Click here to load reader

Doktora Tezi 2014 - teknikbelgeler.com · homogenates, ammonium sulphate precipitation, CM-Sellulose ion-exchange chromatography. The purification was performed with the yield of

  • View
    212

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Doktora Tezi 2014 - teknikbelgeler.com · homogenates, ammonium sulphate precipitation,...

KOYUN BEYNNDEN SORBTOL DEHDROGENAZ

ENZMNN SAFLATIRILMASI,

KARAKTERZASYONU ve BAZI LALARIN

ENZM AKTVTES ZERNE

ETKLERNN NCELENMES

Bedia ZALTIN

Doktora Tezi

Kimya Anabilim Dal

Biyokimya Bilim Dal

Prof. Dr. . rfan KFREVOLU

2014

Her hakk sakldr

ATATRK NVERSTES

FEN BLMLER ENSTTS

DOKTORA TEZ

KOYUN BEYNNDEN SORBTOL DEHDROGENAZ ENZMNN

SAFLATIRILMASI, KARAKTERZASYONU ve BAZI

LALARIN ENZM AKTVTES ZERNE ETKLERNN

NCELENMES

Bedia ZALTIN

KMYA ANABLM DALI

Biyokimya Bilim Dal

ERZURUM

2014

Her hakk sakldr

i

ZET

Doktora Tezi

KOYUN BEYNNDEN SORBTOL DEHDROGENAZ ENZMNN

SAFLATIRILMASI, KARAKTERZASYONU VE BAZI LALARIN ENZM

AKTVTES ZERNE ETKLERNN NCELENMES

Bedia ZALTIN

Atatrk niversitesi

Fen Bilimleri Enstits

Kimya Anabilim Dal

Biyokimya Bilim Dal

Danman: Prof. Dr. . rfan KFREVOLU

Koyun beyninden sorbitol dehidrogenaz [L-iditol: NAD+

oksidoredktaz, EC 1.1.1.14]

enzimi saflatrld. Saflatrma; homojenatn hazrlanmas, amonyum slfat ktrmesi,

CM-Selloz C-52 iyon deiim kromatografisi metotlar ile gerekletirildi. Saflatrma

ilemi %0,66 verimle ve 450 kat olarak gerekletirildi. SDS-PAGE yntemi ile koyun

beyni SDH enziminin alt birim molekl ktlesi 38,2 kDa olarak hesaplanrken aktif

formunun mol ktlesi ise jel filtrasyon kromatografisi yntemi ile 159 kDa olarak

hesapland. Ayrca koyun beyni SDH enziminin optimum pH ve optimum scaklk

deerleri sras ile 10,0 ve 40C olarak bulundu. Koyun beyni SDH enziminin stabil

olduu pH aral 5,5-8,5 olarak bulundu. Koyun beyni SDH enzimi inko ihtiva ettii

iin atomik absorpsiyon yntemi ile inko tayini yapld. Bu almalarn yan sra

koyun beyni SDH enzim aktivitesi zerine ampisilin, oksitetrasiklin dihidrat,

enrofloksasin, kanamisin, gentamisin slfat, tilozin ve sefaleksin etken maddelerinin

inhibisyon etkileri aratrld. Bu etken maddeler iin IC50 deerleri ve ampisilin,

enrofloksasin, oksitetrasiklin dihidrat ve kanamisin etken maddeleri iin Ki sabitleri

belirlendi.

2014, 111 sayfa

Anahtar Kelimeler: Sorbitol dehidrogenaz, koyun beyni, etken madde, inhibisyon

ii

ABSTRACT

Ph. D. Thesis

PURIFICATION, CHARACTERIZATION OF SORBITOL DEHYDROGENASE

FROM SHEEP BRAIN, AND INVESTIGATION EFFECTS OF SOME ACTIVE

SUBSTANCES ON THE ENZYME ACTIVITY

Bedia ZALTIN

Atatrk University

Graduate School of Natural and Applied Sciences

Department of Chemistry

Department of Biochemistry

Supervisor: Prof. Dr. . rfan KFREVOLU

Sorbitol dehydrogenase [L-iditol: NAD+

oksidoreductase, EC 1.1.1.14] enzyme was

purified from sheep brain. Purification was performed by methods of preparation of

homogenates, ammonium sulphate precipitation, CM-Sellulose ion-exchange

chromatography. The purification was performed with the yield of 0,66% and 450 fold.

By the method of SDS-PAGE sheep brain SDH enzymes subunit molecular weight was

calculated as 38,2 kDa, SDH enzymes active form molecular weight was calculated as

159 kDa via gel filtration chromatography. Besides, optimal pH and optimal

temperature of the enzyme was observed as 10,0 and 40C respectively. It was found

that sheep brain SDH activity is stable between 5,5 and 8,5 pH. Because SDH enzyme

has zinc atom, zinc analyze was done by atomic absorption method. In addition to these

studies, the effects of inhibition of ampicillin, oxytetracycline dihydrate, enrofloxacin,

kanamycin, gentamicin sulfate, tylosin and cephalexin on sheep brain SDH enzyme

activity were investigated. For these active substaces IC50 values were calculated and for

ampicillin, enrofloxacin, oxytetracycline dihydrate and kanamycin Ki constants were

determined from Lineweaver Burk graphs.

2014, 111 pages

Keywords: Sorbitol dehydrogenase, sheep brain, active substance, inhibition

iii

TEEKKR

Doktora tezi olarak sunduum bu alma Atatrk niversitesi Fen Fakltesi

Biyokimya Aratrma Laboratuvarnda gerekletirilmitir.

Doktora tez almam sresince ilgi, sabr, anlay ve desteini esirgemeyen danman

hocam Sayn Prof. Dr. . rfan KFREVOLUna sonsuz kran ve minnettarlm

sunarm.

almalarm esnasnda desteini esirgemeyen biyokimya alma grubu hocalarm

Sayn Prof. Dr. kr BEYDEMRe, Sayn Prof. Dr. Mehmet FTye, Sayn Prof.

Dr. Hasan ZDEMRe, Sayn Prof. Dr. lhami GLNe ve almalarmda her an

desteini grdm deerli arkadam Sayn Ar. Gr. Zuhal ALIMa ve Sayn Yrd.

Do. Dr. Ebru AKKEMKe, yardmlarn esirgemeyen Sayn Namk KILINa, Sayn

Musa AKKUa ve ayrca dier Biyokimya alma grubu arkadalarma teekkr

ederim.

Doktora eitimim sresince burs katksndan dolay TBTAK-BDEBe teekkr

ederim.

Ayrca her zaman maddi ve manevi desteini grdm eime ve aileme teekkr

ederim.

Bedia ZALTIN

Mays, 2014

iv

NDEKLER

ZET.................................................................................................................................. i

ABSTRACT ...................................................................................................................... ii

TEEKKR ..................................................................................................................... iii

KISALTMALAR ve SMGELER DZN ..................................................................... vii

EKLLER DZN .......................................................................................................... ix

ZELGELER DZN .................................................................................................... xi

1. GR ....................................................................................................................... 1

1.1. Sorbitol Dehidrogenaz Enzimi ............................................................................ 16

1.2. Diabetes Mellitus ................................................................................................. 21

1.3. Deneysel almada Kullanlan lalarn Etken Maddeleri ................................ 28

2. KAYNAK ZETLER ........................................................................................ 34

3. MATERYALve METOD ..................................................................................... 40

3.1. Materyal ............................................................................................................... 40

3.1.1. Kullanlan kimyasal maddeler .......................................................................... 40

3.1.2. Kullanlan alet ve cihazlar ................................................................................ 40

3.1.3. Kullanlan zeltiler ve hazrlanmas ............................................................... 41

3.2. Metod ................................................................................................................... 44

3.2.1. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enziminin aktivitesinin lm ............... 44

3.2.2. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enziminin saflatrlmas ......................... 45

3.2.2.a. Koyun beyni dokusunun temini ve homojenat hazrlanmas ......................... 45

3.2.2.b. Amonyum slfat ktrmesi ......................................................................... 45

3.2.2.c. Diyaliz ........................................................................................................... 47

3.2.2.d. Ultrasantrifj ................................................................................................. 47

3.2.2.e. DEAE-Sephadex iyon deiim kromatografisi ............................................. 47

3.2.2.f. CM-Selloz C-52 iyon deiim kromatografisi ............................................. 47

3.2.3. Bradford yntemi ile kantitatif protein tayini ................................................... 48

3.2.4. Sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi kolonunun hazrlanmas ve

koyun beyninden elde edilen SDH enziminin doal halinin molekl

ktlesinin tayini ................................................................................................ 49

v

3.2.5. Kalitatif protein tayini ...................................................................................... 51

3.2.6. Sodyum dodesil slfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile

enzim saflnn kontrol ................................................................................. 51

3.2.7. Sodyum dodesilslfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile

enzimin molekl ktlesi tayini ......................................................................... 52

3.2.8. Koyun Beyni Sorbitol dehidrogenaz enziminin aktivitesi zerine baz ila

etkilerinin belirlenmesi .................................................................................... 53

3.2.9. nhibitr etkisi gsteren ilalar iin IC50 ve Ki deerlerinin belirlenmesine

ait almalar .................................................................................................... 53

4. ARATIRMA BULGULARI .............................................................................. 60

4.1. Kantitatif Protein Tayini in Kullanlan Standart Grafik ................................... 60

4.2. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enziminin Saflatrlmas Sonular ........ 60

4.2.1. Amonyum slfat ktrmesi sonular ............................................................. 60

4.2.2. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enziminin CM-Selloz C-52 iyon

deiim kromatografisi ile saflatrlmas sonular ........................................ 62

4.3. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enziminin SDS-PAGE ile Saflk

Kontrol .............................................................................................................. 62

4.4. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enziminin Optimum pH almalarna

Ait Sonular ......................................................................................................... 64

4.5. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enziminin Optimum yonik iddetin

Bulunmasna Dair Sonular ............................................................................... 66

4.6. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enziminin Optimum Scaklk

almalarna Ait Sonular ................................................................................. 68

4.7. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enziminin Stabil Olduu pHnn

Bulunmasna Dair alma Sonular ................................................................. 70

4.8. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enziminde inko Belirlenmesi ................ 72

4.9. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enziminin Aktif Formunun Molekl

Ktlesinin Sephadex G-100 Jel Filtrasyon Kromatografisi ile Belirlenmesine

Ait Sonular ......................................................................................................... 73

4.10. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enzimi zerine Baz lalarn Etken

Maddelerinin Etkilerinin Belirlenmesine Ait alma Sonular ..................... 74

vi

4.11. Koyun Beyni Sorbitol Dehidrogenaz Enzimi zerine nhibitr Etkisi

Gsteren Baz lalar in Ki Deerlerinin Belirlenmesine Ait almalarn

Sonular ........................................................................................................... 80

5. TARTIMA ve SONU ....................................................................................... 84

KAYNAKLAR ............................................................................................................. 103

ZGEM .................................................................................................................. 112

vii

KISALTMALAR ve SMGELER DZN

ADH Alkol dehidrogenaz

AR Aldoz redktaz

BSA Bovine serum albmin

C Santigrat derece

DCCT The Diabetes Control and Complication Trials Group

DHAP Dihidroksiaseton fosfat

DM Diabetes melitus

DNA Deoksiribonkleikasit

E Enzim

EC Enzim komisyon numaras

EG Erken glikasyon rnleri

EI Enzim-nhibitr kompleksi

ES Enzim-Substrat kompleksi

ESI Enzim-Substrat-nhibitr kompleksi

E Enzim nitesi

GAPDH Gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz

GR Glutatyon redktaz

GSH ndirgenmi glutatyon

GSSG Ykseltgenmi glutatyon

I nhibitr

IDF International Diabetes Federation

G leri glikasyon rnleri

IC50 Maksimum hz yarya dren inhibitr konsantrasyonu

Ki Enzim inhibitr kompleksinin ayrma sabiti

MEB Milli Eitim Bakanl

NAD+

Nikotinamid Adenin Dinkleotit (ykseltgenmi form)

NADH Nikotinamid Adenin Dinkleotit (indirgenmi form)

NADP+

Nikotinamid Adenin Dinkleotit Fosfat (ykseltgenmi form)

