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Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und des Zentrums für
systemische Neurowissenschaften Hannover
Charakterisierung eines Rattenmodells für pharmakoresistente Epilepsie
These zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Biologie (Dr. rer. nat.)
im Fach Pharmakologie
durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Kerstin Bethmann
aus Hannover
Hannover 2007
Supervisor: Univ. Prof. Dr. W. Löscher
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. W. Löscher Univ. Prof. Dr. Dr. h.c. H. Nau Prof. Dr. M. Stangel 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher (Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. H. Nau (Institut für Lebensmitteltoxikologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)
3. Gutachter: Prof. Dr. M. Stangel (Klinik für Neurologie, Medizinische Hochschule Hannover)
4. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Möhler (Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität und Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich)
Datum der mündlichen Prüfung: 02.11.2007
Einige Daten der vorliegenden These sind in folgenden Publikationen veröffentlicht:
1) The multidrug transporter hypothesis of drug resistance: Proof-of-principle in a rat model of temporal lobe epilepsy; Claudia Brandt, Kerstin Bethmann, Alexandra Gastens, Wolfgang Löscher; Neurobiology of Disease 24 (2006), 202 – 211
2) Resistance to Phenobarbital extends to phenytoin in a rat model of temporal lobe epilepsy; Kerstin Bethmann, Claudia Brandt, Wolfgang Löscher; Epilepsia 48 (4) (2007), 816-826
gefördert durch ein Stipendium der National Institutes of Health (Bethesda, USA)
Meinen Eltern, meiner Großmutter und meinem Bruder
1 Einleitung ............................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht.................................................................................................. 3 2.1 Epilepsien ............................................................................................................. 3
2.1.1 Temporallappenepilepsie........................................................................ 4
2.2 Epilepsiemodelle .................................................................................................. 5
2.3 Definition der Pharmakoresistenz bei Epilepsie.................................................... 8
2.4 Mögliche Ursachen der Pharmakoresistenz ....................................................... 10
2.4.1 Genetische Ursachen ........................................................................... 10
2.4.2 Veränderungen der Zielstruktur von Antiepileptika (Targetstruktur-
Hypothese) .................................................................................................... 11
2.4.3 Multidrug-Transporter………………………………………………………..12
2.4.4 Blut-Hirnschranke…………………………………………………………….20
2.4.5 Inhibitoren von Multidrug-Transportern [Tariquidar (XR 9576)]…….......21
2.5 Pharmakoresistenz im Tiermodell……………………………………………………22
2.5.1 Modellübersicht: Tiermodelle für pharmakoresistente Epilepsie……. …22
2.5.2 Elektrisches Post-Status epilepticus-Modell………………………………24
2.6 Antiepileptika………………………………………………………………………. ….25
2.6.1 Phenobarbital…………………………………………………………………26
2.6.2 Phenytoin……………………………………………………………………..26
2.7 GABAA-Rezeptoren bei Epilepsie…………………………………………………….27
3 Zusammenfassung und Zielsetzung………………………………………………...30
4 Material und Methoden…………………………………………………………….......33 4.1 Elektrische Epilepsiemodelle………………………………………………………….33
4.1.1 Versuchstiere…………………………………………………………………33
4.1.2 Elektrodenimplantation………………………………………………………33
4.1.3 Beurteilung der Krampfschwere während des sich selbst erhaltenden
Status epilepticus und während spontan wiederkehrender Anfälle…………...35
4.1.4 Modell der elektrischen Stimulation der basolateralen Amygdala……...37
4.2 Überwachung…………………………………………………………………………...38
4.2.1 Überwachung von spontanen Anfällen im elektrischen Epilepsie-
modell………………………………………………………………………………..38
4.2.1.1 Kontinuierliche Überwachung mittels EEG-Ableitung …………………38
4.2.1.2 Kontinuierliche Überwachung mittels Videoaufzeichnung…………….39
4.3 Pharmakologische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell…………40
4.3.1 Phenobarbital-Applikation für chronische Untersuchungen im Post-
Status epilepticus-Modell…………………………………………………………..42
4.3.2 Phenytoin-Applikation für chronische Untersuchungen im Post-Status
epilepticus-Modell…………………………………………………………………..42
4.3.3 Selektion von Respondern und Nonrespondern………………………….45
4.3.4 Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar (XR 9576) bei
Phenobarbital-Nonrespondern…………………………………………………….45
4.3.5 Blutentnahme…………………………………………………………………46
4.4 Histologie………………………………………………………………………………..46
4.4.1 Fixierung………………………………………………………………………46
4.4.2 Gefrierschnitte………………………………………………………………..47
4.4.3 Immunperoxidasefärbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten………...47
4.4.3.1 Antikörper…………………………………………………………………...47
4.4.3.2 Farbreaktion (DAB-ABC-Methode)……………………………………... 48
4.4.4 Standardprotokoll für die Färbung von GABAA-Rezeptoruntereinhei-
ten…………………………………………………………………………………….48
4.5 Auswertung……………………………………………………………………………..50
4.5.1 Optische Dichtemessung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten…………50
4.6 Statistik………………………………………………………………………………….51
4.7 Geräte- und Chemikalienlisten………………………………………………………..53
4.7.1 Geräte für die EEG- und Videoüberwachung……………………………..53
4.7.2 Chemikalienliste……………………………………………………………...55
5 Ergebnisse……………………………………………………………………………….57 5.1 elektrisches Post-Status epilepticus-Modell…………………………………………57
5.1.1 Status epilepticus während Dauerstimulation der basolateralen
Amygdala…………………………………………………………………………….57
5.1.2 Spontane Anfälle nach Status epilepticus…………………………………57
5.1.3 EEG-Muster der spontan wiederkehrenden Anfälle……………………...57
5.2 Pharmakologische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell…………59
5.2.1 Selektion von Respondern und Nonrespondern unter Phenobarbital….59
5.2.2 Selektion von Respondern und Nonrespondern unter Phenytoin………68
5.2.3 Gesamtergebnis Selektionsstudie………………………………………….77
5.2.4 Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar (XR 9576) bei
Phenobarbital-Nonrespondern im chronischen Post-Status epilepticus-Modell
………………………………………………………………………………………..78
5.2.5 GABAA-Rezeptoruntereinheiten……………………………………………85
6 Diskussion………………………….…………………………………………………..105 6.1 Selektion ……………………………………………………………………....105
6.2 Kombinationstherapie………………………………………………………..111
6.3 GABAA-Rezeptoruntereinheiten…………………………………………….122
7 Schlussfolgerungen und Ausblick…………………………………………………145
8 Zusammenfassung……………………………………………………………………147 9 Summary………………………………………………………………………………..150 10 Literaturverzeichnis…………………………………………………………………153
Abkürzungen ABC ATP-binding cassette proteins
BCRP Breast cancer related protein
Da Dalton
DAB 3,3´ Diaminobenzidin
DG Gyrus dentatus
DG GC Körnerzellen des Gyrus dentatus (granule cells)
EEG Elektroenzephalogramm
GABA γ-Aminobuttersäure
Hz Hertz
i.m. intramuskulär
i.p. intraperitoneal
kg Kilogramm
M Molar
μ Mikro- (gramm, - liter, -meter, etc.)
m Milli- (gramm, -meter, -liter, - ampere etc.)
MEZ Mitteleuropäische Zeit
Min. Minute
MRP Multidrug-Resistenz-assoziiertes Protein
PBS phosphatgepufferte Saline
P-gp Permeabilitäts-Glykoprotein
RNA Ribo-Nukleinsäure
S; Sek. Sekunde
SE Status epilepticus
SEM Mittelwertsfehler (standard error of the mean)
SSSE sich selbst-erhaltender Status epilepticus (self-sustained status
epilepticus)
Std. Stunde
Str. Stratum
Einleitung
1
1 Einleitung
Ein schwerwiegendes Gesundheitsproblem bei der Epilepsietherapie stellt die
Pharmakoresistenz gegenüber gängigen Antiepileptika dar, welche mit einer
erhöhten Morbidität und Mortalität einhergeht und nicht zuletzt auch mit einer
ökonomischen Belastung verbunden ist (REGESTA und TANGANELLI, 1999). Bei
der häufigsten Epilepsieform, der Temporallappenepilepsie werden zirka dreiviertel
der Patienten als pharmakoresistent angesehen (LEPPIK, 1992). Die Einführung
diverser neuer Antiepileptika hat das Problem der Therapie von refraktären oder
schwer zu behandelnden Anfällen nicht lösen können (REGESTA und TANGANELLI,
1999; LÖSCHER, 2002a): Eine chirurgische Resektion des epileptischen Gewebes
ist nur dann möglich, wenn der Fokus des Epilepsiegeschehens eindeutig
identifizierbar ist (FOLDVARY et al., 2001).
Ziel der vorliegenden Arbeit sollte es daher sein, ein bestehendes Tiermodell für
refraktäre Epilepsie, welches die Selektion von pharmakoresistenten und
pharmakosensitiven Tieren ermöglicht, dahingehend weiterzuentwickeln, dass der
klinischen Definition von Pharmakoresistenz entsprochen werden kann. Das
bedeutet, dass zwei Antiepileptika in ihrer maximal tolerierbaren Dosis über einen
angemessenen Zeitraum verabreicht werden, ohne zu einer Anfallsreduktion um
mindestens 50 % beizutragen (REGESTA und TANGANELLI, 1999). Da es sich bei
Pharmakoresistenz allem Anschein nach um einen multifaktoriellen Prozess handelt
(REGESTA und TANGANELLI, 1999; LÖSCHER und POTSCHKA, 2002; KWAN und
BRODIE, 2002), sollen zusätzlich gängige Theorien über die zugrunde liegenden
Mechanismen überprüft werden. Aus der Krebsforschung ist seit mittlerweile 30
Jahren bekannt, dass Pharmakoresistenz durch die Überexpression von Multidrug-
Transportern wie dem P-Glykoprotein vermittelt werden kann (JULIANO und LING,
1976). Inzwischen existieren Hinweise, dass eine Hochregulierung einiger dieser
Multidrug-Transporter in der Blut-Hirnschranke zu einer verminderten Konzentration
des Antiepileptikums im epileptischen Fokus führt und somit auch zur
Pharmakoresistenz beim Epilepsiegeschehen beitragen kann (LÖSCHER und
POTSCHKA, 2002). Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Studie eine
Kombinationstherapie eines etablierten Antiepileptikums mit einem hochselektiven P-
Einleitung
2
gp-Inhibitor durchgeführt, um die Hypothese zu testen, ob die Pharmakoresistenz
dadurch behoben werden kann.
Des weiteren wurde mittels einer immunhistochemischen Färbemethode und
spezifischen Antikörpern untersucht, ob bei epileptischen Ratten, speziell bei
pharmakoresistenten Tieren, die Zusammensetzung von GABAA-
Rezeptoruntereinheiten modifiziert ist. Es ist bekannt, dass chronische
Veränderungen der postsynaptischen GABAA-Rezeptorfunktion bei
Temporallappenepilepsie auftreten und deshalb als mutmaßliche epileptogene
Mechanismen in Frage kommen (BUHL et al., 1996; GIBBS et al., 1997; BROOKS-
KAYAL et al., 1998).
Literaturübersicht
3
2. Literaturübersicht
2.1 Epilepsien Epilepsie wird charakterisiert als Störung des Gehirns, welche gekennzeichnet ist
durch eine anhaltende Prädisposition für die Generation epileptischer Anfälle, sowie
durch die neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und sozialen
Konsequenzen, welche sich daraus ergeben (Definition der Internationalen Liga
gegen Epilepsie und dem Internationalen Epilepsiebüro, aus FISHER et al., 2005).
Ein epileptischer Anfall wird bedingt durch eine abnorme exzessive oder synchrone
neuronale Aktivität im Gehirn
Epilepsien gehören zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen
des Zentralnervensystems und betreffen ungefähr 1 bis 2 % der Weltbevölkerung
(BROWNE and HOLMES, 2001). Die Prävalenz für Epilepsieerkrankungen liegt bei
schätzungsweise 1,4 bis 5,7 % der Weltbevölkerung (HAUSER, 1999). Hinter dem
Begriff Epilepsie verbirgt sich eine Vielzahl von Krankheiten und Symptomen, denen
das Auftreten von wiederholten, epileptischen Anfällen gemeinsam ist (FRÖSCHER
und VASELLA, 1994). Betroffen sind nicht nur Humanpatienten, sondern in der
Veterinärmedizin vor allem Hund und Katze (HAUSER, 1999; LÖSCHER, 1994 und
2003). Die verfügbaren Antiepileptika scheinen trotz eines frühen
Behandlungsbeginns und einer Anfallsunterdrückung keine Effekte auf die
Progression der Epilepsie oder deren Ursachen auszuüben (LÖSCHER, 1998). Die
postulierten Ursachen für Epilepsie sind mannigfaltig und beinhalten ein
Ungleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Neurotransmission,
Veränderungen in der Expression und Funktion von Neurotransmitter-Rezeptoren,
die Entwicklung von „epileptischen“ Ionenkanälen, funktionale (intrinsische)
Neuronenveränderungen, die Entstehung von epileptischen Netzwerken
(Kreisläufen) in und zwischen Hirnregionen, morphologische Veränderungen wie
Hippocampalsklerose und das Aussprießen von Axonen (was zu aberranter
neuronaler Synchronisation führt) sowie genetische Ursachen (MCNAMARA, 1999;
OLSEN et al., 1999, COULTER, 2001; DALBY und MODY, 2001).
Literaturübersicht
4
2.1.1 Temporallappenepilepsie Die Temporallappenepilepsie stellt die häufigste Epilepsieform beim Menschen dar
und ist charakterisiert durch komplex-fokale Anfälle, bei denen die Patienten im
Gegensatz zum einfachen fokalen Anfall das Bewusstsein verlieren. Die Anfälle
können sekundär zu tonisch-klonischen Anfällen generalisieren (GASTAUT et al.,
1975; Hauser et al., 1993). In der Tiermedizin spielen partiale Epilepsien wie die
Temporallappenepilepsie ebenfalls eine wichtige Rolle, hier vor allem bei Hund und
Katze (LÖSCHER 1994 und 2003). Die Internationale Liga gegen Epilepsie ordnet
die Temporallappenepilepsie den symptomatischen Epilepsien zu, da sie
lokalisationsgebunden auftritt. Die komplex-fokalen Anfälle nehmen ihren Ursprung
wie der Name besagt, in Regionen des Temporallappens, vornehmlich im
Hippocampus und der Amygdala (WOLF et al., 1993). Temporallappenepilepsie ist
gekennzeichnet durch einen besonders hohen Prozentsatz an Patienten (70-80 %),
die unter Pharmakoresistenz leiden (LEPPIK, 1992). Ein häufig beobachtetes
Merkmal der Temporallappenepilepsie bei der Mehrheit der Patienten ist eine
charakteristische Schädigung des Hippocampus. Diese so genannte
Hippocampalsklerose besteht aus einem extensiven Zellverlust (typischerweise >
50%) in der CA3 und CA1 des Hippocampus und im Hilus des dentaten Gyrus
(ENGEL, 1996; FISHER et al., 1998). Neben dieser Hippocampalsklerose kommt es
auch in anderen anatomisch verbundenen, limbischen Strukturen des
Mesiotemporallappens, einschließlich der Amygdala und entorhinalen Region, zu
einer massiven Neurodegeneration (PITKÄNEN et al., 1998; YILMAZER-HANKE et
al., 2000). Es existiert eine anhaltende Debatte darüber, ob die mesiale
Temporalsklerose die Ursache oder die Konsequenz der Temporallappenepilepsie
darstellt (FISHER et al., 1998; MASUKAWA et al., 1999). Es ist jedoch zu beachten,
dass Temporallappenepilepsie sich auch in der Abwesenheit jeglicher hippocampaler
Schädigung entwickeln kann, und die Hippocampalsklerose für die Konsolidierung
dieses Epilepsietyps nicht unbedingt Voraussetzung ist (MARGERISON und
CORSELLIS, 1966; BLÜMCKE et al., 1999; BRANDT et al., 2004).
Temporallappenepilepsie wird allgemein als progressiver Epilepsietyp angesehen,
bei dem die Anfallsfrequenz steigt und die kognitiven Fähigkeiten nachlassen. Die
Literaturübersicht
5
Faktoren, welche zu diesen fortschreitenden Merkmalen führen sind nur
unzureichend bekannt (ENGEL, 1996; COLE, 2000; PITKÄNEN und SUTULA,
2002). Einhergehend mit den klinischen Charakteristika der Progression, wurden
fortschreitende Eigenschaften auch in Tiermodellen der Temporallappenepilepsie
gefunden, bei denen sich Anfälle nach einem Status epilepticus (SE) entwickeln
(GORTER et al., 2001). Einige dieser Modelle sollen im folgenden vorgestellt
werden.
2.2 Epilepsiemodelle Ein ideales Tiermodell für Epilepsie sollte die folgenden Bedingungen erfüllen: 1) es
sollten sich spontan wiederkehrende Anfälle entwickeln; 2) der Anfallstyp sollte der
klinischen Phänomenologie der Anfallstypen beim Humanpatienten entsprechen; 3)
paroxysmale EEG-Veränderungen sollten den EEG-Veränderungen der jeweiligen
Anfallstypen beim Menschen ähneln; 4) es sollte eine hohe Anfallsfrequenz
vorliegen, um eine akurate und chronische Bewertung der Effizienz von
Medikamenten zu gewährleisten; 5) die Pharmakokinetik (besonders die
Eliminationsrate) von Antiepileptika sollte die Aufrechterhaltung von effektiven
Plasmaspiegeln während chronischer Behandlung erlauben; 6) die effektiven
Plasma- und Gehirnkonzentrationen von Antiepileptika sollten denen entsprechen,
die auch für die Kontrolle relevanter Anfallstypen bei epileptischen Humanpatienten
gelten. Bis jetzt existiert noch kein Modell, welches alle Bedingungen erfüllt
(LÖSCHER und SCHMIDT, 1988; LÖSCHER, 1999).
Rattenmodelle für Temporallappenepilepsie, bei welchen sich spontan
wiederkehrende Anfälle nach einem chemisch oder elektrisch induziertem SE
entwickeln, sind weit verbreitet, um die zugrunde liegende Pathophysiologie der
Entwicklung von partialer Epilepsie zu studieren (COULTER et al., 2002; DUDEK et
al., 2002; LEITE et al., 2002). Das Modell der elektrischen Stimulation der
basolateralen Amygdala entwickelte sich aus dem Kindling-Modell (to kindle =
entflammen), welches erstmalig von Goddard beschrieben wurde (GODDARD et al.,
1969). Das Kindling-Modell wurde mit der Intention entwickelt, Lernverhalten durch
subkonvulsive elektrische Stimulation zu beeinflussen. Dabei stellte sich heraus,
Literaturübersicht
6
dass sich durch die wiederholte subkonvulsive elektrische Stimulation anhand einer
unilateralen Reiz- und Ableitelektrode in der Region des limbischen Systems
epileptische Anfälle entwickeln, die bei wiederholter Stimulation an Dauer und
Schweregrad zunehmen. Kindling umfasst zum einen den fortschreitenden Prozess
der Epileptogenese und zum anderen den permanenten Zustand einer erhöhten
Anfallsbereitschaft. Die Sensitivität des Gehirns gegenüber dem Stimulus steigt
kontinuierlich bis zu einem Punkt, an dem der Sensitivitätsgrad dauerhaft geworden
ist. An diesem Punkt spricht man von „vollgekindelten“ Tieren (MCNAMARA, 1984).
Die permanenten Gehirnveränderungen, welche beim Kindling zu beobachten sind,
lassen sich mit den pathophysiologischen und neurochemischen Modifikationen in
Resektionsgewebe von Humanpatienten mit komplex-fokaler Epilepsie vergleichen
(LÖSCHER et al., 1993; HEINEMANN et al., 1994). Der Nachteil des Kindlingmodells
besteht darin, dass die Anfälle nicht spontan auftreten, sondern induziert werden.
Beim Menschen treten epileptische Anfälle oft nach einer Latenzzeit in Folge
schwerwiegender Verletzungen wie einem Schädel-Hirn-Trauma zutage, weshalb es
optimal wäre, mit einem Tiermodell diese Situation simulieren zu können. Ein Modell,
welches die Temporallappenepilepsie beim Menschen imitiert und zu spontan
wiederkehrenden Anfällen führt, basiert auf der elektrischen Dauerstimulation der
Amygdala (MCINTYRE et al., 1982; HANDFORTH und ACKERMANN; 1988;
NISSINEN et al., 2000; BRANDT et al., 2003). Die Entwicklung des Modells nahm
ihren Ausgang in einer 60 minütigen Stimulation der basolateralen Amygdala bei
einer Frequenz von 60 Hz und einer Stromstärke von 50 μA (MCINTYRE et al.,
1982). Dadurch konnte bei gekindelten Ratten ein sich selbst erhaltender fokaler SE
(SSSE) induziert werden, der über die Stimulation hinaus andauerte. Es konnte
beobachtet werden, dass die fokalen Anfälle zum Teil sekundär generalisierten,
nachdem die Stimulation beendet wurde, jedoch hauptsächlich fokaler Natur waren.
Die Entwicklung von spontanen Anfällen wurde hierbei nicht berücksichtigt.
Ein SE wird definiert als kontinuierliche konvulsive motorische Aktivität oder
wiederholt auftretende Anfälle über einen Zeitraum von mindestens 30 Min., da eine
SE-Dauer von 30 Min. vermutlich den Übergangspunkt markiert, ab dem ein
anfallsinduzierter neuronaler Schaden entsteht, wofür der klinische Nachweis jedoch
Literaturübersicht
7
noch aussteht (LOWENSTEIN, 1999; FOUNTAIN; 2000). Die Mortalitätsrate beim SE
liegt für Erwachsene bei 15-20 % und bewegt sich bei Kindern zwischen 3 und 15 %
(FOUNTAIN, 2000).
Sechs Jahre nach dem von McIntyre beschriebenen Modell wurde erstmals die
Einteilung des SSSE in verschiedene Typen, wie im Methodenteil beschrieben,
dokumentiert (HANDFORTH und ACKERMANN, 1988). Bei diesem Versuch wurden
die Tiere ebenfalls für 60 Min. mit 60 Hz stimuliert, jedoch lag die Stromstärke bei
400 μA. Auch hier wurde das Auftreten von spontanen Anfällen nicht untersucht.
Zwölf Jahre darauf wurde ein Modell generiert, bei welchem der Zeitparameter der
Stimulation auf 20-30 Min. erhöht wurde (60 Hz, 400 μA) (NISSINEN et al., 2000).
Mittels der Stimulation der lateralen Amygdala entwickelten die Ratten einen SE, der
bis zu 20 Std. anhielt. Nach einigen Wochen konnten spontan wiederkehrende
Anfälle detektiert werden. Auf pathophysiologischer Ebene exprimierten die Ratten
eine Neurodegeneration im Hippocampus, in der Amygdala und im perikortikalen
Gewebe sowie ein Auswachsen von so genannten Moosfasern (Axone der
Körnerzellen) im Gyrus dentatus. Die Weiterentwicklung des Modells bestand
wiederum in einer Erhöhung der Stromstärke (700 μA) bei einer Stimulationsdauer
von 25 Min. und der Wahl der basolateralen Amygdala als Stimulationsort (BRANDT
et al., 2003). Der Typ des SSSE (fokal; fokal mit vereinzelten generalisierten
Anfällen; generalisiert) war dabei abhängig vom Rattenstamm, der
Elektrodenlokalisation sowie dem Geschlecht der Tiere. Weibliche Sprague-Dawley
Ratten zeigten dabei im Vergleich mit männlichen Sprague-Dawleys sowie
männlichen und weiblichen Wistar-Ratten am häufigsten einen rein generalisierten
SE und in Abhängigkeit davon, die meisten spontan wiederkehrenden epileptischen
Anfälle. Im Gegensatz zu männlichen Wistar-Ratten (56 % generalisierter SSSE) war
bei weiblichen Sprague-Dawleys die Mortalität während des SSSE deutlich geringer.
Bei einem rein generalisierten SE (Typ 3) und einem generalisierten SE mit einigen
fokalen Anfällen (Typ 2) entwickeln sich zu 90 % spontane Anfälle, bei einem rein
fokalen SE (Typ 1) sind es lediglich 33 %. Die optimale Dauer eines SE, um das
Auftreten von spontanen Anfällen zu gewährleisten, beträgt dabei vier Stunden
(BRANDT et al., 2003).
Literaturübersicht
8
Es soll der Vollständigkeit halber noch erwähnt werden, dass die Induktion eines SE
mit nachfolgenden spontanen Anfällen auch durch chemische Krampfgifte induziert
werden kann. Ein häufig verwendetes Modell für Temporallappenepilepsie ist dabei
die Induktion eines SE mit dem exzitotoxischen Glutamatanalogon Kainat. Die
Kainat-induzierten Anfälle führen zu einem großflächigen Gehirnschaden, welcher
bei anderen Modellen in dieser Form nicht anzutreffen ist (SPERK, 1994).
Anfälle, welche durch den cholinergen (muskarinergen) Agonisten Pilocarpin
ausgelöst werden, sind als experimentelles Modell für refraktäre Epilepsie mit
Anfällen, welche komplex-fokalen (limbischen) Anfällen ähneln, die sekundär
generalisieren können, etabliert (TURSKI et al., 1989).
Elektrische SE-Modelle bieten jedoch diverse Vorteile gegenüber den
Chemokonvulsiva. So gibt es bei den toxischen Chemikalien oft Komplikationen bei
der Interpretation (GOODMAN, 1998), welche bei den elektrischen Modellen nicht
auftreten. Außerdem können mittels elektrischer Stimulation mehrere SE-Stadien
ausgelöst werden (HANDFORTH und ACKERMANN, 1992; MCINTYRE et al., 1991;
MOHAPEL et al., 1996; WHITE und PRICE, 1993; BRANDT et al., 2003). Auch ist
die Mortalität bei chemischen Modellen deutlich höher (GOODMAN, 1998). Des
weiteren zeigen Ratten mit einem chemisch induziertem SE oft ein sehr aggressives
Verhalten und extreme Hypersensitivität beim Handling, was beim elektrischen SE
nicht derart ausgeprägt vorkommt (BRANDT et al., 2003).
2.3 Definition der Pharmakoresistenz bei Epilepsie Die genaue Definition der Pharmakoresistenz in der Humanmedizin ist umstritten,
jedoch wird ein Patient im Allgemeinen als refraktär angesehen, wenn zwei
nacheinander applizierte Antiepileptika in ihrer maximal tolerierbaren Dosis über
einen adäquaten Zeitraum zu keiner Anfallsfreiheit oder zumindest zu keiner
Anfallsreduktion um mindestens 50 % führen (REGESTA und TANGANELLI, 1999;
KWAN und BRODIE, 2002). Nimmt man diese Definition als Grundlage, können etwa
30 % der Epilepsiepatienten als pharmakoresistent eingestuft werden (REGESTA
und TANGANELLI, 1999; KWAN und BRODIE, 2000). In Bezug auf den adäquaten
Zeitraum der Behandlung bestehen unterschiedliche Ansichten. LEPPIK (1992)
Literaturübersicht
9
postuliert, dass von refraktärer Epilepsie gesprochen werden kann, wenn Anfälle
innerhalb eines Jahres unter Behandlung mit Antiepileptika nicht kontrolliert werden
können. Es existieren einige Faktoren, welche als Prognose für eine
Resistenzentwicklung fungieren können (REGESTA und TANGANELLI, 1999): Ein
früher Beginn der Anfälle im ersten Lebensjahr (ANNEGERS et al., 1979;
SOFIJANOV, 1982), ein langer Zeitraum mit Anfällen vor der Behandlung, eine hohe
Anfallsfrequenz vor Behandlungsbeginn, Fieberanfälle, der Anfallstyp (komplex-
fokal), die Persistenz der Anfälle unter Behandlung, das Epilepsiesyndrom,
Abnormalitäten im EEG und in Bezug auf den neurologischen Status sowie die
Familiengeschichte im Hinblick auf Epilepsie. Aller Wahrscheinlichkeit nach handelt
es sich bei dem Phänomen der Pharmakoresistenz um einen multifaktoriellen
Prozess (REGESTA und TANGANELLI, 1999; LÖSCHER und POTSCHKA, 2002;
KWAN und BRODIE, 2002). Die Konsequenzen von Pharmakoresistenz können sehr
schwerwiegend sein. So liegt die Mortalitätsrate bei refraktären Patienten vier bis
siebenmal höher als bei sensitiven Patienten (SPERLING, 2004). SISODIYA (2005)
postuliert, dass auch Patienten als refraktär eingestuft werden, deren Epilepsie
schlicht und einfach aus dem Grund als pharmakoresistent eingestuft wird, weil noch
keine adäquaten Antiepileptika für die Behandlung dieser Epilepsie bereitstehen.
HAUSER (1992) meint, dass auf gewisse Weise jede Art von Epilepsie refraktär ist,
da es keinen Hinweis darauf gibt, dass die Wirkweise von Antiepileptika nicht
lediglich palliativer Natur ist (Anfallsprävention) und keinen Einfluss auf die zugrunde
liegenden pathologischen Zustände nimmt. SCHACHTER (1993) beschreibt, dass
ein Patient mit refraktärer Epilepsie sich dadurch definiert, dass er aufgrund von
Anfällen, Nebenwirkungen von Antiepileptika und/oder psychosozialen Problemen
nicht in der Lage ist, einen Lebensstil zu führen, der seinen Fähigkeiten entspricht.
Literaturübersicht
10
2.4 Mögliche Ursachen der Pharmakoresistenz 2.4.1 Genetische Ursachen Drei generelle Kategorien von Mechanismen könnten für eine intrinsische oder
erworbene Pharmakoresistenz bei verschiedenen Hirnerkrankungen verantwortlich
sein (LÖSCHER und POTSCHKA 2005a):
1) genomische Variabilität: beispielsweise Polymorphismen die zu Veränderungen
im Metabolismus des Medikaments führen oder Zielstrukturen des Arzneimittels
sowie deren Transporter modifizieren. Diese Gendiversität könnte erklären, warum
zwei Patienten mit dem gleichen Krankheitsbild hinsichtlich ihrer initialen
Ansprechbarkeit auf ein Medikament differieren.
2) Krankheitsbezogene Mechanismen: Diese beinhalten die Ätiologie einer
Krankheit, die Progression der Krankheit unter Behandlung, strukturelle
Gehirnveränderungen und/oder Netzwerkmodifikationen, Modifikationen in den oder
der Zielstruktur(en) des Medikaments sowie Unterschiede in Bezug auf die
Arzneistoffaufnahme ins Gehirn.
