambios makromolekulės, susidarančios iš keleto lygmenų struktūrų

1. Nukleotidai sudaro pasikartojančius vienetus 2. Nukleotidai susijungia sudarydami grandinę 3. Dvi grandinės sąveikauja sudarydamos dvigubą

spiralę 4. Dviguba spiralė susisuka, susilanksto ir sąveikauja

su baltymais, sudarydama 3-D struktūras, formuojančias chromosomas

2.2 NUKLEINO RŪGŠČIŲ STRUKTŪRA

2-20

2-21

2-22

Nukleotidai yra pasikartojantys DNR ir RNR struktūriniai vienetai

Juos sudaro trys komponentai Fosfatinė grupė Pentozė (cukrus) Azotinė bazė

Nukleotidai

2-23

2-24

Nukleotidų, randamų (a) DNR ir (b) RNR, struktūra

A, G, C ar T

Šie atomai randami laisvuose nukleotiduose Tačiau jie yra pašalinami, kai nukleotidai jungiasi tarpusavyje,

sudarydami DNR ir RNR grandines

A, G, C ar U

Pasikartojantis dezoksiribonukleinorūgšties (DNR) elementas

Pasikartojantis ribonukleino rūgšties(RNR) elementas

2-25

Bazė + cukrus nukleozidas Pavyzdžiai

Adeninas + ribozė = adenozinas Adeninas + dezoksiribozė = dezoksiadenozinas

Bazė + cukrus + fosfatas(i) nukleotidas Pavyzdžiai

Adenozino monofosfatas (AMP) Adenozino difosfatas (ADP) Adenozino trifosfatas (ATP)

2-26

Bazė visada prisijungia čia

Fosfatai prisijungia čia

2-27

Nukleotidai kovalentiškai susijungia per fosfodiesterinę jungtį Fosfatas jungia vieno nukleotido 5’ anglies atomą su kito

nukleotido 3’ anglies atomu Tuo būdu grandinė turi kryptį

Iš 5’ į 3’

Fosforo rūgšties liekanos ir cukrūs sudaro nukleino rūgšties grandinės karkasą Bazės kyšo iš karkaso

2-28

2-29

1953 m. James Watson ir Francis Crick nustatė, kad DNR sudaro dviguba spiralė, kurioje nukleotidai sąveikauja tarpusavyje pagal tam tikras taisykles

Tačiau šio atradimo mokslinius pagrindus sukūrė kiti mokslininkai Linus Pauling Rosalind Franklin ir Maurice Wilkins Erwin Chargaff

DNR struktūra buvo išaiškinta remiantis keliais esminiais rezultatais

2-30

Penktajame XX a. dešimtmetyje jis nustatė, kad tam tikri baltymų regionai gali susilankstyti į antrinę struktūrą -spiralė

Linusas Paulingas

Šiai struktūrai išaiškinti, jis pagamino modeli, sudarytą iš rutuliukų ir lazdelių

2-31

Dirbo vienoje laboratorijoe su Mauricu Wilkinsu

Naudojo Rentgeno spindulių difrakciją drėgnų DNR siūlų struktūrai tirti

Rosalind Franklin

Difrakcinį vaizdą galima interpretuoti, naudojant matematinio

modeliavimo metodus. Tai gali suteikti informacijos apie tiriamos

molekulės struktūrą

2-32

Rentgeno difrakcijos metodais ji pasiekė gana didelės pažangos, tyrinėjant DNR struktūrą

Difrakciniai vaizdai atspindėjo kai kurias pagrindines DNR savybes

Spiralinė struktūra Daugiau nei viena grandinė 10 bazių porų tenka vienai pilnai

spiralės vijai

Rosalind Franklin

2-33

Chargaffas pirmasis panaudojo daugelį nukleino rūgščių išskyrimo iš gyvų ląstelių, išgryninimo ir matavimo biocheminių metodų

Tuo metu jau buvo žinoma, kad DNR sudaro keturios bazės: A, G, C ir T

Bazių sudėties analizė gali atskleisti svarbias DNR struktūros ypatybes

Erwino Chargaffo eksperimentai

2-34

2-35

Chargaffo tyrimų duomenys: bazių procentinis santykis skirtingų organizmų DNR

OrganizmasBazių %

Adeninas Timinas Guaninas Citozinas

Escherichia coli 26.0 23.9 24.9 25.2

Streptococcus pneumoniae 29.8 31.6 20.5 18.0

Mielės 31.7 32.6 18.3 17.4

Vėžlių eritrocitai 28.7 27.9 22.0 21.3

Lašišų spermatozoidai 29.7 29.1 20.8 20.4

Viščiukų eritrocitai 28.0 28.4 22.0 21.6

Žmogaus kepenų ląstelės 30.3 30.3 19.5 19.9

2-36

Rezultatų interpretavimas

2-37

Duomenys, pateikti lentelėje, sudaro tik nedidelę dalį visų rezultatų, gautų Chargaffo