NADPH Nikotinamid Adenin Dinkleotit Fosfat (indirgenmi form)

viii

NO Nitrik oksit

NOS Nitrik oksit sentaz

Nox NADH-oksidaz

PAGE Poliakrilamid jel elektroforezi

PER Amonyum peroksidislfat

PKC Protein kinaz C

RNA Ribonkleik asit

mRNA Mesajc RNA

ROS Serbest oksijen radikalleri

rpm Devir/dakika

S Substrat

SDH Sorbitol dehidrogenaz

SDS Sodyum dodesil slfat

TEMED N,N,N,N-Tetrametilendiamin

UKPDS United Kingdom Prospective Diabetes Study

Vmax Maksimum hz

ix

EKLLER DZN

ekil 1.1. Poliol yolu ve enzimleri .................................................................................. 17

ekil 1.2. SDH enziminin aktif blgesindeki inko iyonunun koordinasyonu ............... 19

ekil 1.3. SDH enziminin kuarterner yaps ................................................................... 19

ekil 1.4. SDH enziminin bir alt biriminin yaps .......................................................... 20

ekil 1.5. Sorbitol (poliol) yolu ...................................................................................... 23

ekil 1.6. leri glikasyon rnleri (G) oluumu .......................................................... 27

ekil 1.7. Ampisilin etken maddesinin yapsal forml ................................................. 29

ekil 1.8. Tylosin etken maddesinin yapsal forml ..................................................... 29

ekil 1.9. Sefaleksin etken maddesinin yapsal forml ................................................ 30

ekil 1.10. Oksitetrasiklin dihidrat etken maddesinin yapsal forml .......................... 31

ekil 1.11. Enrofloksasin etken maddesinin yapsal forml ......................................... 32

ekil 1.12. Gentamisin slfat etken maddesinin yapsal forml ................................... 33

ekil 1.13. Kanamisin etken maddesinin yapsal forml .............................................. 33

ekil 2.1. Sorbitol dehidrogenaz inhibitr SDI 158in kimyasal yaps ....................... 37

ekil 2.2. SDI 158 (CP-166,572)in insan SDH enziminin katalitik inko iyonuyla

ve NADH ile etkileimi .................................................................................. 38

ekil 4.1. Bradford yntemiyle proteinlerin kantitatif tayininde kullanlan standart

grafik ............................................................................................................... 60

ekil 4.2. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi iin amonyum slfat

doygunluk aral tespitine ynelik aktivite-ktrme aral grafii ............ 61

ekil 4.3. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enziminin saflnn SDS-PAGEde

elde edilen sonucu .......................................................................................... 63

ekil 4.4. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi yntemiyle koyun beyni SDH

enziminin molekl ktlesi tayininde kullanlan standart grafik ..................... 63

ekil 4.5. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesi zerinde pHnn etkisi ..................... 66

ekil 4.6. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesi zerinde iyonik iddetin etkisi ........ 68

ekil 4.7. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesi zerinde scakln etkisi ................. 69

ekil 4.8. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesinin belirli pH deerlerinde

(pH 5,0-8,0) zamanla deiimi ....................................................................... 71

x

ekil 4.9. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesinin belirli pH deerlerinde

(pH 8,5-10,5) zamanla deiimi ..................................................................... 72

ekil 4.10. Jel filtrasyon kromatografisi sonucu elde edilen enzim zeltilerinde

atomik absorpsiyon spektrofotometresi yntemi ile inko tayini

yaplmasnn sonucu ....................................................................................... 72

ekil 4.11. Koyun beyni SDH enziminin aktif formunun molekl ktlesinin tayini

iin kullanlan jel filtrasyon kromatografisi grafii ........................................ 73

ekil 4.12. Koyun beyni SDH enziminin aktif formunun molekl ktlesi tayini iin

Sephadex G-100 kolon materyali kullanlarak yaplan jel filtrasyon

kromatografisi sonucu elde edilen standart grafik .......................................... 74

ekil 4.13. Koyun beyni SDH enzimi zerine ampisilin etken maddesinin etkisi ......... 77

ekil 4.14. Koyun beyni SDH enzimi zerine oksitetrasiklin dihidrat etken

maddesinin etkisi ............................................................................................ 77

ekil 4.15. Koyun beyni SDH enzimi zerine tylosin etken maddesinin etkisi ............. 78

ekil 4.16. Koyun beyni SDH enzimi zerine kanamisin etken maddesinin etkisi ........ 78

ekil 4.17. Koyun beyni SDH enzimi zerine enrofloksasin etken maddesinin etkisi... 79

ekil 4.18. Koyun beyni SDH enzimi zerine gentamisin slfat etken maddesinin

etkisi ............................................................................................................... 79

ekil 4.19. Koyun beyni SDH enzimi zerine sefaleksin etken maddesinin etkisi ........ 80

ekil 4.20. Koyun beyni SDH enzimi zerine ampisilin etken maddesinin etkisi ......... 81

ekil 4.21. Koyun beyni SDH enzimi zerine oksitetrasiklin dihidrat etken

maddesinin etkisi ............................................................................................ 81

ekil 4.22. Koyun beyni SDH enzimi zerine kanamisin etken maddesinin etkisi ........ 82

ekil 4.23. Koyun beyni SDH enzimi zerine enrofloksasin etken maddesinin etkisi... 82

ekil 5.1. Mikrovaskler komplikasyonlarn biyolojisi .................................................. 84

ekil 5.2. Byk damarlarda metabolik hasar ................................................................ 85

ekil 5.3. Diyabetes mellitusta artan oksidatif stres iin mekanizma. ............................ 85

ekil 5.4. Hiperglisemi ve endotelyal fonksiyon bozukluu .......................................... 86

ekil 5.5. Poliol yolunun diyabetik komplikasyonlarla ilikisi ...................................... 87

ekil 5.6. Sorbitol dehidrogenaz enzim aktivitesiyle iskemik rahatszlk arasndaki

iliki ................................................................................................................ 88

ekil 5.7. Oksidatif stres ve sorbitol yolu arasndaki iliki ............................................ 89

xi

ZELGELER DZN

izelge 1.1. Enzim snflar ve katalizledikleri reaksiyon tipleri ..................................... 4

izelge 1.2. Jel filtrasyon kromatografisinde kullanlan baz jellerin proteinleri

ayrma snrlar ........................................................................................... 13

izelge 3.1. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi zerinde ampisilin etken

maddesinin IC50 deerinin belirlenmesinde kullanlan zeltilerin

miktarlar ve bunlara karlk gelen inhibitor konsantrasyonlar ............... 54

izelge 3.2. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi zerinde oksitetrasiklin

dihidrat etken maddesinin IC50 deerinin belirlenmesinde kullanlan

zeltilerin miktarlar ve bunlara karlk gelen inhibitor

konsantrasyonlar ....................................................................................... 55

izelge 3.3. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi zerinde tylosin etken

maddesinin IC50 deerinin belirlenmesinde kullanlan zeltilerin

miktarlar ve bunlara karlk gelen inhibitor konsantrasyonlar ............... 56

izelge 3.4. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi zerinde kanamisin etken

maddesinin IC50 deerinin belirlenmesinde kullanlan zeltilerin

miktarlar ve bunlara karlk gelen inhibitor konsantrasyonlar ............... 57

izelge 3.5. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi zerinde enrofloksasin

etken maddesinin IC50 deerinin belirlenmesinde kullanlan zeltilerin

miktarlar ve bunlara karlk gelen inhibitor konsantrasyonlar ............... 58

izelge 3.6. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi zerinde gentamisin slfat

etken maddesinin IC50 deerinin belirlenmesinde kullanlan zeltilerin

miktarlar ve bunlara karlk gelen inhibitor konsantrasyonlar ............... 59

izelge 4.1. Koyun beyni SDH enzimi iin amonyum slfat doygunluk aral

tespitine ynelik aktivite-ktrme aral izelgesi ................................. 61

izelge 4.2. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enziminin saflatrlmas

basamaklar ................................................................................................ 62

izelge 4.3. pH 5,5-8,0 aralnda koyun beyni SDH enziminin aktivitesini gsteren

izelge ........................................................................................................ 64

xii

izelge 4.4. pH 7,5-9,0 aralnda koyun beyni SDH enziminin aktivitesini

gsteren izelge .......................................................................................... 65

izelge 4.5. pH 8,5-10,5 aralnda koyun beyni SDH enziminin aktivitesini

gsteren izelge .......................................................................................... 65

izelge 4.6. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesinin farkl iyonik iddetlerdeki

deiimini gsteren izelge ........................................................................ 67

izelge 4.7. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesinin scaklkla deiimini

gsteren izelge .......................................................................................... 69

izelge 4.8. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesinin belirli pH deerlerinde

(pH 5,0-8,0) zamanla deiimi .................................................................. 70

izelge 4.9. Koyun beyni SDH enziminin aktivitesinin belirli pH deerlerinde

(pH 8,5-10,5) zamanla deiimi ................................................................ 71

izelge 4.10. Ampisilin etken maddesinin koyun beyni SDH aktivitesi zerine etkisi . 74

izelge 4.11. Oksitetrasiklin dihidrat etken maddesinin koyun beyni SDH aktivitesi

zerine etkisi ............................................................................................. 75

izelge 4.12. Tylosin etken maddesinin koyun beyni SDH aktivitesi zerine etkisi ..... 75

izelge 4.13. Kanamisin etken maddesinin koyun beyni SDH aktivitesi zerine

etkisi ......................................................................................................... 75

izelge 4.14. Enrofloksasin etken maddesinin koyun beyni SDH aktivitesi zerine

etkisi ......................................................................................................... 76

izelge 4.15. Gentamasin etken maddesinin koyun beyni SDH aktivitesi zerine

etkisi ......................................................................................................... 76

izelge 4.16. Sefaleksin etken maddesinin koyun beyni SDH aktivitesi zerine

etkisi ......................................................................................................... 76

izelge 4.17. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi iin bulunan IC50 deerleri .. 80

izelge 4.18. Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi iin bulunan

Ki, Kideerleri ve inhibisyon tipleri ........................................................ 83

izelge 5.1. Koyun beyni SDH enzim aktivitesini inhibe eden ilalarn etken

maddelerinin IC50 (mM) deerleriyle tbbi uygulamada kullanlan

konsantrasyonlarnn karlatrlmas ..................................................... 100

izelge 5.2. SDH enziminin saflatrlmas ile ilgili sonular ...................................... 102

1

1. GR

Canl hcrelerde gerekleen yapm ve ykm tepkimelerinin hepsine birden

metabolizma denir. Kimyasal tepkimenin balayabilmesi ve devam etmesi iin

tepkimeye girecek molekllerin aktivasyon enerjisi denilen enerji engelini amas

gerekir.

Aktivasyon enerjisi, bir kimyasal tepkimenin balayabilmesi iin gerekli olan en dk

enerji miktardr. Aktivasyon enerjisi engelinin almas katalizr kullanlmasyla

salanr.

Kimyasal tepkimeye girecek molekller hareket halindedir ve birbirleri ile

arpmaktadr. Molekllerin stlmas ile hareket enerjileri ykseltilir. Bylece

molekller birbirleri ile daha sk arparak tepkimeye girmeleri kolaylar.

Ancak canl sistemlerde kimyasal tepkimelerin ou hcrede meydana gelir. Hcrede

kimyasal tepkimelerin olabilmesi iin, enerji engeli biyolojik katalizr kullanlarak

alabilir. Canl sistemlerdeki bu biyolojik katalizrlere enzim denir (Anonim 2012a).

Enzimler canl hcreler tarafndan sentezlenen ve canl organizmada kimyasal

reaksiyonlar hzlandran, tepkime sonucunda hibir deiiklie uramadan kan ve

ayn zamanda tam verim salayan biyolojik katalizrlerdir. Katalitik RNA moleklleri

dndaki btn enzimler protein yapsndadr.