3) Arzneimittelbezogene Mechanismen: Beispielsweise der Verlust der
therapeutischen Effizienz (funktionelle Toleranz), der Induktion von
metabolisierenden Enzymen (metabolische Toleranz) oder von Drug-Transportern
sowie ineffektive Wirkmechanismen des Arzneistoffes.
Zu Punkt 1) ist anzumerken, dass ein C3435T Polymorphismus in Exon 26 des MDR
1-Gens (ABCB1) mit einer erhöhten Expression und Funktionalität des Multidrug-
Transporters P-gp (Permeabilitäts-Glykoprotein) einhergeht (siehe auch 2.4.3) und
für Pharmakoresistenz bei Epilepsie mitverantwortlich gemacht wird (SIDDIQUI et al.,
2003; SORANZO et al., 2004; ZIMPRICH et al., 2004). Jedoch existieren auch
Studien, welche den Beitrag des C3435T Polymorphismus an der
Pharmakoresistenz nicht bestätigen konnten (TAN et al., 2004; SILLS et al., 2005).
Ebenso zeigte sich in einer Studie mit Phenytoin-sensitiven und pharmakoresistenten
Wistar-Ratten kein Unterschied der mdr1a kodierenden Sequenz (BAARS et al.,
2006). Es sind bis jetzt mehr als 50 Einzel-Nukleotid Polymorphismen (SNPs) im
humanen MDR1 Gen, welches für P-gp kodiert, identifiziert worden (ISHIKAWA et
Literaturübersicht
11
al., 2004). Somit herrscht noch Ungewissheit über die Beteiligung von genetischen
Modifikationen bei refraktärer Epilepsie und es besteht Klärungsbedarf für den
Beitrag der einzelnen Polymorphismen am Gesamtgeschehen der
Pharmakoresistenz.
2.4.2 Veränderungen der Zielstruktur von Antiepileptika (Targetstruktur-Hypothese) Antiepileptika der ersten Wahl für die Behandlung von Temporallappenepilepsie, wie
Phenytoin oder Carbamazepin wirken aller Wahrscheinlichkeit nach durch die
Modulation von spannungsabhängigen Natrium- und Kalziumkanälen (DELORENZO,
1995; MACDONALD, 1999). Es wurde gezeigt, dass sich die Eigenschaften dieser
Kanäle im Hippocampus von Patienten mit refraktärer Temporallappenepilepsie
verändern (BECK et al., 1997; BECK et al., 1998; RECKZIEGEL et al., 1998), was
den Verlust der therapeutischen Effizienz einiger wichtiger Antiepileptika erklären
könnte. In der Tat konnte belegt werden, dass bei Patienten mit pharmakoresistenter
Temporallappenepilepsie und Hippocampalsklerose die Modulation der Inaktivierung
von Natriumströmen durch das Antiepileptikum Carbamazepin in hippocampalen
Neuronen gestört ist (VREUGDENHIL et al., 1998). Auch REMY et al. (2003)
berichten, dass die Fähigkeit von Carbamazepin, die Natriumkanäle
spannungsabhängig zu blockieren, in hippocampalen Neuronen von Carbamazepin-
resistenten Epilepsiepatienten vollständig verloren geht. Ein ähnlicher Wirkverlust
von Carbamazepin wurde im Pilocarpin-Modell von Ratten detektiert (REMY et al.,
2003). Allerdings konnten JEUB et al. (2002) bei gekindelten Ratten keine
Unterschiede in der Sensitivität für Phenytoin bei Natrium- und Kalziumkanälen
zwischen Phenytoin-Respondern und Phenytoin-Nonrespondern feststellen, was
gegen eine Rolle beim Pharmakoresistenzgeschehen spricht.
Ein wichtiges Charakteristikum von pharmakoresistenter Epilepsie besteht wie
beschrieben darin, dass die Mehrzahl der Patienten mit refraktärer Epilepsie auf die
meisten, wenn nicht sogar alle Antiepileptika unzureichend ansprechen (REGESTA
und TANGANELLI, 1999). Als Konsequenz haben Patienten, welche während einer
Monotherapie mit einem ersten AED nicht hinreichend therapiert werden können, nur
Literaturübersicht
12
eine Chance von 10 % oder weniger, auf andere Antiepileptika anzusprechen auch
wenn diese andere Wirkmechanismen aufweisen. Laut der Targetstruktur-Hypothese
sollten Patienten, welche aufgrund einer Veränderung der Zielstruktur
(Natriumkanäle) nicht mehr auf Phenytoin ansprechen, mit einem GABA-
modifizierenden Antiepileptikum wie Phenobarbital erfolgreich therapiert werden
können, was jedoch meistens nicht der Fall ist. Diese Tatsache spricht gegen
Epilepsie-induzierte Veränderungen in speziellen Zielstrukturen der Antiepileptika als
Hauptursache für pharmakoresistente Epilepsie. Vielmehr scheinen unspezifische
und möglicherweise adaptive Mechansimen, wie eine verminderte Aufnahme von
Antiepileptika ins Gehirn durch eine anfallsinduzierte Überexpression von Multidrug-
Transportern in der Blut-Hirnschranke eine Rolle zu spielen (LÖSCHER und
POTSCHKA, 2002), wie im folgenden erläutert.
2.4.3 Multidrug-Transporter Die Effektivität der Therapie vieler Krankheiten, darunter Krebs, infektiöse
Erkrankungen, rheumatoide Arthritis und Hirnleiden wie Epilepsie, Depression,
Schizophrenie, sowie HIV-assoziierter neurologischer Dysfunktion, wird begrenzt
durch eine schlechte Ansprechbarkeit oder hartnäckige Resistenz gegenüber der
Behandlung (BALDINI, 1997; HELLEWELL, 1999; BART et al., 2000;
GOTTESMANN et al., 2002; GREDEN, 2002; LÖSCHER, 2002a; TAYLOR, 2002;
LAGE, 2003). So wurde beispielsweise bei einem Patienten mit refraktärer Epilepsie
trotz einer kontinuierlichen und verstärkten Gabe von Antiepileptika über
persistierende subtherapeutische Plasmakonzentrationen von Antiepileptika
(einschließlich Phenobarbital und Phenytoin) berichtet (LAZAROWSKI et al., 1999).
In diesem Zusammenhang ist es von speziellem Interesse, dass neben anderen
Geweben, wie dem Darm, in den Endothelzellen der Blut-Hirnschranke so genannte
Multidrug-Transporter vorkommen, die einen aktiven auswärts gerichteten Efflux-
Mechanismus ausüben, welcher als aktiver Verteidigungsmechanismus angesehen
werden kann, der die Akkumulation vieler lipophiler Substanzen im Gehirn begrenzt
(FROMM, 2000; SPECTOR, 2000; ABBOTT et al., 2002). Allen Zellen ist der Besitz
dieser Efflux-Transporter gemeinsam, welche sie vor endogenen oder exogenen
Literaturübersicht
13
toxischen Substanzen schützen (SCHINKEL und JONKER, 2003). Die Mehrheit
dieser Transporter gehört zur ABC-Superfamilie (ATP-binding cassette proteins),
welche die zelluläre Ausschleusung vieler therapeutischer Substanzen mit den
unterschiedlichsten Strukturen und klinischen Anwendungsgebieten vermittelt.
Neben dem Permeabilitäts-Glykoprotein (P-gp) sind auch die Familie der Multidrug-
assoziierten Resistenzproteine (MRPs) und das Brustkrebs-assoziierte
Resistenzprotein (BCRP) an der Regulation der Aufnahme und Ausschleusung von
Arzneimitteln und anderen Substanzen involviert (LÖSCHER und POTSCHKA,
2005b). Die MRPs, welche zur ABCC-Familie gehören, umfassen 12 Mitglieder und
wirken als Transporter von organischen konjugierten Anionen, aber auch von
neutralen organischen Substanzen, wohingegen P-gp hauptsächlich unkonjugierte,
kationische Substanzen transportiert (BORST et al., 2000; KRUH et al., 2001;
HAIMEUR et al., 2004). Da es im Rahmen dieser Arbeit zu weit führen würde, alle
MRPs zu charakterisieren, soll hier nur kurz auf MRP2 eingegangen werden,
welches mutmaßlich am Epilepsiegeschehen beteiligt ist. Durch den Vergleich der
Gehirngängigkeit des Antiepileptikums Phenytoin in MRP2-defizienten TR- - und
normalen Wistar-Ratten konnte mittels Mikrodialyse gezeigt werden, dass MRP2
substantiell an der Funktion der Blut-Hirnschranke in vivo beteiligt ist (POTSCHKA et
al., 2003). HOFFMANN et al. (2006) konnten nach einem Pilocarpin-induziertem
konvulsiven SE eine deutliche MRP2-Färbung in Endothelzellen von Gehirnkapillaren
und in geringerem Maße, in perivaskulären Astrogliazellen und Neuronen in diversen
Hirnregionen nachweisen. Die Relevanz anderer Multidrug-Transporter für die
Pharmakoresistenz ist beim Menschen jedoch nicht so gut charakterisiert wie bei P-
gp (FROMM, 2004). Des weiteren existieren für die MRP-Subfamilie keine selektiven
Inhibitoren, wie sie für P-gp verfügbar sind (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005c).
Außerdem ist der immunhistochemische Nachweis von beispielsweise MRP2 sensitiv
gegenüber der Fixierung und der Färbeparameter (VOLK et al., 2005). Obgleich die
diversen Transporter eine beachtliche Überlappung bezüglich ihrer Substratspezifität
zeigen (LÖSCHER und POTSCHKA 2005b), soll hier nur auf P-gp eingegangen
werden.
Literaturübersicht
14
P-gp wurde erstmals in den 1970ern als Prototyp eines Transporters bei multipler
Resistenz von Krebszellen beschrieben (JULIANO und LING, 1976). TISHLER et al.
(1995) waren dann die ersten, die zeigen konnten, dass das P-gp codierende Gen
MDR1 bei der Mehrzahl der Humanpatienten mit pharmakoresistenter Epilepsie im
Gehirn markant erhöht ist. ABC-Transporter wie P-gp sind integrale
Membranproteine mit mehreren Domänen, welche die Energie der ATP-Hydrolyse
dazu nutzen, Substanzen zwischen zellulären Membranen zu translozieren (JONES
und GEORGE, 2004). P-gp gehört dabei zu den atypischen ATP-abhängigen
Transportern, da die basale ATPase-Aktivität sehr hoch ist und nicht auf die Bindung
und den Transport von Substraten angewiesen zu sein scheint (SHAROM, 1997).
Zwei C-Terminale hydrophile Nukleotid-bindende Domänen binden und hydrolysieren
ATP und zwei N-Terminale hydrophobe Transmembran-Domänen, welche aus
multiplen (üblicherweise sechs) membran-durchspannenden α-Helices bestehen,
formen den Kanal, durch welchen die Substrate die Membran passieren (ISHIKAWA
et al., 2004; HIGGINS, 2007).
Es wird vermutet, dass ABC-Transporter bereits seit drei Milliarden Jahren existieren
und in allen drei Reichen lebender Organismen präsent sind (SAIER et al., 1998).
Bei prokaryotischen Organismen konnten annähernd 50 verschiedene Mitglieder der
ABC-Superfamilie identifiziert werden (FATH und KOLTER, 1993). Die
Demonstration von P-gp-Genhomologien zwischen phylogenetischen Linien weist
darauf hin, dass es sich bei P-gp um ein sehr ursprüngliches Protein mit
fundamentalen zellulären Aufgaben handelt (LEVEILLE-WEBSTER und ARIAS,
1995).
P-gp ist ein phosphoryliertes Glykoprotein, welches in seiner funktionellen Form ein
Molekulargewicht von 170 kDa aufweist. P-gp ist ein Produkt des Gens ABCB1 (auch
bekannt als Multidrug Resistence 1 [MDR1] Gen), welches beim Menschen auf
Chromosom 7 lokalisiert ist und 28 Exone aufweist (FROMM, 2004). Diejenigen P-gp
Isoformen, welche für Pharmakoresistenz verantwortlich sein können, werden beim
Menschen vom MDR1 Gen codiert und bei Rodentiern von den Genen mdr1a und
mdr1b, welche aufgrund ihrer Verteilung im Gewebe zusammen anscheinend die
gleiche Funktion erfüllen, wie das einzelne humane Gen (LEVEILLE-WEBSTER und
Literaturübersicht
15
ARIAS, 1995). Mäuse, die eine Deletion von mdr1a oder mdr1a und mdr1b
aufweisen, zeigen zwar keine offensichtlichen physiologischen Abnormalitäten, aber
einen deutlichen Anstieg der Aufnahme von diversen lipophilen Substanzen wie z. B.
dem Anthelminthikum Ivermectin ins Gehirn mit entsprechend resultierender
Neurotoxizität (SCHINKEL et al., 1996, 1997). Im Nagergehirn ist die mdr1a Isoform
des P-gps vorwiegend in endothelialen Mikrogefäßzellen der Blut-Hirnschranke
präsent, wohingegen die mdr1b Isoform in erster Linie in Astrozyten lokalisiert
(REGINA et al., 1998; DECLEVES et al., 2000). Im normalen menschlichen Gehirn,
wird P-gp in geringem Maße in kapillären Endothelzellen exprimiert (ABBOT und
ROMERO, 1996). In epileptischem Gewebe von pharmakoresistenten
Humanpatienten kommt es zu einer signifikanten Hochregulation von P-gp im
Vergleich zu Kontrollen (DOMBROWSKI et al., 2001). P-gp konnte mittels
immunhistochemischer Methoden bei nicht-epileptischen Patienten nicht im
Gehirnparenchym, also den Astrozyten oder Neuronen nachgewiesen werden
(TISHLER et al., 1995; SISODIYA et al., 2002). Eine potentielle Erklärung für diese
augenscheinliche Divergenz zwischen Nagern und Menschen bezüglich der P-gp
Expression in Astrozyten könnte darin bestehen, dass der Detektionslevel der
verwendeten Assays beim gesunden Menschen zu gering ist. Bei pathologischen
Zuständen wie der Epilepsie steigt der P-gp Gehalt in Gliazellen jedoch an und wird
detektierbar (DOMBROWSKI et al., 2001; SISODIYA et al., 2001, 2002; TISHLER et
al., 1995; LAZAROWSKI et al., 2004). Eine erhöhte P-gp-Expression konnte auch in
Neuronen von refraktären Humanpatienten mit Hippocampussklerose im mesialen
Temporallappen detektiert werden (D`GIANO et al., 1997). P-gp konnte ebenfalls in
Neuronen von Ratten nachgewiesen werden (LAZAROWSKI et al. 2004; VOLK et
al., 2004b). Da die Überexpression am deutlichsten in Astrozyten auftritt, welche
Blutgefäße umgeben, könnte die Präsenz von P-gp in perivaskulären Gliazellen eine
zweite Barriere darstellen, welche das Eintreten von Xenobiotika, aber auch
Medikamenten beschränken soll (SISODIYA et al., 2002), weil die Blut-Hirnschranke
während epileptischer Anfälle vorübergehend durchlässig wird (DUNCAN und TODD,
1991). P-gp wird außer in der Blut-Hirnschranke auch in weiteren Geweben mit
exkretorischen Funktionen wie Darm, Leber und Niere, aber auch in der Blut-
Literaturübersicht
16
Hodenschranke und der Plazenta exprimiert. Dadurch wird der Eintritt von
Arzneistoffen nach oraler Aufnahme in den Körper beschränkt und die Elimination
dieser Substanzen gefördert (FROMM, 2004; LIN, 2004).
Die meisten der verfügbaren Daten weisen darauf hin, dass P-gp bei Säugetieren,
einschließlich dem Menschen, vorwiegend in der luminalen (apikalen) Membran von
Endothelzellen der Gehirnkapillaren exprimiert wird (DEMEULE et al., 2002;
SCHINKEL und JONKER, 2003; SUN et al., 2003). Durch diese Lokalisation können
Substrate von P-gp, welche von den Blutgefäßen aus in die Endothelzellen eintreten,
zum Teil wieder ins Blut zurückgepumpt werden. Daneben ist P-gp auch in
zytoplasmatischen Vesikeln präsent, in denen der Multidrug-Transporter dergestalt
lokalisiert ist, dass die Substrate in das Innere der Vesikel transportiert und dort
konzentriert werden können, somit also eine Sequestrierung der Xenobiotika weg
von ihren subzellulären Zielstrukturen erfolgt (SHAPIRO et al., 1998; RAJAGOPAL
und SIMON, 2003). In Endothelzellen von Gehirnkapillaren sind zirka 70 % des P-
gps in so genannten Caveolen lokalisiert (JODOIN et al., 2003), flaschenförmigen
Invaginationen der Plasmamembran, welche an vielen zellulären Prozessen beteiligt
sind, darunter auch dem Transport von Makromolekülen zwischen Zellen durch
Transzytose (DEMEULE et al., 2000; JODOIN et al., 2003; SCHLACHETZKI und
PARDRIDGE, 2003). DEMEULE et al. (2000) konnten zeigen, dass P-gp mit
Caveolin-1, einem integralen Membranprotein von Caveolen kolokalisiert und
interagiert. Mutationen in einem Caveolin-1 bindenden Motiv, welches im P-gp-
Molekül exprimiert wird, reduzieren die Interaktionen von P-gp mit Caveolin-1 und
erhöhen die Transportaktivität von P-gp (JODOIN et al., 2003). BENDAYAN et
al.(2006) wiesen P-gp auch im endoplasmatischen Retikulum, in zytoplasmatischen
Vesikeln, im Golgi-Apparat und in der Kernmembran nach, also unter anderem
Regionen, die für die Proteinsynthese und Glykolisierung verantwortlich sind. P-gp
besitzt mindestens vier verschiedene Substratbindungsstellen, welche interagieren
und durch allosterische Kommunikation Konformationen mit hoher oder niedriger
Affinität einnehmen können (MARTIN et al., 2000). SHAPIRO et al. (1999) fanden
jedoch Hinweise darauf, dass P-gp nur zwei verschiedene, positiv interagierende
Bindungs- und Transportstellen (R und H) für die Substrate besitzt, und beschrieben
Literaturübersicht
17
eine mögliche dritte allosterische Bindungsstelle, welche selber keine Substanzen
transportiert. SHAROM (1997) postuliert hingegen, dass Medikamente und
Chemosensitizer mit verschiedenen überlappenden Regionen einer einzigen
flexiblen Bindungsstelle interagieren, welche groß genug ist, mehr als eine
Komponente gleichzeitig zu erfassen.
Da Anfälle zu einer transienten Hochregulierung von P-gp führen können, ist es
interessant, dass der exzitatorische Neurotransmitter Glutamat , welcher in der Blut-
Hirnschranke von P-gp transportiert wird (LIU und LIU, 2001), die P-gp Expression
steigert und die mdr1a/mdr1b mRNA-Level in Endothelzellen von Mikrogefäßen im
Rattengehirn erhöht (ZHU und LIU, 2004). Anfälle verursachen bekanntermaßen
eine exzessive Glutamatfreisetzung im Gehirn (HOLMES, 2002), was eine logische
Erklärung für die gesteigerte P-gp Expression nach Anfällen, wie sie bei Tieren und
Menschen beobachtet wird, sein könnte (LÖSCHER und POTSCHKA 2005c). Durch
die Aktivierung von NMDA-Rezeptoren kommt es zur Glutamat-induzierten
Freisetzung von Sauerstoffradikalen, welche die P-gp Expression in Endothelzellen
von Mikrogefäßen im Rattengehirn bei Ischämie nachgewiesenermaßen steigern
(FELIX und BARRAND, 2002) und während des Epilepsiegeschehens ebenso wirken
könnten.
Es ist immer noch nicht abschließend geklärt, ob die Überexpression von P-gp und
MRPs in epileptogenem Gewebe von Patienten mit refraktärer Epilepsie eine
Konsequenz der Epilepsie, eine Folge von unkontrollierten Anfällen, der chronischen
Behandlung mit Antiepileptika oder eine Kombination dieser Faktoren darstellt
(LÖSCHER und POTSCHKA, 2002). In Tiermodellen der Temporallappenepilepsie
wurde gezeigt, dass Anfälle zu einer transienten Überexpression von P-gp in
Endothelzellen von Gehirnkapillaren, Astroglia und Neuronen führen können, was
darauf hindeutet, dass die Anfälle bei der Hochregulierung von Transportern eine
größere Rolle spielen als die Epilepsie an sich (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b).
In einem Kainat-Modell für Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Überexpression
von P-gp bereits innerhalb der ersten 3-24 Std. nach Anfallsbeginn im Hippocampus
detektierbar ist (RIZZI et al., 2002). Der beobachtete Effekt war jedoch nach 72 Std.
nicht mehr vorhanden. Ähnliches wurde in einer Studie von SEEGERS et al. (2002b)
Literaturübersicht
18
beobachtet, was dafür spricht, dass die anhaltende Anfallsaktivität, jedoch nicht die
Prozesse, welche der Entwicklung von Epilepsie zugrunde liegen, für die
Überexpresson verantwortlich ist. Das könnte auch erklären, warum eine hohe
Anfallsfrequenz vor Behandlungsbeginn einen wichtigen Indikator für
Pharmakoresistenz darstellt (REGESTA und TANGANGELLI, 1999). Bei Patienten
mit Malformationen der kortikalen Entwicklung scheint jedoch eine konstitutive
Überexpression von Multidrug-Transportern wichtiger zu sein als eine induzierte oder
erworbene Hochregulation (SISODIYA et al., 1999). Es konnte außerdem belegt
werden, dass eine Langzeitbehandlung mit Antiepileptika wie Phenytoin oder
Phenobarbital die Expression von P-gp im Gehirn nicht induziert (SEEGERS et al.,
2002a).
Die meisten Arzneistoffe, welche geeignete P-gp Substrate darstellen, besitzen ein
Molekulargewicht von 400 Da, was erklären könnte, weshalb diese Substanzen
weniger effizient ins Gehirn penetrieren, als von ihrer Lipidlöslichkeit zu erwarten
wäre (SCHINKEL, 1999). Antiepileptika sind im Gegensatz zu Chemotherapeutika
nur schwache P-gp Substrate. Das könnte den Grund dafür liefern, warum
Antiepileptika ihre Zielstrukturen im Gehirn erreichen, wenn P-gp normal exprimiert
wird, jedoch bei einer Überexpression von P-gp nur noch in so geringem Maße die
Blut-Hirnschranke passieren können, dass eine Pharmakoresistenz entsteht
(LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a). Da die behandlungsresistenten Patienten die
gleichen neurotoxischen Nebenwirkungen von Antiepileptika aufweisen, wie
pharmakosensitive Patienten, scheint die Überexpression von Multidrug-
Transportern bei refraktären Patienten auf den epileptischen Fokus beschränkt zu
sein (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a).
P-gp ist auch in sofern ein ungewöhnlicher Transporter, dass er eine hohe
Promiskuität aufweist und bisher schon Hunderte von Komponenten als Substrate
identifiziert werden konnten (SHAROM, 1997). Substanzklassen, die generell von P-
gp transportiert werden, beinhalten Opiode, Steroide, Antibiotika,
Kalziumkanalblocker, Chemotherapeutika, Immunsuppressiva und andere (BAUER
et al., 2005). Bislang wurde für sieben Haupt-Antiepileptika nachgewiesen, dass sie
Literaturübersicht
19
Substrate von P-gp darstellen: Phenytoin, Phenobarbital, Carbamazepin, Lamotrigin,
Gabapentin, Felbamat und Topiramat (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b).
In der Regel sind die typischen P-gp Substrate hydrophob, mit einem planaren
Ringsystem und oft positiver Ladung bei physiologischem pH (SHAROM, 1997). Die
transportierten Substrate sind jedoch sehr heterogen, können aromatische Gruppen
enthalten oder nicht, ungeladen oder schwach geladen sein und der einzige
gemeinsame Nenner aller Substanzen scheint ihre amphipathische Natur zu sein
(SCHINKEL und JONKER, 2003).
Die Funktionalität der membranassoziierten Effluxtransporter variiert mit
Polymorphismen und Schwankungen im Expressionslevel, post-translationalen
Prozessen sowie der Membrankomposition der Transporter. Zusätzlich kann der
Transport eines Substrates von der Präsenz anderer Substrate abhängig sein
(LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a). Die Expression von Drug-Transportern wie P-
gp oder den MRPs obliegt der strikten transkripitonalen Regulation durch Orphan-
Nuklear-Rezeptoren wie PXR (Pregnane X Rezeptor; bekannt als PXR in Nagetieren
und als Steroid- und Xenobiotika-Rezeptor [SXR] beim Menschen) (SCHUETZ und
STROM, 2001; SYNOLD et al., 2001; WANG und LECLUYSE, 2003; BAUER et al.,
2005). PXR wird von natürlich vorkommenden Steroiden wie Progesteron sowie
synthetischen Glukokortikoiden aktiviert, aber auch von einigen Medikamenten wie
z.B. Phenobarbital (SYNOLD et al., 2001). PXR reguliert nach seiner Aktivierung
auch eine Reihe von Genen, welche in Leber und Darm für den Metabolismus von
Xenobiotika verantwortlich zeichnen (BAUER et al., 2005). Viele Stoffe sind sowohl
Substrate von P-gp als auch von Cytochrom P450 3A4, welche beide von SXR/PXR
reguliert werden und in Leber und Darm kolokalisieren, um dort ein koordiniertes
System für die Absorption, den Metabolismus und die Disposition vieler Arzneistoffe
darzustellen (SCHUETZ und STROM, 2001).
Während oxidativer Stress die P-gp Expression im Rattengehirn erhöht, können
Entzündungsreaktionen zu einer verminderten Expression von Multidrug-
Transportern führen (BAUER et al., 2005).
Veränderungen der Aktivität von P-gp könnten resultieren aus 1) der direkten
Modifikation der Pumpenfunktion durch Inhibitoren und intrazelluläre Signale, 2) der
Literaturübersicht
20
Insertion und Freisetzung von vorgefertigten Transportern, welche in Vesikeln
gespeichert sind, 3) der veränderten Transportersynthese durch verstärkte oder
gehemmte Transkription oder Translation (BAUER et al., 2005).
P-gp könnte Substanzen entweder durch einen Proteinkanal aus dem Zytoplasma
ausschleusen (Porenmodell) oder Substanzen, welche in die Membran eingedrungen
sind, aus der Zelle befördern (HIGGINS und GOTTESMANN, 1992; SHAROM,
1997). Da die meisten P-gp Substrate lipophiler Natur sind, wäre die zweite
Hypothese zu favorisieren (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a). Dabei könnte P-gp
wie ein Flippase Substanzen aus der inneren Membran aufnehmen und zu der
äußeren Membran der Lipiddoppelschicht transferieren, von wo aus die Substrate
dann in die Extrazellulärflüssigkeit diffundieren. Experimentelle Daten sprechen
dafür, dass P-gp Substrate in der inneren Membranschicht erkennt, diese „ansaugt“
und durch einen Proteinkanal ins extrazelluläre Medium transportiert, ähnlich wie ein
Staubsauger (HOCHMAN et al., 2002). Substanzen mit einer hohen Polarität oder
Ladung könnten den Transporter von der wässrigen Phase aus erreichen,
wohingegen hydrophobe Substrate von der Lipiddoppelschicht aus mit dem Protein
interagieren könnten (SHAROM; 1997).
Es ist jedoch anzumerken, dass nicht alle Antiepileptika Substrate für Multidrug-
Transporter darstellen, so dass die Hypothese der Überexpression bestimmter
Transporter die Pharmakoresistenz gegenüber Antiepileptika nicht vollständig
erklären kann (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005c).
2.4.4 Blut-Hirnschranke In der Blut-Hirnschranke zeigen die Endothelzellen der Gehirnkapillaren nur eine
geringe Permeabilität. Transzellulare Passagemöglichkeiten wie Poren fehlen und es
sind nur wenige pinozytotische Vesikel vorhanden. Jedoch gibt es größere und mehr
Mitochondrien als bei den peripheren Kapillaren. Die Endothelzellen, welche die
Gehirnkapillaren und Perizyten begrenzen, werden von einer Basalmembran
umgeben. Ungefähr 90 % der Oberfläche der Endothelzellen ist von astrozytären
Fortsetzen bedeckt, welche die Eigenschaften der Blut-Hirnschranke unterstützen
(ABBOTT, 2002). Gehirnkapillaren sind zirka 50-100 Mal dichter als periphere
Literaturübersicht
21
Mikrogefäße, bedingt durch die Präsenz von komplexen „tight-junctions“ (Zonulae
occludens), welche den parazellulären Zutritt von hydrophilen Substanzen ins Gehirn
beschränken, so dass die Penetration ins Gehirnendothelium auf transzelluläre
Mechanismen begrenzt ist (ABBOTT, 2002).
Obwohl Substanzen auch durch die Blut-Liquorschranke ins Gehirn aufgenommen
werden können, ist die Oberfläche der Blut-Hirnschranke ungefähr 5000 Mal größer
als die der Blut-Liquorschranke, so dass die Blut-Hirnschranke als Hauptroute für die
Aufnahme von endogenen und exogenen Liganden ins Gehirnparenchyma
angesehen wird (PARDRIGE, 1995; TERASAKI und HOSOYA, 1999; SUZUKI et al.,
1997; TSUJI und TAMAI, 1999). VAN VLIET et al. (2007a) konnten zeigen, dass
durch eine artifizielle Öffnung der Blut-Hirnschranke mittels Mannitol bei chronisch
epileptischen Ratten ein anhaltender Anstieg der Anfallsfrequenz bei der Mehrzahl
der Tiere ausgelöst werden kann. Das spricht dafür, dass eine derartige
Durchlässigkeit der Blut-Hirnschranke während der Epileptogenese und der
chronisch epileptischen Phase auftritt und zur Progression der Epilepsie beitragen
könnte (VAN VLIET et al., 2007a).
2.4.5 Inhibitoren von Multidrug-Transportern [Tariquidar (XR 9576)] Der spezifische P-gp Modulator Tariquidar (XR 9576) ist ein hochpotentes
Anthranilamidderivat und gehört zur dritten Generation von P-gp Inhbitoren (ROE et
al., 1999). Die Agenzien der dritten Generation zeichnen sich gegenüber den ersten
beiden Generationen dadurch aus, dass sie bei relevanten Konzentrationen nicht mit
dem Cytochchrom P450 3A4 interagieren (DANTZIG et al., 1999; WANDEL et al.,
1999). Es konnte nachgewiesen werden, dass Tariquidar im Gegensatz zu
Cyclosporin A und Verapamil auch in hohen Konzentrationen die MRP-Funktion nicht
beeinflusst (STEWART et al., 2000).