Iš rezultatų akivaizdžiai matyti, kad Adenino procentas = timino procentui Citozino procentas = guanino procentui

Šis dėsningumas vadinamas Chargaffo taisykle Tai buvo vienas pagrindinių atspirties taškų, kuriuos

panaudojo Watsonas ir Crickas DNR struktūrai išaiškinti

2-38

Būdami susipažinę su visais šiais tyrimų rezultatais, Watsonas ir Crickas pasiryžo išsiaiškinti DNR struktūrą Jie bandė pagaminti DNR modelį iš rutuliukų ir lazdelių,

kuriam būtų būdingi visi žinomi eksperimentiniai DNR bruožai

Esminis klausimas buvo kaip dvi (ar daugiau) grandinių sąveikauja tarpusavyje Pirminė idėja buvo, kad grandinės sąveikauja per fosfato-

Mg++ sąsiuvas

Watsonas ir Crickas

2-39

Ši hipotezė, žinoma, buvo neteisinga!

2-40

Tada jie sukūrė modelį, kuriame Fosfodezoksiribozinis karkasas buvo išorėje Bazės buvo projektuojamos viena priešais kitą

Pradžioje jie manė, kad vandenilinės jungtys jungia identiškas bazes, esančias priešingose grandinėse t.y., A su A, T su T, C su C, and G su G

Tačiau modeliavimas parodė, kad ir šis modelis nėra teisingas

Watsonas ir Crickas

2-41

Tik tada jie suprato, kad vandenilinės jungtys susidaro tarp A ir T bei tarp C ir G Taigi, jie pagamino modelį, kuriame A sąveikavo su T, o G

– su C Šis modelis jau atitiko visus tuo metu žinomus duomenis apie DNR

struktūrą

Watsonas ir Crickas

Watsonas, Crickas ir Wilkinsas 1962 m. už DNR struktūros išaiškinimą gavo Nobelio premiją

Deja, Rosalind Franklin mirė 1958, o Nobelio premijos nėra skiriamos po mirties.

Watsonas ir Crickas

2-42

2-43

Pagrindinės struktūros ypatybės

Dviguba DNR spiralė

Dvi grandinės yra susivijusios apie centrinę ašį Vieną pilną apviją sudaro 10 bazių Abidvi grandinės yra antiparalelios

Vienos kryptis yra nuo 5’ į 3’, o kitos - nuo 3’ į 5’ Spiralė yra dešninė

Kai ji vijasi nuo jūsų, spiralė sukasi pagal laikrodžio rodyklę

2-44

Pagrindinės struktūros ypatybės

Dviguba DNR spiralė

DNR struktūra yra stabilizuojama

1. Tarp komplementarių bazių susidaro vandenilinės jungtys A jungiasi su T per dvi vandenilines jungtis C jungiasi su G per tris vandenilines jungtis

2. Bazių stekingas DNR struktūroje bazės yra orientuotos taip, kad jų plokščiosios dalys

“žiūri” viena į kitą. Esant tokiai orientacijai, tarp bazių susidaro stekingo jėgos, kurios papildomai stabilizuoja DNR struktūrą

2-45

Pagrindinės savybės

•Dvi DNR grandinės formuojadešninę dvigubą spiralę

•Bazės priešingose grandinėsejungiasi vandenilinėmis jungtimis pagal A/T ir G/Ctaisyklę

•DNR grandinės yra anti-paralelios pagal savo5’3’ kryptį

•Kiekvienos grandinės pilną 360° apviją sudaro 10 nukleotidų

2-46

Pagrindinės struktūros ypatybės

Dviguba DNR spiralė

Spiralės paviršiuje susiformuoja du asimetriški grioveliai

1. Didysis griovelis

2. Mažasis griovelis

Kai kurie baltymai gali jungtis prie šių griovelių Tuo būdu jie gali sąveikauti su tam tikromis nukleotidų sekomis