Enzimlerin katalitik aktiviteleri, doal protein konformasyonunun salamllna

baldr. Eer enzim denatre olursa veya alt birimlerine ayrlrsa katalitik aktivitesi

kaybolur. Bu yzden protein enzimlerinin birincil, ikincil, ncl ve drdncl yaps

katalitik aktivite iin esastr. Enzimlerin hzlar turnover says ile belirtilir. Turnover

says birim zamanda bir mol enzimin rne dntrd substratn mol says olarak

http://www.diyadinnet.com/YararliBilgiler-1231&Bilgi=molek%C3%BClhttp://www.diyadinnet.com/YararliBilgiler-1231&Bilgi=molek%C3%BClhttp://www.diyadinnet.com/YararliBilgiler-1379&Bilgi=ilehttp://www.diyadinnet.com/YararliBilgiler-1206&Bilgi=canl%C4%B1

2

ifade edilmektedir. Turnover says en yksek olan enzim, 40 000 000 s-1

ile katalazdr

(Fersht 1999).

Bir ksm enzimler katalitik aktivite gstermek iin amino asit kalntlar dnda

kimyasal bir guruba ihtiya duymazlar. Dierleri kofaktr olarak adlandrlan Fe+2

,

Mg+2

, Mn+2

gibi bir veya daha fazla inorganik iyona ya da koenzim olarak adlandrlan

kompleks organik veya metaloorganik molekllere gereksinim duyarlar. Bir dier ksm

enzimler ise aktivite gsterebilmeleri iin hem koenzime hem de bir veya daha fazla

metal iyonuna ihtiya duyarlar.

Protein yapsna ok sk hatta kovalent olarak balanan bir koenzim veya metal iyonu

prostetik grup olarak adlandrlr. Metal iyonlar ile veya koenzimiyle birlikte katalitik

olarak aktif bir enzim, holoenzim olarak adlandrlrken bu gibi enzimlerin sadece

protein ksm apoenzim veya apoprotein olarak adlandrlmaktadr. Koenzimler; tiamin

pirofosfat, aldehitler, koenzim A, ail gruplar gibi zgl ilevsel gruplar iin geici

tayc olarak grev yaparlar. Koenzimler ounlukla diyet ile dk miktarlarda alnan

organik besinler olan vitaminlerden temin edilirler (Nelson and Cox 2005).

Genel olarak enzimlerin zellikleri u ekilde sralanabilir;

1. Enzimler genellikle renksizdirler, suda znrler

2. Enzimlerin etki ettii maddelere substrat denir. Reaksiyonsonunda meydana gelen

maddeye ise rn ad verilir.

3. Enzim substrat ilikisi anahtar ile kilidin uyumuna benzer.

4. Enzim moleklnde aktif blge denilen zel bir blm vardr. Enzim

substratna geici olarak aktif blgeden balanr ve substrat-enzim bileii oluur.

5. Daha sonra substrat rne veya rnlere paralanr.

6. Enzimler reaksiyondan deimeden ktklar iin tekrar tekrar kullanlabilirler.

7. ok hzl alrlar. rnein re, enzim olmadan uzun zamanda paralanrken, reaz

enziminin varlnda saniyede 30 000 re molekl paralanabilir.

8. Her hcrede tepkime eidi kadar enzim eidi vardr.

3

9. Enzimler takm halinde alrlar. Bir enzimin etki ettii tepkimenin rn, baka bir

enzimin substratn oluturur. rnein, amilaz enzimi niastay maltoza paralar. Oluan

maltoz, maltaz enziminin substratdr.

10. Enzimlerin bazlar tek substrata etki ederler yani spesifiktir. rnein, L-laktat

dehidrogenaz enzimi laktik asidin yalnzca L-izomerine etki etmekte D-laktikasidi

substrat olarak kullanmamaktadr.

11. Baz enzimler ise eitli substratlara etki ederler yani daha az zgldr (MEB 2011).

Birok enzim, substratlarnn adna veya aktivitelerini tanmlayan bir kelime ya da

szck grubuna az son eki ekleyerek adlandrlr. reaz, amilaz, arjinaz, proteaz ve

lipaz, substrat tanmlayan; DNA polimeraz, laktat dehidrojenaz ve adenilat siklaz,

tepkimeyi tanmlayan adlandrmalardr. reaz, renin hidrolizini katalize eden; DNA

polimeraz ise DNAnn sentezini katalize eden enzimdir. Pepsin, tripsin, amigdalin,

pityalin, zimaz gibi, substratlarn veya aktivitelerini tanmlamayan, genel bir tanma

uymayan enzim isimleri de kullanlmtr. Kark isimlendirmelerin sonucu olarak

bazen ayn enzim iin iki veya daha fazla ad kullanlmtr; bazen de iki farkl enzim

iin ayn ad kullanlmtr. Byle belirsiz anlamllklar ve yeni olarak kefedilen

enzimlerin srekli artan says nedeniyle, uluslararas antlamalar vastasyla, enzimlerin

isimlendirilmesi ve snflandrlmas iin bir sistem benimsenmitir. Uluslararas

Biyokimya ve Molekler Biyoloji Birlii (IUBMB) tarafndan nerilen ve benimsenen

sistematik adlandrmada enzimler, alt byk snfa ayrlrlar, her snfn da katalizlenen

reaksiyon tipine dayanan alt snflar vardr.

4

izelge 1.1. Enzim snflar ve katalizledikleri reaksiyon tipleri

Enzim gurubu Katalizledikleri reaksiyon tipi

1 Oksiredktazlar ki substrat arasndaki redoks tepkimesini

katalizler.

2 Transferazlar

ki substrat arasndaki hidrojen dndaki

gruplarn transferini gerekletiren

tepkimeyi katalizlerler.

3 Hidrolazlar

Su katlmas suretiyle balarn

paraland hidroliz reaksiyonlarn

katalize eden enzimlerdir

4 Liyazlar

Oksidasyon veya hidrolizden farkl bir

mekanizma ile substratlardan baz

gruplarn uzaklatrld ve ift balarn

oluturulduu tepkimeleri katalizleyen

enzimlerdir.

5 zomerazlar Molekl iindeki deiiklikleri

katalizleyen enzimlerdir.

6 Ligazlar

Enerjice zengin bir ban kopmas ile

ortaya kan enerji yardmyla iki

molekln balanmas reaksiyonlarn

katalizleyen enzimlerdir.

Enzimler genelde ya ayn reaksiyonu ya da ayn tip benzer reaksiyonlar katalizlerler.

Substratlara kar spesifiklikleri olduka yksektir, hatta baz enzimlerin substrat

zgllkleri mutlaktr. rnein, proteolitik enzimler peptit balarnn hidrolizini

gerekletirirler. Bu enzimlerin substrat zgllkleri birbirinden farkldr. Tripsin

sadece lisin veya arginin rezidlerinin karboksil grubu tarafndaki peptit balarn

paralar. Kann phtlamasnda grev alan trombin ise karboksil bileeni arginine ve

amino grup bileeni glisin aminoasitine ait peptit ban paralamaktadr. Buradan

5

anlalaca gibi trombinin substrat zgll yine bir proteolitik enzim olan tripsine

gre daha fazladr (Keha ve Kfreviolu 2010).

Birok enzimin sterospesifiklik zellii de vardr. Baz enzimler substrat moleklnn

D-formunu rne evirirken, bir ksm da L-formunu rne dntren tepkimeyi

katalizlemektedir. rnein, glutamat dehidrogenaz enzimi L-glutamat ve laktat

dehidrogenaz enzimi de L-laktat zerinde etkilidirler (Keha ve Kfreviolu 2010).

Bununla birlikte, ayn canl trnde ayn reaksiyonu katalizleyen ancak farkl kimyasal

ve fiziksel zellikleri olan enzimler de vardr. Bu tip enzimlere izoenzim denir.

zoenzimlerin substratlarna, kofaktrlerine ve inhibitrlerine kar ilgileri farkldr.

zoenzimlerin balca zellikleri arasnda aminoasit say ve srasnn farkl olmas,

izoelektrik noktalarnn farkl olmas, her bir izoenzimin farkl geninin olmas ve

elektroforetik hareketliliklerinin farkl olmas saylabilir. zoenzimler farkl dokularda

snrlandrlm olabildii gibi, bir hcrenin farkl subselller fraksiyonlarnda da

yerleebilirler (Devlin 2002).

Enzimlerin bir dokudan saflatrlmas ilemi olduka zor bir ilemdir. Enzimler

genellikle protein yapsnda olduklar iin artlarn deimesinden ok hzl bir ekilde

etkilenebilirler. Bu yzden bir zeltideki enzim varl, enzimin etki ettii substrat

molekl veya reaksiyon sonucu oluan rn ya da enzimatik reaksiyona araclk eden

dier parametreler zerinden tespit edilmektedir.

Enzimlerin aktivitesini etkileyen faktrler;

Substrat konsantrasyonu

Scaklk

pH

Allosterik etkiler

Hormonlar

yonik iddet

Enzim konsantrasyonu

6

nhibitr ve aktivitrlerin varl eklinde sralanabilir.

Her enzim iin aktivitelerin maksimum olduu pH deerleri vardr. Bu deerlerin

zerinde ve altnda aktivite der. Bu pH derecesine "Optimum pH" denir. rnein,

proteini paralayan pepsin, midede pHnn 2,0 olduu asidik ortamda maksimum

alr; bunun aksine pankreastan salglanan ve yine protein sindiriminde rol alan

tripsin, ancak pH 8,5te optimum olarak alabilir. Bir enzimin optimum pHs normal

hcre ii ortamn pHs ile ayn deildir. Bu durum hcre iindeki enzim aktivitesinin

kontrolnde pH-aktivite ilikisinin nemini gstermektedir. Genelde bir kimyasal

reaksiyonun hz scaklkla art gstermektedir. Scaklk enzimli reaksiyonlarnda

hzlarnn artna sebep olan nemli bir faktrdr, yani tepkime hznn ykselmesi,

scaklkla doru orantldr. Bununla birlikte belli bir noktaya gelindiinde enzim

aktivitesinde bir d gzlenir. Bu durum yksek scaklkta enzimin boyutlu

yapsnn etkilendiini yani enzimin denatre olduunu gstermektedir. Bir enzim iin

10oClik scaklk deiiminin meydana getirdii aktivite farkll Q10 deeriyle ifade

edilir (Keha ve Kfreviolu 2010).

Enzimlerin aktivitelerini pozitif ynde etkileyen bileiklere aktivatr ad verilir.

Aktivatrleri iki grupta toplamak mmkndr. Birinci gruptakiler sadece substratla

birleerek aktivatr rol oynayan bileikler. kinci gruptakiler ise serbest enzimle

birleerek aktivatr rol oynayan bileiklerdir (Gzkara 1989).

Enzimlerin hem in vivo hem de in vitro aktivitelerinin, baz bileikler tarafndan

azaltlmas ve hatta yok edilmesi olayna inhibisyon denir. Bu olaya sebep olan yani

enzimle katalizlenen bir reaksiyonun hzn azaltan herhangi bir maddeye de inhibitr

denilir. nhibitrler genellikle kk molekl ktlesine sahip bileikler veya iyonlardr

(Keha ve Kfreviolu 2010). Enzim aktivitesini inhibe eden madde veya faktrler

aadaki ekilde sralanabilir:

Substrat benzeri maddeler

Toksinler

7

lalar

Metal kompleksleri.

Enzimatik aktivitenin inhibisyonu, biyolojik sistemlerde bal bana bir kontrol

mekanizmas oluturduundan nemli bir olaydr. Enzimler hemen hemen btn

hcresel sreleri katalizlediinden, enzim inhibitrlerinin bilinen en nemli

farmakolojik ajanlar arasnda olmas tesadf deildir. Birok ila ve zehirli bileikler

etkilerini bu yolla gsterirler (Keha ve Kfreviolu 2010). rnein; aspirin

(asetilsalisilat) baz ar reten sreleri de iine alan pek ok srete yer alan

prostaglandinlerin sentezindeki ilk basama katalizleyen enzimi inhibe eder. Enzim

inhibitr almalar ayrca enzim mekanizmalar hakknda deerli bilgiler salamtr

ve baz metabolik yollarn tanmlanmasna yardmc olmutur (Lehninger 2005).

nhibisyon almalar ne gibi faydalar salamaktadr?