Die genaue Bindungsstelle von XR 9576 ist noch unbekannt, aber es entfaltet seine
Wirkung, indem es die ATPase Aktivität von P-gp unterbindet, und wird selbst nicht
transportiert. Es ist jedoch bekannt, dass XR 9576 die P-gp Funktion hemmt, indem
es an eine Stelle bindet, die sich von der Bindungsstelle für den Substrattransport
unterscheidet (MARTIN et al., 1999, 2000). Tariquidar besitzt beim Menschen eine
Literaturübersicht
22
Halbwertszeit von ungefähr 24 Std. und muss daher nur einmal täglich appliziert
werden (LUM et al., 1993).
2.5 Pharmakoresistenz im Tiermodell 2.5.1 Modellübersicht: Tiermodelle für pharmakoresistente Epilepsie Die meisten der zur Verfügung stehenden Tiermodelle für Pharmakoresistenz sind
Modelle der Temporallappenepilepsie (LÖSCHER, 2006). In Analogie zur Epilepsie
bei Mensch und Tier wäre es ideal, wenn es möglich wäre, in Tiermodellen mit
Antiepileptika Responder und Nonresponder zu selektieren. Nonresponder, also
Tiere die gegenüber Antiepileptika resistent sind, könnten durch direkten Vergleich
mit Respondern zur Klärung der Mechanismen von Pharmakoresistenz verwendet
werden. Eine derartige Selektion refraktäre und sensitive Tiere ist in einigen
Epilepsiemodellen in Ratten-Auszuchtstämmen gelungen (LÖSCHER, 2006). Es
wäre optimal, Inzucht-Rattenstämme zur Verfügung zu haben, welche entweder
Responder oder Nonresponder gegenüber Antiepileptika sind und damit die
aufwendige Selektion und teilweise relativ geringe Ausbeute von Respondern und
Nonrespondern in Auszuchtstämmen zu vermeiden. Leider sind bislang alle
Versuche, einen Stamm zu finden, der zu 100 % Responder oder Nonresponder
beinhaltet, fehlgeschlagen (LÖSCHER, 2006). Als erstes Modell für die
Untersuchung von refraktärer Epilepsie wurde das bei den Epilepsiemodellen
beschriebene Amygdala-Kindling-Modell eingeführt (LÖSCHER, 1986; LÖSCHER et
al., 1986). Es stellte sich heraus, dass fokale Anfälle wesentlich weniger auf
Antiepileptika ansprechen als sekundär generalisierte Anfälle, was auch in der Klinik
häufig beobachtet wird. Es konnte gezeigt werden, dass vollgekindelte weibliche
Ratten eines Wistar-Auszuchtstammes bezüglich ihrer Ansprechbarkeit auf das
Antiepileptikum Phenytoin variieren, da einige Tiere mit einer kompletten
Anfallskontrolle auf Phenytoin reagierten, wohingegen andere überhaupt nicht darauf
ansprachen (RUNDFELDT et al., 1990). Als Parameter für Ansprechbarkeit wurde
dabei die Schwelle für die Induktion fokaler Anfallsaktivität angesehen, das heißt die
Schwelle für die Induktion von Nachentladungen. Die durchschnittlichen Daten von
insgesamt 200 Ratten ergaben, dass nur 16 % der Tiere auf Phenytoin reagierten,
Literaturübersicht
23
16% keinen antikonvulsiven Effekt erkennen ließen, und die verbleibenden 61 %
variabel auf Phenytoin ansprachen (LÖSCHER, 1997; LÖSCHER, 2002b). Die
Subgruppe der Nonresponder ähnelt dabei Patienten mit refraktärer
Temporallappenepilepsie, wohingegen Responder als Modell für Patienten dienen,
bei welchen eine komplette Anfallskontrolle durch Antiepileptika erreicht werden
kann. Variable Responder spiegeln Patienten wider, bei denen die Behandlung mit
Antiepileptika die Anfallsfrequenz reduziert, jedoch zu keiner vollständigen
Anfallskontrolle führt (LÖSCHER, 2006). Nach Phenytoin wurden im gleichen Modell
zahlreiche weitere Antiepileptika getestet, welche alle signifikant weniger oder
überhaupt nicht effizient bei Phenytoin-Nonrespondern wirkten, verglichen mit
Respondern, so dass sich die Resistenz einer Subgruppe von gekindelten Wistar-
Ratten gegenüber Phenytoin auf diverse alte und neue Antiepileptika ausdehnt. Die
einzige Ausnahme stellte dabei das Antiepileptikum Levetiracetam dar (LÖSCHER,
2006), welches kein P-gp Substrat ist (POTSCHKA et al., 2004b). Im Kindling-Modell
konnte weiterhin gezeigt werden, dass gekindelte Ratten geringere extrazelluläre
Gehirnkonzentrationen von Phenytoin aufweisen als gleichaltrige Kontrolltiere
(POTSCHKA und LÖSCHER, 2002) und dass Phenytoin-Nonresponder sich von
Respondern durch eine markante Überexpression von P-gp in der gekindelten
Amygdala unterscheiden (POTSCHKA et al., 2004a).
Ein weiteres interessantes Modell für pharmakoresistente Epilepsie ist das 6-Hz
psychomotorische Anfallsmodell bei Mäusen (BARTON et al., 2001). Das 6-Hz-
Modell basiert auf einer elektrischen Stimulation durch Rechteck-Impulse von 0,2
Millisekunden mit niedriger Frequenz, welche über Kornealelektroden für eine relativ
lange Dauer (3 Sekunden) appliziert werden. Die dadurch induzierten Anfälle sind
gekennzeichnet durch Immobilität, Klonus der Vorderextremitäten sowie
automatisierte, stereotype Verhaltensweisen, welche denen bei humaner limibischer
Epilepsie ähneln und nicht auf Phenytoin ansprechen (SWINYARD, 1972). Durch
eine Erhöhung der Stromstärke konnte beobachtet werden, dass bei 44 Milliampere
die meisten Antiepileptika ihre Effizienz verlieren und lediglich Valproat und
Levetiracetam noch zu einer kompletten Kontrolle der 6 Hz Anfälle führten, weshalb
dieses Modell als adäquat für Resistenzstudien angesehen wurde (BARTON et al.,
Literaturübersicht
24
2001). Das 6-Hz-Modell birgt gegenüber dem Kindling-Modell den Vorteil, dass es
sehr einfach ist und das Screening vieler Substanzen in relativ kurzer Zeit erlaubt
(LÖSCHER, 2006). Obwohl Kindling und das 6-Hz-Modell interessant sind für die
Testung von Antiepileptika, sind beide augenscheinlich nicht geeignet für die
Untersuchung von Mechanismen, die zu chronischer Epilepsie mit spontanen
Anfällen führen (LÖSCHER, 2006).
Eine Möglichkeit für die Untersuchung chronischer Epilepsie besteht zum Beispiel in
der Verwendung eines Pilocarpin-induzierten SE, nach dem sich spontan
wiederkehrende Anfälle entwickeln (siehe auch Kapitel Epilepsiemodelle). So wurden
in einem Versuch von GLIEN et al. (2002) bei Pilocarpin-behandelten Ratten
subkutan osmotische Minipumpen implantiert, welche zunächst für zwei Wochen mit
Natriumchlorid-Lösung gefüllt waren (Predrug-Kontrollphase), danach für zwei
Wochen mit Levetiracetam befüllt wurden, welches kontinuierlich freigesetzt wurde
(Drug-Phase) und anschließend für zwei Wochen durch substanzfreie Pumpen
ersetzt wurden (Postdrug-Kontrollphase). Es stellte sich heraus, dass bei 25 % der
Tiere durch Levetiracetam eine vollständige Anfallskontrolle erreicht werden konnte,
wohingegen weitere 25 % als Nonresponder definiert wurden. Die verbleibenden 50
% galten als variable Responder mit einer Senkung der Anfallsfrequenz (GLIEN et
al., 2002). LEITE und CAVALHEIRO (1995) bedienten sich ebenfalls des Pilocarpin-
Modells, um die Effizienz einiger Antiepileptika zu testen. Diese Studie wird im
Diskussionsteil des Selektionsmodells näher beschrieben. Wie bereits bei den
Epilepsiemodellen erläutert, weisen chemische Modelle einige Nachteile gegenüber
elektrischen Modellen auf, weshalb im folgenden Kapitel speziell auf das elektrische
Post-SE-Modell und seine besondere Relevanz für Pharmakoresistenzstudien
eingegangen werden soll.
2.5.2 Elektrisches Post-Status epilepticus-Modell für Pharmakoresistenzstu-dien Das für die vorliegende Arbeit verwendete elektrische Post-SE-Modell, welches bei
den Epilepsiemodellen ausführlich beschrieben wurde, konnte von BRANDT et al.
(2004) als Modell für Pharmakoresistenz etabliert werden. So sprachen in dieser
Literaturübersicht
25
vorhergehenden Studie sechs von insgesamt elf Ratten mit spontan
wiederkehrenden Anfällen mit einer kompletten Anfallskontrolle auf das
Antiepileptikum Phenobarbital an und ein weiteres Tier zeigte eine Senkung der
Anfallsfrequenz um mehr als 90 %, weshalb diese sieben Ratten als Responder
beschrieben wurden. Drei weitere Tiere zeigten während der Behandlung statt einer
antikonvulsiven Reaktion sogar einen Anstieg der Anfallsfrequenz. Das vierte Tier
zeigte nur eine moderate (< 50 %) Anfallskontrolle, so dass diese vier Tiere als
Nonresponder eingestuft wurden (BRANDT et al., 2004). Die Plasmakonzentrationen
von Phenobarbital unterschieden sich zwischen Respondern und Nonrespondern
nicht signifikant. Alle Tiere zeigten generalisierte konvulsive Anfälle (BRANDT et al.,
2004). VOLK und LÖSCHER (2005) konnten dann bei den gleichen Phenobarbital-
Nonrespondern eine signifikante Hochregulation von P-gp im piriformen Kortex, im
Gyrus dentatus und in der CA1-Region des Hippocampus gegenüber den
Respondern nachweisen. Histologische Untersuchungen ergaben außerdem einen
signifikanten Neuronenverlust in der CA1, CA3c/CA4 und im dentaten Hilus von
Nonrespondern, wohingegen sich die Responder diesbezüglich nicht von nicht-
epileptischen Kontrollen unterschieden (VOLK et al., 2005). Des weiteren wurde
anhand von Rezeptor-autoradiographischen Untersuchungen beobachtet, dass die
Nonresponder eine erhöhte Dichte von Diazepam-insensitiven GABA-Rezeptoren im
Gyrus dentatus, sowie eine reduzierte Dichte von Diazepam-sensitiven Rezeptoren
im Hilus aufwiesen (VOLK et al., 2005). Das Modell wird daher als geeignet
angesehen für Studien, welche sich mit der Untersuchung der multifaktoriellen
Ursachen von Pharmakoresistenz beschäftigen. Das elektrische Post-SE-Modell
sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst dahingehend erweitert werden, dass neben
Phenobarbital ein zweites Antiepileptikum zum Einsatz kommt, welches im folgenden
beschrieben wird.
2.6 Antiepileptika Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Antiepileptika wirken nach gegenwärtigem
Kenntnisstand rein symptomatisch (antikonvulsiv, anti-iktal) und sind weder in der
Lage eine Epilepsie noch ihre Progression zu verhindern (SCHACHTER, 2002). Die
Literaturübersicht
26
im folgenden beschriebenen, hier verwendeten Antiepileptika Phenobarbital und
Phenytoin haben sich als effektiv bei der Behandlung einfacher und komplex-fokaler
Anfälle, sekundär generalisierter Anfälle und primär generalisierter tonisch-klonischer
Anfälle erwiesen (LÖSCHER, 1997).
2.6.1 Phenobarbital Das Antiepileptikum Phenobarbital gehört zu den Barbituraten und wirkt 1) indem es
die GABA-Antwort bei geringen Konzentrationen potenziert, 2) über eine direkte
Aktivierung des GABA-Rezeptors und 3) über eine Blockade des Chloridkanals bei
hohen Konzentrationen (STUDY und BARKER, 1981; TWYMAN et al., 1989). Es
wurde beschrieben, dass Phenobarbital ein Substrat des Multidrug-Transportes P-gp
darstellt (SCHUETZ et al., 1996; POTSCHKA et al., 2002). Phenobarbital ist für
chronische Untersuchungen besonders geeignet, da es eine ausreichend lange
Halbwertszeit besitzt (17 Std. bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten), welche eine
Aufrechterhaltung eines „therapeutischen“ Plasmalevels über eine längere
Behandlungsdauer erlaubt (LÖSCHER und HÖNACK, 1989; LEITE und
CAVALHEIRO, 1995; BRANDT et al., 2004).
2.6.2 Phenytoin Phenytoin gilt als eines der wichtigsten nicht-sedativen Antiepileptika für die
Behandlung von generalisierten, tonisch-klonischen und fokalen Anfällen. Die
antiepileptische Wirkung scheint in erster Linie durch einen inhibitorischen Effekt auf
spannungsabhängige Natriumkanäle vermittelt zu werden (ROGAWSKI und
PORTER, 1990). Das Antiepileptikum Phenytoin wird als Stabilisator von erregbaren
Membranen angesehen, da es wiederholter elektrischer Aktivität vorbeugt oder diese
unterdrückt (JURNA, 1985; ROGAWSKI und PORTER, 1990) Es ist bekannt, dass
Phenytoin ein Substrat des Multidrug-Transporters P-gp darstellt (POTSCHKA und
LÖSCHER, 2001a) und allem Anschein nach wird es auch von MRP2 transportiert
(POTSCHKA und LÖSCHER, 2001b; LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b und c).
Die Metabolisierung von Phenytoin erfolgt durch Hydroxylierung mittels eines
Hydroxylasekomplexes im endoplasmatischen Retikulum der Leber (JONES und
Literaturübersicht
27
WIMBISH, 1985). Da die Rate, mit welcher Phenytoin hydroxyliert wird,
dosisabhängig ist (Kinetik 0. Ordnung), kann keine genaue Halbwertszeit kalkuliert
werden (JONES und WIMBISH, 1985; PERUCCA und RICHENS, 1984). Außerdem
inhibiert der Hauptmetabolit von Phenytoin, das 5-5-Phenylhydantoin die
Hydroxylierung des Phenytoins bei der Ratte (ASHLEY und LEVY, 1972). Durch
wiederholte Phenytoinapplikation werden die metabolisierenden Enzyme langfristig
gehemmt, was zu einer verminderten Elimination von nachfolgenden Dosen führt. Als
Konsequenz der resultierenden Akkumulation und Neurotoxizität der Substanz ist die
Entwicklung eines Behandlungsprotokolls für chronische Phenytoinapplikationen um
einiges komplizierter als für andere Antiepileptika. Ein Vorteil dieser speziellen
Sättigungskinetik ist jedoch, dass aktive Plasmakonzentrationen durch einmalige
Gabe am Tag aufrechterhalten werden können, wohingegen die meisten anderen
Antiepileptika bis zu dreimal täglich verabreicht werden müssen, bedingt durch die
schnellere Eliminationsrate bei Ratten im Vergleich zum Menschen (RUNDFELDT
und LÖSCHER, 1993; LÖSCHER und SCHWARK, 1985; HÖNACK und LÖSCHER,
1989; LÖSCHER und HÖNACK, 1989; LÖSCHER et al., 1989; LÖSCHER und
RUNDFELDT, 1991). LÖSCHER und RUNDFELDT beschrieben 1991, dass
Phenytoin sich im Kindling-Modell als geeignet erwies, pharmakoresistente von
pharmakosensitiven Tieren zu selektieren. So reagierten 20 % der weiblichen Wistar-
Ratten mit einem Anstieg der fokalen Anfallsschwelle (Phenytoin-Responder) und 20
% nicht (Phenytoin-Nonresponder). Die übrigen 60 % wurden als variable Responder
eingestuft (LÖSCHER und RUNDFELDT, 1991).
2.7 GABAA-Rezeptoren bei Epilepsie GABA (γ-Aminobuttersäure) stellt von den Säugetieren bis zu den Crustaceen den
wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Zentralnervensystem dar (BARNARD
et al., 1998). Neben metabotropen GABAB-Rezeptoren existieren ionotrope GABAA-
und GABAC-Rezeptoren, wobei letzterer insensitiv gegenüber klassischen
Modulatoren wie Benzodiazepinen und Barbituraten ist und ausschließlich in der
Retina exprimiert wird. Daneben gibt es möglicherweise ionotrope GABAD-
Rezeptoren, welche im embryonalen Hirnstamm exprimiert werden. Die genaue
Literaturübersicht
28
Klassifikation ist dabei nicht ganz unumstritten (BARNARD et al., 1998). Bei der
Temporallappenepilepsie treten chronische Modifikationen der Funktion von
postsynaptischen GABAA-Rezeptoren auf, welche potentielle Mechanismen für
Epileptogenese und Pharmakoresistenz darstellen (BUHL et al., 1996; GIBBS et al.,
1997; BROOKS-KAYAL et al., 1998). Aus diesem Grund soll im folgenden genauer
auf den GABAA-Rezeptor eingegangen werden.
Beim GABAA-Rezeptor handelt es sich um einen transmittergesteuerten Ionenkanal,
welcher aus einem Pentamer mit vier membrandurchspannenden Kanälen (M1-M4)
konstituiert wird, um einen intrinsischen Chloridkanal zu formen (ALEXANDER et al.,
2007). GABAA-Rezeptoren werden von einer Vielzahl positiver und negativer
allosterischer Modulatoren, einschließlich Barbituraten, Benzodiazepinen,
Neurosteroiden, Penizillinen, Picrotoxin, Bicucullin und Zink, reguliert (KAPUR und
MACDONALD, 1997). Die pharmakologischen Eigenschaften sind abhängig von der
Komposition der Untereinheiten (MACDONALD und OLSEN, 1994). Die Sensitivität
von GABAA-Rezeptoren gegenüber Benzodiazpinen erfordert beispielsweise die
Präsenz einer γ-Untereinheit und die relative Affinität für viele Benzodiazpinrezeptor-
Agonisten basiert auf der jeweiligen α-Untereinheit des Rezeptors (KAPUR und
MACDONALD, 1997). Um alle pharmakologischen Eigenschaften eines nativen
GABAA-Rezeptors zu erfüllen, müssen mindestens drei verschiedene Untereinheiten
exprimiert werden (ARAUJO et al., 1998).
Bei Säugetieren konnten insgesamt 19 Untereinheiten differenziert werden: sechs α,
drei β, drei ρ, drei γ, eine δ, eine ε, eine θ und eine π (BARNARD, 2000; KORPI et
al., 2002). Im Zentralnervensystem werden vornehmlich Rezeptoren bestehend aus
α1β2γ2 exprimiert, gefolgt von α2β3γ2 und α3β3γ2 -Isoformen. Die α- und die β-
Untereinheit tragen zur GABA-Bindungsstelle bei (ALEXANDER et al., 2007). Die
Benzodiazpinbindungsstelle ist höchstwahrscheinlich zwischen der α- und der γ-
Untereinheit lokalisiert (SIGEL und BUHR, 1997). Die einzelnen Isoformen der α- und
γ-Untereinheiten üben gravierende Effekte auf die Effizienz und das
Erkennungspotenzial der Benzodiazepin-Bindungsstelle aus. Es werden mehrere
Typen von Bindungsstellen unterschieden: Typ I umfasst Rezeptorkompositionen mit
α1β1γ2 und einer Sensitivität für Zolpidem und Diazepam. Die Zusammensetzung
Literaturübersicht
29
α2β1γ2, α3β1γ2 oder α5β1γ2 produziert die Benzodiazepin-Bindungsstelle Typ II mit
hoher Diazepam- und geringer Zolpidemsensitivität. Typ III enthält Rezeptoren mit
α4- oder α6-β1γ2-Untereinheiten, welche insensitiv gegenüber Benzodiazepinen sind
(MACDONALD und KELLY, 1995; MACDONALD und KAPUR, 1999).
Während Benzodiazepine vornehmlich extrazellulär binden, sind Bindungsstellen für
Barbiturate in der Transmembranregion lokalisiert (KORPI et al., 2002). Barbiturate
binden an eine allosterische regulatorische Bindungsstelle des GABAA-Rezeptors
(MACDONALD und KAPUR, 1999). Die Effekte von Barbituraten sind größtenteils
von der β-Untereinheit abhängig, und die Aktivität von Agonisten wird durch die
jeweilige α-Untereinheit substantiell beeinflusst (DRAFTS und FISHER, 2006).
Barbiturate wie das hier verwendete Phenobarbital wirken auf den GABAA-Rezeptor
durch eine Erhöhung der Dauer der Kanalöffnung (MACDONALD et al., 1989;
TWYMAN et al., 1989) wohingegen Benzodiazepine die Frequenz der
Rezeptoröffnung erhöhen (VICINI et al., 1987; ROGERS et al., 1994).
Barbiturate aktivieren in hohen Konzentrationen, ähnlich Neurosteroiden, den
Rezeptor direkt, d. h. auch in der Abwesenheit von GABA (PUIA et al., 1990). Der
Prototyp eines GABAA-Rezeptors wird selektiv von Muscimol aktiviert und kompetitiv
durch Bicucullin sowie nicht-kompetitiv mittels Picrotoxin antagonisiert (KORPI et al.,
2002).
Zusammenfassung und Zielsetzung
30
3 Zusammenfassung und Zielsetzung
Epilepsie beschreibt nicht nur ein einzelnes Krankheitsbild, sondern vielmehr eine
diverse Familie von Krankheiten, welcher die abnorme Anfallsprädisposition
gemeinsam ist (Internationale Liga gegen Epilepsie, aus FISHER et al., 2005). In der
Human- und Veterinärmedizin stellen Epilepsien die häufigsten chronischen
neurologischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems dar, und die
Behandlung erfolgt in den meisten Fällen pharmakotherapeutisch. Ungefähr ein
Drittel der Patienten leidet unter Pharmakoresistenz (REGESTA und TANGANELLI,
1999; LÖSCHER, 2003) und den daraus resultierenden sozialen, neurobiologischen
und kognitiven Konsequenzen.
Bei der häufigsten Epilepsieform, der so genannten Temporallappenepilepsie,
welche gekennzeichnet ist durch komplex-fokale Anfälle, erweisen sich sogar
dreiviertel der Patienten als refraktär gegenüber gängigen Behandlungsstrategien
(LEPPIK, 1992). Tiermodelle, welche diese Situation beim Menschen widerspiegeln,
wären daher optimal, um Kausalitätsstudien durchzuführen und darauf basierend
neue Behandlungsmöglichkeiten zu entwickeln.
Die Frage, warum sich manche Epilepsien nicht oder nur unzureichend behandeln
lassen, ist noch nicht hinreichend geklärt. Es handelt sich jedoch aller
Wahrscheinlichkeit nach um einen multifaktoriellen Prozess (REGESTA und
TANGANELLI, 1999; KWAN und BRODIE, 2002; LÖSCHER und POTSCHKA,
2002). Neben genetischen Ursachen werden Veränderungen der Zielstruktur sowie
eine Überexpression von Multidrug-Transportern wie P-gp in der Blut-Hirnschranke
als mögliche Gründe für pharmakoresistente Epilepsie genannt (LÖSCHER und
POTSCHKA, 2002; LÖSCHER und POTSCHKA, 2005 a und b). Weiterhin treten bei
der Temporallappenepilepsie chronische Modifikationen der Funktion von
postsynaptischen GABAA-Rezeptoren auf, welche potentielle Mechanismen für
Epileptogenese und Pharmakoresistenz darstellen (BUHL et al., 1996; GIBBS et al.,
1997; BROOKS-KAYAL et al., 1998).
In der vorliegenden Arbeit sollten die zugrunde liegenden Mechanismen von
refraktärer Epilepsie anhand eines Tiermodells, basierend auf dem bisherigen
Zusammenfassung und Zielsetzung
31
Wissensstand, weitergehend untersucht werden. Dafür wurden folgende
Fragestellungen und Arbeitshypothesen definiert:
1) Ist es möglich, ein bereits etabliertes elektrisches Post-SE-Rattenmodell für
die Selektion von pharmakoresistenten und pharmakosensitiven Tieren
dahingehend weiterzuentwickeln, dass es der oben beschriebenen Definition
von Pharmakoresistenz entspricht, nach welcher die pharmakoresistenten
Tiere sich als refraktär gegenüber der Behandlung mit mindestens zwei
Antiepileptika erweisen müssen?
2) Ist es möglich, die Überexpression des Multidrug-Transporters P-gp bei
pharmakoresistenten Ratten durch gleichzeitige Gabe eines hochspezifischen
P-gp-Inhibitors mit einem Antiepileptikum zu überwinden?
3) Inwieweit treten zwischen pharmakoresistenten und pharmakosensitiven
Ratten Modifikationen von GABAA-Rezeptoruntereinheiten in hippocampalen
Subregionen auf, im Vergleich untereinander und im Vergleich zu Kontrollen?
Zur Beantwortung dieser Fragen wurde bei weiblichen Sprague-Dawley Ratten
mittels elektrischer Stimulation der basolateralen Amygdala ein Status epilepticus
ausgelöst, welcher in den darauf folgenden Wochen zur Entwicklung von spontan
wiederkehrenden Anfällen führte. Die Behandlung dieser Anfälle erfolgte mittels der
beiden Standardantiepileptika Phenobarbital und Phenytoin, welche die Selektion
von pharmakoresistenten und pharmakosensitiven Subgruppen ermöglichten. Die
Definition eines Responders erforderte dabei eine Anfallsreduktion um > 50%. Tiere
mit einer Senkung der Anfallsfrequenz um weniger als 50 % wurden als
Nonresponder deklariert. Die Überwachung der Tiere erfolgte dabei mithilfe einer
kontinuierlichen EEG- und Videoaufzeichnung sowie einer chromatographischen
Detektion der Plasmalevel des jeweiligen Antiepileptikums. Nach Analyse der
Phenobarbitalphase wurde mit den Nonrespondern eine Kombinationstherapie,
bestehend aus dem Antiepileptikum Phenobarbital und dem hochspezifischen P-gp
Inhibitor Tariquidar, durchgeführt. Danach wurden die Tiere perfundiert und die
Gehirne immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern für die GABAA-
Zusammenfassung und Zielsetzung
32
Rezeptoruntereinheiten α1-5, β2/3, γ2 und δ gefärbt. Die Auswertung der
Gehirnschnitte erfolgte dann mittels optischer Dichtemessung in Bereichen des
Ammonshorns und des Gyrus dentatus in beiden Hirnhemisphären.
Material und Methoden
33
4. Material und Methoden
4.1 Elektrische Epilepsiemodelle 4.1.1 Versuchstiere Als Versuchstiere wurden 40 weibliche Sprague-Dawley Ratten verwendet, welche
von Harlan-Winkelmann, Borchen, bezogen wurden. Weibliche Sprague-Dawley
Ratten wurden deshalb verwendet, da sie verglichen mit weiblichen Wistar-Ratten
und männlichen Sprague-Dawleys den höchsten Prozentsatz (64 %) an Tieren
aufweisen die nach einer Stimulation der basolateralen Amygdala einen SSSE mit
rein generalisierten Konvulsionen entwickeln (BRANDT et al., 2003). In
Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass der Östrus bei gekindelten weiblichen
Ratten keinen Einfluss auf die Anfallsempfindlichkeit oder den Effekt von
Antikonvulsiva ausübt (RUNDFELDT et al., 1990; WAHNSCHAFFE und LÖSCHER,
1992). Die Tiere wurden einzeln in Makrolonkäfigen vom Typ III gehalten, die
Weichholzgranulat als Einstreu enthielten (Altromin; Firma Altrogge, Lage). Als Futter
diente Altromin 1324 Standarddiät, welches einmal wöchentlich erneuert wurde.
Leitungswasser stand ad libitum zur Verfügung und wurde zweimal in der Woche
erneuert. Die Umsetzung der Ratten in frische Käfige erfolgte in einwöchigem
Abstand. Der Hell-Dunkel-Rhythmus bestand aus einem 12 Std. Zyklus (Sommerzeit:
6:00 Uhr Licht an; 18:00 Uhr Licht aus; Winterzeit: 05:00 Uhr Licht an; 17:00 Uhr
Licht aus). Die Raumtemperatur betrug zirka 22˚ Celsius und die Luftfeuchtigkeit 50-
60 %. Bis zum Versuchsbeginn vergingen 5-8 Tage, in denen sich die Tiere an die
neuen Haltungsbedingungen akklimatisieren konnten. Zum Zeitpunkt der Operation
wogen die Tiere 200-230 g. Die Tiere wurden regelmäßig gehandelt und gewogen,
um sie an diese Prozeduren zu gewöhnen.
4.1.2 Elektrodenimplantation Zu Beginn des Eingriffs wurden die Tiere mit Chloralhydrat (360 mg/kg in 10 ml/kg
Aqua dest.) in Narkose versetzt. Ein Tier (NIH 16) verstarb während der Narkose.
Die Implantation der bipolaren Elektrode, bestehend aus einer Ableit- und einer
Stimulationselektrode aus rostfreiem Stahl mit Teflon-Ummantelung, richtete sich
nach der stereotaktischen Operationstechnik. Um die Elektroden exakt zu
positionieren, wurden die Tiere in einen stereotaktischen Apparat eingespannt (Fa.
Material und Methoden
34
Kopf, Tujunga, Kalifornien, USA) und der stereotaktische Atlas von PAXINOS und
WATSON (1998) zur Hilfe genommen, welcher die Lokalisation der Hirnstrukturen
relativ zu Bregma (rostraler Kreuzungspunkt der Schädelknochennähte) darstellt. Die
Verwendung des Atlas bedingt, dass Bregma und Lambda (kaudaler
Kreuzungspunkt der Schädelknochennähte) sich auf gleicher Höhe befinden (siehe
Abb. 1). Dafür musste die Oberkieferhalterung des Stereotakten bei Sprague-
Dawley-Ratten auf -3,9 mm ventral der Interaurallinie eingestellt werden. Die
Koordinaten sowie die Einstellung der Oberkieferhalterung für die
Elektrodenpositionierung variiert zwischen den Rattenstämmen (siehe Tabelle 1).