2-47

2-48

DNR dviguba spiralė gali sudaryti skirtingos konformacijos antrines struktūras

Dominuojanti forma, randama gyvose ląstelėse yra B-DNR

Esant tan tikroms in vitro sąlygoms, gali formuotis A-DNR ir Z-DNR dvigubos spiralės

DNR gali susiformuoti į kelių tipų dvigubas spirales

2-49

A-DNR Dešninė spiralė Vienoje vijoje 11 bp Susiformuoja esant žemai drėgmei Nėra aiškių įrodymų apie jos biologinę svarbą

Z-DNR Kairinė spiralė Vienoje vijoje 12 bp Formavimą skatina

Esant didelei druskų koncentracijai - GC-turtingos sekos Esant mažai druskų koncentracija – citozino metilinimas

Tokia konformacija gali būti svarbi transkripcijai ir rekombinacijai, bent jau mielių ląstelėse

9-50

Bazės pakrypusios

centrinės ašies

atžvilgiu

Bazės pakrypusios

centrinės ašies

atžvilgiu

Fosfofdezoksiribozinis karkasas išsidėstęs

zigzagiškai

Bazės santykinai statmenos centrinei

ašiai

2-51

XX a. Šeštojo dešimtmečio pabaigoje Alexander Rich et al atrado trigubą DNR Ji susiformavo in vitro naudojnant sintetinės DNR

fragmentus

Devintajame dešimtmetyje buvo nustatyta, kad natūrali dvigrandininė DNR gali jungtis su sintetine DNR grandine ir suformuoti trigubą DNR spiralę (tripleksą) Sintetinė DNR grandinė jungiasi prie natūralios DNR

didžiojo griovelio

DNR gali sudaryti trigubą spiralę

2-52

Tripleksinės DNR formavimasis priklauso nuo specifinių sekų

Bazių poravimosi taisyklės yra

Tripleksinė DNR gali dalyvauti keliuose svarbiuose procesuose

Replikacijoje, transkripcijoje, rekombinacijoje

Neseniai aptikti ląstelių baltymai, specifiškai atpažįstantys tripleksinę DNR

T jungiasi prie AT poros

natūralioje DNR

C jungiasi prie GC poros

natūralioje DNR

Kaspino modelis Bazių sekos pavyzdys

2-53

Tam, kad DNR tilptų ląstelėjė, ji turi būti efektyviai kompaktizuota per erdvines struktūras Tokios struktūros sukuriamos dalyvaujant baltymams,

galintiems jungtis prie DNR Plačiau apie tai bus kalbama sekančioje paskaitoje

Erdvinė DNR struktūra

2-54

DNR apsiveja apie histoninius

baltymus

2-55

Pirminė RNR grandinės struktūra yra labai panaši į DNR grandinės struktūrą

RNR grandinės paprastai būna nuo kelių šimtų iki kelių tūkstančių nukleotidų ilgio

RNR sintetinama naudojant DNR kaip matricą. Šios sintezės metu naudojama tik viena iš dviejų DNR grandinių

RNR struktūra

2-56

2-57

Nors RNR dažniausiai yra viengrandininė, RNE molekulėse gali formuotis dvigrandininiai regionai Šios antrinės struktūros susidaro dėl komplementarių bazių

poravimosi A su U ir C su G

Dėl to trumpuose RNR segmentuose susiformuoja dviguba spiralė

Tipiška RNR dviguba spiralė Yra dešninė Sudaro A formą, kurioje vienai vijai tenka 11-12 bp

Gali susidaryti skirtingų tipų RNR antrinės struktūros

2-58

Taip pat vadinama smeigtuko

galvute

Komplementarūs regionai

Nenkomplementarūs regionai

Palaikomi vandenilinių jungčių

Turi bazes, išsikišančias iš dvigrandininių regionų

Išsikišusi kilpa Vidinė kilpa Išsišakojusi kilpa arba mazgas Kamieninė kilpa

2-59

Daugelis veiksnių gali įtakoti RNR tretinę struktūrą Pavyzdžiui

Bazių poravimasis ir stekingas RNR molekulėje

Sąveikos su jonais, mažomis molekulėmis ir stambiais baltymais

Tretinė tRNRphe struktūra Tai transportinė RNR kuri perneša fenilalaniną

Molekulė turi viengrandininius ir

dvigrandininius regionus

Jie sąveikauja sudarydami šias 3-D

struktūras

Kaspino modelis