Metabolik yollar hakknda bilgi

la ve toksinlerin, etkilerini nasl gsterdiinin aklanmas

Enzim reaksiyon mekanizmalarnn daha iyi aydnlatlmas

Enzim aktivitelerinin dzenlenmesiyle kontrol sisteminde etkili olmalar

Substrat analoglar kullanlarak nemli aratrmalar yaplmas

Enzimatik inhibisyon iki grupta incelenir;

a) Dnmsz inhibisyon

b) Dnml inhibisyon

Dnmsz inhibisyonda inhibitr enzime ya kovalent olarak balanr ya da zor

ayrabilen bir kompleks oluturur. Dnmsz inhibisyonda Vmax (enzimatik

reaksiyonda ulalabilecek maksimum hz) azalr, KM ise (enzimin substrata olan ilgisini

gsteren sabit) deimeden kalr. Reaksiyon emas;

8

eklinde yazlabilir (Segel 1975; Keha ve Kfreviolu 2010).

Dnmsz inhibisyonun aksine dnml inhibisyonda enzim ile inhibitr

etkilemesi bir denge reaksiyonu eklindedir.

Dnml inhibisyon grupta incelenir:

a) Yarmal (kompetitif) inhibisyon

b) Yarmasz (nonkompetitif) inhibisyon

c) Yar yarmal (unkompetitif) inhibisyon

Geri dnml inhibisyon, dnmsz inhibisyonun aksine bir denge reaksiyonu

eklindedir. En sk karlalan dnml iki inhibisyon tipi yarmal ve yarmasz

inhibisyondur.

Dnml inhibisyonun en basit tipi yarmal (kompetitif) inhibisyondur. Yarmal

inhibitr yap itibariyle substrata benzer ve enzimin aktif blgesine balanr. Bylece

substratn enzime balanmas nlenmi olur. Fakat substrat konsantrasyonu arttrlmakla

inhibisyon etkisi ortadan kaldrlabilir. Yani enzimin Vmax deeri deimezken, KM

deeri artar. Reaksiyon emas;

9

eklinde yazlabilir (Segel 1975; Telefoncu 1986; Keha ve Kfreviolu 2010).

Yine dnml bir tip olan yarmasz (nonkompetitif) inhibisyonda; inhibitr ve

substrat enzim moleklne ayn anda balanabilir. Bu durum balanmann enzimin ayn

blgesine olmadn gsterir. Yarmasz bir inhibitr etkisini; bir enzimin turnover

saysn, yani katalitik aktivitesini drerek gsterir. Burada substrat ve inhibitr

arasnda yarma sz konusu deildir. Substrat konsantrasyonu arttrlmakla inhibisyon

kaldrlamaz. Enzimin Vmax deeri azalrken, KM deeri sabit kalr. Substrat ve inhibitr

farkl blgelere balanabildiinden, enzimin iki farkl inaktif kompleksi meydana gelir.

Reaksiyon emas;

eklinde yazlabilir (Telefoncu 1986; Keha ve Kfreviolu 2010).

10

Bir baka dnml inhibisyon tipi, yar yarmal (unkompetitif) inhibisyondur. Bu

inhibisyon eitinde; inhibitr serbest enzime balanamaz, sadece ES kompleksine

balanr. Bunun iin tek substratl sistemlerde, yar yarmal inhibisyona seyrek

rastlanr. Birden fazla substratl enzimlerde bu inhibisyon tipine daha sk rastlanr.

ESI kompleksi ortamda srekli olarak var olacandan, yar yarmal inhibitr

varlnda Vmax azalr. ESI kompleksinin oluumu vastasyla; ES kompleksi ortamdan

srekli ekildiinden, enzim ve substrattan ES kompleksinin oluum dengesi daha fazla

saa kayar ve KM deeri klr (Segel 1975; Telefoncu 1986). Reaksiyon emas;

eklinde yazlr.

Yarmasz (nonkompetitif) inhibisyonun zel bir tr olan lineer kark tip inhibisyon,

dnml inhibisyon snfna girer. Bu tr inhibisyonda; E, S ve Inn balanma denge

sabitleri farkllamaktadr. Bu inhibisyonun reaksiyon emas ise;

11

eklinde yazlabilmektedir.

Baz inhibitrler enzimin spesifik gruplaryla kovalent balar oluturarak etki

gsterirler. rnein kurun, proteindeki sisteinin slfidril yan zinciriyle kovalent balar

oluturur. Ar metallerin balanmas yarmal olmayan inhibisyon gsterir (Lippincott

2007).

Birok multienzim sistemi, net reaksiyon hzlarn kendileri dzenleme kapasitesine

sahiptir. Bu sistemlerin ounda, seri reaksiyonlarn son rn belirli bir

konsantrasyona ulatnda; sistemin ilk enzimini veya dallanma noktasndaki enzimini

inhibe eder. Bu enzimlere allsoterik enzimler ad verilir. Bu olaya da feed-back (geri

besleme) inhibisyonu denir. Birden fazla polipeptid zinciri ihtiva eden allosterik

enzimlerde; inhibitrlerin enzime balanmasyla, deiik alt birimlerin balanma

merkezleri arasndaki etkilemelerle allosterik inhibisyon meydana gelir. Allosterik

enzimleri etkileyen bileiklere modlatr ad verilir (Stryer 1988).

nhibisyon eidinin ve ilgili Ki sabitinin belirlenmesi iin en ok bavurulan yntem

Lineweaver-Burk erileridir. Bu yntemde 1/V ye kar 1/[S] grafii en az farkl

sabit inhibitr konsantrasyonunda izilerek Ki sabiti hesaplanr. Ki sabitlerinin

bulunmasnn ikinci yntemi Dixon grafikleri yoludur. Bu yntemde en az iki sabit

substrat konsantrasyonunda 1/V-[I] grafii izilerek Ki sabitleri bulunur (Telefoncu

1986).

eitli organizmalar kendilerine has proteinlere sahip olduklar gibi, her hcre tipi de

birok deiik protein ihtiva etmektedir. Bunun yannda proteinler, biyolojik

aktivitelerini ancak belirli pH ve scaklk snrlarnda gsterebilirler. Bu sebeplerden

dolay bir proteinin saf halde bir hcre veya dokudan izolasyonu g bir itir. Bu

glklere ramen imdiye kadar birok protein saf olarak elde edilmitir. Binin

zerinde enzim ksmen saflatrlm ve iki yzden fazlas saf kristal halde elde

edilmitir. Ayrca hibir enzimatik aktivite gstermeyen yzlerce protein eitli

kaynaklardan yksek saflk derecesinde izole edilmitir. Proteinler boyutlu yaplar,

12

scaklk, pH, yzey gerilimi gibi birok faktrden hzl bir ekilde etkilenerek ksa

srede enzim aktivitelerini kaybedebilmektedirler. Bu nedenle enzim saflatrlmas

deneyleri olduka dikkat gerektiren almalardr.

Saflatrma ilemleri genelde enzimlerin;

1. Molekl bykl,

2. znrlkleri farkllklar,

3. Elektriksel yk,

4. Adsorbsiyon davranlarndaki farkllklar esasna gre gerekletirilmektedir (Keha

ve Kfreviolu 2010).

Proteinler genelde byklk olarak birbirinden farkldr. Bu da bir proteini dierinden

ayrmay kolaylatrr ve bu esasa dayal proteinleri ayrma metotlar diyaliz,

ultrafiltrasyon, younluk gradienti santrifgasyonu ve jel filtrasyon kromatografisidir.

Bu durum, bir proteini dier proteinlerden ve kk molekllerden ayrmay mmkn

klar. Jel filtrasyon kromatografisinde kolon materyali olarak Sepharose, Biogel gibi

polimerler yannda yaygn olarak kullanlan ve bir karbonhidrat trevi olan Sephadex

polimeridir. Sephadex yapsnda fazla miktarda hidroksil grubu ihtiva etmesi dolaysyla

suya ve elektrolit zeltilerine ilgisi fazladr. Bu teknikte kk molekl ktleli

proteinler ve dier safszlklar Sephadexin porlarna taklrlar. Byk molekl ktleli

proteinler ise Sephadexin porlarna taklmadan geerler ve molekl ktlelerinin

byklk srasna gre kolondan ele edilirler; szme ileminin tersi gerekleir. Bu da

proteinlerin ayrmlar iin olduka avantajl bir durumdur.

Jellerin zelliklerini belirlemede kullanlan temel terim su kazanm deeri dir. Bir

gram kuru jelin emebildii su miktarna o jelin su kazanm deeri denir. Bu deer 10 ile

arplarak jelin ticari adnn sonuna yazlr. rnein Sephadex G-15 jelinin su kazanm

deeri 1,5tur (1 g madde 1,5 g su emebilir). Bir jelin su kazanm deeri arttka

gzenek bykl de artar.

13

izelge 1.2. Jel filtrasyon kromatografisinde kullanlan baz jellerin proteinleri ayrma

snrlar

Dolgu maddesi Ayrma snr (molekl ktlesi,

Dalton)

Sephadex G-10 0-700

Sephadex G-15 0-1 500

Sephadex G-25 1 000-5 000

Sephadex G-50 1 500-30 000

Sephadex G-75 3 000-80 000

Sephadex G-100 4 000-150 000

Sephadex G-150 5 000-300 000

Sephadex G-200 5 000-600 000

Baz proteinler ve virsler gibi daha byk molekllerin agardan elde edilen ve ntral

bir polisakkarit olan agaroz jeli kullanlr. Jel filtrasyonda karmlar ayrmada molekl

byklkleri ilem iin ayrt edici faktrdr. Molekller bydke ayrlma molekl

byklnden ziyade molekl ktlesine gre olur. rnein; Sephadex G-100 ve G-200

tipi jellerde ele etme hacmi yaklak olarak molekl ktlesinin logaritmas ile doru

orantldr. Bunlardan yararlanlarak byk molekll bileiklerin mesela proteinlerin

molekl ktleleri tayin edilebilir (Kfreviolu ve ifti 2008).

znrlk farkll da proteinleri saflatrmada kullanlan dier bir metottur.

Proteinlerin znrl balca pH, iyonik iddet, zcnn dielektrik zellii ve

scakla baldr. Bu esaslara dayal proteinleri ayrma metotlar:

zoelektrik kelme

Ntral tuzlarla ktrme

zclerle fraksiyonlama

Scaklkla ktrmedir.

14

pH proteinlerin ounun znrln etkileyen bir parametredir. Deiik proteinlerin

iyonlaabilir R gruplar tayan amino asitlerinin says farkl olduundan, izoelektrik

pHlar da farkldr ve bundan dolay ou kez izoelektrik kelme ile ayrt edilebilirler.

Proteinler iin izoelektrik kelme ortamdaki iyon ieriine gre deiir; nk

proteinler belirli anyon ve katyonlar balayabilirler. Eer bir protein zeltisi, H+

ve

OH-

dndaki kk iyonlar uzaklatrmak iin saf suya kar diyaliz edilirse,

izoelektrik pH, izoiyonik pHde gerekleir ve bu da proteine gre sabittir.

Ntral tuzlar dk konsantrasyonlarda protein molekllerinin znrln arttrrlar.

Bu olaya salting-in denir. MgCl2 ve (NH4)2SO4 gibi iki deerlikli tuzlar, NaCl, NH4Cl

ve KCl gibi tek deerliklilerden daha etkilidir. Ntral tuzlarn bu zellii, onlarn iyon

iddetlerine baldr. Bu iyonlar protein moleklnde yan gruplarn ayrmasn

modifiye ederler. Yeteri kadar yksek tuz konsantrasyonunda bir protein bir zeltiden

hemen hemen kantitatif olarak keltilebilir; yani yksek tuz konsantrasyonunda

proteinlerin znrl azalr ve hatta kerler. Bu olaya salting-out ad verilir.

Suda znebilen ntral organik zclerin, zellikle etanol ve asetonun ilavesi, ou

globuler proteinlerin sudaki znrln kelme derecesine kadar azaltabilir. Bu

etkinin kantitatif aratrmalar, sabit pH ve sabit iyonik iddette znrln ortamn

dielektrik sabitinin bir fonksiyonu olduunu gstermitir. Etanol sudan daha kk bir

dielektrik sabitine sahip olduundan sulu protein zeltisine etanolun ilavesiyle zt

yklerin ekimi artar ve proteinler kmelenerek kerler.

Globuler proteinlerin znrlne etki eden bir baka faktr de scaklktr. Genelde

znrlkleri 0-40C zerinde azalr ve birou denatre olur. Bu nedenle proteinlerin

ayrlmas ilemleri daha ok dk scaklklarda gerekletirilir.