Die angegebenen Koordinaten basieren auf Elektroden-Lokalisation-Versuchen von
U. Ebert und C. Brandt.
Tabelle 1: Koordinaten in mm relativ zu Bregma für die Implantation der Elektrode in
die rechte basolaterale Amygdala.
lateral rostrokaudal ventral
♀ Sprague-Dawley -4,7 -2,2 8,7
Kontralateral zur Elektrodenimplantation in der rechten basolateralen Amygdala
wurde eine indifferente Erdungselektrode, welche über einen Teflon-isolierten Draht
mit einer Messingbuchse verbunden war, mit Hilfe einer Schraube am
Schädelknochen der Tiere montiert. Außerdem wurden zwei zusätzliche Schrauben
am Schädelknochen der Ratten befestigt (Abb. 1), welche die Fixierung des
kaltpolymerisierenden Kunststoffes Paladur® (Kutzer, Weinheim) optimieren sollten.
Um einer möglichen Wundinfektion vorzubeugen, wurde die erste Schicht Paladur®,
welche in direktem Kontakt zum Schädelknochen stand, zusammen mit dem
Antibiotikum Gentamicinsulfat aufgetragen. Zur weitergehenden Prophylaxe einer
Wundinfektion bekamen die Ratten direkt nach der Implantation 20 mg/kg
Gentamicin intramuskulär (i. m.) injiziert. An den beiden darauf folgenden Tagen
wurde Gentamicin einmal täglich subkutan verabreicht. Anschließend wurde für
insgesamt fünf Tage zweimal am Tag je 100 mg/kg Chloramphenicol-Succinat i.m.
Material und Methoden
35
appliziert. Ein Tier (NIH 12) verstarb während der Antibiose. Nach der Operation
hatten die Tiere ungefähr vier Wochen Zeit, sich zu regenerieren, bevor die
elektrische Stimulation durchgeführt wurde. Neben den Tieren, die durch die
Stimulation einen SE bekommen sollten, wurde auch einer Sham-Gruppe Elektroden
implantiert. Die Tiere dieser Gruppe wurden jedoch nicht elektrisch stimuliert. Eine
weitere Kontrollgruppe wurde zwar in Narkose versetzt und in den Stereotakten
eingespannt, bekam jedoch keine Elektrode eingesetzt.
Abb. 1: Aufsicht auf den Rattenschädel mit Darstellung der Lokalisationen der Stimulations- und Ableitelektrode sowie der Fixationsschrauben (nach PAXINOS und WATSON, 1998; modifiziert von BRANDT, 2002). 4.1.3 Beurteilung der Krampfschwere während des sich selbst erhaltenden Status epilepticus und während spontan wiederkehrender Anfälle Die korrekte Beurteilung der konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfälle während des
SSSE sowie der spontan wiederkehrenden Anfälle erforderte eine standardisierte
Charakterisierung der Anfälle. Für die Bewertung der Krampfschwere kindling-
induzierter Anfälle wurde eine Skala mit den Stadien 0-V aufgestellt (RACINE, 1972).
Material und Methoden
36
Diese wurde nach LÖSCHER und SCHMIDT (1988) modifiziert. C. BRANDT (2002)
hat in ihrer Doktorarbeit ein weiteres Stadium (VI) definiert (siehe Tabelle 2).
Tabelle 2: Skala der Krampfstadien (RACINE 1972, modifiziert nach LÖSCHER und SCHMIDT 1988) Während des SSSE konnten drei verschiedene Statustypen differenziert werden: Typ
1: rein fokaler, nicht-konvulsiver SSSE, welcher gekennzeichnet ist durch Anfälle des
Stadiums I und II; Typ 2: fokaler SSSE mit ähnlichen Symptomen wie Typ 1, jedoch
unterbrochen von gelegentlichen Anfällen des Stadiums III sowie generalisierten
Anfällen (Stadium IV, V oder VI); Typ 3: rein generalisierte, konvulsive Anfallsaktivität
(Stadium IV, V oder VI) (nach BRANDT et al., 2003).
Material und Methoden
37
4.1.4 Modell der elektrischen Stimulation der basolateralen Amygdala Vier bis sechs Tage vor der elektrischen Stimulation wurde von 28 Tieren für jeweils
sechs Stunden ein Ruhe-EEG angefertigt um eventuelle Abweichungen vom
Normalzustand feststellen zu können. Die Stimulation der basolateralen Amygdala
zur Induktion eines SSSE begann 26 bis 30 Tage nach Implantation der Elektroden.
Die Tiere wogen initial 220 bis 260 g. Der Versuchsbeginn variierte von 08:30 bis
11:00 Uhr MEZ, da nur zwei Stimulatoren verfügbar waren, so dass lediglich zwei
Ratten zur gleichen Zeit stimuliert werden konnten.
Anfangs wurden die Tiere an ihrem Steckeraufsatz über ein abgeschirmtes,
zweiadriges Kabel mit der Aufzeichnungseinheit (siehe 4.2) verbunden.
Anschließend wurden die Ratten mit einem weiteren abgeschirmten, zweiadrigen
Kabel an die Stimulator-Einheit (Accupulser Modell A310C und Stimulus Isolator
A365, World Precision Instruments, Berlin) angeschlossen. Zur Induktion eines
SSSE wurde Reizstrom verwendet, welcher aus bipolaren Einzelpulsen von je 1 ms
Dauer bestand. In jeder Sekunde wurden zwei Einzelpulsserien mit einer Dauer von
100 ms generiert. Die Frequenz betrug 50 Hz und die Stromstärke 700 μA.
Insgesamt wurden die Tiere über 25 Min. kontinuierlich stimuliert und dabei auf die
Anfallsstärke hin beobachtet (Tab. 2). Die Definition eines Status epilepticus bedingte
eine andauernde motorische Krampfaktivität der Stadien 1-6 und entsprechende
Ausschläge im EEG (mind. 3 Spitzen/Sek. mit einer doppelt hohen Amplitude wie im
Ruhe-EEG). Die Beurteilung der Krampfschwere erfolgte wie in 4.1.3. erläutert. Nur
Ratten mit einem SSSE wurden in den weiteren Versuch integriert. Nach der
Induktion des SE wurden die Ratten für weitere 1 – 2 Std. kontinuierlich und dann nur
noch stündlich für ca. 5 Min beobachtet, um den weiteren Verlauf des SE
dokumentieren zu können. Nach insgesamt 240 Min. wurde der SSSE mit 10-20
mg/kg Diazepam i. p. unterbrochen. Eine SSSE-Dauer von vier Std. wurde als
adäquate Zeitspanne ermittelt, um das Auftreten von spontan wiederkehrenden
Anfällen während der Latenzphase zu gewährleisten (BRANDT et al., 2003). Nach
abgeschlossener Stimulation wurden die Tiere wieder an die Überwachungseinheit
angeschlossen, und die EEG- und Videoaufzeichnungen wurden bis zum nächsten
Morgen fortgeführt.
Material und Methoden
38
Da die Tiere nach dem SSSE sehr geschwächt waren, wurden die schwächsten
Tiere ab dem zweiten Tag nach der Stimulation für zwei bis drei Tage mit Babybrei
zugefüttert, bis sie wieder selbständig Nahrung aufnehmen konnten.
4.2 Überwachung 4.2.1. Überwachung von spontanen Anfällen im elektrischen Epilepsiemodell In der Latenzphase von der elektrischen Stimulation bis zum Beginn der Selektion
wurden die Tiere regelmäßig gewogen, gehandelt und spontane Anfälle notiert. Nach
ungefähr 3-4 Wochen wurden alle 28 stimulierten Ratten für jeweils acht Std. an das
EEG angeschlossen um zu verifizieren ob bereits paroxysmale Aktivität in Form von
iktalen oder interiktalen Spikes auftrat, welche ein Hinweis auf ein Anfallsgeschehen
darstellen können, und ob die EEGs der Tiere überhaupt verwertbar sind. Zirka 6-7
Wochen nach der Induktion des SSSE wurde mit 20 ausgewählten Tieren eine
längerfristige Frequenzanalyse durchgeführt. Für die Frequenzanalyse wurden die
Tiere für jeweils fünf Tage neun Std. in der Hellphase (08:00-17:00 Uhr MEZ) mittels
EEG und Video überwacht. In Abhängigkeit vom SSSE-Typ (möglichst Typ 3 oder
Typ 2 mit häufigen generalisierten Anfällen), dem Auftreten von spontanen Anfällen
in der Latenzphase sowie der Präsenz von interiktalen Spikes im EEG während der
Frequenzanalyse wurden 15 Tiere für die Selektionsphase ausgewählt.
Während der Behandlungs- und Kontrollphasen wurden die Ratten systematisch auf
spontan wiederkehrende Anfälle mittels einer kontinuierlichen (24 Std./Tag, 7
Tage/Woche) EEG- und Videoaufzeichung überwacht. Tiere, die ihren
Steckeraufsatz im chronischen Versuch verloren, konnten ausschließlich
videoüberwacht werden.
4.2.1.1 Kontinuierliche Überwachung mittels EEG-Ableitung Zur dauerhaften Ableitung eines EEG wurde eine Einheit, bestehend aus einem
Acht-Kanal-Verstärker (CyberAmp 380, Axon Instruments, Inc. Foster City, CA)
beziehungsweise einem acht Ein-Kanal-Verstärker (BioAmps, ADInstruments Ltd,
Hastings, UK), zwei Analog-Digitalwandlern (PowerLab/800s, ADInstruments Ltd.
Hastings, East Sussex, UK) und einem Personal Computer mit der Software Chart4
Material und Methoden
39
für Windows verwendet. Der Verstärker amplifizierte das EEG-Signal um das 100
fache. Insgesamt wurde ein Bereich von +/- 500 mV erfasst. Aufgezeichnet wurde mit
einer Abtastrate von 200 Hz. Sämtliche Frequenzen über 60 Hz wurden durch einen
„low pass Filter“, alle Frequenzen unter 0,1 Hz von einem „High pass filter“ eliminiert.
Unter zur Hilfenahme eines Notch-Filters wurde eine schmales Frequenzband um die
50 Hz (Netzstromfrequenz) herausgefiltert, damit die Aufnahme nach Möglichkeit
störungsfrei war. Die Kabel, welche zur Ableitung des EEG verwendet wurden,
mussten selbst angefertigt werden, da im Handel keine Kabel erhältlich sind, die den
Tieren einen optimalen Bewegungsfreiraum gewährleisten und zudem eine
störungsfreie Aufnahme ermöglichen. Deshalb wurden abgeschirmte, zweiadrige,
ummantelte Kabel benutzt, welche mit einem Telefonentzwirler verbunden wurden.
Die Kabelabschirmung wurde mittels einer Krokodilklemme am Verstärker montiert
um das Grundrauschen möglichst niedrig zu halten.
Die EEGs wurden visuell analysiert. Das System erlaubte eine parallele
Aufzeichnung von 16 Tieren.
4.2.1.2 Kontinuierliche Überwachung mittels Videoaufzeichnung Da die Ratten im chronischen Versuch Gefahr laufen, ihren Steckeraufsatz zu
verlieren, ist es notwendig, die EEG-Ableitungen durch Videoaufzeichnungen zu
ergänzen und notfalls zu kompensieren. Außerdem kann nur durch die
Videoüberwachung der genaue Anfallstyp detektiert werden, da sich fokale und
generalisierte Anfälle im EEG oft ähneln. Im vorliegenden Versuch kamen infrarot-
sensitive CCD-Kamera-Module für Schwarz-Weiß-Aufnahmen zum Einsatz (Conrad
Electronic GmbH, Hannover). Insgesamt standen vier Kameras zur Verfügung,
welche jeweils vier Tiere gleichzeitig erfassen konnten. Das erlaubte eine simultane
Überwachung von maximal 16 Tieren. Die Kameras waren mit einem Multiplexer
(Monacor TVMP-400, Menzel Electronic, Hannover), einem Langzeitvideorekorder
(Sanyo RS232C, Menzel Electronic, Hannover) und einem Fernsehapparat
verbunden. Für die Aufzeichnungen wurden Videobänder mit einer Lauflänge von
240 Min. verwendet. Die Aufnahmen erfolgten in vierfach erhöhter Geschwindigkeit,
so dass eine Zeitspanne von maximal 12 Std. aufgezeichnet werden konnte. Die
Material und Methoden
40
Tiere befanden sich in umgewandelten Aquarien (60 cm x 40 cm x 40 cm), die
rundherum transparent waren und Luftlöcher aufwiesen. Diese Aquarien wurden in
der Mitte mit einer Spanplatte geteilt und stellten so Platz für jeweils zwei Ratten zur
Verfügung. Für die Nachtaufnahmen befanden sich Infrarotlampen über den Käfigen
(Conrad Electronic GmbH, Hannover). Die im EEG ermittelten Anfälle wurden in der
entsprechenden Videosequenz ausgewertet. Bei Kabeldefekten und Verlust des
Steckeraufsatzes wurde das Video komplett analysiert. Die Auswertung der im
Langzeit-Modus aufgenommenen Kassetten am Videorekorder geschah in
Normalgeschwindigkeit. Dadurch ergab sich eine vierfach erhöhte
Abspielgeschwindigkeit. Für die genaue Klassifizierung der Anfallsparameter
Schweregrad, Dauer und Zeitpunkt wurde der Vorlauf manuell geregelt.
4.3 Pharmakologische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell Die pharmakologischen Untersuchungen begannen mit einer Selektionsphase. Dafür
wurden 15 Ratten mit spontan wiederkehrenden Anfällen in die
Überwachungsanlage verbracht. Ein Tier mit einer besonders hohen Anfallsfrequenz
(NIH 9) war aufgrund seiner hohen Aggression nicht zu handeln und musste noch
vor Versuchsbeginn euthanasiert werden. Für den genauen Versuchsablauf siehe
Abb. 2. Während der Substanzphasen (Phenobarbital und Phenytoin) wurde den
Sham-Tieren (n=7), den naiven Kontrollen (n=10) sowie den SE-Tieren, die nicht an
der Selektion teilnahmen (n=6), das äquivalente Volumen 0.9 % ige
Natriumchloridlösung injiziert. Während der Vehikelphase 1 wurde auch den
Selektionstieren 0.9 % ige Natriumchloridlösung als Vehikel appliziert. In den
anderen beiden Vehikelphasen wurde jedoch darauf verzichtet, da die Tiere durch
die kontinuierlichen Applikationen leichte Nekrosen in der Bauchregion aufwiesen.
Material und Methoden
41
Abb. 2: Versuchsplan A) Selektionsphase
Induktion Status
epilepticus spontan wieder-
kehrende Anfälle
Vehikel- phase 1
Vehikel- phase 2
Pheno- barbital
Pheny- toin
Vehikel- phase 3 Implantation
der Elektroden
4 Wochen 14.5 Tage 14.5 Tage 23 Tage 15.5 Tage 13.5 Tage 9 Wochen
EEG/Video-Überwachung 24 Std./Tag, 7 Tage/Woche
B) Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar in Phenobarbital-Nonrespondern
5.5 Tage 8 Tage 7.5 Tage 8 Tage 8 Tage 7 Tage 7 Tage 7 Tage
Video-Überwachung 24 Std./Tag, 7 Tage/Woche
Pheno-barbital + Tariquidar (20 mg/kg)
Kontroll- phase 1
Pheno-barbital + Tariquidar (10 mg/kg)
Pheno-barbital
ohne Tariquidar
Kontroll- phase 2
Pheno-barbital + Tariquidar (15 mg/kg)
Kontroll- phase 3
Tariquidar ohne
Pheno-barbital
X X X
X X X X X X
X = Blutentnahmen für Plasmaanalyse
X X X X
Material und Methoden
42
4.3.1 Phenobarbital-Applikation für chronische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell Die therapeutische Plasmakonzentration für Phenobarbital liegt bei epileptischen
Patienten im Bereich von 10-40 μg/ml (BAULAC, 2002). Aus diesem Grund wurde
ein Dosierungsschema gewählt, welches die Erhaltung eines Plasmaspiegels
innerhalb dieser Grenzen bei Ratten erlaubt (BRANDT et al., 2004). Phenobarbital
wurde in 0.9 % Natriumchlorid gelöst und in einem Volumen von 3 ml/kg appliziert.
Die Injektionen wurden in einem zeitlichen Abstand von 10 bzw. 14 Std. (08:00 Uhr
und 18:00 Uhr MEZ) gesetzt. Die Kontrollen erhielten 0.9 %ige Natriumchloridlösung.
Das Applikationsschema war folgendes:
1. Tag 08:00 Uhr: Bolus 25 mg/kg Phenobarbital i. p.
1. Tag 18:00 Uhr: 15 mg/kg Phenobarbital i. p.
2. – 14.5 Tag 08:00 Uhr und 18:00 Uhr: jeweils 15 mg/kg Phenobarbital i. p.
4.3.2 Phenytoin-Applikation für chronische Untersuchungen Post-Status epilepticus-Modell Für Phenytoin liegt die therapeutische Plasmakonzentration bei epileptischen
Patienten bei 10-20 μg/ml (HVIDBERG, 1985; KUTT und HARDEN, 1999). Phenytoin
wurde in 0.9 %igem Natriumchlorid gelöst und dabei auf dem Heizrührer bis maximal
50° C erwärmt. Unter langsamem Rühren wurde 1 M NaOH dazugeben bis der pH-
Wert bei ungefähr 11,5 lag. Dieser basische pH-Wert ist unerlässlich, damit die
Substanz gelöst bleibt. Die Lösung wurde schnellstmöglich injiziert, da beim
Abkühlen die Gefahr besteht, dass Phenytoin ausfällt. Phenytoin wurde i. p. in einem
Volumen von 3 ml/kg verabreicht. Die Injektionen erfolgten in einem Abstand von 12
Std. (07:00 Uhr und 19:00 Uhr MEZ). Die Kontrollen erhielten 0.9 % ige
Natriumchloridlösung. Zur Ermittlung des optimalen Dosierungsschemas für
Phenytoin wurden mehrere Vorversuche an nicht epileptischen Tieren unternommen:
1. Vorversuch (n=2): 1. Tag: 07:00 Uhr: Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab
2. Tag: 07:00 Uhr und 19:00 Uhr: je 50 mg/kg Phenytoin– toxisch nach 4 Tagen (Seitenlage der Tiere; Plasmakonzentration 50-80 μg/ml)
Material und Methoden
43
2. Vorversuch (n=2): kein Bolus; ab Tag 1: 07:00 Uhr und 19:00 Uhr je 50 mg/kg
Phenytoin – toxisch nach 4 Tagen (Seitenlage der Tiere, Plasmakonzentration bei 40 μg/ml) 3. Vorversuch (n=1): 1. Tag: 07:00 Uhr: Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab
2. Tag: 07:00 Uhr: 40 mg/kg Phenytoin; 19:00 Uhr: 20 mg/kg Phenytoin –
Plasmakonzentration nach 5 Tagen zu gering (< 10 μg/ml) 4. Vorversuch (n=2): 1. Tag: 07:00 Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab 2.
Tag: 07:00 Uhr und 19:00 Uhr: je 35 mg/kg Phenytoin – Plasmakonzentration bei einem Tier nach 8 Tagen zu gering (< 10 μg/ml) 5. Vorversuch (n=1): 1. Tag: 07:00 Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab 2.
Tag: 07:00 Uhr und 19:00 Uhr: je 25 mg/kg Phenytoin – Plasmakonzentration nach 5 Tagen zu gering (< 10 μg/ml) 6. Vorversuch (n=8): 1. Tag: 07:00 Uhr Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab 2. Tag: 07:00 Uhr: 50 mg/kg Phenytoin; 19:00: 25 mg/kg Phenytoin – Plasmakonzentrationen auch nach 5-8 Tagen noch im gewünschten Bereich (10-20 μg/ml) Beim Übertragen des Dosierungsschemas aus dem 6. Vorversuch auf die
epileptischen Tiere zeigten sich ab dem 2. Behandlungstag unerwartet gravierende
Nebenwirkungen (starke Sedation und Ataxie, prokonvulsive Effekte). Deshalb
wurden die Ratten ab dem 2. Tag zirka 30 Min. vor der Applikation auf
Nebenwirkungen beobachtet und in Abhängigkeit vom jeweiligen Befinden individuell
dosiert (Tab. 3).
Material und Methoden
44
Tab. 3: Individuelle Tagesdosis Phenytoin für jedes epileptische Tier über 15 Behandlungstage in mg/kg Vor dem Schrägstrich ist die jeweilige Morgendosis angegeben und hinter dem Schrägstrich die jeweilige Abenddosis
Phenytoin-Responder Phenytoin-Nonresponder Tag NIH 4 NIH 7 NIH 10 NIH 18 NIH 21 NIH 25 NIH 6 NIH 8 NIH 13 NIH 14 NIH 17 NIH 23 NIH 24 NIH 31 NIH 11
1 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 2 50/0 50/0 50/0 50/25 50/0 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/0 50/25 50/0 50/25 3 25/25 12,5/12,5 25/12,5 50/25 25/25 50/12,5 50/12,5 50/25 50/12,5 50/12,5 50/25 50/25 50/25 12,5/25 50/25 4 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 25/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 5 50/25 25/25 50/25 50/25 25/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 25/25 50/25 25/25 50/25 6 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 7 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 8 50/35 50/35 50/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 9 50/35 50/35 50/35 50/50 50/0 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 10 50/35 50/35 50/35 50/50 50/25 50/25 50/0 50/35 50/25 50/35 50/35 50/12,5 50/35 50/12,5 50/35 11 50/35 50/35 50/35 50/50 50/35 50/35 50/50 50/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/0 50/35 12 50/35 50/35 35/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/25 50/35 0 50/35 13 50/35 50/35 50/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/25 50/35 25/35 50/35 14 50/35 35/35 50/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 15 50/35 50/25 50/35 50/50 50/35 50/25 50/25 50/35 50/35 50/35 50/35 50/25 50/35 50/35 50/25
Material und Methoden
45
4.3.3 Selektion von Respondern und Nonrespondern Für die anschließende Kombinationsstudie wurden die Versuchstiere anhand der
EEG- und Videoauswertungen in pharmakoresistente (Nonresponder) und
pharmakosensitive (Responder) Tiere unterteilt. Der Definition eines Responders
wurde dann entsprochen, wenn die Anfälle während der Behandlungsphase im
Vergleich mit der ersten Vehikelphase entweder komplett oder um mindestens 50 %
reduziert werden konnten. Nonresponder zeigten entsprechend überhaupt keine
Verminderung ihrer Anfallsfrequenz oder lediglich eine Reduktion um < 50 %
(BRANDT et al., 2004). Da die Auswertungen der EEG- und Videoaufzeichnungen
sehr zeitintensiv sind, wurden nur die Nonresponder aus der Phenobarbitalphase
(n=6) in die Kombinationsstudie übernommen. Die Analyse der Phenytoinphase
folgte später.
4.3.4 Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar (XR 9576) bei Phenobarbital-Nonrespondern Die Kombinationsstudie startete etwa zwei Monate nach Beendigung der
Selektionsphase. Diese Zeitspanne war nötig, um das Video- und EEG-Material
auszuwerten. Im Kombinationsmodell von Phenobarbital und dem P-gp-Inhibitor
Tariquidar wurde für Phenobarbital dieselbe Dosierung verwendet wie unter 4.3.3
beschrieben. Tariquidar wurde in 2,5 % Dextroselösung (mit Aqua dest.) unter
leichter Erwärmung auf dem Heizrührer gelöst. Aufgrund der besseren Verträglichkeit
wurde die Applikationsroute für Tariquidar nach 5 Behandlungstagen von i. p. auf
peroral mittels Metallsonden für eine intragastrale Applikation umgestellt. In
klinischen Studien wurden Probanden ebenfalls orale Kapseln verabreicht
(STEWART et al., 2000). Die orale Bioverfügbarkeit von XR 9576 liegt für Mäuse bei
80 % und ist bei Ratten bislang unbekannt (John Waterfall, Xenova Group,
persönliche Mitteilung). Das Dosierungsvolumen lag bei 3 ml/kg. Tariquidar wurde in
Dosierungen von 10, 15 und 20 mg/kg (siehe Versuchsplan B Abb. 2) 45 Min. vor
Phenobarbital verabreicht.
Die Behandlungsdauer betrug während der Gabe von 20 mg/kg Tariquidar und
Phenobarbital bei 5,5 Tage und während der darauf folgenden Versuche 7-8 Tage,
Material und Methoden
46
da die Verfügbarkeit von Tariquidar begrenzt war und möglichst viele
unterschiedliche Dosierungen getestet werden sollten. Weiterhin war die Frequenz
der spontan wiederkehrenden Anfälle bei den Phenobarbital-Nonrespondern hoch
genug, um eine Aussage über die Behandlungseffizienz während einwöchiger
Versuche zu treffen. Jeweils 10 Std. nach der ersten und nach der letzten Injektion
wurde Blut entnommen, um die Plasmakonzentration von Phenobarbital zu
bestimmen.
4.3.5 Blutentnahme Zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Phenobarbital und Phenytoin
wurde den Versuchstieren zu bestimmten Zeitpunkten (siehe Abb. 2) Blut aus dem
retrobulbären Venenplexus entnommen. Dazu wurden die Augen der Ratten kurz vor
der Entnahme mit 2 % iger Tetracainlösung lokal anästhesiert. Zum Blutabnehmen
wurden die Tiere fixiert und eine heparinisierte Hämatokritkapillare am
Augeninnenrand bis zum Venenplexus vorgeschoben. Der Plexus wurde punktiert
und ungefähr 0.5 ml Blut in Eppendorfgefäßen, welche jeweils 10 μl EDTA
(Ethylendiamintetraacetat) zur Hemmung der Blutgerinnung enthielten, aufgefangen.
Die Blutung wurde durch Kompression mit Eisbeuteln zum Stillstand gebracht. Das
gewonnene Blut wurde bei 12.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.
Anschließend wurde das Plasma im Überstand abpippetiert und bis zur Analyse bei
-20˚ Celsius aufbewahrt. Die Detektion der Plasmakonzentration erfolgte mittels
HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) mit Ultraviolett-Nachweis. Die HPLC-
Bestimmung von Phenobarbital und Phenytoin erfolgte nach der bei POTSCHKA et
al. (2002) beschriebenen Methode.
4. 4 Histologie 4.4.1 Fixierung Der Nachweis einer veränderten Expression von GABAA-Rezeptoruntereinheiten
erforderte eine Perfusion aller Tiergruppen aus dem Selektionsmodell. Zu Beginn der
Perfusionsfixierung wurden sämtliche Ratten mit 500 mg/kg Chloralhydrat in eine
tiefe Narkose versetzt. Die Perfusionmethode bedient sich des natürlichen
Material und Methoden
47
Gefäßsystems des Körpers. Zunächst wurde eine Knopfkanüle durch den linken
Herzventrikel bis in die Aorta vorgeschoben. Danach wurde der rechte Herzvorhof
eröffnet, um den Abfluss von Perfusionslösung und Blut zu ermöglichen. Der
konstante Perfusionsdruck wurde durch die Position der Flaschen mit der
Perfusionslösung gewährleistet und entsprach ungefähr dem Blutdruck des Tieres.
Zuerst wurde der Blutkreislauf der Tiere mit 0,01 M phosphatgepufferter 0,9 % iger
Kochsalzlösung (pH 7,6) gespült. Anschließend wurden die Ratten mit maximal 500
ml Fixans perfundiert. Die Fixationslösung bestand aus 4 % Paraformaldehyd sowie
15 % gesättigter Pikrinsäure-Lösung in 0,15 M Phosphatpuffer (pH 7,4) und besaß
eine Temperatur von 4˚ Celsius (SOMOGYI und TAGAKI, 1982). Die Fixierung mit
Paraformaldehyd denaturiert die Epitope der Proteine weniger stark als eine
Formalinfixierung. Die Verwendung von Pikrinsäure erleichtert die Penetration der
Antikörper. Die Gehirne wurden sofort nach der Perfusion entnommen und für 90
Min. in eiskalter Fixans nachfixiert. Um einen ausreichenden Gefrierschutz zu
erreichen, wurde das Gewebe über Nacht in 10 % Zuckerlösung gelagert und am
folgenden Tag in 30 % Zuckerlösung überführt, bis die Gehirne auf den Boden der
Gefäße sanken (24-48 Std.).
4.4.2 Gefrierschnitte
Nach der Perfusion wurden von den Gehirnen Gefrierschnitte am Gefriermikrotom
(Frigomobil CM1325, Leica) angefertigt. Die Schnittdicke betrug 40 μm, und es
wurden insgesamt sechs Serien erstellt, sodass die Schnitte innerhalb einer Serie
einen Abstand von 240 μm innehatten. Die Gehirne wurden in einem Bereich von 1,6
mm anterior bis -6,04 mm posterior relativ zu Bregma geschnitten und in 0,1 M
Phosphatbuffer überführt.
4.4.3 Immunperoxidasefärbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten 4.4.3.1 Antikörper Aus den 19 bekannten Untereinheiten des GABAA-Rezeptors (BARNARD, 2000;
KORPI et al., 2002) wurden folgende 6 Untereinheiten ausgewählt, für welche
Material und Methoden
48
Antikörper zur Verfügung standen und die beim Epilepsiegeschehen eine Rolle
spielen könnten: α1-5, β2/3, δ und γ2.
Zum Nachweis der verschiedenen Untereinheiten wurden monoklonale, identische
Antikörper aus Meerschweinchen, Kaninchen und Maus verwendet, welche aus B-
Zellklonen gewonnen werden und die sich gegenüber den aus B-Lymphozyten
generierten polyklonalen Antikörpern durch eine hohe Spezifität kennzeichnen. Der
Nachteil bei der Verwendung von monoklonalen Antikörpern besteht darin, dass kein
Nachweis mehr möglich ist, wenn das Epitop beispielsweise durch die Fixierung
beschädigt wurde, wohingegen polyklonale Antikörper an verschiedene
Bindungsstellen andocken können (BOENISCH, 2003).
4.4.3.2 Farbreaktion (DAB-ABC-Methode) Bei der DAB-ABC (Avidin-Biotin-Complex)- Methode werden immunenzymatische
Enzym-Substratreaktion genutzt, um farblose Chromogene (DAB;
3,3´Diaminobenzidin) in gefärbte Endprodukte umzuwandeln. Die verwendete
Färbemethode basiert auf der hohen Affinität von Streptavidin (Streptomyces avidinii)
zu dem Hühnereiweiß Biotin (HSU et al., 1981). Dabei bindet ein spezifischer
Primärantikörper an einen biotinylierten Sekundärantikörper gegen Immunglobuline
derjenigen Art, aus welcher der Primärantikörper gewonnen wurde. Ein Komplex,
bestehend aus Streptavidin und Meerrettichperoxidase bindet dann an das Biotin.