Proteinlerin elektriksel yklerine gre ayrlmas, polipeptid zincirlerindeki iyonlaabilir

yan gruplarn says ve cinsi ile belirlenen asit baz zelliklerine dayanmaktadr.

Proteinler, aminoasit bileiminde ve diziliinde farkllk gsterdiklerinden, her protein

zel bir asit baz davranna sahiptir. Elektriksel yk farkna dayanan ayrma

15

metotlarndan biri olan iyon deiim kromatografisinde duran fazda bulunan ve

yerlerinden kolaylkla ayrlabilen iyonlar evrelerindeki iyonlar ile yer deitirir. Bu

deiim sonucunda duran fazn fiziki grnmnde deime olmaz. yon deiim

kromatografisi ile basit inorganik ve organik iyonlar birbirlerinden ayrlabilecei gibi

enzimler, hormonlar ve nkleik asitler gibi biyolojik nemi olan polielektrolitler de

ayrlabilir.

yon deiim kromatografisinde kullanlan materyaller, ounlukla sellozun sentetik

olarak hazrlanm trevleridir. Dietilaminoetil selloz (DEAE-selloz), pH 7,0da

pozitif ykl gruplar ihtiva eder ve bu yzden bir anyon deitiricidir. Karboksimetil

selloz (CM-selloz) ise, ntral pHda negatif ykl gruplar ihtiva eder ve bir katyon

deitiricidir.

Proteinlerin DEAE-Selloz kolonlar zerinde ayrlmasnda ve her bir komponentin

srasyla elsyonunda, azalan pHl tamponlarn bir serisi veya artan iyonik iddetli tuz

zeltilerinin bir serisi kullanlr. Bunlarn kolondan geirilmesi srasnda anyonik

proteinlerin balanmas azaltlr. nk pHnn dmesiyle birlikte, iyon deitiriciye

tutunan proteinlerin negatif ykl blgeleri ntral hale gelir. Yine iyonik iddetin

artmasyla pozitif iyonlar proteinin negatif ykl blgelerine balanrlar; negatif iyonlar

ise, proteinlerle iyon deitiriciye balanma hususunda yara girerler. Bylece

proteinler bu blgeye daha yava bir kuvvetle balanrlar ve hatta koparlar.

Proteinlerin CM-selloz kolonlar zerinde ayrlmasnda ve her bir komponentin

srasyla elsyonunda ise artan pHl tamponlarn bir serisi veya azalan iyonik iddetli

tuz zeltilerinin bir serisi kullanlr. Bu sayede katyonik proteinlerin kolona

balanlmas azaltlr.

Elatlar kk fraksiyonlarda toplanarak gerekli analizler yaplr. Bu metodun nemli

bir taraf da, iyon deiim kromatografisi ve jel filtrasyon kromatografisini kombine

edebilmesidir. rnein, DEAE-Sephadex kullanlarak proteinleri yklerine ve molekl

byklklerine gre ayrmak mmkndr.

16

yon deiim kromatografisi yntemiyle proteinlerin saflatrlmas srasnda kolonun

hazrlanmas, dengelenmesi, numune tatbiki ve elsyon ilemleri jel filtrasyon

kromatografisindekine ok benzer. En nemli fark elsyon ilemindedir. Genelde iki

farkl elsyon uygulanr. Basamakl elsyonda, kolondan proteinlerin elsyonu

srasnda deiik pHl ve deiik iyonik iddetli zeltiler srasyla geirilir. Bu yntem

ok zaman alcdr. Gradientli elsyonda ise bir gradient mikser kullanlr. Elsyon

tamponunda bir pH gradienti oluturulur. Her protein izoelektrik pHsna geldiinde

ykszleir ve duran faza tutunamayarak ele edilir. Benzer durum iyonik iddet

gradienti olarak da uygulanabilir (Kfreviolu ve ifti 2008).

Biyokimya alannda gnmze kadar en ok aratrma yaplan konu enzimlerdir.

Gnmzde birok enzim saflatrlm, karakterize edilmi ve 200den fazla enzim de

kristallendirilmitir. Enzimler salktan endstriyel konulara kadar uygulama alan

bulmutur.

Kataliz olay ile ilgili ilk denemeler 1760-1825 yllar arasnda midedeki enzimatik

sindirim zerine yaplmtr. Belirli bir enzim zerindeki ilk alma 1860 ylnda

Pasteur tarafndan yaplm ve fermantasyon olaynn enzimlerce yrtldn ispat

etmitir. Bu yzden enzimler iin Ferment terimi kullanlmtr. Buchner kardeler

1897li yllarda maya hcrelerinde alkolik fermantasyonu katalize eden enzimleri elde

etmeyi baarmlardr. Bu bulu enzimlerin aktivite gstermeleri iin hcre iinde

bulunmalarnn art olmadn ortaya koymutur. Yaplan genetik almalar ve hcre

iindeki kimyasal reaksiyonlarn eitlilii daha birok enzimin kefedilmediini

gstermektedir. Btn canl hcrelerde meydana gelen reaksiyonlar enzimlerle ilgilidir.

Enzimler canl hcrelerde sentezlenir ve hcre canlln yitirdikten sonra uzun sre

etkili kalrlar.

1.1. Sorbitol Dehidrogenaz Enzimi

Poliol dehidrogenazlar genelde eker alkollerini ekerlere dntrrler. Bu enzimler

katalitik eker alkollerini dntrmede ok kullanldrlar. Ancak daha ok karakterize

17

poliol dehidrogenazlarn olumsuz kinetik zelliklerinden dolay kullanmlar snrldr.

Sorbitol dehidrogenaz enzimi de bir poliol dehidrogenaz ailesi yesidir.

Sorbitol dehidrogenaz (L-iditol: NAD+ oksidoredktaz, EC 1.1.1.14) sorbitol yolu

olarak adlandrlan poliol yolunun iki enziminden biri olup sorbitol ve fruktoz

arasndaki dnml oksidasyon-redksiyon reaksiyonunu katalizler ve koenzim

olarak NAD+y kullanr (Lindstad et al. 1994).

ekil 1.1. Poliol yolu ve enzimleri

SDH memeli alkol dehidrogenazlarn da iine alan orta zincirli dehidrogenaz/redktaz

protein familyasna dahil olan bir inko enzimidir (Jrnval et al.1984; Jeffery et al. 1984).

Ak yap ve mekanistik olarak benzer olmalarna ramen SDH ve ADH farkl inko

ierikleri ile beraber birok ayrt edici zellikleri vardr. SDH tetramerik olmasna

karn, memeli ADH dimeriktir. SDH her bir alt biriminde katalitik blgede bulunan bir

inko atomu ierirken, ADH her bir alt biriminde iki tane inko iyonu

bulundurmaktadr. Btn bunlarla birlikte SDH ile ADHlerin substratlar da farkldr.

SDH sorbitol, xylitol D-mannitol ve L-iditol gibi poliollerde aktivite gsterirken primer

alkollerde etkin deildir (Luque et al.1998).

Polioller CnH2(H2O)n, ya da alditoller; aldozlardan ya da ketonlardan, karbonil

gurubunun indirgenmesi ile olumu polifonksiyonel alkollerdir. Polioller karbon

saylarna gre tetritol, pentitol, hegzitol gibi adlandrlrlar bu ekilde adlandrlmalar

onlarn fizikokimyasal zellikleri ve karbon saylarna gre olabilir. Birok poliol

yaygn olarak geni bitki ve hayvan filumlarndan ve daha yksek hayvanlardan

bakterilere kadar zellikle mantar algler ve bitkilerde bol miktarda bulunurlar (Touster

Glukoz Sorbitol Fruktoz

Aldoz Redktaz Sorbitol Dehidrogenaz

NADPH NADP+ NADH NAD

+

18

et al. 1962; Brimacombe et al. 1972). Buna ramen doada n>6 olan uzun zincirli

polioller sentezlenmektedir. Birok poliol ve trevleri yaygn uygulamalar sayesinde

kefedilmitir. rnein sorbitol ve xylitol di sal ve diyabet kontrolnden dolay

yaygn olarak eker yerine kullanlan poliollerdir. eitli poliol esterleri patlayc madde

ve ila olarak kullanlrlar (Lindstad et al. 1998).

Sorbitol dehidrogenaz enziminin memeli dokusunda aktif olduu ilk kez 1942 ylnda

saptanmtr (Breusch 1942). Bu almadan sonra SDH deiik memeli dokularnda

saflatrlm ve karakterizasyon almalar yaplmtr.

nsan SDH enzimi homotetramer olup her bir alt birimi katalitik olarak aktiftir. Katalitik

blgede His69, Cys44, Glu70 ve bir su molekl ile koordine olan bir inko atomu

bulunmaktadr (Pauly et al. 2003). Aktif blgedeki bu inko atomunun fonksiyonu,

sorbitol ve fruktoz arasndaki dnml oksidasyon-redksiyon reaksiyonunun katalizi

sresince sorbitol hidroksilinin veya fruktoz karbonilinin oksijenini balamaktr (Jeffery

et al. 1984; Eklund et al. 1985; Karlsson et al. 1989, 1995). SDH enziminin

izoenzimlerinin varl bu gne kadar belirlenememitir. Enzimle ilgili kristalografik

aratrmalar devam etmektedir. inko atomu koordinasyonun geometrisi, substrat

balanmas iin iki serbest koordinasyon ile birlikte ligantlar arasnda 90o/180

o lik

ann olduu oktahedral bir yapdr (Johansson et al. 2001). Enzimin drt alt

biriminden herbiri 355 rezidden oluur (Jeffery et al. 1984; Karlsson et al. 1989).

19

ekil 1.2. SDH enziminin aktif blgesindeki inko iyonunun koordinasyonu (Johansson

et al. 2001)

ekil 1.3. SDH enziminin kuarterner yaps (Johansson et al. 2001)

Sorbitol dehidrogenaz enziminin her bir alt birimi iki farkl blgeye sahiptir. Bu

blgelerden biri NAD+nn baland koenzim balama blgesi, dieri ise Zn iyonunun

bulunduu katalitik blgedir (Johansson et al. 2001).

20

ekil 1.4. SDH enziminin bir alt biriminin yaps *(A: koenzim balama blgesi, B: katalitik blge) (Johansson et al.2001)

Sorbitol dehidrogenaz memeli dokularnn ousunda bulunmakla beraber (Jeffery and

Jrnvall 1984) zellikle karacier ve testis dokularnda bol miktarda bulunmaktadr.

Karacier hasar ve diyabetik komplikasyonlarn tespitinde nemlilik arz etmektedir

(Asada and Galambos 1963; Hodgen and Sherins 1973).

Hepatosit sitoplazmasnda bulunan sorbitol dehidrogenaz enzimi karacier iin ksmen

spesifiktir (Anderson 1992; Turgut 1997). Normal durumda serumda bulunmayan

sorbitol dehidrogenaz enzimi karacier harabiyeti halinde seruma geerek yksek

aktivite gstermektedir. Bu nedenle serum SDH enzim aktivitesinde meydana gelen

deiiklikler, karacier hastalklarnn klinik tehisinde faydal olmaktadr (Dixon et al.

1987).

Sorbitol dehidrogenaz enzimi kan glukoz seviyesinin artmas durumunda aktivite

gsterip kalp bbrek ve gz hastalklarnn geliiminde nemli rol oynayan sorbitol

(poliol) yolunun iki enziminden biridir. Bu balamda SDH enziminin diyabetteki roln

aklamak iin birok aratrma yaplmaktadr (Obrosova et al. 1999; Nishikawa et al.

2000; Amano et al. 2003; Chu-Moyer et al. 2002).

21

1.2. Diabetes Mellitus

Diabetes mellitus (DM) insulinin tamamen veya ksm eksikliine bal olarak gelien

ve yksek kan ekeri (hiperglisemi) ile karakterize bir hastalktr. nslin eksikliinin

yan sra insline kar gelien diren, diabetes mellitus geliiminde rol oynamakta ve

karbohidrat, lipit ve protein metabolizmasn da etkilemektedir (Abou-Seif et al. 2004;

Hasselbaink et al. 2003). ki eit diyabet hastal olup bunlar tip 1 (insline baml)

ve tip 2 (insline bal olmayan) diye adlandrlmaktadr.