Beim eigentlichen Färbevorgang transferiert die Meerrettichperoxidase
Wasserstoffionen aus dem DAB auf Wasserstoffperoxid unter der Bildung von
Wasser. Das DAB fällt dabei unter Bildung einer bräunlichen Färbung aus.
Eine Abschwächung der unerwünschten Hintergrundfärbung wurde durch die
Zugabe von Rattenserum zur Primärantikörperlösung erreicht, da das Rattenserum
unspezifische Bindungsstellen blockiert.
4.4.4 Standardprotokoll für die Färbung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten Zur Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten wurde ein in der Arbeitsgruppe von
Prof. J.M. Fritschy etabliertes Protokoll verwendet (FRITSCHY und MÖHLER, 1995).
Zur Analyse der regionalen Verteilung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten im
Material und Methoden
49
Hippocampus wurden je sechs Schnitte pro Tier und pro Antikörper aus
verschiedenen Hirnregionen verwendet. Um Artefakte zu vermeiden, wurden für
jeden Antikörper die zu untersuchenden Gruppen (Responder, Nonresponder, Sham,
Kontrollen) gemeinsam in einem Durchgang gefärbt und die einzelnen Gruppen
dabei in den verschiedenen Wellplatten so verteilt, dass sich in einer Wellplatte
immer mehrere Gruppen befanden. Die frei flotierenden Schnitte wurden über Nacht
bei 4˚ Celsius auf dem Rüttler mit dem Primärantikörper inkubiert (je zwei Schnitte
pro well). Der Primärantikörper wurde in Trisgepufferter Saline (pH 7.4), bestehend
aus 2 % des Serums, aus welchem der Sekundärantikörper stammt, 0,2 % Triton X-
100 und 2 % Rattenserum, versetzt. Die Antikörper wurden wie folgt verdünnt: α1:
1:20.000; α2: 1:750; α3: 1:4000; α4: 1:2000; α5: 1:3000; β2/3: 1:20.000; δ: 1: 2000;
γ2: 1:2000. Am zweiten Tag wurden die Schnitte dreimal in Tris-Triton gewaschen,
bevor sie mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper (1:300 in Tris-Triton, pH 7.4 und
2 % normalem Serum aus der Ziege) inkubiert wurden. Alle Sekundärantikörper
stammten aus der Ziege (α1, α4, δ: Ziege-anti Kaninchen Antiserum; α2, α3, α5, γ2:
Ziege-anti Meerschweinchen Antiserum; β2/3: Ziege-anti Maus Antiserum).
Anschließend wurden die Schnitte für 30 Min. im Sekundärantikörper auf dem Rüttler
inkubiert bevor sie erneut dreimalig mit Tris-Triton gespült wurden. Danach wurden
die Schnitte für 30 Min. in Avidin-Peroxidase-Lösung (ABC-Lösung: Elite ABC kit,
Vector Laboratories: 1 % Reagenz A und 1 % Reagenz B in Tris-Triton, pH 7.4)
transferiert. Mittels eines weiteren Spülganges wurde überschüssige Lösung entfernt
und die Schnitte wurden vor dem eigentlichen Färbeschritt für 5-10 Min. in der Hälfte
der DAB-Lösung (verdünnt in Tris-Triton, pH 7.7: 1 ml DAB in 50 ml Triton)
vorinkubiert. Die Färbereaktion wurde gestartet, indem die andere Hälfte der DAB-
Lösung zusammen mit 0,03 % H202 dazupipettiert wurde. In Abhängigkeit von der
Färbeintensität wurde die Färbung der Schnitte nach 5-10 Min. durch einen Transfer
in eiskalte PBS (4˚ Celsius) beendet. Abschließend wurden die Schnitte gründlich
vom DAB gereinigt, auf Gelatine-bezogene Objektträger aufgezogen und über Nacht
an der Luft getrocknet. Am darauf folgenden Tag wurden die Schnitte in einer
aufsteigenden Ethanol- (70 %, 70 %, 96 %, 96 %, 100 %, 100 %, 100 % je 5 Min.)
und Xylolreihe (viermal je 5 Min.) dehydriert und mit Eukitt eingedeckt.
Material und Methoden
50
In Kontrollversuchen wurde keine spezifische Färbung bezüglich der Prä-Absorption
der primären Antikörper mit ihrem jeweiligen Antigen detektiert.
Bei Messungen der optischen Dichte wäre es optimal, für jede Untereinheit den
Hintergrund in der weißen Substanz zu messen, das heißt, in einer Region, in
welcher die jeweilige Untereinheit nicht oder kaum exprimiert wird. In
Sagittalschnitten ist dies relativ einfach durchzuführen. Bei Koronalschnitten, wie im
vorliegenden Versuch verwendet, im Bereich des Hippocampus, gibt es solche
Regionen jedoch kaum. Eine weitere Lösung wäre die Subtraktion des Hintergrunds
im Corpus Callosum, jedoch ergibt sich dadurch kein Unterschied bei den
Ergebnissen, da die weiße Substanz leicht angefärbt wird. Eine dritte Möglichkeit der
Normalisierung der Intensität bestünde in der Messung einer Region, welche durch
das Epilepsiegeschehen keine Änderungen aufweist. Wiederum existieren solche
Regionen in Koronalschnitten kaum (persönliche Kommunikation Prof. Fritschy,
Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Uni Zürich). Aus diesen Gründen wurde
kein Referenzwert von den ermittelten Dichtedaten abgezogen.
4.5 Auswertung 4.5.1 Optische Dichtemessung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten Die Analyse der optischen Dichte der GABAA-Rezeptoruntereinheiten erfolgte mittels
eines computerbasierten Bildanalysesystems bestehend aus einem Axioskop-
Mikroskop mit einer Plan-Neofluar Linse (Zeiss, Deutschland), einer digitalen
Farbkamera (CCD, Axiocam, Zeiss, Göttingen, Hallbergmoos, Deutschland) sowie
einem Computer mit einem Pentium III-Rechenprozessor, welcher mit einem
Bildgrabber ausgestattet war (V7-Mirage, Spea, USA). Als Bildanalysesoftware
diente das Programm KS400 (Windows Release 3.0, Carl Zeiss Vision). Die
Gehirnschnitte wurden bei 400 facher Vergrößerung ipsi- und contralateral zur
Elektrode ausgewertet. Es wurde lediglich eine Region untersucht, welche den
Bereich von Bregma -3.80 mm bis -5.60 mm) umfasste, da die Anzahl der Schnitte
begrenzt war. Die optische Dichtemessung erfolgte in verschiedenen hippocampalen
Subregionen: dentater Hilus, Gyrus dentatus (Körnerzellschicht und
Molekularschicht), CA1, CA2 (nur α5) und CA3 des Ammonshorns. Für die CA1,
Material und Methoden
51
CA2 und CA3 wurden das Stratum pyramidale und Teile des Str. oriens und Str.
radiatum ausgewertet. Die Messung wurde dabei in Feldern von je 38.321,06 μm2
vorgenommen. Die Anzahl der Felder war abhängig von der Größe der untersuchten
Region: CA1, CA3: je 5 Felder; CA2, Hilus: je 3 Felder; DG: 10 Felder). Die
Pixelgröße lag bei 1300x1030 Pixel. Die Auswertung ist dem System für die
Detektion des Proteins Fos in Gehirnschnitten (RIEUX et al., 2002) angelehnt, bei
welchem Grauwerte erfasst und in optische Dichte umgerechnet werden.
Die optische Dichte wurde im vorliegenden Fall jedoch direkt gemessen, indem das
System mit einem Standard kalibriert wurde (Calibration of Step Tablet No.
507ST101, Eastman Kodak Company, USA). Mittels diesen Standards war es
möglich, die Beleuchtungsstärke des Mikroskops zu überprüfen und konstant zu
halten. Durch eine sogenannte „Shading correction“ konnten die eingelesenen Bilder
auf optische Distorsion korrigiert und Unregelmäßigkeiten der Helligkeit ausgeglichen
werden. Für letzteres wurde ein Bild eines freien Bereiches des Objektträgers
(Hellfeld-Hintergrund) eingelesen und von den gemessenen Bildern subtrahiert. Die
Unterscheidung des positiven Signals der GABAA-Rezeptoruntereinheit vom
Hintergrundsignal erforderte die Festlegung einer Schwelle. Die Schwelle war immer
gleich und so festgelegt, dass sie den kompletten messbaren Bereich erfasste (L 0;
C 127; H 255). In die Auswertung wurden nur diejenigen Pixel einbezogen, welche
eine optische Dichte über dem Schwellenwert aufwiesen. Bildanalysesysteme mit
gleich bleibender Schwelle zeigen, dass sie objektiv sind und vergleichbare
Ergebnisse liefern, vorausgesetzt, das Hintergrundsignal schwankt um nicht mehr als
3 % (RIEUX et al., 2002; WILLEMSE et al., 1994). Die Variation des
Hintergrundsignals sollte möglichst gering gehalten werden, weshalb alle Schnitte
einer Messreihe gleichbehandelt wurden.
4.6 Statistik Die statistischen Auswertungen wurden mit dem Programm Graph Pad Prism 4
(Graph Pad Software, Inc.) vorgenommen. Detailliertere Angaben zu den
statistischen Verfahren sind bei den entsprechenden Stellen im Ergebnisteil zu
finden.
Material und Methoden
52
Zunächst wurde mit dem D´Agostino und Pearson omnibus Normalitätstest verifiziert,
ob eine Normalverteilung nach Gauß gegeben ist.
Die Daten wurden prinzipiell als Mittelwert und dazugehöriger SEM (standard error of
the mean, Mittelwertsfehler, Standardfehler) angegeben. Bei nicht normalverteilten
Daten wurde der Median berechnet. Bei parametrischen Daten wurde für den
Vergleich zweier Stichproben der Student`s t-Test verwendet. Waren die Stichproben
außerdem verbunden, wurde ein gepaarter t-Test angewendet.
Sollten drei oder mehr Stichproben verglichen werden, wurde mit einer einfaktoriellen
Varianzanalyse (One-way ANOVA) gerechnet. Bei Normalverteilung wurde ein post
hoc Bonferroni`s t-Test angeschlossen. Lagen nicht-parametrische Daten vor, z B bei
kleinen Gruppengrößen (n< 5), wurde für unverbundene Stichproben ein Mann-
Whitney U-Test durchgeführt. Bei mehr als zwei nicht-parametrischen Datensets
wurde für verbundene Stichproben eine ANOVA (Friedman-Test) mit einem
anschließenden Wilcoxon post hoc-Test durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde
auf p< 0,05 festgelegt. Die statistischen Tests wurden in der Regel zweiseitig
durchgeführt, außer wenn basierend auf der Arbeitshypothese und der gängigen
Literatur nur Datenveränderungen in eine Richtung anzunehmen waren.
Material und Methoden
53
4.7 Geräte- und Chemikalienlisten 4.7.1 Geräte für die EEG- und Videoüberwachung
Geräte Typ-Bezeichung Bezugsquelle
Stabilisierende
Netzgeräte
2224.0 Statron Gerätetechnik
GmbH, Fürstenwalde
8-Kanal Verstärker Cyper Amp 380
Bio Amp
Axon Instruments,
Inc. Foster City, CA,
USA
Digitalwandler PowerLab/800S
Programm: Chart4 for Windows
AD Instruments Ltd,
Hastings, East Sussex,
UK
Multiplexer Monacor TVMP-400 B/W Elektronik Menzel,
Hannover
Personal Computer Intel-Pentium IV-Prozessor mit 1000
MHz
256 MB Arbeitsspeicher
40 GB SCSI-Festplatte
Betriebssystem Windows XP
Dell, Deutschland
Kamera CCD-Kamera-Modul für Schwarz-
Weiß-Aufnahmen
Conrad Electronic
GmbH, Hannover
Infrarotstrahler Conrad Electronic
GmbH, Hannover
Langzeit-
videorekorder
SANYO RS232C/RS485 Control Elektronik Menzel
Hannover
Material und Methoden
54
Fernseher JVC AV14BM8ENS
Sharp TV 37EM-33S
Makro Markt Hannover
Videokassetten Kodak HS E-240 Aldi, Hannover
EEG-Kabel Kabelentzwirler einschließlich:
Anschlußkabel/
Westernbuchse
2adriges, abgeschirmtes,
ummanteltes Kabel
BNC-Stecker
Krokodilklemmen
Binder-Stecker
Elektronik Menzel,
Hannover
Material und Methoden
55
4.7.2 Chemikalienliste
Substanz Bezugsquelle
Chloralhydrat E. Merck AG, Darmstadt
Chloramphenicol Succinate Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
3`3 Diaminobenzidin Sigma, St Louis, MO
Diazepam (Diazepam-Ratiopharm®) Ratiopharm, Ulm
EDTA (Ethylendiamintetraacetat) E. Merck, Darmstadt
Ethacridinlactat (Rivanol®) Chinosol, Hannover
Ethanol (70%, 96%, 100%) Fluka, Seelze
Eukitt Erne Chemie, Dällikon, Schweiz
Gentamicin (Friseo-Gent®) Essex Tierarznei, München
Normales Ziegenserum Serotec, UK
Paraformaldehyd Riedel de Häen, Hannover
Phenobarbital Serva, Heidelberg
Phenytoin (Diphenylhydantoin) Aldrich-Chemie, Steinheim
Pikrinsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
Kaninchen-Antikörper α1 Institut für Pharmakologie und
Toxikologie, Universität Zürich
Kaninchen-Antikörper α4 W. Sieghart, Wien
Kaninchen-Antikörper δ W. Sieghart, Wien
Maus-Antikörper β2/3 Chemikon, Hofheim
Material und Methoden
56
Meerschweinchen-Antikörper α2 Institut für Pharmakologie und
Toxikologie, Universität Zürich
Meerschweinchen-Antikörper α3 Institut für Pharmakologie und
Toxikologie, Universität Zürich
Meerschweinchen-Antikörper α5 Institut für Pharmakologie und
Toxikologie, Universität Zürich
Meerschweinchen-Antikörper γ2 Institut für Pharmakologie und
Toxikologie, Universität Zürich
Rattenserum Serotec, UK
Salzsäure (HCl) Fluka, Seelze
Sekundärantikörper (biotinyliert) aus der
Ziege (anti Kaninchen, Maus oder
Meerschweinchen)
Jackson Immunoresearch, West Grove,
PA
Tariquidar Xenova group, UK
Tetracain CAELO Caesar & Lorenz
Triton Fluka, Seelze
Vectastain Elite kit standard Vector Laboratories
Wasserstoffperoxid Fluka, Seelze
Xylene Fluka, Seelze
Ergebnisse
57
5 Ergebnisse
5.1 Elektrisches Post-Status epilepticus-Modell 5.1.1 Status epilepticus während Dauerstimulation der basolateralen Amygdala Von den insgesamt 22 stimulierten Tieren entwickelten 18 % (n=4) einen rein
generalisierten SSSE (Typ 3). 73 % (n=16) zeigten fokale und generalisierte Anfälle
(Typ 2) und 9 % (n=2) bekamen keinen SSSE. Rein fokale SSSE (Typ 1) wurden
nicht detektiert. Es konnte keine Mortalität verzeichnet werden.
5.1.2 Spontane Anfälle nach Status epilepticus Die beobachteten spontan wiederkehrenden Anfälle waren überwiegend komplex-
fokal, d. h. die Anfälle begannen fokal und generalisierten sekundär, einhergehend
mit einem Bewusstseinsverlust der Tiere. Fokale und generalisierte Anfälle
unterschieden sich nicht im EEG, weshalb die EEG-Aufzeichnungen in der
entsprechenden Videosequenz überprüft werden mussten. Ein Tier mit einer
besonders hohen Anfallsfrequenz (NIH 18) zeigte ein abweichendes EEG-Muster mit
geringerer Amplitude und Frequenz als bei den übrigen Ratten (siehe 5.1.3.). Von
den insgesamt fünfzehn überwachten Tieren zeigten fünf der überwachten Tiere rein
konvulsive Anfälle. Diese waren gekennzeichnet durch die Stadien IV und V und
selten durch das Stadium VI (siehe Tab.2). Die übrigen zehn Ratten exprimierten
sowohl konvulsive als auch nicht-konvulsive Anfälle. Letztere wurden definiert, wenn
die Tiere Immobilität zeigten (aus der Bewegung oder aus einer Ruheposition),
stereotyp mit dem Kopf wackelten (head weaving), den Kopf in den Nacken legten
(Opisthotonus) oder sich ohne Klonus der Vorderextremitäten aufrichteten.
Stereotypes Zirkeln wurde nur in Verbindung mit anderen nicht-konvulsiven
Anfallsmustern gewertet, da auch gesunde Ratten ein Drehverhalten zeigen können.
Es wurde kein Tier mit rein nicht-konvulsiven Anfällen detektiert.
5.1.3 EEG-Muster der spontan wiederkehrenden Anfälle Im folgenden sind einige im EEG beobachtete Anfallsmuster dargestellt. Es wurden
weder die Frequenz noch die Amplitude oder Dauer der Anfälle ausgewertet, da dies
für die vorliegende Fragestellung keine Rolle spielt, jedoch sollen einige typische und
Ergebnisse
58
atypische Anfallsmuster von konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfällen
veranschaulicht werden.
Abb. 3: EEG-Sequenz (NIH 18) während der 2. Vehikelphase; Stadium VI,
gekennzeichnet durch Rennen und Springen
Abb. 4: EEG-Sequenz (NIH 18) eines eher atypischen nicht-konvulsiven Anfalls
während der 2. Vehikelphase. Es fehlt der flache Beginn, und Amplitude und
Frequenz sind deutlich geringer, als bei typischen konvulsiven und nicht-konvulsiven
Anfällen.
Abb. 5: EEG-Sequenz eines eher typischen nicht-konvulsiven Anfalls (NIH 24),
einhergehend mit plötzlicher Immobilität aus einem Ruhezustand und head weaving.
Dieser Anfall ähnelt im EEG den konvulsiven Anfällen (siehe Abb.8) hinsichtlich der
hohen Amplitude und Frequenz. Der genaue Anfallstyp kann nur mittels der
entsprechenden Videosequenzen ermittelt werden.
C h a r t W i n d o w
NIH
24
(mV
)
- 0 , 5
0 , 0
0 , 5
9 : 1 2 : 2 0 1 9 : 1 2 : 3 0 1 9 : 1 2 : 4 0 1 9 : 1 2 : 5 0 1 9 : 1 3 : 0 0 1 9 : 1 3
1 5 . 0 3 . 2 0 0 5 1 9 : 1 2 : 1 8 , 3 6 1
C h a r t W i n d o w
NIH
18
(mV
)
- 0 , 4
- 0 , 3
- 0 , 2
- 0 , 1
0 , 0
0 , 1
0 , 2
8 : 4 2 : 2 4 8 : 4 2 : 2 6 8 : 4 2 : 2 8 8 : 4 2 : 3 0 8 : 4 2 : 3 2 8 : 4 2 : 3 4 8 : 4 2 : 3 6 8 : 4 2 : 3 8
3 0 . 0 3 . 2 0 0 5 8 : 4 2 : 2 3 , 2 8 4
C h a r t W i n d o w
NIH
18
(mV
)
- 0 , 2
- 0 , 1
0 , 0
0 , 1
0 , 2
0 , 3
1 4 : 1 8 : 2 5 1 4 : 1 8 : 3 0 1 4 : 1 8 : 3 5 1 4 : 1 8 : 4 0 1 4 : 1 8 : 4 5 1 4 : 1 8 : 5 0
0 1 . 0 4 . 2 0 0 5 1 4 : 1 8 : 2 1 , 5 5 2
C h a r t W i n d o w
NIH
18
(mV
)
- 0 , 6
- 0 , 4
- 0 , 2
0 , 0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
0 : 0 4 : 5 2 0 : 0 4 : 5 4 0 : 0 4 : 5 6 0 : 0 4 : 5 8 0 : 0 5 : 0 0 0 : 0 5 : 0 2 0 : 0 5 : 0 4 0 : 0 5 : 0 6
1 7 . 0 3 . 2 0 0 5 0 : 0 4 : 5 0 , 5 1 1
Ergebnisse
59
Abb. 6: EEG-Sequenz (NIH 18) eines untypischen konvulsiven Anfalls (Stadium V)
während der Vehikelphase 2. Zwar ist die Abflachung des EEGs zu Beginn sowie die
regelmäßige Wellenform am Ende des Anfalls zu sehen, jedoch sind Amplitude und
Frequenz geringer, als beim typischen konvulsiven Anfall (siehe Abb. 8).
Abb. 7: Das Tier (NIH 18), welches untypische EEG-Muster zeigte (siehe Abb. 4 und
6), exprimierte auch typische konvulsive Anfälle, hier für die Phenobarbitalphase
dargestellt. Typische und untypische Anfälle kamen z. B. während der
Phenobarbitalphase gemischt vor.
Abb. 8: Typisches EEG-Muster eines konvulsiven Anfalls (NIH 21). Der Iktus beginnt
mit einem abgeflachten EEG, geht dann in eine Sequenz mit hoher Frequenz und
Amplitude über, und endet mit regelmäßigen Entladungen.
5.2 Pharmakologische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell 5.2.1 Selektion von Respondern und Nonrespondern unter Phenobarbital Die Behandlung mit dem Antiepileptikum Phenobarbital führte bei sechs Tieren zu
einer kompletten Anfallskontrolle und bei zwei weiteren zu einer Anfallsreduktion um
mehr als 75 % (siehe Abb. 11). Diese acht Tiere wurden als Phenobarbital-
Responder definiert. Bei sechs weiteren Tieren übte Phenobarbital keinen
antikonvulsiven Effekt aus, weshalb diese als Phenobarbital-Nonresponder
bezeichnet wurden (siehe Abb.12). Eine Ratte (NIH 10) zeigte während der
Vehikelphase 1 und unter Behandlung mit Phenobarbital jeweils nur einen Anfall, so
C h a r t W i n d o w
NIH
18
(mV
)
- 0 , 2
0 , 0
0 , 2
0 , 4
6 : 2 8 : 2 5 6 : 2 8 : 3 0 6 : 2 8 : 3 5 6 : 2 8 : 4 0 6 : 2 8 : 4 5 6 : 2 8 : 5 0
1 1 . 0 3 . 2 0 0 5 6 : 2 8 : 2 0 , 9 5 0
C h a r t W i n d o w
NIH
21
(mV
)
- 0 , 6
- 0 , 4
- 0 , 2
0 , 0
0 , 2
0 , 4
0 , 6
7 : 1 0 8 : 0 7 : 1 5 8 : 0 7 : 2 0 8 : 0 7 : 2 5 8 : 0 7 : 3 0 8 : 0 7 : 3 5 8 : 0 7 : 4 0 8 : 0 7 : 4 5 8 : 0 7 : 5 0
0 1 . 0 4 . 2 0 0 5 8 : 0 7 : 0 9 , 7 5 8
Ergebnisse
60
dass dieses Tier aus der Selektion ausgeschlossen wurde. Eine Ratte (NIH 20)
musste sechs Tage nach Beginn der Behandlung mit Phenobarbital wegen eines
Tumors euthanasiert werden und konnte deshalb nicht gewertet werden. Die
durchschnittliche Anfallsfrequenz während der zweiwöchigen Vehikelphase vor der
Phenobarbital-Behandlung lag für die 15 verwendeten Tiere bei 0,29 Anfällen pro
Tag. Die individuellen Daten wiesen dabei eine große Variation auf (0,07 – 9,5
Anfälle pro Tag). Unter der Gabe von Phenobarbital wurde diese Anfallsfrequenz
nicht signifikant geändert. Während der 2. Vehikelphase, welche sich der
Phenobarbitalphase anschloss, stieg die Anfallsfrequenz bei einigen Ratten
verglichen mit der 1. Vehikelphase deutlich, wenn auch nicht signifikant, an. Von der
dreiwöchigen Vehikelphase 2 wurden für die Phenobarbitalauswertung lediglich die
ersten beiden Wochen genommen. Zwei Nonresponder zeigten unter Behandlung
mit Phenobarbital nicht-konvulsive Anfälle. Ein Tier (NIH 18) exprimierte während der
Vehikelphase 1 ausschließlich konvulsive Anfälle und zeigte unter Behandlung mit
Phenobarbital zu 18 % und während der anschließenden Vehikelphase zu 14 %
nicht-konvulsive Anfälle. Bei einem weiteren Phenobarbital-Nonresponder (NIH 24)
waren während der ersten Vehikelphase ebenfalls keine nicht-konvulsiven Anfälle zu
beobachten. Unter Behandlung mit Phenobarbital erhöhte sich die Frequenz der
nicht-konvulsiven Anfälle auf 99,5 % und sank während der 2. Vehikelphase auf 66
%. Für die Definition der Pharmakoresistenz wurde keine Unterscheidung zwischen
konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfällen vorgenommen, sondern die absolute
Anzahl der Anfälle gewertet.
Ergebnisse
61
Abb. 9: Anfallsfrequenz (Anfälle pro Tag) während Behandlung mit Phenobarbital bei
15 epileptischen Ratten (ohne Selektion in Responder und Nonresponder).
Abb. 10: Anfälle pro Tag bei 8 Phenobarbital-Respondern. Es ist eine signifikante
Reduktion der Anfallsfrequenz gegenüber beiden Vehikelphasen zu erkennen.
Vehikelphase 1 Phenobarbital Vehikelphase 20.00
0.25
0.50
0.75
1.005
10
15
20
Anf
älle
pro
Tag
Vehikelphase 1 Phenobarbital Vehikelphase 20.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
*
Anf
älle
pro
Tag
(n=15)
(n=8)
Ergebnisse
62
Abb. 11: Anfälle pro Tag bei sechs Phenobarbital-Nonrespondern. Diese Tiere
sprachen auf die Behandlung mit Phenobarbital nicht mit einer zufriedenstellenden
Reduktion ihrer Anfallsfrequenz (> 50 %) an.
Tab. 4: Statistische Auswertung der Phenobarbitalversuche. Der Vergleich der
Anfallsfrequenz erfolgte mittels eines nicht-parametrischen Friedman-Tests für
gepaarte Daten. Post hoc Analysen wurden mit einem Wilcoxon Rangsummentest
für gepaarte Daten durchgeführt.
Der statistische Vergleich ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen der
Vehikelphase 1 (VH1) und der Vehikelphase 2 (VH2). Des weiteren unterschieden
sich die Anfallsfrequenzen während der Kontrollphasen nicht signifikant zwischen
Respondern und Nonrespondern (Mann-Whitney-U-Test für ungepaarte Daten)
(P>0.05).
Vehikelphase 1 Phenobarbital Vehikelphase 20.00
0.25
0.50
0.75
1.005
10
15
20
Anf
älle
pro
Tag
(n=6)
Ergebnisse
63
Gruppe N Median der Anfalls-frequenz (Anfälle pro Tag)
ANOVA
(P)
Post hoc Vergleiche
VH
1
Phenobarbital VH 2 Phenobarbital
vs. VH 1
Phenobarbital
vs. VH 2
Gesamt 15 0,28 0,069 0,29 0,0024 0,1531 0,0007
Responder 8 0,28 0 0,29 0,0040 0,0078 0,0156
Nonresponder 6 0,41 0,31 0,465 0,2001 0,6875 0,1875
Einzelgraphen Phenobarbital-Responder
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 4
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 7Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 11Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Ergebnisse
64
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 14Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 20
Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 21
Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 23Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 25Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Ergebnisse
65
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 31Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Einzelgraph variabler Phenobarbital-Responder
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 10Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Einzelgraphen Phenobarbital-Nonresponder
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 6Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10NIH 8
Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Ergebnisse
66
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10 NIH 13 Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
10
Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2NIH 17
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
10
20
30NIH 18 Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsivnicht-konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
10
20
30
40
50 NIH 24Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2
konvulsivnicht-konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Ergebnisse
67
5.2.2. Plasmakonzentration unter Phenobarbital
Tag 1 Tag 7 Tag 140
10
20
30
40
50
Responder Nonresponder Gesamt
Plas
mal
evel
PB
( μg/
ml)
***
Abb. 12: Plasmakonzentrationen von Phenobarbital in μg/ml am 1., 7. und am 14.
Behandlungstag. Die durchschnittlichen Plasmawerte lagen bei den 15 verwendeten
Tieren 10 Std. nach der Applikation am 1. Tag bei 20,9 (im Bereich von 17,7-25,9),
am 7. Tag bei 39,2 (zwischen 13,9 und 48,1) und am 14. Tag bei 35,0 μg/ml (20,2 –
54,1). Die Konzentrationen von Phenobarbital im Plasma waren an den Tagen 7 und
14 signifikant höher als die Plasmalevel an Tag 1 (P< 0,001), was für eine
Akkumulation des Antiepileptikums im Behandlungsverlauf spricht.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
µg/ml
Responder Nonresponder Gesamt
Abb. 13: Vergleich der gesamten Plasmakonzentrationen zwischen Respondern und
Nonrespondern. Der statistische Vergleich zwischen Respondern und
Nonrespondern erfolgte mittels eines zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests da
Ergebnisse
68
aufgrund der zu geringen n-Zahl der Nonresponder (n=6) keine Normalverteilung
angenommen werden konnte. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede
(P>0,05). Die Plasmakonzentrationen lagen bei beiden Gruppen im optimalen
Bereich von 10-40 μg/ml (BAULAC, 2002).
5.2.2 Selektion von Respondern und Nonrespondern unter Phenytoin Dosierung Phenytoin Beim Übertragen des für Phenytoin ermittelten Dosierungsschemas auf die
epileptischen Tiere zeigte sich unerwarteterweise eine deutlich höhere
Nebenwirkungsrate als bei nicht-epileptischen Tieren. Während der ersten drei
Behandlungstage zeigten viele der untersuchten Ratten in hohem Maße Ataxie und
Sedation. Aus diesem Grund wurden die Dosierungen ab dem zweiten Tag abends
individuell eingestellt, je nach Befinden der Tiere, um für jede Ratte tolerierbare
Dosen festzulegen. Das Dosierungsintervall lag dabei zwischen 12,5 und 50 mg/kg
Phenytoin (siehe Tab. 3). Die durchschnittliche Phenytoindosis lag bei den
Respondern bei 81,0 +/- 2,79 mg/kg pro Tag und bei 78,9 +/- 1,89 mg/kg pro Tag in
der Gruppe der Nonresponder. Die Dosierung war nicht signifikant unterschiedlich.
Bei der morgendlichen Injektion wurden zwischen 12,5 und 50 mg/kg Phenytoin
injiziert und abends 0 bis 50 mg/kg. Die minimale Tagesdosis lag bei 50 mg/kg
(zweimal täglich 25 mg/kg) bei einem Tier (NIH 7), welches extrem sensitiv auf
Phenytoin reagierte. Die maximale Dosis lag bei 100 mg/kg bei einer Ratte (NIH 18),
die bei geringeren Dosierungen keine Nebenwirkungen zeigte. Die individuelle
Toleranz gegenüber Phenytoin variierte also deutlich. Des weiteren wurde innerhalb
der ersten drei Behandlungstage bei zehn von 15 Tieren eine erhöhte
Anfallsfrequenz detektiert (Phenobarbital-Responder und Phenobarbital-
Nonresponder waren dabei gleichermaßen betroffen). Bei diesen zehn Ratten lag die
Anfallsfrequenz in den drei Tagen vor der Phenytoin-Behandlung bei 0,40 +/- 0,22
und stieg innerhalb der ersten drei Tage unter Phenytoin-Gabe auf 28,7 +/- 16,9 an
(P= 0,0020). Da von Phenytoin bekannt ist, dass es prokonvulsive Effekte ausüben
kann (LÖSCHER et al., 1998; PERUCCA et al., 1998), wurde beschlossen, die
ersten drei Behandlungstage von den späteren Auswertungen auszuschließen und
Ergebnisse
69
nur die Phase mit der individuellen Dosierung zu integrieren. Diese Phase wurde um
1,5 Tage verlängert, so dass alle im folgenden beschriebenen Ergebnisse auf eine
Behandlungszeit von 12,5 Tagen bezogen sind (15,5 Tage minus die ersten drei
Tage). Sobald eine deutliche Ataxie beobachtet wurde, wurde die Dosis reduziert,
und wenn keine Ataxie zu beobachten war, wurde die nächste Dosis wieder erhöht.
Für den Predrug –Vergleich wurden nur die letzten zwei Wochen der Vehikelphase 2
verwendet, welche der Phenytoinphase unmittelbar vorausgingen.
01
23
410
15
20
25(n=15)
Vehikel-phase 2
Phenytoin Vehikel-phase 3
Anf
älle
pro
Tag
Abb. 14: Anfälle pro Tag bei allen mit Phenytoin behandelten Tieren. Ein Tier (NIH
11) zeigte während der Vehikelphasen 2 und 3 gar keine Anfälle und wurde deshalb
nicht in die Phenytoin-Selektion einbezogen.
Ergebnisse
70
0
1
2
3
410
15
20
25
Vehikel-phase 2
Phenytoin Vehikel-phase 3
(n=9)
Anf
älle
pro
Tag
Abb. 15: Anfälle pro Tag bei Phenytoin-Nonrespondern. Bei neun Tieren zeigte sich
keine Reduktion der Anfallsfrequenz um > 50 % unter der Behandlung mit dem
Antiepileptikum Phenytoin. Statistische Analysen ergaben eine signifikante Erhöhung
der Anfallsfrequenz unter Phenytoin verglichen mit der Vehikelphase 3 (P< 0,05).
0.0
0.5
1.016
111621
*(n=5)
Vehikel-phase 2
Vehikel-phase 3
Phenytoin
Anf
älle
pro
Tag
Abb. 16: Anfälle pro Tag bei Phenytoin-Respondern. Zwei Ratten zeigten eine
komplette Anfallskontrolle und drei weitere Tiere exprimierten gegenüber den
Vehikelphasen 2 und 3 eine Reduktion der Anfallsfrequenz um > 50 % (72 % im
Durchschnitt, variierend von 57-94 %).
Ergebnisse
71
Anzahl der Tage mit Anfällen Ergänzend zum Vergleich der Anfallsfrequenz zwischen Behandlungs- und
Vehikelphasen wurde die Ansprechbarkeit auf Phenytoin mittels der Anzahl der Tage
mit Anfällen ausgewertet. Diese Analyse wurde deshalb durchgeführt, weil einige der
Ratten Anfallscluster an einem Tag aufwiesen, an den Tagen vor und nach einem
solchen Cluster jedoch anfallsfrei waren. Wenn lediglich die Anfallsfrequenz
berücksichtigt wird, könnte der Gruppenvergleich beeinflusst werden.
0
25
50
75
100
Vehikel-phase 2
Phenytoin Vehikel-phase 3
(n=15)
Tage
mit
Anf
älle
n (%
)
Abb. 17: Anzahl der Tage mit Anfällen gesamt. Im Gesamtgruppenvergleich ergibt
sich kein signifikanter Behandlungseffekt (P> 0,05).
0
25
50
75
100
Vehikel-phase 2
Phenytoin Vehikel-phase 3
(n=8)
Tage
mit
Anf
älle
n (%
)
Abb. 18: Phenytoin-Nonresponder bei der Anzahl der Tage mit Anfällen. Sieben der
neun Tiere, welche aufgrund ihrer Anfallsfrequenz als Nonresponder deklariert
wurden, erwiesen sich auch als Nonresponder bezüglich der Anzahl der Tage mit
Ergebnisse
72
Anfällen und zeigten während der Phenytoin-Applikation keine signifikanten
Unterschiede zu den Vehikelphasen.
0
25
50
75
100
Vehikel-phase 2
Phenytoin Vehikel-phase 3
(n=6)
*Ta
ge m
it A
nfäl
len
(%)
Abb.19: Phenytoin-Responder bei der Anzahl der Tage mit Anfällen. Unter dem
Kriterium, dass ein Responder definiert wird, wenn die Anfallsfrequenz um
mindestens 50 % gesenkt wird, gelten vier der fünf Tiere, welche Responder in
Bezug auf die Anfallsfrequenz darstellen, auch als Responder hinsichtlich der Anzahl
der Tage mit Anfällen. Die Anzahl der Tage mit Anfällen war bei den Respondern
unter Behandlung mit Phenytoin im Vergleich mit der Vehikelphase 2 um
durchschnittlich 74 % gesunken (P= 0,0313).
Tab.5: Statistische Auswertung während der Phenytoinselektion. Die Datenanalyse
mittels Friedman-Test mit anschließendem Wilcoxon Rangsummentest ergab keine
Unterschiede hinsichtlich der Anfallsfrequenz zwischen den Vehikelphasen 2 und 3
(VH 2 und 3). Auch die Anfallsfrequenzen von Respondern und Nonrespondern
unterschieden sich während der Kontrollphasen nicht signifikant voneinander (P>
0,05).
Ergebnisse
73
Gruppe N Median der Anfalls-frequenz (Anfälle pro Tag)
ANOVA (P)
Post hoc Vergleiche
VH 2 Phenytoin VH 3 VH 2 vs.
Phenytoin
VH 3 vs.
Phenytoin
Gesamt 15 0,25 0,40 0,074 0,2139 0,3303 0,1354
Responder 5 0,31 0,064 0,074 0,0085 0,0313 0,0313
Nonresponder 9 0,25 1,6 0,15 0,0060 0,0742 0,0039
Einzelgraphen Phenytoin-Responder
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
1
2
3
4
5
6
Vehikelphase 2 PhenytoinphaseVehikelphase 3
konvulsiv
NIH 4
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
560
80
100
120
nicht-konvulsiv
NIH 7 konvulsiv
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
1
2
Vehikelphase 2 Phenytoinphase
konvulsiv
NIH 21
Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Ergebnisse
74
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
1
2 NIH 25konvulsiv
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
5
10
15
20
25nicht-konvulsivNIH 10
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1405
10152025303540455055 konvulsiv
nicht-konvulsivVehikelphase 2 Phenytoinphase
NIH 18
Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Einzelgraphen Phenytoin-Nonresponder
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
5
10
Vehikelphase 2 Phenytoinphase
110130150170190
nicht-konvulsiv
Vehikelphase 3
konvulsiv
NIH 6
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
2
4
6
8
10
NIH 8Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Ergebnisse
75
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
5
10
15
20
nicht-konvulsivkonvulsiv
NIH 13Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789
101112 konvulsivNIH 17
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1405
10152025303540455055 konvulsiv
nicht-konvulsivNIH 24
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
5
10200
250
300
350
nicht-konvulsiv
NIH 31 konvulsiv
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
1
2
nicht-konvulsiv
NIH 14
konvulsiv
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Ergebnisse
76
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
5
1020
25
30
35nicht konvulsivNIH 23konvulsiv
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Einzelgraph variabler Phenytoin-Responder
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140
1
2
3NIH 11
Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3
konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Plasmakonzentration unter Phenytoin
Tag 1 Tag 8 Tag 150
5
10
15
20
25
30
Responder Nonresponder Gesamt
Plas
mal
evel
PH
T ( μ
g/m
l)
Abb. 20: Plasmakonzentrationen von Phenytoin in μg/ml am 1., 7. und am 14.
Behandlungstag.
Die durchschnittliche Plasmakonzentration von Phenytoin lag 10 Std. nach der
Bolusinjektion am 1. Behandlungstag bei 20 μg/ml (zwischen 8,94 und 35,19 μg/ml)
und somit in dem Bereich, welcher in den Vorversuchen mit nicht-epileptischen
Tieren erreicht wurde. Am 7. Behandlungstag lag der durchschnittliche Plasmalevel
Ergebnisse
77
bei 9,7 μg/ml (0,49 bis 25,01 μg/ml) und am letzten Behandlungstag bei 12,7 μg/ml
(1,88 bis 39,22 μg/ml).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Responder Nonresponder Gesamt
μg/
ml
Abb. 21: Durchschnittliche Plasmakonzentration von Phenytoin bei den
verschiedenen Gruppen gesamt. Es besteht kein signifikanter Unterschied, obwohl
eine Tendenz für niedrigere Plasmawerte in der Nonresponder-Gruppe vorhanden
ist, auch wenn alle Tiere mit maximal tolerierbaren Dosen behandelt wurden.
5.2.3 Gesamtergebnis Selektionsstudie Als Gesamtergebnis der Selektionsstudie sollte ermittelt werden, ob sich die
Resistenz der Nonresponder gegenüber Phenobarbital auf eine Resistenz
gegenüber Phenytoin ausdehnt und ob einige der Tiere der Definition von
Pharmakoresistenz entsprechen. Laut dieser Definition dürften die Tiere auf beide
Antiepileptika gar nicht oder nur unzureichend ansprechen. Ein Phenobarbital-
Responder (NIH 11) konnte für diesen Vergleich nicht herangezogen werden, da er
während der dreiwöchigen Vehikelphase 2 (die Periode zwischen der Phenobarbital-
und der Phenytoinphase) sowie der Vehikelphase 3 keinen einzigen Anfall aufwies.
Von den sieben verbleibenden Phenobarbital-Respondern sprachen drei (43 %)
ebenfalls auf Phenytoin an, sowohl in Bezug auf die Anfallsfrequenz als auch auf die
Anzahl der Tage mit Anfällen (> 50 %). Von den sechs Phenobarbital-Nonresponder
besserte sich die Anfallssituation bei fünf Tieren (83 %) auch unter Behandlung mit
Ergebnisse
78
Phenytoin nicht wesentlich. Eine Ausnahme bildete ein Tier (NIH 18) mit einer
besonders hohen Anfallsfrequenz während der Vehikelphasen, welches zwar nicht
auf Phenobarbital ansprach, dafür aber auf die Gabe von Phenytoin mit einer 90 %
igen Reduktion der Anfallsfrequenz und einer ungefähr 70 % igen Senkung der
Anzahl der Tage mit Anfällen reagierte.
5.2.4 Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar (XR 9576) bei Phenobarbital-Nonrespondern im chronischen Post-Status epilepticus-Modell Diejenigen Ratten, welche auf die Behandlung mit Phenobarbital während der
Selektionsphase nicht mit einer Reduktion der Anfallsfrequenz um mindestens 50 %
ansprachen, wurden für eine Kombinationstherapie von Phenobarbital mit dem
selektiven P-gp Inhibitor Tariquidar ausgewählt.
Nach der i. p.-Applikation von Tariquidar entwickelten alle Ratten Anzeichen von
abdominalen Schmerzen, so dass der Versuch nach 5,5 Tagen unterbrochen wurde.
Für die Folgeversuche wurde Tariquidar daher mit einer Schlundsonde peroral
verabreicht. Die Schwere der typischen adversen Effekte von Phenobarbital, wie
Ataxie und Sedation, wurde durch die Kombinationstherapie nicht beeinflusst.
0
1
2
310
20
30
Vehikel-phase 2(Predrug)
20 mg/kgTQ + PB
Kontroll-phase 1(Postdrug)
*Anf
älle
pro
Tag
Abb. 22: Anfälle pro Tag unter 20 mg/kg Tariquidar und Phenobarbital. Die Daten
sind nicht normalverteilt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels eines
zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentests für gepaarte Daten. Bei vier
Ergebnisse
79
Nonrespondern konnte eine komplette Anfallsfreiheit erreicht werden und zwei
weitere Tiere zeigten eine Reduktion ihrer Anfallsfrequenz um mehr als 90 % was in
einem signifikanten Unterschied im Vergleich zur Vehikelphase 2 und zur
Kontrollphase 1 zu erkennen ist. Im anschließenden Versuch sollte verifiziert werden,
ob eine Dosis von 10 mg/kg Tariquidar die Anfallsfrequenz ebenfalls effektiv senken
kann.
0
1
2
310
20
30
Kontroll-phase 1(Predrug)
10 mg/kgTQ + PB
Kontroll-phase 2(Postdrug)
*
Anf
älle
pro
Tag
Abb. 23: Anfälle pro Tag unter 10 mg/kg Tariquidar und Phenobarbital. Ein Tier (NIH
24) verstarb 3,5 Tage nach Beginn der Behandlung mit 10 mg/kg Tariquidar +
Phenobarbital. Dieser Nonresponder exprimierte die höchste Anfallsrate von allen
Tieren (183 Anfälle in 7,5 Tagen in der Kontrollphase 1), was letztendlich zur
Mortalität beigetragen haben könnte. In den entsprechenden Videoaufnahmen zeigte
die Ratte kurz von ihrem Tod ein verlängertes konvulsives Verhalten. Die genaue
Todesursache konnte jedoch auch durch Autopsie nicht geklärt werden.
Die Kombinationstherapie von Phenobarbital mit 10 mg/kg Tariquidar führte ebenfalls
zu einer Senkung der Anfallsfrequenz, jedoch nicht in dem Maße wie 20 mg/kg
Tariquidar. Ein Tier verstarb während der Behandlung. Es wurde nur bei zwei
Nonrespondern völlige Anfallsfreiheit erreicht, und drei weitere Tiere zeigten eine
Anfallsreduktion um > 50 % (87 % im Durchschnitt). Deshalb sollte in einem
Ergebnisse
80
Folgeversuch die Effizienz der intermediären Dosis von 15 mg/kg Tariquidar getestet
werden.
0
1
2
310
20
30
40
50
Kontroll-phase 2(Predrug)
15 mg/kgTQ + PB
Kontroll-phase 3(Postdrug)
*
Anf
älle
pro
Tag
Abb. 24: Anfallsfrequenz (Anfälle pro Tag) unter 15 mg/kg Tariquidar und
Phenobarbital. Bei dieser Dosierung erlangten drei Tiere eine vollständige
Anfallsfreiheit und ein weiterer Nonresponder zeigte eine Senkung der
Anfallsfrequenz um 90 %, was zu einem signifikanten Unterschied gegenüber der
Kontrollphase 2 führte. Eine Ratte (NIH 8) hatte weder unter der
Kombinationstherapie noch während der Kontrollphase 3 Anfälle, so dass keine
Signifikanz zur Postdrugphase festgestellt werden konnte.
0
1
2
31020304050
Kontrollphase 3 (Predrug)
10 mg TQ/kg ohne PB
Anf
älle
pro
Tag
Abb. 25: Anfallsfrequenz unter 10 mg/kg Tariquidar ohne gleichzeitige
Phenobarbitalbehandlung.
Ergebnisse
81
Es erscheint zwar unwahrscheinlich, dass Tariquidar ohne gleichzeitige Gabe von
Phenobarbital einen Effekt auf die Anfallsfrequenz ausübt, jedoch sollte dies mittels
einer Applikation von 10 mg/kg Tariquidar zweimal täglich überprüft werden (Abb.26).
Die alleinige Gabe von Tariquidar führte zu keiner signifikanten Reduktion der
Anfallsfrequenz (P= 0,4375 vs. Kontrollphase). Es war im Gegenteil sogar eine
Tendenz zum Anstieg der Anfallsfrequenz bei den Nonrespondern vorhanden. Zum
Beispiel stieg die Anfallsfrequenz bei einem Tier (NIH 13) von 13,1 Anfällen pro Tag
während der Kontrollphase auf 23,6 Anfälle pro Tag unter der Behandlung mit 10
mg/kg Tariquidar ohne Phenobarbital. Während der Gabe von 10 mg/kg Tariquidar +
Phenobarbital war dieses Tier anfallsfrei. Ein einziges Tier (NIH 18) zeigte eine
tendenzielle Senkung der Anfallsfrequenz unter 10 mg/kg Tariquidar ohne
Phenobarbital verglichen mit der Kontrollphase.
0
1
2
310
20
30
Kontroll-phase 1(Predrug)
Pheno-barbitalohne TQ
Kontroll-phase 2(Postdrug)
Anf
älle
pro
Tag
Abb. 26: Anfallsfrequenz unter Phenobarbital ohne Kombination mit Tariquidar. Die
statistische Analyse mit dem gepaarten, nicht-parametrischen Wilcoxon-
Rangsummentest ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen
Phasen, obgleich eine tendenzielle Reduktion der Anfallsfrequenz vorhanden war
(P= 0,0625 für den Vergleich Predrug zu Phenobarbital sowie Postdrug zu
Phenobarbital). Mit diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass die Phenobarbital-
Nonresponder zirka vier Monate nach Ende der Selektionsphase immer noch der
Definition eines Nonresponders entsprachen.
Ergebnisse
82
Plasmakonzentration von Phenobarbital unter Tariquidar
1. Entnahme 2. Entnahme0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
20 mg/kg TQ10 mg/kg TQPB ohne TQ15 mg/kg TQ
Plas
mal
evel
PB
( μg/
ml)
Abb. 27: Durchschnittliche Plasmakonzentration für Phenobarbital während der
Kombination mit Tariquidar. Die erste Entnahme erfolgte 10 Std. nach der ersten
Injektion, die zweite Entnahme 10 Std. nach der letzten Injektion. Eine Ausnahme
bildet diejenige Phase, in der Phenobarbital ohne Tariquidar gegeben wurde, da hier
lediglich nach der ersten Applikation Blut entnommen wurde. Die
Plasmakonzentration von Phenobarbital stieg über die Dauer der Behandlung an,
was für eine Akkumulation des Antiepileptikums spricht. Statistische Analysen
ergaben keinen Unterschied zwischen den verschiedenen Behandlungsphasen mit
Tariquidar und der Periode, in welcher Phenobarbital ohne Tariquidar verabreicht
wurde. Die Auswertung erfolgte mittels des nicht-parametrischen Wilcoxon-
Rangsummentests für gepaarte Daten (P> 0,05).
Ergebnisse
83
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
20 mg/kg TQ + PB 10 mg/kg TQ + PB 15 mg/kg TQ + PB PB ohne TQ
µg/m
l
Abb. 28: Die Plasmaspiegel von Phenobarbital unterscheiden sich nicht signifikant
zwischen den diversen Kombinationstherapien mit Tariquidar und der alleinigen
Gabe von Phenobarbital ohne Tariquidar. Das deutet darauf hin, dass Tariquidar den
Metabolismus von Phenobarbital nicht beeinflusst. Der durchschnittliche Plasmalevel
von Phenobarbital lag bei dem Versuch mit 20 mg/kg Tariquidar bei 27,03 μg/ml
(13,22 – 55,62 μg/ml), bei dem Experiment mit 10 mg/kg Tariquidar bei 23,06 μg/ml
(13,1 – 47,97 μg/ml). Bei dem Versuch mit 15 mg/kg Tariquidar betrug die
durchschnittliche Plasmakonzentration 23,74 μg/ml (14,2 – 37,67 μg/ml) und bei der
Gabe von Phenobarbital ohne Tariquidar 24,01 μg/ml (17,19 – 37,45 μg/ml).
Tabelle 6: Die Analyse erfolgte mittels eines nicht-parametrischen Friedman-Tests
für gepaarte Daten. Der Post hoc Test bestand aus einem Wilcoxon
Rangsummentest für gepaarte Daten. Durch den Tod eines Nonresponders gingen
ab dem Versuch mit 15 mg/kg Tariquidar + Phenobarbital nur noch fünf Tiere in die
Versuche ein. Nach dem Versuch mit 10 mg/kg Tariquidar ohne Phenobarbital wurde
keine Postdrug-Phase angeschlossen. Als Pre- bzw. Postdrug-Phasen wurden
diejenigen Kontrollphasen verwendet, welche der jeweiligen Behandlungsphase
vorausgingen bzw. dieser folgten. Für den Versuch mit 20 mg/kg Tariquidar +
Ergebnisse
84
Phenobarbital wurde die Vehikelphase 3 aus der Selektionsphase als Predrug
verwendet.
N Behandlung Median der Anfalls- frequenz (Anfälle pro
Tag)
Anova (P)
Post hoc Vergleiche
Pre-
drug
Drug Post-
drug
Drug vs.
Predrug
Drug vs.
Post-
drug
6 Phenobarbital
+ Tariquidar 20
0,465 0 1,8 0,0017 0,0313 0,0313
6 Phenobarbital
+ Tariquidar 10
1,8 0,188 1,0 0,0085 0,0313 0,0313
5 Phenobarbital
+ Tariquidar 15
1,0 0 0,42 0,1040 0,0313 0,1250
5 Tariquidar 10 0,42 0,710 0,4375
Einzelgraph Kombinationsstudie Tariquidar und Phenobarbital Dargestellt ist ein Beispieltier aus der Kombinationsstudie, welche insgesamt sechs
Tiere umfasste.
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 70
10
20
30
40
50
60
70
80NIH 18
Kontroll-phase 1
Kontroll-phase 2
20 mg/kgTQ+ PB
10 mg/kgTQ + PB
15 mg/kgTQ + PB
PB ohne TQ 10 mg/kgTQ ohne PB
Kontroll-phase 3
konvulsivnicht-konvulsiv
Tage
Anz
ahl d
er A
nfäl
le
Ergebnisse
85
5.2.5 GABAA- Rezeptoruntereinheiten Das Hauptziel dieser Studie war die Evaluierung, ob die Expression von GABAA-
Rezeptoruntereinheiten in der hippocampalen Formation zwischen
pharmakoresistenten und pharmakosensitiven Ratten differiert, was mit einer semi-
quantitativen Bildanalyse der relativen optischen Dichte untersucht wurde.
Bei nicht-epileptischen Kontrollen war die Verteilung der GABAA-
Rezeptoruntereinheiten α1, α2, α3, α4, α5 und γ2 im Hippocampus ähnlich zu der
bereits vorher beschriebenen (FRITSCHY und MÖHLER, 1995; SCHWARZER et al.,
1997). Zwischen Kontrollen und Shams waren keine Unterschiede vorhanden.
Im Gegensatz zu Respondern kam es bei den Phenobarbital-Nonrespondern zu
einer deutlicheren und ausgedehnteren Reduktion der Immunreaktivität von GABAA-
Rezeptoruntereinheiten. Alle GABAA-Rezeptoruntereinheiten waren in den meisten
hippokampalen Regionen bei den pharmakoresistenten Tieren im Vergleich zur
Kontrolle runterreguliert. Die Runterregulation war am größten für die α5–
Untereinheit (CA1: ipsilateral: 60,81 % und kontralateral 63,45 % Verlust in Relation
zur Kontrollgruppe) und am schwächsten für die α4–Untereinheit. Da bei den
Nonrespondern eine signifikante Neurodegeneration in der CA1, CA3 und im Hilus
detektierbar war, ist vor allem der relativ gut erhaltene Gyrus dentatus von
speziellem Interesse beim Gruppenvergleich. Es zeigte sich, dass bei den
pharmakoresistenten Tieren eine signifikante Reduktion der Untereinheiten α1, α2,
α5 und γ2 im Gyrus dentatus auftrat. In der Pyramidenzellschicht der CA1 bestand
bei den Nonrespondern eine Tendenz zur Hochregulation der α4-Immunreaktivität.
Die Differenz der Inzidenz von Neurodegeneration zwischen Respondern (einer von
acht) und Nonrespondern (fünf von sechs) war signifikant (p= 0,0256).
Die Phenobarbital-sensitiven Tiere zeigten ebenfalls eine leicht verminderte
Expression der GABAA-Rezeptor-Immunaktivität, vor allem in der CA1 und der CA3
Region. So kam es bei den Respondern zu Runterregulationen von α2 in CA3 und
Hilus (CA2 kontralateral), α3 in CA1 und Hilus, α4 in CA3, α5 und γ2 in CA1, CA3
und Hilus. Die Färbung für α1 war in keiner Subregion von Phenobarbital-
Respondern signifikant verändert. Weiterhin waren keine Veränderungen in der
Körnerzellschicht und dem Str. molekulare des Gyrus dentatus zu beobachten. Beim
Ergebnisse
86
Vergleich von Phenobarbital-Respondern und Phenobarbital-Nonrespondern zeigt
sich, dass bei den Nonrespondern in der CA1 Region die Untereinheiten α1, α4 und
α5 signifikant geringer exprimiert sind (siehe Tab.7). Die δ-Untereinheiten konnte
nicht ausgewertet werden, da die Färbeintensität aus unbekannten Gründen zu
schwach ausfiel und sich für die optische Dichtemessung nicht eignete. Die
Untereinheiten β2/3 konnte ebenfalls nicht analysiert werden, da die Färbung zu
stark und unspezifisch ausfiel. Eine mögliche Ursache könnte darin bestehen, dass
nahezu alle Rezeptoren entweder die Untereinheiten β2 und/oder β3 exprimieren, so
dass die Färbung sehr intensiv und relativ unspezifisch ausfällt, da fast alle
Rezeptoren gefärbt werden.
Die folgenden Ergebnisse beziehen sich daher nur auf die Untereinheiten α1-5 und
γ2.
Ergebnisse
87
Hilus und DG
Hilus CA3
Str. molekulare
Körnerzellen CA1
DG
Hippocampus gesamt
100x
Alpha1
25x
CA1A) B)
D) E) F)
G) H) I)
J) K) L)
Str. oriens
Str. pyramidale
100xStr. lacunosum
C)
Str. radiatum
Ergebnisse
88
Abb. 29: Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheit α1 bei A-C) Kontrolle
(NIH44), D-F) Sham (NIH 27), G-I) Responder (NIH 25) und J-L) Nonresponder
(NIH 13). In den Abb. A-J ist der ipsilaterale Hippocampus gesamt dargestellt.
Die Abb. B-K zeigen eine Ausschnittvergrößerung des Gyrus dentatus. Abb. C-
L wiederum stellt eine Vergrößerung der CA1-Region dar.
Vor allem die dendritischen Schichten des Hippocampus waren deutlich für α1
gefärbt. Am prägnantesten fiel die Färbung für α1 in Str. oriens aus. Aber auch
Str. radiatum, Str. lacunosum und Str. molekulare waren deutlich gefärbt. Das
Str. oriens war stärker gefärbt als das Str. radiatum und dieses war wiederum
markanter gefärbt als Str. lacunosum und Str. molekulare. Im Hilus und in der
CA3 waren Perikaryen und Fasern von mutmaßlichen Interneuronen,
einschließlich Korbzellen, detektierbar. Die Daten entsprechen denen von
SCHWARZER et al. (1997). Die Pyramidenzellschicht in der CA1 und CA3
sowie die Körnerzellen waren nicht angefärbt. Im gesamten Hippocampus
waren Fasern erkennbar. Kontrollen und Shams unterschieden sich nicht. Die
prinzipielle Färbung war auch bei Respondern und Nonrespondern zu
erkennen. In epileptischen Ratten war eine generelle Reduktion der α1-
Immunreaktivität detektierbar, welche bei den Nonrespondern am deutlichsten
auftrat. Bei dem hier abgebildeten Nonresponder sind kaum Interneurone und
Korbzellen im Hilus detektierbar.
Die Kalibrationsbalken sind bei der 25fachen Vergrößerung 500 μm und bei der
100fachen Vergrößerung 200 μm lang.
Ergebnisse
89
Alpha2
DG
CA1 CA3
25x 100x 100x
Körnerzellen
Hilus
Str. molekulare
Str. oriens
Str. pyramidale
Str. radiatum
Str. lacunosum
Abb. 30: Färbung für die GABAA-Rezeptoruntereinheit α2 im Hippocampus von A-C)
Sham (NIH 36), D-F) Responder (NIH 21) und G-I) Nonresponder (NIH 18). In Abb.
A-G ist der Hippocampus gesamt dargestellt. Abb. B-H zeigt eine
Ausschnittvergrößerung des Gyrus dentatus und Abb. C-I stellt die CA1-Region im
Detail dar. Die Untereinheit α2 war in allen hippocampalen Subregionen
nachweisbar, am deutlichsten war die Färbung jedoch für die Molekularschicht des
Gyrus dentatus, wie auch bei SCHWARZER et al. (1997) nachgewiesen. Der Hilus
und das Str. lacunosum waren nur schwach angefärbt. Die Schichten Str. oriens und
Str. radiatum waren in der CA3 deutlicher gefärbt als in der CA1. Die Färbeintensität
war bei epileptischen Ratten reduziert, vor allem bei den Phenobarbital-
Nonrespondern. Kalibrationsbalken: 25 fache Vergrößerung: 500 μm und 100 fache
Vergrößerung: 200 μm.
D)
Hippocampus gesamt Hilus und DG CA1
B) C) A)
E) F)
G) H) I)
Ergebnisse
90
Alpha3
Hippocampus gesamt
Abb. 31: Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheit α3 bei A-C) Sham (NIH 1), D-F)
Responder (NIH 25) und G-I) Nonresponder (NIH 17). In Abb. A-G ist der ipsilaterale
Hippocampus gesamt dargestellt. Die Abb. B-H zeigt den Gyrus dentatus und Abb. C-
I eine Ausschnittvergrößerung der CA1. Die Färbung für die Untereinheit α3 fiel
insgesamt schwach aus, wie bereits bei SCHWARZER et al. (1997) beobachtet. Zwar
waren im Hilus Perikaryen und teilweise Fasern erkennbar, im Gegensatz zu den
Ergebnissen von SCHWARZER et al. (1997) waren hier jedoch keine dunklen Cluster
von Perikaryen zu sehen. Die Pyramidenzellen der CA1 und CA3, die Körnerzellen
des Gyrus dentatus und das Str. molekulare waren am stärksten gefärbt. Die Färbung
für α3 war für die Responder und Nonresponder nicht wesentlich schwächer als für
die Kontrollen und Shams. Kalibrationsbalken: 25 fache Vergrößerung: 500 μm; 100
fache Vergrößerung: 200 μm.