Tip 1 diabetes mellitus (DM) ocukluk ya grubunda sk grlen, T-hcrelerinin

araclk ettii inslin retiminde grev alan pankreasn beta hcrelerinin sregelen

otoimmn veya otoimmn d nedenlerle harabiyeti sonucu gelien inslopeni ve

hiperglisemi ile karakterize kronik metabolik bir hastalktr (Alemzadeh et al. 2004;

Fiallo-Scharer et al. 2004). Duyarl bireylerde T ve B hcrelerinin araclk ettii immn

sistemin anormal aktivasyonu sonucu gelien bir inslitis tablosudur (Atkinson et al.

2001, Haller et al. 2005). Tip 1 diyabetin etiyolojisinde genetik, evresel ve otoimmn

faktrler rol oynar. Genetik yatknlk, virsler, fiziksel uyarclar ve stres gibi d

etkenler hastal tetikleyerek inslin salglayan pankreasn beta adack hcrelerine

otoimmn saldr balatmaktadr. Bu harabiyetin patolojik grnmne inslitis denir.

Tip 1 diyabetin, 5-10 yllk bir srecin sonucunda ortaya kt bilinmektedir (Haller et

al. 2005).

Eer inslin hormonu var, ama miktar azsa veya dokularda insline kar diren varsa,

bu diyabete de Tip 2 diyabet (insline baml olmayan diyabet) denir. Genellikle 35

yandan sonra grlr. Tip 1 diyabetli hastalar yaam boyu inslin kullanmak

zorundadrlar. Tip 2 DM diyabetli hastalar ise diyet, egzersiz ve azdan alnan ilalarla

tedavi edilebilir. Gerekirse hastaln ilerleyen dnemlerinde inslin kullanabilirler

(Anonim 2012b).

Dnyada yaklak 151 milyon diabetes mellitus (DM) hastas vardr. Bunlarn yaklak

%97si tip 2 DMdir (Amos et al. 2010).

22

Tip 2 DMli hastalarn tan konulmasndan ortalama sekiz yl nce diyabetik olduu

dnlmektedir (Haris et al. 1992). Tan aldktan ksa bir sre sonra ise birounda

mikroalbuminri ve aikr nefropati tespit edilir.

DMnin komplikasyonlar mikrovaskler ve makrovaskler komplikasyonlar olarak

ikiye ayrlr. Mikrovaskler komplikasyonlar; retinopati, nefropati ve nropatidir.

Makrovaskler komplikasyonlar ise koroner kalp hastal, periferik damar hastal ve

serebrovaskler hastalklardr (Kurt vd 2004).

Kontrol altna alnmam ve yksek seyreden kan ekeri uzun vadede eitli

komplikasyonlarn ortaya kmasna yol amaktadr. imanlk (obesite) ska tip 2 ile

birlikte olup kalp-damar hastalklar, bbrek yetmezlii ile sonulanan nefropati, sinir

sistemi hastal nropati, krle kadar gtren retinopati ve ayak lserleri gibi uzun

vade komplikasyonlar sonucu fel, kangren veya koroner hastalklarn meydana

gelmesi riskini arttrmaktadr (Sacks et al.1994).

Kan ekerinin yksek olmas baz metabolik yollarn aktivitesini artrarak ve bu

metabolik yollarn birbiriyle olan etkileimlerini deitirerek bu diyabetik

komplikasyonlara neden olmaktadr (UKPDS 1998; Temelkova-Kurktschiev et al.

2000).

Bu metabolik yollar; poliol yolu (Zimmet and Alberti 2001; Oates 2008), glukoz

oksidasyonu (Lipinski 2001; Ostenson 2001; Jakus and Rietbrock 2004), protein kinaz

C (PKC) aktivasyonu (Brownlee 2001), nonenzimatik glikasyon ve ileri glikasyon

rnleri (G) oluumudur (Chappey et al. 1997; Yamagishi and Takeuchi 2004).

Poliol yolu, glukozun sorbitole indirgendii ve sorbitolun da fruktoza dnt iki

adml metabolik bir yoldur. Bu metabolik yol aldoz redktaz ve sorbitol dehidrogenaz

enzimlerini iermektedir. Lens, retina, eritrosit, bbrek, plasenta, periferik sinirlerin

schwann hcreleri, vesica seminalis ve yumurtalk hcrelerinde bulunan aldoz redktaz,

glukozu redkleyerek sorbitol oluturur. Oluan sorbitol, karacier, yumurtalk, sperm,

23

vesica seminalis hcrelerinde bulunan sorbitol dehidrogenaz enzimi vastasyla fruktoza

oksitlenir. Vesica seminalislerde glukozun fruktoza dnmn salayan bu yol enerji

kayna olarak fruktozu tercih eden sperm hcreleri iindir. Karacierde ise sorbitol

fruktoza oksitleyen bu yol besinsel sorbitoln glikoliz veya glukoneogenez yollarna

girebilen bir maddeye (fruktoza) evrilmesini salar (Champe and Harvey 1997).

Poliol yolu diyabetik hiperglisemi de meydana gelen hcresel toksisiteyi aklayan en

nemli mekanizmadr. Kan ekeri artnda poliol yolu aktifleir ve hcrede sorbitol ve

fruktoz birikimi meydana gelir.

OH

OH

OH

O

HO

HO

OH

OH

OH

O

HO

HO

OH

OH

OH

O

HO

HO

OH

OH

OH

O

HO

HO

Glukoz

NADPH NADP+

AR

OH

OH

OH

HO

HO

OH

OH

OH

HO

HO

OH

OH

OH

HO

HO

OH

OH

OH

HO

HO

OH

Sorbitol

NAD+ NADH

SDH

OH

OH

HO

HO

OH

OH

HO

HO

OH

OH

HO

HO

OH

OH

HO

HO

O

OH

Fruktoz

ekil 1.5. Sorbitol (poliol) yolu (Alm ve Beydemir 2012)

Sorbitol yolu lens, beyin, sinirler, eritrosit, bbrek, karacier, pankreas adacklar, aorta

ve kapiller damarlarda etkindir. Bu dokular hcreye glukoz girii ynnden ortaktr. Bu

dokularda hcreye glukozun girii inslinden bamsz olduu iin hcre ii glukoz

oranlar dorudan doruya kan glukozunun artndan etkilenir. Kan glukoz oranlar

normal olduu srece AR enzimi aktif olamaz ancak hiperglisemi de hcre ii glukoz

oranlar artnda aldoz redktaz aktif olabilmekte ve poliol yolu ilerlik kazanmaktadr.

Sorbitol yolu etkinliinin fizyolojik neminin henz bilinmedii bu dokular, diyabetes

mellitusun uzun srede gelien retinopati, katarakt, nropati, nefropati ve ateroskleroz

gibi komplikasyonlarnn gelitii dokulardr (Yenign ve Altunta 2001).

AR eitli karbonil gruplar indirgeyen NAD(P)+

baml birenzim olup sorbitol

yolunun hz kstlayc enzimidir. Substratlarndan olan glukoza ilgisi az olduundan,

hcre ii glukoz seviyesi fizyolojik dzeylerde kald srece AR etkin olamamaktadr.

24

Hiperglisemi durumunda hcre ii glukoz miktar fizyolojik seviyelerin zerine knca

AR aktif hale gemektedir. Hiperglisemide AR enzim aktivitesi artarken SDH enzim

aktivitesi azalr. Bu durumda dokularda sorbitoln fruktoza dnm yavalar.

Sorbitol metabolik olarak kullanlmad ve difzyonu ok yava olduu iin hcre

membran dna kolayca kamaz dokularda birikir ve osmotik etki gstererek hcre

iine daha fazla miktarda suyun ekilmesine bylece hcre demine neden olur.

Sorbitoln kendisi bir doku toksini gibi hareket eder. Bu nedenle retinopati, nropati,

nefropati ve kalp hastalna yol amaktadr (Karasu vd 1990; Bukan vd 2004).

Hipergliseminin hcrelerde sebep olduu poliol birikimi her hcrede farkldr. En byk

etki sinir vazo nervorumlarnda ve bbrek bazal membranlarnda grlr (Yenign ve

Altunta 2001). Kan glukoz orannn artmas hcre seviyesindeki Na+-K

+ pompasnn

almasn ve Na+-K

+ ATPaz enziminin etkisini azaltr.

Diyabette hem periferik sinir hcresine giren hem de bu hcrede sentezlenen

miyoinositol miktarnda azalma olur. Miyoinositolun hcreye girii Na+a baml ve

glukoz ile yarmal olmas ve diyabette Na+-K

+ ATPaz aktivitesinde azalma ve kan

glukoz konsantrasyonunda artma olmasndan hcreye giren miyoinositol miktar azalr.

Bu azalma hcre iindeki inslin etki azl ile paraleldir. Azalan miyoinositol glukozun

sorbitole dnme srecini etkilemezken, sorbitolun fruktoza dnmesini yavalatr ve

hcre iinde sorbitol miktarn artna neden olur. Sorbitol gl su ekici zellii ile

su alarak hcre iinde ki su dejenerasyonuna sebep olur Nikotinamid Adenin

Dinkleotit (NADH) yolu sorbitolu, sorbitol dehidrogenaz enzimi ile fruktoza

dntrmeye alan bir mekanizma olmasna ramen, bu yol hipergliseminin sebep

olduu miyoinositol eksiklii nedeni ile yavalar ve endotel nron hcresinde sorbitol

birikimi devam eder (Yenign ve Altunta 2001). Ayrca miyoinositol eksikliinin

kendisi de Na+-K

+ ATPaz aktivitesinde azalmaya yol aar. Sinir Na

+-K

+ ATPazn

membran fosfoinositidleri; muhtemelen protein kinaz C araclyla kontrol edildii

dnlmektedir. Azalm sinir miyoinositol konsantrasyonlar anormal fosfoinositidler

ile sonulanr. Bu da azalm Na+-K

+ ATPaz aktivitesine yol aar, miyoinositol

transportu bu enzim zerinden olduundan, azalm miyoinositol geri alm zorlar ve

25

azalm Na+-K

+ ATPaz aktivitesi, artm intraaksonal Na

+ birikimine neden olur. Bu

durum sinir impuls yaylmn, sodyuma bal aminoasit geri alnmn ve dier

fenomenleri etkiler. Sodyumun paranodal blgede birikimi aksonal imeye neden olur.

Esas olarak miyelin lamel terminallerinin aksondan ayrlmasna ve daha ileri yapsal

deiikliklere yol aar (Yenign ve Altunta 2001).

Nefropati ile oluan bbrek yetmezlii diyabetin komplikasyonlar sonucunda ortaya

kan bir durumdur (Kimmelstiel and Wilson 1936). Diyabet skl ile art gsteren

nefropati diyabetik komplikasyonlar sonucu meydana gelen lmlerin onda birini

oluturur (Humphrey et al. 1989; Forsblom et al. 1998). Diyabetik nefropatinin

patogenezinde poliol yolu aktivasyonu nemli rol oynar.

Yaplan almalarda, miyokardiyumda oluan iskemi srasnda, poliol yolunun

miyokardiyal glukoz metabolizmasna etkileri incelenmi, kardiyak AR aktivitesinin

iskemi srasnda artt gsterilmitir (Ramasamy et al. 1999; Hwang et al. 2002). Buna

bal olarak miyokardiyumdaki NADH/NAD+

oran artmakta, glikoliz ve ATP retimi

de azalmaktadr. Bu durum iskemik hasarn sebebidir (Williamson et al. 1993).

Bilindii gibi iskemi, kann yeterli oranda organlara verilememesidir. Bu durum oksijen

yetmezliini ortaya karmaktadr. AR enzimin ininhibe edilmesi kalbi korumaktadr.

Bu enzim iskemik hasarda nemli rol oynamaktadr.

Sorbitol dehidrogenaz enziminin (SDH) aktiflemesi ile oluan NADH, NADH-oksidaz

(Nox) enziminin etkisi ile serbest oksijen radikalleri (ROS) oluturur (Tesfamariam

1994; Morre et al. 2000). ROS, gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz enzim (GAPDH)

inhibisyonuna neden olarak daha fazla glukozun poliol yoluna ynelmesine ve AR

aktivitesinin artmasna neden olmaktadr (Stevens et al. 2000). Aldoz redktaz enzim

aktivite gstermek iin NADPHye ihtiya duyduundan, hcre ii NADPH tketimi

artar. Glutatyon redktaz enzimi (GR), NADPH baml olarak, ykseltgenmi

glutatyonun (GSSG) indirgenmi glutatyona (GSH) redksiyonunu salayan enzimdir.

ARnin NADPH iin Km deeri, glutatyon redktaz enziminin NADPH iin Km

deerinden 10 kat daha dktr. Poliol yolanda artan AR aktivitesiyle NADPHnin

26

fazlaca tketilmesi, GSHnin retiminin azalmasna neden olur (Yeh and Ashton 1990).

Hcre ii majr antioksidan olan GSHnin azalmas hcrenin antioksidan kapasitesini

snrlar yani hcrenin oksitleyici etkenlere kar korunma gcn azaltr ve bu durum

oksidatif strese neden olur (Lee and Chung 1999; Maritim et al. 2003).

Hiperglisemi durumunda sorbitol yolu aktivitesinin artmas ile oluan hcre ii NADPH

tketimi, NO sentezini etkilemekle beraber GSH retimini de azaltr. Nitrik oksit sentaz

enzimi (NOS), NADPH kullanarak arjininden nitrik oksit oluumunu katalizlemektedir.

ARnin artmas ile beraber NADPH miktar azalr. Ve buna bal olarak endotelyal NO

sentezi azalr (Tesfamariam 1994). Nihayetinde oksidatif stresin artmas ile NO

azalmas ateroskleroza sebebiyet verir (Kurowska 2002).

Poliol yolunun en nemli enzimi olan ve bu yolun aktivitesini snrlayan aldoz redktaz

enzimi glukozu sorbitole dntrrken, dier bir enzim olan sorbitol dehidrogenaz,

sorbitol fruktoza evirir. Sorbitol hcre zarn geemediinden hcre iinde birikir.

Sorbitol birikimi, ozmotik etkilerle piridin nkleotidlerinin redoks durumunu

deitirerek (NADH/NAD+ orannda ve protein kinaz Cde art) hcre ii miyoinositol

seviyelerini azaltr. Bu durum doku hasarna neden olur. Glukoz, proteinlerin amino

gruplarna nonenzimatik olarak balanarak schiff-base rnleri oluturur. Schiff-

base rnlerinden sonra daha stabil olan amadori rnleri oluur (Diner vd 2002).

Saatler ierisinde bu rnler kan glukoz konsantrasyonuna uygun olarak belirgin bir

seviyeye ular. Sonrasnda daha stabil erken glikasyon rnleri (EG) oluur.

Hiperglisemiye uzun sreli maruz kalma kollajen, intraseller proteinler ve nkleik

asitler gibi stabil makromolekllerde kmltif ve giderek artan tarzda geri dnmsz

deiiklere neden olur. Erken glikasyon rnleri (EG) ileri glikasyon rnleri

(G)ni oluturmak zere birleirler (Kurt vd 2004).

27

Glukoz +Protein Schiff-base Amadori rnleri

Erken glikasyon rnleri(EG)

leri glikasyon rnleri(G)

ekil 1.6. leri glikasyon rnleri (G) oluumu

Hiperglisemi durumunda poliol yolunun aktive olmas sonucu, sorbitoln fruktoza

oksidasyonu ile sitozolik NADH/NAD+ oran ykselmektedir. NADH bu art

glisealdehit-3-fosfat-dehidrogenaz (GAPDH) enzimini inhibe eder ve trioz-fosfat

konsantrasyonunu artrr (Baynes and Thorpe 1999; Dunlop 2000; Garcia et al. 2001).

Hcre ii konsantrasyonu artan gliseraldehit-3-fosfat, trioz-fosfat izomeraz enzimi ile

dihidroksiaseton-fosfata (DHAP) dnr. DHAPn gliserol-3-fosfata redksiyonu

NADH bamldr. NADH/NAD+artmas, DHAPnin indirgenmesi ile protein kinaz C

(PKC)nin aktivatr olan diailgliserol (DAG) oluumuna neden olur ve bu da poliol

yolunun aktivatr olan PKC yolunun aktivitesinin artmasna neden olur (Williamson et

al. 1993; Garcia et al. 2001). PKC aktivasyonu diyabetin sebebiyet verdii

komplikasyonlarn ortaya karr (Xia et al. 1994).

Diyabetik sorbitol birikimi erken dnemde aldoz redktaz inhibitrleri kullanlarak

nlenilebilir. Hiperglisemiye engel olacak glukoz reglasyonu salanamazsa olay geri

dnmsz olduundan nropati, retinopati, nefropati gelimesi nlenemez (Yenign

ve Altunta 2001).

Aldoz redktaz NADPH kullandndan, sorbitol yolunun etkinlemesi ile hcrenin

NADPH tketimi artar. Hcrenin oksitleyici etkenlere kar korunmasnda grevi olan

indirgenmi glutatyonun oluumunu salayan glutatyon redktaz da NADPHyi

kullandndan, hiperglisemide mevcut NADPHnin aldoz redktaz ile glutatyon

redktaz rekabet ederler. Dolaysyla, hiperglisemide etkinlii artan sorbitol yolunun

28

artan NADPH tketimi, hcrenin oksitleyici etkenlere kar korunma gcn azaltr.

Diyabetin kronik komplikasyonlarnn patogenezinde sorbitol yolunun nemini bu yolla

aklayan aratrmaclar, hcrede sorbitol birikiminin deil, NADPH tketimine neden

olan sorbitol oluumunun nemli olduunu savunmaktadrlar (Yenign ve Altunta

2001). Dolays ile AR nin inhibe olmas sorbitol birikimini engelleyeceinden

diyabetik komplikasyonlarn ortaya kmas bu yolla engellenebilir.

zetle, hiperglisemi sonucu oluan sorbitol birikimi:

ntraaksonal proteinlerin transport ve sentez hznda azalmaya

Sinir Na+-K+ ATPaz aktivitesinde azalmaya

Serbest oksijen radikal oluumunun artna

Glikolipitlerin ve aminoasitlerin miyelin oluturma hznda azalmaya

Anormal inositol lipid metabolizmasna

Ar glikojen birikimine ve periferik sinir glikolizasyonunun artmasna neden olur.

1.3. Deneysel almada Kullanlan lalarn Etken Maddeleri

Koyun beyni sorbitol dehidrogenaz enzimi zerinde alma yaplrken kullanlan

ilalarn etken maddelerinin baz zellikleri;

Ampisilin: Penisilin grubu bir antibiyotiktir. Ampisilin vcut ierisindeki bakterilerle

savar. (D(-)-(-aminino benzilpenisilin) etkin bir semi-sentik penisilin trevidir. Gram

pozitif ve gram negatif bakterilere kar geni bir etki spektrumu vardr. Bakteri hcre

duvarnn mukopeptid biyosentezini inhibe ederek etkir. Penisilazlar tarafndan

ykldnda penisilaz reten bakterilere kar etkisi yoktur. Bakterilerin ampisiline

duyarll yledir:

Duyarl bakteriler: Beta hemolitik Streptococus sp'leri de ieren ou gram pozitif

bakteriler, baz anaeroblar, baz gram negatif aeroblardr. Ampisilin Oral zelti Tozu

29

rumitasyona balamam buza, kuzu ile olaklarda, eti tavuklarda ve taylarda

ampisiline duyarl bakteriler tarafndan meydana getirilen sindirim, solunum sistemi,

rogenital sistemi enfeksiyonlarnda, septisemlerde, yumuak doku enfeksiyonlarnda,

viral enfeksiyonlarla seyreden ve bakteriler tarafndan meydana getirilen sekonder

enfeksiyonlarn tedavisinde kullanlr (Kandur 2007).

ekil 1.7. Ampisilin etken maddesinin yapsal forml

Tylosin: Makrolid grubu bir antibakteriyeldir. Strep. fradie kltrlerinden elde edilen

bakteriyostatik etkili bir antibakteriyeldir. Tylosin kas ii uygulama sonras hzla emilir.

Uygulama yerinden emilen tylosin tm vcuda dalr, ste nemli miktarlarda geer.

Tylosin hcre iindeki 50S ribozomal alt birimlere balanp, peptitlerin

translokasyonunu ve protein sentezini engelleyerek duyarl mikroorganizmalara kar

bakterisidal ve mikroplazmisidal etki gsterir. Tylosine balca gram pozitif bakteriler

duyarldr.

Tylosine duyarl bakterilerden kaynaklanan sr, koyun ve keilerde zatrre, metritis,

piyoderma, erken dnemdeki mastitis ve agalaksia, pododermatitits, difteri, dizanteri,

arthritis, enteritis, kei cier ars bata olmak zere, solunum sistemi, sindirim sistemi

ve yumuak doku enfeksiyonlarnn; hindilerde CRD bata olmak zere solunum,

sindirim sistemi ve yumuak doku enfeksiyonlarnn tedavisinde kullanlr (Kandur

2007).

ekil 1.8. Tylosin etken maddesinin yapsal forml

30

Sefaleksin: Sefalosporinlerin ana ekirdei sefem trevi olan 7-

aminosefolosporanikasit (7-ASA) oluturur. Sefaleksin penisilinler gibi bakteri hcre

duvarnn peptidoglikan takasnn sentezinin son basaman (transpeptidaz

reaksiyonunu) inhibe etmek ve otolitik enzimleri aktive etmek suretiyle bakterisid etki

oluturur.

Sefaleksin bata gram pozitif olmak zere hem gram pozitif hem de negatif bakterilere

kar etkilidir. Sefaleksin kas ii uygulamay takiben tm vucuda dalr. Kas ii

uygulamay takiben 30 dakika iinde doruk plazma seviyesine ular. Atlm byk

oranda glomeruler filtrasyon ile bbrekler araclyla olmaktadr.

Sefaleksin etken maddesi sefaleksine duyarl bakterilerin yol at enfeksiyonlarn

tedavisinde kullanlr. Duyarl bakterilerden kaynaklanan solunum sistemi ve riner

sistem enfeksiyonlarnn tedavisinde akut mastitis septisemi deri ve yumuak doku

enfeksiyonlarn ayak r kemik ve eklem hastalklarnn tedavisinde kullanlr

(Kandur 2007).

ekil 1.9. Sefaleksin etken maddesinin yapsal forml

Oksitetrasiklin dihidrat: Oksitetrasiklin dihidrat etken maddesi bir antibakteriyeldir.

Oksitetrasiklinler bakterilerin 30 S ribozomlarna balanarak onlarn protein sentezini

duruduraran bakteriyostatik etkili antibakteriyellerdir. Gram pozitif aerob bakteriler,

gram negatif bakteriler, gram negatif anaerob bakterilere kar iyi derece etkilidirler.

la uygulama sonras kandaki tedavi edici oksitetrasiklin konsantrasyonu en az 4 gn

srer. Oksitetrasiklin hedef hayvanlarda enfeksiyona yol aan bakteriler iin MIC

deerleri 0,062-2,0 g/ml arasndadr. Oksitetrasiklinler tm vcutta ok iyi bir dalm

gsterir. Akcier, uterus ve ayak dokusunda yerleen duyarl mikroorganizmalara

etkilidir (Kandur 2007).

31

Oksitetrasiklinler ya deimemi olarak ya da mikrobiyolojik olarak inaktif formda

idrar ve dk ile atlrlar. Sr ve koyunlarda oksitetrasikline duyarl

mikroorganizmalarca oluturulan solunum, sindirim, rogenital sistem

enfeksiyonlarnda, septisemilerde, viral enfeksiyonlarla ile beraber seyreden ve duyarl

bakteriler tarafndan meydana getirilen sekonder enfeksiyonlarn tedavisinde endikedir.

Bu kapsamda sr, koyun ve keilerde balca zatrre, ayak r, septisemi,

enterisitislerde ayrca mastitis ve metritislerde lokal tedaviye destek olarak kullanlr

(Kandur 2007).

ekil 1.10. Oksitetrasiklin dihidrat etken maddesinin yapsal forml

Enrofloksasin: Yksek bakterisit etkiye sahiptir. ok geni bir endikasyon alan

bulunup, gram negatif, gram pozitif bakteriler ve mikoplazmalar etkiler. Enrofloksasin

bakteri DNAsnn remesinde nemli bir role sahip DNA- giraz enzimini

(topoizomeraz II) inhibe ederek bakterinin lmne yol aar. lacn parenteral yola

verilmesini takiben uyguland yerden hzla emilip, ortalama 1 saat ierisinde en

yksek plazma seviyesine eriir. Akcierlerde ila konsantrasyonu plazma deerinin 4

katna kadar kar. Bakterisit etkili plazma ve doku younluu 24 saat srer.