A)
Hilus und DG CA1
CA1
DG CA3
Körnerzellen
25x
100x Hilus
Str. molekulare 100x
Str. oriens
Str. pyramidale
Str. radiatum
Str. lacunosum
B) C)
D) E) F)
G) H) I)
Ergebnisse
91
Alpha4Hippocampus gesamt
A)Hilus und DG CA1
25x
CA1
DG CA3
100x
Körnerzellen
Hilus
Str. molekulare 100x
Str. oriens Str. pyramidale
Str. radiatum
Str. lacunosum
Abb. 32: Färbung für die GABAA-Rezeptoruntereinheit α4 bei A-C) Kontrolle (NIH39),
D-F) Responder (NIH 21) und G-I) Nonresponder (NIH 13). Die Abb. A-G zeigen den
ipsilateralen Hippocampus gesamt. In Abb. B-H ist eine Ausschnittvergrößerung des
Gyrus dentatus zu sehen und Abb. C-I stellt die CA1 Region vergrößert dar. Die
Molekularschicht des Gyrus dentatus war am prägnantesten und Str. oriens sowie Str.
radiatum der CA1 waren schwach gefärbt, was die Resultate von SCHWARZER et al.
(1997) bestätigt. Die übrigen hippocampalen Bereiche wiesen nur eine schwache
Färbung auf. Responder und Nonresponder unterschieden sich nicht deutlich von
Kontrollen und Shams. Allerdings war bei zwei Nonrespondern (NIH13 und NIH17)
eine deutliche Anfärbung der Pyramidenzellschicht erkennbar (Pfeil), welche bei den
Kontrollen, Shams und Respondern fehlte. Kalibrationsbalken: 25 fache
Vergrößerung: 500 μm; 100 fache Vergrößerung: 200 μm.
B) C)
D) E) F)
G) H) I)
Ergebnisse
92
Alpha5
Hippocampus gesamt
A)
Hilus und DG CA2
25x
CA1
DG CA3
100x 200x
Körnerzellen
Hilus
Str. oriens
Str. pyramidale
Str. radiatum
Abb. 33: Färbung für die GABAA-Rezeptor-Untereinheit α5 bei A-C) Sham (NIH
36), D-F) Responder (NIH 23) und G-I) Nonresponder (NIH 18). Abb. A-G zeigt
den ipsilateralen Hippocampus gesamt. In den Abb. B-H ist der Hilus vergrößert
dargestellt und Abb. C-I stellt eine Ausschnittvergrößerung der CA2 dar. Wie bei
SCHWARZER et al. (1997) waren auch im vorliegenden Versuch vor allem die
dendritischen Schichten des Str. oriens und Str. radiatum intensiv für die
Untereinheit α5 gefärbt. Epileptische Ratten wiesen das gleiche Färbeschema auf,
waren jedoch schwächer gefärbt. Nonresponder waren gegenüber den Kontrollen
deutlich weniger gefärbt. Bei dem hier abgebildeten Nonresponder fällt der
deutliche Verlust von α5 in der CA2 auf (Abb.I). Kalibrationsbalken: 25x
Vergrößerung: 500 μm; 100x Vergrößerung: 200 μm; 200x Vergrößerung:100 μm.
B) C)
D) E) F)
G) H) I)
Ergebnisse
93
Gamma2
200x
A)
Hippocampus gesamt Hilus und DG CA1
25x
CA1
DG
CA3
100x
Körnerzellen
Hilus
Str. molekulare
Str. oriens
Str. pyramidale
Str. radiatum
Abb. 34: Färbung für die GABAA-Rezeptoruntereinheit γ2 bei A-C) Sham (NIH3), D-
F) Responder (NIH 31) und G-I) Nonresponder (NIH 6). Abb. A-G zeigt den
ipsilateralen Hippocampus gesamt. Die Abb. B-H zeigt den Gyrus dentatus und Abb.
C-I stellt die CA3-Region vergrößert dar. Die Ergebnisse für die γ2-Färbung
entsprechen denen von SCHWARZER et al. (1997). Die γ2-Immunreaktivität
konzentrierte sich in den Dendriten des Str. radiatum von der CA1 zur CA3, dem Str.
lacunosum und der Molekularschicht. Der Hilus wies kaum Färbung auf, jedoch
waren einzelne Perikaryen sichtbar. Epileptische Ratten zeigten eine generelle
Reduktion der Färbeintensität, welche bei den Phenobarbital-Nonrespondern am
ausgeprägtesten war. Kalibrationsbalken: 25 fache Vergrößerung: 500 μm; 100 fache
Vergrößerung: 200 μm; 200 fache Vergrößerung: 100 μm.
B) C)
D) E) F)
G) H) I)
Ergebnisse
94
Einzelgraphen GABAA-Rezeptoruntereinheiten Resultate der optischen Dichtemessung in CA1, (CA2), CA3, Hilus und Gyrus
dentatus für die GABAA-Rezeptoruntereinheiten α1-5 und γ2 im Gruppen- und
Seitenvergleich. Die Auswertung zwischen den Gruppen erfolgte mittels einer One-
way-ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Post hoc Test. (P< 0,05). Der
Seitenvergleich erfolgte mittels eines paarigen, zweiseitigen t-Tests (P< 0,05).
Signifikanzsterne zwischen der kontra- und der ipsilateralen Seite bedeuten
Unterschiede zwischen den Hirnhemisphären für die darunter angegebenen
Gruppen.
Ergebnisse
95
GABAA-Rezeptor-Untereinheit Alpha 1
kontralateral ipsilateral
0
10
20
30
40
50
60
ResponderNonresponderKontrolle
Sham
CA1 ****
*****
***O
ptis
che
Dic
hte
kontralateral ipsilateral
0
5
10
15
20
25
30
35 ResponderNonresponder
KontrolleSham
CA3
Opt
isch
e D
icht
e
*
kontralateral ipsilateral
0
10
20
30
40
ResponderNonresponderKontrolleSham
Hilus
***
***
**Sham
Opt
isch
e D
icht
e
kontralateral ipsilateral
05
1015202530354045
ResponderNonresponder
KontrolleSham
Gyrus dentatus
Opt
isch
e D
icht
e
**** *
Ergebnisse
96
GABAA-Rezeptor-Untereinheit Alpha 2
kontralateral ipsilateral05
1015202530354045
Responder NonresponderKontrolle ShamCA1** **
*O
ptis
che
Dic
hte
kontralateral ipsilateral0
10
20
30
40
50
ResponderNonresponder
KontrolleSham
*
*****
*CA3
Nonres-ponder
Opt
isch
e D
icht
e
kontralateral ipsilateral0
10
20
30
40
ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
*****
***Hilus
kontralateral ipsilateral05
10152025303540455055
ResponderNonresponder Kontrolle
Sham
Opt
isch
e D
icht
e
* **Gyrus dentatus
Ergebnisse
97
GABAA-Rezeptor-Untereinheit Alpha 3
kontralateral ipsilateral0
5
10
15
20
25
Responder Nonresponder KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
CA1 ***
*********
kontralateral ipsilateral
0
5
10
15
20
25ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
*CA3
kontralateral ipsilateral0
5
10
15
20
25ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
*
*** Hilus
*Kon-trolle
kontralateral ipsilateral0
5
10
15
20
25
30 ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
Gyrus dentatus
Ergebnisse
98
GABAA-Rezeptor-Untereinheit Alpha 4
kontralateral ipsilateral0
5
10
15
20
25ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
***
****
***
***
CA1
kontralateral ipsilateral0
5
10
15
20 ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
CA3
kontralateral ipsilateral0
5
10
15 ResponderNonresponder
KontrolleSham
Hilus
Opt
isch
e D
icht
e
**Kon-trolle
kontralateral ipsilateral
0
5
10
15
20
25
30 ResponderNonresponder
KontrolleSham
*ShamO
ptis
che
Dic
hte
Gyrus dentatus
Ergebnisse
99
GABAA-Rezeptor-Untereinheit Alpha 5
kontralateral ipsilateral0
10
20
30
40
50
60
ResponderNonresponder Kontrolle
Sham
Opt
isch
e D
icht
e***
*
***
*****
*
*CA1
kontralateral ipsilateral
0
10
20
30
40ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
*****
**** CA2
kontralateral ipsilateral05
1015202530354045
ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e *******
***
CA3
Ergebnisse
100
GABAA-Rezeptor-Untereinheit Alpha 5
kontralateral ipsilateral0
5
10
15 ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e**
**Hilus
kontralateral ipsilateral0
5
10
15
20 ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
* Gyrus dentatus
Ergebnisse
101
GABAA-Rezeptor-Untereinheit Gamma 2
kontralateral ipsilateral05
1015202530354045
ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
***
*******
CA1
kontralateral ipsilateral20
25
30
35
40
ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
***
**
****
CA3
kontralateral ipsilateral0
5
10
15
20
25
30
35 ResponderNonresponder Kontrolle
Sham
Opt
isch
e D
icht
e ****
**
Hilus
kontralateral ipsilateral0
10
20
30
40
ResponderNonresponder
KontrolleSham
Opt
isch
e D
icht
e
*Gyrus dentatus
Ergebnisse
102
Tab. 7: Die Auswertung erfolgte mittels einer One-way-ANOVA, gefolgt von einem
Bonferroni-Post hoc Test. Die Pfeile bedeuten eine signifikante Runterregulierung
beziehungsweise Hochregulation gegenüber den dahinter in Kürzeln angegebenen
Gruppen (P<0,05). Die Prozentangaben zeigen den Verlust der jeweiligen
Untereinheit gegenüber der Kontrollgruppe an. Die CA2 Region wurde nur bei der
Untereinheit α5 ausgewertet, da die Modulation dieser Untereinheit in der CA2 beim
Epilepsiegeschehen eine Rolle innehaben könnte (HOUSER und ESCLAPEZ, 2003).
Die CA2 Region ist mikroskopisch gegenüber der CA1 und der CA3 teilweise nur
schwer abgrenzbar, weshalb die Analyse dieses Bereiches auf die α5-Untereinheit
beschränkt wurde. Die Regionen des Ammonshorn sind mehr oder weniger stark von
Neurodegeneration betroffen (siehe auch Diskussion), wie C. Fuest anhand eines
Score-Systems zeigen konnte. Da der Gyrus dentatus keinen solchen extremen
Neuronenverlust aufweist und daher von besonderem Interesse ist, ist diese Region
in der Tabelle grau hinterlegt.
links GABA-A Rezeptor Untereinheiten
Gruppe Hippocampale
Region α 1 α 2 α 3 α 4 α 5 γ 2
Responder CA1 ↑ N
18,75 %19,74
%
↓ K, ↑ N 16,79
%
↑ N 22,58
% ↓K, ↑ N 33,48 %
↓ S 22,56 %
CA2 33,77 % ↓ K
CA3 25,16
%
↓ K 28,50
% 20,52
% 17,81
% ↓ K
35,80 % ↓ K
25,57 %
Hilus 25,80
% 21,83
%
↓ K, S 28,70
% 12,05
% ↓ K
31,29 % ↓ S
24,56 %
Gyrus dentatus 16,51
% 17,92
% 16,49
% 15,87
% 28,10 % 20,52 %
Non- CA1
↓ K, S, R 55,30 %
↓ K, S 37,20
%
↓ K, S, R 35,06
%
↓ K, S, R 49,54
% ↓ K, S, R 63,45 %
↓ K, S 42,81 %
responder CA2 ↓ K, S
54,55 %
CA3 ↓ S
35,12 %
↓ K 29,79
% 22,12
% 24,12
% ↓ K, S
59,02% ↓ K, S
34,42 %
Ergebnisse
103
Hilus ↓ K, S
42,82 %
↓ K, S 41,73
%
↓ K, S 26,96
% 15,85
% ↓ K
35,64 % ↓ K, S
34,71 %
Gyrus dentatus ↓ K, S
35,09 %
↓ K 27,62
% 11,82
% 23,70
% ↓ K
39,00 % ↓ K
24,37 %rechts GABA-A Rezeptor Untereinheiten
Gruppe Hippocampale
Region α 1 α 2 α 3 α 4 α 5 γ 2
Responder CA1 15,71
% 10,81
% 7,65 %24,81
% ↑ N ↓ K 29,15 % 20,26 %
CA2 31,62 %
CA3 4,55 %
↓ K 25,74
% 16,81
%
↓ K 14,53
% 28,92 % ↓ S
25,57 %
Hilus 17,17
%
↓K 28,11
% 21,00
% 9,66 % 20,19 % 19,62 %
Gyrus dentatus 12,01
% 18,74
% 9,07 % 24,70
% 15,44 % 17,03 %
Non- CA1 ↓ K, S
46,66 %
↓ K 33,50
%
↓ K, S 22,69
% 47,08
% ↓ K, S, R 60,81 %
↓ K, S 42,86 %
responder CA2 ↓K
41,99 %
CA3 15,89
%
↓K 39,45
%
↓ K 23,11
%
↓ K, S 21,51
% ↓K, S
56,17 % ↓ K, S
34,42 %
Hilus ↓ K, S
34,50 %
↓K 39,29
% 19,31
% 5,01 % 28,61 % ↓ K
27,47 %
Gyrus dentatus ↓ S
33,13 %
↓ K 30,93
% 8,62 % 27,71
% 29,79 % 20,33 % Legende: K=Kontrolle, S=Sham, R=Responder, N=Nonresponder
Ergebnisse
104
Tab. 8: Vergleich der ipsi- und kontralateralen Hirnhemisphären hinsichtlich der
GABAA-Rezeptoruntereinheiten. Ipislateral bezieht sich auf die rechte Hemisphäre, in
welcher die Elektrode lokalisiert ist. Kontralateral beschreibt entsprechend die linke
Hirnhälfte. Der Seitenvergleich erfolgte mittels eines paarigen, zweiseitigen t-Tests
(P< 0,05): Es sind keine besonderen Unterschiede zwischen den Hirnhemisphären
erkennbar.
GABA-A Rezeptor-Untereinheiten
Gruppe Hippocampale
Region α 1 α 2 α 3 α 4 α 5 γ 2Responder CA1
CA2 CA3 Hilus Dentater Gyrus
Nonresponder CA1 CA2 CA3 * l > r Hilus Dentater Gyrus
Sham CA1 CA2 CA3 Hilus ** l > r Dentater Gyrus * l > r
Kontrolle CA1 CA2 CA3 Hilus * l > r ** l > r Dentater Gyrus
Diskussion
105
6 Diskussion
6.1 Selektion In einer vorhergehenden Studie, bei welcher in dem gleichen post-SE Rattenmodell
für Temporallappenepilepsie Phenobarbital verabreicht wurde, konnten von
insgesamt elf Ratten vier Phenobarbital-Nonresponder selektiert werden (36 %)
(BRANDT et al., 2004). Dieses Resultat konnte in der vorliegenden Arbeit
reproduziert werden, da hier sechs von 15 Tieren (40 %) als Phenobarbital-
Nonresponder eingestuft wurden. Diese Resistenz konnte auf ein weiteres
Antiepileptikum mit differierendem Wirkmechanismus ausgedehnt werden, da 83 %
der Phenobarbital-Nonresponder sich auch als resistent gegenüber der Behandlung
mit Phenytoin erwiesen und damit der Situation bei Humanpatienten entsprechen,
bei welchen 86-90 % der Epilepsiekranken mit persistierenden Anfällen sich trotz
Behandlung mit einem adäquaten Antiepileptikum auch als resistent gegenüber
alternativen Medikamenten zeigen (ZUMSTEG et al., 2006).
Verglichen mit Phenobarbital gestaltete sich die Entwicklung eines geeigneten
Dosierungsschemas für Phenytoin ungleich schwieriger, da Phenytoin nur eine
relativ enge therapeutische Konzentrationsspanne aufweist. Bei leicht erhöhten
Plasmaspiegeln kann es zu toxischen Effekten wie Ataxie und Somnolenz kommen
(KUTT und HARDEN, 1999). Des weiteren kann Phenytoin bei toxischen
Konzentrationen sowohl bei Humanpatienten als auch bei Labortieren prokonvulsive
Effekte ausüben, was zu einer Anfallsverschlechterung führen kann (LÖSCHER et
al., 1998; PERUCCA et al., 1998). Ob Phenytoin pro- oder antikonvulsive Effekte
ausübt, scheint vom jeweiligen Status der Neurone abzuhängen. So ist anzunehmen,
dass die exzitatorischen Effekte, welche Phenytoin auf eine Subgruppe von
normalen Neuronen ausübt, durch Prozesse wie Kindling verstärkt werden, und
dadurch Phenytoin-Konzentrationen, die normalerweise antikonvulsiv wirken, zu
prokonvulsiver Aktivität führen (JURNA, 1985). Verglichen mit Vorversuchen zur
Dosisfindung bei nicht-epileptischen Tieren, reagierten die epileptischen Tiere mit
verstärkten neurotoxischen Nebenwirkungen (Ataxie, Sedation) und einer Erhöhung
der Anfallsfrequenz bei hohen Phenytoin-Dosen, welche mit Plasmaspiegeln > 20
μg/ml einhergingen und eine individuelle Phenytoin-Dosierung unumgänglich
Diskussion
106
machten. Nach Anpassung der Dosierung führte Phenytoin bei 40 % der Tiere zu
einer Anfallsreduktion. Die durchschnittliche Plasmakonzentration, bei welcher
Phenytoin antikonvulsive Effekte aufwies, lag bei 12 μg/ml (im Bereich von 6-23
μg/ml), das heißt nahe bei der therapeutischen Plasmakonzentration von 10-20
μg/ml, welche für Humanpatienten gilt (HVIDBERG, 1985; KUTT und HARDEN,
1999). Bei der Mehrheit der Patienten wird eine verbesserte Anfallskontrolle
beobachtet, wenn die Plasmaspiegel von Phenytoin 10 μg/ml erreichen (KUTT und
HARDEN, 1999). Der vorliegende Versuch zeigt, dass durch eine individuelle
adäquate Adjustierung der Phenytoin-Dosierung eine komplette Kontrolle der
spontan wiederkehrenden Anfälle bei einigen Tieren erzielt werden kann
(BETHMANN et al., 2007).
Zwei weitere Studien haben den Effekt von Phenytoin auf spontan wiederkehrende
Anfälle in post-SE-Modellen für Temporallappenepilepsie charakterisiert (LEITE und
CAVALHEIRO, 1995; VAN VLIET et al., 2006). Die Studie von VAN VLIET (2006)
wird bei der Kombinationstherapie diskutiert. In der Studie von LEITE und
CAVALHEIRO (1995) wurden in einem Pilocarpin-Modell männliche Wistar-Ratten
zweimal täglich mit je 50 mg/kg Phenytoin i. p. über einen Zeitraum von zwei
Wochen behandelt. Von insgesamt acht untersuchten Tieren wurde bei zweien eine
komplette Anfallskontrolle observiert und fünf weitere zeigten einen deutlichen
Anfallsrückgang. Während der Phenytoin-Gabe beobachteten LEITE und
CAVALHEIRO (1995) Sedation und leichte Muskelrelaxierung. Während der
zweiwöchigen Kontrollphasen vor und nach der Behandlung sowie der
Behandlungsphase, wurden die Anfälle lediglich für 10 Std./Tag, 5 Tage/Woche
aufgezeichnet, und nur zwei der acht Tiere besaßen EEG-Elektroden, mittels derer
für 2 Std./Tag, 3 Tage/Woche ein EEG abgeleitet wurde. Es erfolgte also keine
kontinuierliche EEG- und Videoüberwachung, welche für die Evaluierung von
Effekten von Antiepileptika bei Ratten mit spontan wiederkehrenden Anfällen eine
Grundvoraussetzung darstellt (STABLES et al., 2003; BERTRAM, 2006).
Ein generelles Problem bei der Testung von Antiepileptika auf ihre Effizienz im
Rattenmodell mit spontanen Anfällen liegt in der Bestimmung der optimalen Dauer
des Behandlungszeitraums, welcher verlässliche Einschätzungen der Effizienz
Diskussion
107
erlauben muss, besonders im Hinblick auf beachtliche inter-individuelle Variabilitäten
bei der Anfallsfrequenz. Deshalb wurde bei dem Selektionsmodell ein Testschema
mit Kontrollphasen vor und nach der Behandlungsphase verwendet, welches die
Möglichkeit bot, dass jedes Tier als seine eigene Kontrolle fungierte. Vorhergehende
Versuche mit dem vorliegenden Post-SE-Modell für Temporallappenepilepsie
konnten bestätigen, dass die Mehrheit der epileptischen Ratten spontan
wiederkehrende Anfälle während zweiwöchiger Perioden zeigte, und dass sich die
Frequenz dieser Anfälle zwischen Pre- und Postrdrug-Phasen nicht signifikant
unterschied (BRANDT et al., 2004). Für präzisere Aussagen bezüglich der Effizienz
von Antiepileptika wäre es sicherlich von Vorteil, die Dauer der Kontroll- und
Behandlungsphasen noch auszudehnen. Es würde jedoch einen enormen Aufwand
hinsichtlich der visuellen Analyse von EEGs und Videobändern bedeuten, wenn
große Tiergruppen über mehrere Wochen mit einer kontinuierlichen Überwachung
(24 Std./Tag, 7 Tage/Woche) aufgenommen werden würden (BERTRAM, 2006). Die
momentan auf dem Markt erhältlichen automatischen Programme zur
Anfallsdetektion sind nicht akkurat genug, um für die Verwendung bei der EEG-
Analyse der Effizienz von Antiepileptika in Rattenmodellen in Frage zu kommen.
Außerdem ist eine Kombination von EEG- und Videomonitoring unerlässlich, um
EEG-Artefakte auszumerzen (BERTRAM, 2006). Die EEG- und Videoaufzeichnung
von Nagetieren ist technisch aufwendig, teuer und verbunden mit einem enormen
personellen Zeitaufwand, was erklärt, dass nur wenige Arbeitsgruppen die Effizienz
von Antiepileptika in Rattenmodellen mit spontanen Anfällen evaluieren (STABLES et
al., 2003; BERTRAM, 2006). Die Entwicklung neuer Technologien, welche die
Genauigkeit von automatischer Anfallsdetektion verbessern und somit die Testung
von Antiepileptika in einem kleineren Zeitrahmen ermöglichen, wäre daher
wünschenswert (STABLES et al., 2003).
In Bezug auf die Beobachtung, dass epileptische Ratten mit spontanen Anfällen
sensitiver auf die zentralen Nebenwirkungen von Phenytoin ansprechen als nicht-
epileptische Kontrollen, ist es interessant zu bemerken, dass in früheren Versuchen
gekindelte Ratten sensitiver als nicht-gekindelte Ratten auf neurotoxische
Nebenwirkungen einschließlich prokonvulsiver Effekte von mehreren klinisch
Diskussion
108
etablierten Antiepileptika, darunter auch Phenytoin, reagierten (LÖSCHER et al.,
1989; LÖSCHER und HÖNACK, 1990; LÖSCHER und HÖNACK, 1991;
RUNDFELDT et al., 1994; WLAZ et al., 1994; HÖNACK und LÖSCHER, 1995;
LÖSCHER et al., 1998; POTSCHKA et al., 2000). Das könnte darauf hindeuten, dass
die Epileptogenese, wie sie durch Kindling oder einen SE induziert wird, das Gehirn
empfindlicher gegenüber neurotoxischen Effekten bestimmter Medikamente werden
lässt und damit den therapeutischen Index dieser Substanzen einschränkt. Die
Gründe einer erhöhten Sensitivität für prokonvulsive Effekte sind nicht hinreichend
klar, beinhalten aber mutmaßlich eine verminderte Anfallsschwelle korreliert mit einer
erhöhten Erregbarkeit des Gehirns und/oder Veränderung in Zielstrukturen des
Antiepileptikums, wie sie beim Epilepsiegeschehen vorkommen (LÖSCHER, 1999;
REMY und BECK, 2006).
Durch die vorliegende Beobachtung, dass die Mehrheit derjenigen Tiere, welche sich
als resistent gegenüber Phenobarbital erwiesen, ebenfalls nicht auf Phenytoin
ansprach, erfüllt das Epilepsiemodell die wichtigste Bedingung eines Tiermodells für
pharmakoresistente Epilepsie, die besagt, dass die anhaltende Anfallsaktivität nicht
oder nur schwach auf mindestens zwei Antiepileptika, welche in ihrer maximal
tolerierbaren Dosis verabreicht werden, anspricht (STABLES et al., 2003). Diese
Definition von Pharmakoresistenz für Epilepsiemodelle wurde von einem Modell-
Workshop empfohlen, welcher von den National Institutes of Health (NIH) 2002
organisiert wurde (STABLES et al., 2003).
Die Frequenz von spontan wiederkehrenden Anfällen kann bekanntermaßen in Post-
SE-Modellen für Temporallappenepilepsie stark variieren (NISSINEN et al., 2000;
CAVALHEIRO et al., 2006; DUDEK et al., 2006). Das konnte auch für das
vorliegende Modell (BRANDT et al., 2003; BRANDT et al., 2004) bestätigt werden.
Vor allem Ratten mit einer besonders hohen Anfallsfrequenz scheinen resistent
gegenüber Phenobarbital zu sein (BRANDT et al., 2004), was auf einen schwereren
Krankheitsgrad hindeutet. Allerdings sprach im vorliegenden Versuch ein
Phenobarbital-Nonresponder mit einer besonders hohen Anfallsfrequenz auf
Phenytoin an. Die Ursache hierfür ist nicht klar, jedoch passt diese Beobachtung zu
klinischen Erfahrungen, bei den Patienten mit anhaltenden Anfällen trotz der
Diskussion
109
Behandlung mit geeigneten Antiepileptika in maximal tolerierbaren Dosierungen
immerhin eine geringe Chance haben, auf alternative Antiepileptika anzusprechen
(ZUMSTEG et al., 2006).
Ein möglicher Erklärungsansatz für die beobachtete, simultane Resistenz gegenüber
Phenytoin und Phenobarbital könnte die Überexpression des Efflux-Transporters P-
glykoprotein (P-gp) in kapillären Endothelzellen von Nonrespondern in limbischen
Hirnregionen (Hippocampus, piriformer Kortex) darstellen, welche kürzlich
nachgewiesen wurde (VOLK und LÖSCHER, 2005). Sowohl Phenytoin als auch
Phenobarbital stellen P-gp-Substrate dar, so dass die erhöhte Expression dieses
Multidrug-Transporters in Endothelzellen von Gehirnkapillaren, welche die Blut-
Hirnschranke formen, die Aufnahme dieser Antiepileptika ins Gehirn reduzieren
könnte (LÖSCHER und POTSCHKA 2005 a und b). VAN VLIET et al. (2007b)
konnten in einem ähnlichen Post-SE-Modell für Temporallappenepilepsie zeigen,
dass die Überexpression von P-gp im Hippocampus sowie im entorhinalen Kortex zu
verminderten Phenytoin-Konzentrationen in diesen Hirnregionen führt.
Durch die Verwendung von Phenytoin für die Selektion von Phenytoin-resistenten
Ratten im Amygdala-Kindling-Modell für Temporallappenepilepsie konnte in früheren
Untersuchungen gezeigt werden, dass sich die Resistenz gegenüber Phenytoin bei
diesen Tieren auch auf Phenobarbital und diverse andere Antiepileptika ausdehnt
(LÖSCHER, 1997). Phenytoin-resistente gekindelte Ratten wurden intensiv
charakterisiert, und es scheinen sowohl genetische Faktoren als auch kindling-
assoziierte Gehirnveränderungen, einschließlich einer P-gp-Überexpression in der
gekindelten Amygdala, in die Mechanismen, welche Pharmakoresistenz zugrunde
liegen, involviert zu sein (LÖSCHER, 1997; POTSCHKA et al., 2004a; LÖSCHER,
2006). Interessanterweise war das neue Antiepileptikum Levetiracetam das einzige
Antiepileptikum, welches sich bei Phenytoin-Nonrespondern als effektiv herausstellte
(LÖSCHER et al., 2000). In einer Folgestudie mit einem Pilocarpinmodell für
Temporallappenepilepsie konnten Ratten mit spontanen Anfällen selektiert werden,
die entweder auf Levetiracetam ansprachen oder nicht (GLIEN et al., 2002), was
darauf hinweist, dass Post-SE-Modelle der Temporallappenepilepsie die klinische
Effizienz von Antiepileptika eventuell korrekter vorhersagen als Kindlingstudien. Beim
Diskussion
110
Modell-Workshop des NIH 2002 wurde beschieden, dass basierend auf dem
heutigen Wissensstand und den verfügbaren Modellen, Modelle für symptomatische
Epilepsie, basierend auf elektrisch oder chemisch induziertem SE, die meisten
Parallelen mit einer häufigen Form der humanen pharmakoresistenten Epilepsie, der
mesialen Temporallappenepilepsie aufweisen (STABLES et al., 2003). Während des
Workshops wurde weiterhin beschlossen, dass Post-SE-Modelle für chronische
limbische Epilepsie für Studien zur Pharmakosensitivität und Resistenz empfohlen
werden für die Entwicklung neuartiger Therapiestrategien für pharmakoresistente
Epilepsie (STABLES et al., 2003). Mit den vorliegenden Versuchen anhand eines
Post-SE-Modells für Temporallappenepilepsie, in welchem spontan wiederkehrende
Anfälle mittels andauernder elektrischer Stimulation der basolateralen Amygdala
induziert wurden, werden einige dieser Empfehlungen berücksichtigt.
Die vorliegende Arbeit basiert auf mehreren vorhergehenden Versuchen zur
Pharmakoresistenz in unterschiedlichen Epilepsiemodellen. So untersuchten LEITE
und CAVALHEIRO (1995) den antikonvulsiven Effekt von konventionellen
Antiepileptika wie Phenobarbital, Phenytoin, Carbamazepin, Valproat und
Ethosuximid auf spontan wiederkehrende Anfälle im Pilocarpin-Modell bei Ratten.