Enrofloksasin immun sistem zerine bask yapmad iin tedavi srasnda hayvann

direncinde krlma olmaz. Enrofloksasinin biyolojik yar mr 2 ila 6 saat arasndadr.

Enrofloksasin deiime uramadan byk oranda bbreklerden idrar yoluyla ve az bir

ksm da safra/gaita yoluyla atlr. drarda esas olarak deimemi halde, az miktarda da

metabolitleri, siprofloksasin ve glukuronid halinde, safra da ise metabolize olmam

halde bulunur.

Sr ve koyunlarda gram negatif, gram pozitif bakterilerle Mycoplasmalarn

oluturduu hastalklarn tedavisinde kullanlr (Kandur 2007).

32

ekil 1.11. Enrofloksasin etken maddesinin yapsal forml

Gentamisin slfat: Bir aktinomiset olan Micromonospora purpureadan elde edilen,

duyarl bakterilerin normal protein sentezini inhibe ederek etkisini gsteren bakterisid

etkili bir aminoglikozit antibiyotiidir. Gentamisin slfat E.coli, indol pozitif ve negatif

Proteus trleri, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella-Enterobacter-Serratia grubu

trleri, Citrobacter trleri ve penisilin ve metisiline direnli Staphylococcus trleri de

dhil geni etki spektrumuna sahiptir. Ayrca Shigella ve Salmonella trlerine kar da

in vitro olarak etkilidir.

Gentamisin slfat dier aminoglikozit antibiyotiklere direnli bakterilere kar da etkili

olabilmektedir. Gentamisin slfata kar bakteriyel diren genellikle g gelimektedir.

Gentamisin slfat hcre duvar sentezini etkileyen antibiyotikler ile kombine

kullanld zaman D grubu streptokok sular zerinde sinerjik bir etki gstermektedir.

Bundan dolay penisilin G ile kombine edildiinde Streptococcus faecalis, S.faecium ve

S. durans sular zerinde sinerjik bakterisid bir etki gsterir. Ayrca ampisilin veya

karbenisilin ile kombine edildii zaman da bakterisid etkisi artar. Pseudomonas

aeruginosann birok suuna kar gentamisin ve karbenisilin kombinasyonu etkilidir.

Sefalosporinlerle kombine edildiinde de birok gram negatif mikroorganizmaya kar

sinerjik etki gsterir.

Sz edilen duyarl bakterilerin neden olduu ar enfeksiyonlarda, dier antibiyotiklere

direnli ve zellikle gram negatif bakterilerin neden olduu septisemi, bakteriyemi;

idrar yollar enfeksiyonlar; alt ve st solunum yolu enfeksiyonlar; deri, kemik ve

yumuak doku enfeksiyonlar; enfekte yank; gastrointestinal sistem enfeksiyonlar;

menenjit; kulak enfeksiyonlar; yeni domularn sepsislerinde ve Pseudomonas

33

aeruginosann oluturduu hayat tehdit eden enfeksiyonlarda karbenisilin ile birlikte

kullanlr (Kandur 2007).

ekil 1.12. Gentamisin slfat etken maddesinin yapsal forml

Kanamisin: Streptomyces kanamyceticusdan retilen aminoglikozit grubu bir

antibiyotiktir. Kanamisin, protein sentezini inhibe etmek suretiyle bakterisid etki

gsterir. Ortamn pH'sndan ok az etkilenir ve plazma proteinlerine balanmaz.

Kanamisin balca gram negatif ve aside dayankl bakteriler zerinde birincil derecede

etkilidir. Kanamisin, penisilin ve tetrasiklin grubu antibiyotiklerin etkisini

glendirmektedir. Bu nedenle bu gibi ilalarla kombine kullanlmas mmkndr.

Sr, at, koyun, kpek, kedilerde duyarl bakterilerin neden olduu solunum sistemi,

riner sistem enfeksiyonlar, yumuak doku ve deri enfeksiyonlar ile duyarl

bakterilerin kart sekonder enfeksiyonlarn tedavisinde, septisemilerde kullanlr

(Kandur 2007).

ekil 1.13. Kanamisin etken maddesinin yapsal forml

34

2. KAYNAK ZETLER

Sorbitol dehidrogenaz (SDH) memeli dokularnn ousunda bulunur. Her bir alt birimi

38 kDa olan homotetramerik bir inko enzimidir (Iwata and Carper 1995). Aktif

blgedeki bu inko enziminin fonksiyonu, dnml reaksiyon sresince sorbitol

hidroksilini veya fruktoz karbonilini balamaktr (Jrnvall et al. 1984; Eklund et al.

1985).

Sorbitol dehidrogenaz, koyun (Smith M.G. 1962) ve insan dokular gibi pek ok

dokulardan saflatrlmtr (OBrien et al. 1982; Maret and Auld 1988; Baretto and

Bcutler 1975; Jedziniak et al. 1981).

Sorbitol, gda tatlandrcs olarak kullanlan ve glukoz redksiyonu sonucu retilen bir

alkol ekeridir. Glukoz metabolizmasnda sorbitol (poliol) yolu nemlilik arzetmektedir

ancak oksidatif stresi arttrd ve diyabet patogenezinde nemli rol oynad

dnlmektedir (Chung et al. 2003; Jay et al. 2006).

Sorbitol yolu iin iki enzim gereklidir. Bu enzimler sorbitol dehidrogenaz ve aldoz

redktazdr. Aldoz redktaz glukoz ve galaktozun sorbitole dnmn katalizlerken,

sorbitol dehidrogenaz sorbitolun fruktoza dnmn salar. Glukoz normal

miktarlarda iken aldoz redktaz enzimi aktif deildir. Hiperglisemi hallerinde ise aldoz

redktaz enzimi uyarlr; glukoz, aldoz redktaz enzimi yoluyla sorbitole dnr

sorbitol de sorbitol dehidrogenaz enzimi vastasyla fruktoza dntrlr. Oluan

fruktoz enerji kayna olarak kullanlr. Hiperglisemi gibi normal olmayan artlarda,

total glukozun neredeyse te biri poliol yolunda metabolize edilir (Chung et al. 2003;

Gonzalez et al. 1984; Jay et al. 2006) ve retim fazlas olan sorbitol ve fruktoz gibi

poliol rnleri ortaya kar (Balendiran and Rajkumar 2005).

Sperm hcreleri zerine yaplan bir almada; sperm hcrelerinin seminal kesede,

enerji kayna olarak sorbitol yolunda, glukozun fruktoza dntrdn

35

kantlanmtr (Hers 1956; Kador et al. 1986; Bhatnagar and Srivastava 1992). Fare

testisinde yksek miktarda AR mRNAs tespit edilmi olup, fazla miktarda AR

enziminin testis metabolizmasnda nemli rol olduu dnlmektedir (Gui et al.

1995). Poliol yolann varl daha sonra diyabetik san lensinde de gsterilmitir

(Van Heyningen 1959).

Bir almada diyabetik komplikasyonlarn patogenezinde nemli rol oynayan SDHnin

poliol yolu iin nemini aratrmak amac ile diyabetik olan ve diyabetik olmayan

sanlar zerine aratrmalar yaplmtr Hem enzim ierii hem de enzim aktivitesi

bbrek ve karacierde ok olmasna ramen testiste enzim ieriinin fazla olmasna

karn, aktivitesinin olmad saptanmtr. SDH diyabetik karacier proteininde bol

miktarda hem glikolize hem de nonglikolize formlar bulunmutur. Dahas,

saflatrlm enzimin glukoz ya da fruktozla inkbasyonu sonrasnda aktivitesinin

belirgin bir ekilde dtn gzlemlenmitir bu sonular glikasyonun diyabetik

koullar altnda karacier SDH aktivitesinin azalmasna neden olduunu gstermektedir

(Hoshi et al. 1996).

Baka bir almada shcwan hcrelerindeki poliol aktivitesini aratrmak iin

hiperglisemik ve hiperglisemik olmayan artlarda kltrl hcrelerde aldoz redktaz

(AR) ve sorbitol dehidrogenaz (SDH) mRNA miktarlar yarmal RT-PCR tekniini

kullanlarak alma yaplmtr. Schwan hcrelerindeki AR ve SDH mRNAsnn

yksek (30 mM) glukoz ieriine karn deimediini belirlemilerdir. RT-PCR

sistemi teknii ile belirlenen AR mRNAs AR aktivitesi ile ilikili olduu kadar kltr

Schwan hcrelerindeki hiperglisemik artlarda biriken sorbitol miktar ile ilikili olduu

belirlenmitir, bu almada gelitirilen RT-PCR sisteminin diyabetik

komplikasyonlarn gzlendii organlarda, sorbitol yolunun aktivitesinin artmasyla

meydana gelen metabolik bozukluklarda aldoz redktaz ve sorbitol dehidrogenaz

enzimlerinin roln belirlemede faydal olabileceini belirlenmitir (Maekawa et al.

2001).

36

Tilton ve arkadalarnn yapt almada, inhibe olan SDH enziminin sorbitol

birikimini artrmasna karn yan etkileri olmadan bozulmu sinir iletimi ve sinirlerde,

aortta, gzle ilgili dokulardaki vaskler fonksiyon bozukluklarn ieren

komplikasyonlar azaltt gzlemlenmitir. Bu sonu, bu dokulardaki patogenezlerin

glukozun sorbitole indirgenmesinden ziyade SDH tarafndan katalizlenen sorbitoln

fruktoza dnmesi ile daha yakndan ilikili olduunu gstermitir. Bu nedenle yksek

NADH/NAD+ oran eitli diyabetik dokulardaki patogenezlerin en nemli belirleyicisi

olarak grlr (Tilton et al. 1995).

Schwan hcreleri zerine yaplan bir almada osmotik stres boyunca sorbitol

birikimini gzlemlemek iin, sorbitol dehidrogenaz inhibitrleri varlnda ve

izoosmotik artlar altnda almlardr. Sorbitol dehidrogenaz inhibisyonunun

hiperglisemik artlar altnda sorbitol birikimini artrdn, izoosmotik artlarda ise

sorbitol birikiminin +4C scaklkta veya ortamda guainidin varlnda meydana

geldiini grmlerdir. Sorbitol birikiminin izoosmotik artlarn salanmas ve SDH'nin

aktif olabilmesi ile nlenebilecei sonucuna ulamlardr (Mizisin et al. 1997).

Sr beyni SDH enzimi zerinde yaplan almalarda spesifik bir aldoz redktaz enzim

inhibitr olduu dnlen (Kador et al. 1985) quercetinin sr beyni SDH enzimini

nemli lde inhibe ettii (Wiesinger and Hamprecht 1989) ve benzer inhibisyonun

insan beyni SDH enziminde de gzlendii belirtilmitir (OBrien et al. 1983). Bu

almalar sonucunda aratrmaclar, AR inhibitrlerinin in vivo artlarda ilk olarak

SDH enzimi zerinde denenmesinin iyi sonular dourabileceini belirtmilerdir

(Wiesinger and Hamprecht 1989).

n vivo artlarnda aktif olan sadece bir snf (piperazin pirimidinler) sorbitol

dehidrogenaz enzim inhibitrleri varlna ulalmtr (Geisen et al. 1992). Bunun

dnda ditiyotreitol ve dier metal elatlayc tiyollar ieren ikinci bir snfn, SDH

enziminin katalitik inko iyonuyla etkileerek in vitro artlar altnda gl inhibitr

etkisi gsterdii belirlenmitir (Lindstad and McKinley-McKee 1996).

37

Geisen ve arkadalar yaptklar bir alma sonucunda 2-hidroksimetil- 4- 4(4-N,N,

dimetilaminslfonil-1- piperazin) pirimidin'in SDHnin ilk inhibitr olduunu

kantlamlardr (Geisen et al. 1994) .

N

N

N

N

SO2NMe2

HO

ek