Dabei stellte sich heraus, dass Phenobarbital (40 mg/kg/Tag), Carbamazepin (120
mg/kg/Tag), Phenytoin (100 mg/kg/Tag) sowie Valproat (600 mg/kg/Tag) die Anfälle
effektiv verhindern, wenn sie über einen Zeitraum von zwei Wochen appliziert
werden. Daraus wurde geschlussfolgert, dass die spontan wiederkehrenden Anfälle,
welche sich nach einem Pilocarpin-induzierten Status epilepticus entwickeln, ein
adäquates Modell für die Entdeckung neuer Antiepileptika mit einer höheren Effizienz
gegenüber komplex-fokalen Anfällen darstellen könnten. Da bei dem Versuch sehr
hohen Dosen von Phenobarbital, Phenytoin, Carbamazepin und Valproat verabreicht
wurden, konnten die spontanen Anfälle bei allen Ratten unterdrückt werden. Dies
entspricht jedoch nicht der klinischen Situation der Temporallappenepilepsie, bei
welcher mindestens 50 % der Patienten als pharmakoresistent eingestuft werden
(LEPPIK, 1992). Da in der Studie von LEITE und CAVALHEIRO (1995) keine
Plasmalevel ermittelt wurden, ist es nicht möglich, direkte Vergleiche zwischen den
Daten von Ratten und Humanpatienten zu ziehen, da die Pharmakokinetik von
Diskussion
111
Antiepileptika sich bei diesen beiden Spezies stark unterscheidet (LÖSCHER und
SCHMIDT, 1988). Die meisten Antiepileptika werden bei Ratten schneller eliminiert
als beim Menschen (LÖSCHER und SCHMIDT, 1988), was die Aufrechterhaltung
eines aktiven Medikamentenspiegels durch herkömmliche Applikationsrouten fast
unmöglich gestaltet. Um zu vermeiden, dass die Arzneistoffe zu rasch eliminiert
wurden, waren LEITE und CAVALHEIRO (1995) gezwungen, alle Antiepileptika
außer Phenobarbital zwei- bis dreimal täglich intraperitoneal zu injizieren. Dadurch
kann es zu starken Fluktuationen des Plasmaspiegels zwischen den Injektionen und
zu Peaks der Plasmakonzentration kommen, welche die therapeutischen
Plasmalevel beim Menschen weit übersteigen. LEITE und CAVALHEIRO
beobachteten gravierende Nebenwirkungen, wie Sedation und Muskelrelaxation. Da
die Definition der Pharmakoresistenz jedoch besagt, dass keine klinisch relevante
Verbesserung der Anfälle bei maximal tolerierbaren Dosierungen von
Standardantiepileptika zu beobachten ist (REGESTA und TANGANELLI, 1999), wäre
der antikonvulsive Effekt einer Substanz bei toxischer Dosierung für die Klinik
irrelevant (BETHMANN et al., 2007).
6.2 Kombinationstherapie Die vorliegenden Versuche basieren auf einer Reihe von Vorkenntnissen. So ist
bekannt, dass Phenobarbital-Nonresponder, welche mittels des Post-SE-Modells für
Temporallappenepilepsie selektiert werden, eine markante Überexpression des
Multidrug-Transporters P-gp in Endothelzellen der Gehirnkapillaren in limbischen
Hirnregionen, einschließlich des Hippocampus, aufweisen (VOLK und LÖSCHER,
2005). Da Phenobarbital ein bekanntes Substrat von P-gp darstellt (SCHUETZ et al.,
1996; POTSCHKA et al., 2002), könnten aus der erhöhten P-gp Expression
subtherapeutische Phenobarbital-Konzentrationen in den Zielstrukturen des Gehirns
resultieren (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a). Die P-gp Expression konnte im
vorliegenden Versuch nicht verifiziert werden, da die immunhistologische
Aufarbeitung der Gehirne auf die Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten hin
optimiert wurde, welche sich dadurch nicht mehr für P-gp-Analysen eigneten. So
betrug die Schnittdicke der Gehirne 40 μm, welche nicht geeignet ist, einzelne
Diskussion
112
Gefäße zu erfassen, da sich verschiedene Gehirnebenen überlagern können. Des
weiteren wurde die Regulation von P-gp im gleichen Selektionsmodell wie dem hier
verwendeten bereits in einer früheren Studie untersucht (VOLK und LÖSCHER,
2005). Dabei konnte gezeigt werden, dass P-gp bei Phenobarbital-resistenten Tieren
verglichen mit Phenobarbital-sensitiven Ratten in limbischen Hirnregionen (CA1,
Gyrus dentatus, piriformer Kortex) signifikant hochreguliert war.
Da die vorliegende Arbeit in genau der gleichen Art und Weise durchgeführt wurde,
wie die frühere Untersuchung zur P-gp Expression bei Nonrespondern (VOLK und
LÖSCHER, 2005), wurde vorausgesetzt, dass die Pharmakoresistenz hier ebenfalls
an eine erhöhte Expression von P-gp gekoppelt ist. Es war weiterhin bekannt, dass
die Hemmung von P-gp in der Blut-Hirnschranke die Penetration von systemisch
appliziertem Phenobarbital im Gehirn von normalen, nicht-epileptischen Ratten
erhöht (POTSCHKA et al., 2002). Deshalb wurde die Kombinationstherapie mit
einem selektiven P-gp Inhibitor bei Phenobarbital-resistenten epileptischen Ratten
mit einer Überexpression von P-gp in limbischen Hirnregionen als plausible Strategie
angesehen, um die Rolle von P-gp bei der Resistenz dieser Ratten zu erforschen. In
einem Mausmodell konnte die gleichzeitige Gabe des P-gp Inhibitors Tariquidar (6-
12 mg/kg i. p.) die antitumorale Aktivität einer Reihe von chemotherapeutischen
Agenzien, welche gegen zwei hochgradig chemotherapieresistente, P-gp
überexprimierende, humane Xenograft-Tumore gerichtet waren, vollständig
aufheben, ohne die Plasma-Pharmakokinetik oder die Toxizität der
Chemotherapeutika zu modifizieren (MISTRY et al., 2001). Tariquidar ist einer der
potentesten und selektivsten P-gp Inhibitoren, die derzeit zur Verfügung stehen
(MARTIN et al., 1999; MISTRY et al., 2001; BATES et al., 2002; THOMAS und
COLEY, 2003), und wurde darum als ideale Substanz für die vorliegenden
Experimente angesehen.
Bei der Mehrheit der Phenobarbital-Nonresponder konnte die Kombination mit
Tariquidar die Resistenz gegenüber Phenobarbital aufheben. Das Ausmaß dieses
dosisabhängigen Effektes war unerwartet, da die meisten Ratten, welche auf die
alleinige Behandlung mit Phenobarbital nicht ansprachen, unter der gleichzeitigen
Gabe von Tariquidar in Dosierungen von 15-20 mg/kg komplett anfallsfrei wurden.
Diskussion
113
Dieser erstaunliche Effekt des Tariquidars war weder mit einer erhöhten Toxizität
noch mit einem veränderten Plasmalevel von Phenobarbital verknüpft. Obwohl eine
epileptische Ratte während der Behandlung mit Tariquidar verstarb, wird dies nicht
als eine Konsequenz der Therapie mit dem P-gp Inhibitor (oder Phenobarbital)
angesehen, da eine andere Arbeitsgruppe gezeigt hat, dass Ratten eine Dosis bis zu
500 mg/kg Tariquidar ohne toxische Nebeneffekte tolerieren (Dr. John F. Waterfall;
Xenova Group, unveröffentlichte Daten). Es wird daher angenommen, dass der Tod
des Tieres eher eine Folge der schweren Epilepsie darstellte und nicht aus der
Behandlung resultiert, obgleich solche Schlussfolgerungen mittels zusätzlicher
Experimente in therapieresistenten, chronisch epileptischen Ratten überprüft werden
sollten. Die Tatsache, dass die Kombination mit Tariquidar die Resistenz gegenüber
den antikonvulsiven Effekten von Phenobarbital aufhob ohne gleichzeitige Erhöhung
der Toxizität, könnte durch die regional begrenzte Überexpression von P-gp im
Gehirn von Phenobarbital-Nonrespondern erklärt werden (VOLK und LÖSCHER,
2005). In dem verwendeten Modell wurde eine Hochregulation von P-gp in den
Kapillarendothelien im Hippocampus und im piriformen Kortex gefunden, also in
Hirnregionen die aller Wahrscheinlichkeit nach in das epileptische Netzwerk, welches
der Temporallappenepilepsie zugrunde liegt, involviert sind, jedoch nicht in extra-
limbischen Gehirnbereichen wie dem zerebralen Kortex (VOLK und LÖSCHER,
2005). Bei normalen Ratten wurde ein moderater, wenngleich statistisch
signifikanter, Anstieg der Phenobarbital-Gehirnlevel lediglich nach intrazerebraler
Perfusion einer hohen Konzentration des P-gp Inhibitors Verapamil (POTSCHKA et
al., 2002) und nicht nach systemischer Gabe von 15 mg/kg des selektiveren P-gp
Inhibitors Tariquidar beobachtet (C. Brandt, unveröffentlichte Daten).
Basierend auf diesen Daten könnte angenommen werden, dass bei normaler P-gp
Expression in der Blut-Hirnschranke ein zu vernachlässigender Effekt von P-gp auf
die Durchlässigkeit von lipophilen Antiepileptika wie Phenobarbital ausgeübt wird,
welche die Blut-Hirnschranke einfach durch passive Diffusion durchqueren
(LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b). In diesem Fall würde die Inhibition von P-gp
durch Tariquidar den Gehirnzugang von Antiepileptika nur dann wesentlich
beeinflussen, wenn P-gp in limbischen Hirnregionen überexprimiert wird, jedoch nicht
Diskussion
114
in anderen Hirnregionen oder in peripherem Gewebe mit normaler P-gp Expression.
Die gleichzeitige Gabe von Tariquidar würde dann zwar die therapeutischen
Konzentrationen von Phenobarbital in limbischen Hirnregionen gewährleisten, jedoch
nicht die Neurotoxizität steigern (BRANDT et al., 2006). Wie bereits erwähnt, erwies
sich derselbe Dosierungsbereich von Tariquidar, welcher in der vorliegenden Arbeit
verwendet wurde, auch als geeignet, um die antitumorale Aktivität von
Chemotherapeutika gegen P-gp überexprimierende Tumoren wiederherzustellen,
ohne die Toxizität dieser Agenzien zu erhöhen (MISTRY et al., 2001). In diesem
Zusammenhang ist es auch wichtig zu erwähnen, dass im Gegensatz zu den
deutlichen Unterschieden bezüglich des antikonvulsiven Effekts von Phenobarbital
die neurotoxischen Nebenwirkungen von Phenobarbital bei Respondern und
Nonrespondern die gleichen waren. Das deutet daraufhin, dass Nebenwirkungen von
anderen Hirnregionen vermittelt werden, als die antikonvulsiven Effekte von
Phenobarbital. Das gleiche trifft auch für Humanpatienten mit refraktärer Epilepsie
zu, bei denen Antiepileptika zwar die Anfälle nicht beeinflussen, aber dennoch
neurotoxische Nebeneffekte ausüben (KWAN und BRODIE, 2000).
Obwohl die ermittelten Daten deutlich für eine funktionelle Beteiligung von P-gp bei
Pharmakoresistenz sprechen, kann auch mit dem für diese Studie verwendeten
Modell nicht ausgeschlossen werden, dass andere Mechanismen zum
Resistenzgeschehen beitragen. Wie beispielsweise in der Literaturübersicht erwähnt,
könnten intrinsische oder erworbene Veränderungen der Zielstrukturen (Targets) der
Antiepileptika im Gehirn bei pharmakoresistenter Epilepsie eine Rolle spielen (REMY
und BECK, 2006). Einhergehend mit der Hypothese der Targetveränderung wurde
berichtet, dass Phenobarbital-Nonresponder, welche mit dem gleichen Modell wie
dem vorliegenden selektiert wurden, sich von Respondern hinsichtlich der
Pharmakologie der GABAA-Rezeptorbindung im Gyrus dentatus des Hippocampus
unterscheiden (VOLK et al., 2006; siehe auch Diskussion GABAA). Des weiteren
wiesen Phenobarbital-Nonresponder eine gravierende Neurodegeneration in der
hippocampalen Formation auf, was bei Respondern nicht der Fall war (VOLK et al.,
2006). Diese Befunde lassen darauf schließen, dass bei der Resistenz von Anfällen
gegenüber Antiepileptika im Rattenmodell für Temporallappenepilepsie die
Diskussion
115
veränderten Netzwerkeigenschaften aus einem Verlust von Neuronen im dentaten
Hilus und den assoziierten Modifikationen der GABAA-Rezeptoren resultieren. Unter
Berücksichtigung der vorhergehenden (VOLK und LÖSCHER, 2005) und der
aktuellen Daten zur Multidrug-Transporter-Hypothese, ist es wichtig zu bemerken,
dass die Hypothesen zur Targetveränderungen und zu den Transportern sich nicht
ausschließen, sondern gemeinsam im gleichen Gewebe vorkommen oder sogar
interagieren könnten. Das wird auch durch diese und vorherige Daten zu den
Phenobarbital-Nonrespondern demonstriert, bei denen eine gesteigerte P-gp
Expression, Zellverluste und Veränderungen von GABAA-Rezeptoren zusammen in
der hippocampalen Formation auftreten und gemeinsam agieren könnten, um die
Effizienz der Antiepileptika bei diesen Tieren zu reduzieren (VOLK und LÖSCHER,
2005; VOLK et al., 2006). Wie durch die aktuellen Daten gezeigt wird, welche
belegen, dass die Hemmung von P-gp die Phenobarbital-Resistenz bei den meisten
Nonrespondern umkehren kann, scheint die Überexpression von P-gp doch in
diesem Modell eine Hauptrolle bei der Pharmakoresistenz zu spielen. Da die
unterschiedlichen Antiepileptika verschiedenartige Wirkmechanismen aufweisen,
kann der Anteil des jeweiligen Resistenzmechanismus von der entsprechenden
Zielstruktur des Antiepileptikums abhängen und von Antiepileptikum zu
Antiepileptikum variieren. Eine Möglichkeit, zu testen, inwieweit Veränderungen von
GABAA-Rezeptoruntereinheiten oder Überexpression von P-gp eine Rolle spielen,
könnte der Einsatz von Tariquidar und Diazepam sein, wobei letzteres kein Substrat
von P-gp darstellt und durch Modulation des GABAA-Rezeptors wirkt.
Eine Studie, welche die vorliegenden Ergebnisse der Kombinationstherapie
unterstützt, wurde von VAN VLIET et al. (2006) für ein elektrisches Rattenmodell
beschrieben, bei welchem männlichen Sprague-Dawley Ratten eine Kombination von
Tariquidar und Phenytoin verabreicht wurde. Der SE wurde hierbei über eine
kontinuierliche Stimulation des Hippocampus induziert. Die EEG- und
Videoauswertung erfolgte lediglich für acht Std. täglich, da acht Stunden als das
therapeutische Fenster von Phenytoin angesehen wurden. Bei sechs Tieren wurde
Tariquidar in zwei verschiedenen Dosierungen (12 mg/kg und 24 mg/kg) für jeweils
sieben Tage, eine Stunde vor Phenytoin per os verabreicht. Phenytoin wurde in
Diskussion
116
Dosierungen von 50 mg/kg (Bolus: 75 mg/kg) einmal täglich unter
Isoflurananästhesie i.p. injiziert. Tariquidar erhöhte die antikonvulsive Wirkung von
Phenytoin. Der antikonvulsive Effekt von Phenytoin während der Kombination mit
Tariquidar war jedoch transient und konnte bei beiden Tariquidar-Dosierungen nur
während der ersten drei bis vier Behandlungstage beobachtet werden und nicht wie
bei der vorliegenden Studie über den gesamten Behandlungszeitraum (VAN VLIET
et al., 2006). Die beiden Studien lassen sich jedoch auch nur schwerlich vergleichen,
da die Ratten bei VAN VLIET et al. (2006) vor der Tariquidar-Behandlung nicht in
Phenytoin-Responder und Phenytoin-Nonresponder unterteilt wurden. Des weiteren
wurde Phenytoin bei der VAN VLIET-Studie (2006) nicht in maximal tolerierbaren
Dosen verabreicht, so dass hier kaum geschlussfolgert werden kann, dass
Pharmakoresistenz durch Inhibition von P-gp beigelegt werden kann.
Neben der P-gp Inhibition könnte eine alternative Erklärungsmöglichkeit für den
Effekt der Kombination mit Tariquidar darin bestehen, dass Tariquidar seinerseits
antikonvulsive Effekte ausübt und somit die Effizienz von Antiepileptika wie
Phenobarbital oder Phenytoin potenziert. Leider war im vorliegenden Versuch die
Verfügbarkeit des Tariquidars beschränkt, so dass nur eine relativ kleine Dosis
dieser Substanz (10 mg/kg zweimal täglich) alleine getestet werden konnte.
Tariquidar ohne Phenobarbital übte keinen signifikanten antikonvulsiven Effekt aus.
VAN VLIET et al. (2006) überprüften ebenfalls den Effekt einer längeren Behandlung
mit einer Dosis von 24 mg/kg Tariquidar ohne Phenytoin und beobachteten keine
Veränderung bezüglich der Anfallsfrequenz, der Anfallsdauer oder dem Verhalten im
Vergleich zur Predrug-Kontrollphase. Während der präklinischen Entwicklung von
Tariquidar wurden wesentlich höhere Dosierungen auf ihre antikonvulsiven Effekte in
Standard-Nagermodellen für Epilepsie geprüft und kein antikonvulsiver Effekt von
Tariquidar festgestellt (Dr. John F. Waterfall, Xenova Group; unveröffentlichte
Daten). Tariquidar wurde auch in vitro mit einer großen Anzahl von Rezeptorassays
untersucht und als negativ befunden, was die hohe Selektivität von Tariquidar für P-
gp unterstreicht (Dr. John F. Waterfall, Xenova Group; unveröffentlichte Daten). Es
scheint also sehr unwahrscheinlich, dass andere Mechanismen, als die P-gp
Inhibition dem Effekt der Kombination von Tariquidar mit Antiepileptika in
Diskussion
117
Epilepsiemodellen zugrunde liegen, wie in der Studie von VAN VLIET et al. (2006)
und der vorliegenden beobachtet.
Natürlich ist nicht auszuschließen, dass bei einer Inhibition von P-gp andere
Multidrug-Transporter die Rolle von P-gp übernehmen könnten. So konnten
beispielsweise VAN VLIET et al. (2005) einen erhöhten Proteinlevel für MRP1, MRP2
und BCRP in Astrozyten und Blutgefäßen des limbischen Systems einschließlich des
Hippocampus nach einem SE bei Ratten nachweisen. Problematisch gestaltet sich
jedoch, dass nicht für alle Multidrug-Transporter adäquate Inhibitoren zur Verfügung
stehen, um deren genaue Funktion zu analysieren. Zum Beispiel existieren keine
spezifischen Inhibitoren für BCRP (VAN VLIET et al., 2005). Da im vorliegenden
Versuch die spezifische Hemmung von P-gp jedoch sehr effizient wirkte, scheint eine
kompensatorische Hochregulation der anderen Multidrug-Transporter hier keine
Rolle zu spielen, könnte jedoch möglicherweise für den beobachteten Wirkverlust bei
VAN VLIET et al. (2006) verantwortlich sein. So verwendeten VAN VLIET et al.
(2006) Phenytoin als Antiepileptikum, welches nachgewiesermaßen von P-gp und
MRP2 transportiert wird (POTSCHKA et al., 2003). Umgekehrt konnte bestätigt
werden, dass Phenobarbital wohl kein Substrat von MRP`s darstellt, da die
gleichzeitige Gabe von Phenobarbital und dem MRP1/MRP2 Inhibitor Probenecid die
extrazelluläre Konzentration von Phenobarbital, im Gegensatz zu Phenytoin, nicht
erhöht (POTSCHKA et al., 2003). So könnte der transiente Effekt in der Studie von
VAN VLIET et al. (2005) evtl. damit erklärt werden, dass MRP2 nach einigen Tagen
als Antwort auf die P-gp Inhibition vermehrt exprimiert wurde und die Funktion von P-
gp übernommen hat, was letztendlich den Transport von Phenytoin blockiert haben
könnte. Im Gegensatz zu Phenobarbital (POTSCHKA et al., 2002) wirkt Phenytoin
nicht nur als P-gp Substrat, sondern auch als Inhibitor von P-gp (POTSCHKA et al.,
2001, 2002; POTSCHKA und LÖSCHER, 2001b; WEISS et al., 2003), was
Interpretationen erschweren könnte, wenn Phenytoin und Tariquidar gleichzeitig
verabreicht werden. Außerdem wurde erst kürzlich nachgewiesen, dass Phenytoin
auch von dem nicht-ABC-Transporter Ra1A Bindungsprotein 1 (RLIP76) in
Endothelzellen der humanen Blut-Hirnschranke transportiert wird, was zeigt, dass
dieser Transporter ebenfalls eine signifikante Funktion bei der Vermittlung von
Diskussion
118
Medikamentenresistenz bei Epilepsie haben könnte bzw. synergistisch mit P-gp
kooperiert (AWASTHI et al., 2005).
In einer Folgearbeit konnten VAN VLIET et al. (2007a) dann bei epileptischen Ratten
zeigen, dass die Phenytoin-Konzentration um 20-30 % in denjenigen Hirnregionen
reduziert war, in welchen P-gp überexprimiert wurde. Eine gleichzeitige Erhöhung
der P-gp Expression in der Leber führte akut nicht zu einer signifikanten Änderung
der Phenytoin-Clearance, jedoch wurden keine chronischen Veränderungen
untersucht. Die Überexpression von P-gp scheint mit der Anfallsaktivität
einherzugehen, da alle Hirnregionen, in denen eine Überexpression beobachtet
wurde, in die Anfallsgenerierung oder Anfallsausbreitung involviert sind (VAN VLIET
et al., 2007a). Passend dazu konnten auch KWAN et al. (2002) eine erhöhte
Expression von MDR-Genen nur in Regionen nachweisen, welche bei audiogener
Anfallsaktivität (Zwischenhirn und Kortex) in einem genetischen Rattenmodell (GEPR
= genetically epilepsy-prone rats) eine Rolle spielen.
MARCHI et al. (2006) zeigten, dass die P-gp Funktion bei
Methylazoxymethanolazetat (MAM) - behandelten Ratten mit Anfällen, einem Modell
für humane Gehirn-Malformationen, mittels Tariquidar selektiv blockiert werden
konnte.
Die vorliegende Arbeit beschreibt unseres Wissens nach zum ersten Mal einen
proof-of-principle für die Multidrug-Transporter-Hypothese bei der Resistenz
gegenüber Antiepileptika (BRANDT et al., 2006). SISODIYA (2003) postuliert, dass
die Arbeit an der Transporter-Hypothese rational erfolgen sollte. Ein Zugang besteht
in der Beachtung einer Reihe von Kriterien (adaptiert an die Postulate von Koch),
welche erfüllt werden müssen, um einen bestimmten Transportmechanismus als
relevant für Resistenz bei Epilepsie anzusehen (SISODIYA, 2003): 1) die
Mechanismen müssen im epileptogenen Hirngewebe nachweisbar sein; 2) die
Mechanismen müssen eine angemessene Funktionalität innehaben; 3) die
Mechanismen müssen bei der Pharmakoresistenz aktiv sein und 4) Überwindung der
Mechanismen sollte die Pharmakoresistenz beeinflussen.
Beachtliche experimentelle Arbeiten beschäftigen sich mit den ersten drei Kriterien
(SISODIYA, 2003; SCHMIDT und LÖSCHER, 2005; LÖSCHER und POTSCHKA
Diskussion
119
2005a und b). Das vierte Kriterium ist wohl das wichtigste, was den Grund für die
Durchführung der vorliegenden Experimente liefert. Die Daten weisen daraufhin,
dass die Kombination mit einem hochselektiven P-gp Inhibitor wie Tariquidar,
welches in Phase III-Studien bei Patienten mit chemotherapieresistentem Krebs
evaluiert wurde, eine neue Behandlungsoption darstellen könnte, um Resistenz
gegenüber Antiepileptika bei Epilepsie vorzubeugen oder beizulegen. Es wäre wohl
verfrüht, vorzuschlagen, dass die vielversprechenden Ergebnisse einen klinischen
Versuch mit Tariquidar bei Patienten mit refraktärer humaner Epilepsie rechtfertigen
würden, um den potenziellen therapeutischen Nutzen dieser neuartigen Strategie
auszutarieren, da nur zwei Antiepileptika (Phenytoin bei VAN VLIET et al., 2006) in
einem einzigen Rattenmodell für resistente Epilepsie getestet wurden. Da neben
Phenobarbital anscheinend auch zahlreiche andere Antiepileptika Substrate für P-gp
sind (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005 a und b), könnte sich das proof-of-principle-
Konzept der vorliegenden Arbeit auch auf andere Antiepileptika anwenden lassen,
die heutzutage bei der Behandlung von refraktärer humaner Epilepsie häufiger
genutzt werden. Ein Beispiel unter diesem Aspekt ist die Studie von MARCHI et al.
(2005), bei der bei Epilepsiepatienten, die sich einer Operation unterzogen, gezeigt
werden konnte, dass P-gp wohl auch für die Vermittlung der Pharmakoresistenz
gegenüber dem neuen Antiepileptikum Oxcarbazepin verantwortlich ist. MARCHI et
al. (2005) schlagen deshalb vor, dass die Hemmung der P-gp Funktion durch
selektive Blocker eine neue Strategie für die Aufhebung der Pharmakoresistenz
gegenüber Antiepileptika liefern könnte, und somit die Notwendigkeit einer
Resektionsoperation gemindert werden könnte.
Es existieren zwei Studien, welche den Erfolg einer Kombinationstherapie von
Antiepileptika und P-gp-Inhibitoren bei pharmakoresistenten Epilepsiepatienten
belegen. So beschreiben IANETTI et al. (2005) die Behandlung eines elfjährigen
Jungen mit refraktärem SE, welcher auf die üblichen Antiepileptika, die im
Algorhythmus der SE-Behandlung verabreicht wurden (Diazepam, Phenytoin,
Pentobarbital etc.), nicht ansprach. Am 37. Behandlungstag wurde der Kalzium-
Kanal-Blocker und P-gp Inhibitor Verapamil intravenös (0,034 mg/min) simultan mit
Valproat und Phenobarbital verabreicht. Anderthalb Stunden nach Infusionbeginn,
Diskussion
120
bei einer kumulativen Verapamildosis von 3,125 mg, erlangte der Patient das
Bewusstsein wieder, atmete spontan und der SE verschwand. In den sechs Monaten
nach dem SE wurden zwei fokale motorische Anfälle mit sekundärer Generalisierung
beobachtet. Die Verapamil-Behandlung wurde sechs Monate nach dem SE aufgrund
von möglichen synkopalen Episoden abgebrochen und die Anfälle erschienen erneut
mit einer täglichen bis wöchentlichen Frequenz und zeigten sich weiterhin resistent
gegen eine Vielzahl von Antiepileptika. Die Autoren erklären die dramatische Antwort
auf die intravenöse Gabe von Verapamil mit dessen direkter antikonvulsiver Wirkung
basierend auf der Beteilung von Kalzium-Kanälen am Epilepsiegeschehen und mit
der erleichterten Hirnpenetration von Valproat und Phenobarbital, da Verapamil den
Multidrug-Transporter P-gp im zerebrovaskulären Endothelium des epileptischen
Fokus inhibiert haben könnte. Auch im Tiermodell wurde gezeigt, dass die Inhibition
von P-gp durch Verapamil (5 mM) die Konzentration von Phenobarbital in der
Extrazellulärflüssigkeit des zerebralen Kortex signifikant erhöht (POTSCHKA et al.,
2002). Ähnliche Ergebnisse erhielten auch SUMMERS et al. (2004), welche
Verapamil zusammen mit Antiepileptika bei einer 24jährigen Frau mit refraktärer
Epilepsie verabreichten. Die allgemeine Anfallskontrolle besserte sich, die subjektive
Lebensqualität stieg und das durchschnittliche Intervall zwischen
Krankenhausaufenthalten verdoppelte sich.
POTSCHKA und LÖSCHER (2001b) beschreiben ein weiteres Tiermodell, bei
welchem weiblichen Wistar-Ratten via Mikrodialyse drei verschiedene P-gp-
Inhibitoren (Sodium Cyanid, Verapamil und PSC 833) in den rechten frontalen Kortex
appliziert wurden. Die Perfusion mit dem Inhibitor startete 15-60 Min. vor der
systemischen (i. p.) Gabe von 50 mg/kg Phenytoin. Es stellte sich heraus, dass alle
drei P-gp Inhibitoren (Sodium Cyanid > Verapamil > PSC 833) die Konzentration von
Phenytoin in der extrazellulären Flüssigkeit nach lokaler Administration signifikant
erhöhten, was dafür spricht, dass Phenytoin ein Substrat von P-gp darstellt, und dass
P-gp in der Blut-Hirnschranke die Penetration von Phenytoin ins Gehirnparenchym
normalerweise limitiert.
Antiepileptika sind anscheinend nur relativ schwache Substrate von Multidrug-
Transportern, da Substanzen, welche von P-gp effizient transportiert werden, kaum
Diskussion
121
Gehirngängigkeit zeigen (SCHINKEL, 1999). Da die Molekülgröße von Antiepileptika
unter 400 Da liegt, stellen sie keine idealen P-gp-Substrate dar. Es wird daher
angenommen, dass es erst zu einer funktionell relevanten Reduktion der AED-
Konzentration im Gehirnparenchym kommen kann, wenn die Multidrug-Transporter
im epileptischen Fokus überexprimiert sind (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a).
Tariquidar wurde fünf Jahre lang relativ erfolgreich in klinischen Studien getestet, um
zu ermitteln, ob durch die selektive P-gp Inhibition die Effizienz von zytotoxischen
Agenzien bei der Krebsbehandlung gesteigert werden kann. Im Jahr 2003 wurden
die Versuche mit Tariquidar in der dritten klinischen Phase III bei Patienten mit non-
small-cell Lungenkrebs (NSCLC) vorerst abgebrochen, da die toxischen Level der
Zytostatika bei Patienten, die Tariquidar in Kombination mit den Zytotoxika erhielten,
erhöht waren gegenüber denjenigen, die nur ein Placebo und Zytotoxika verabreicht
bekamen. Weitere Phase I und II Studien wurden jedoch von den National Cancer
Institutes (NCI) in den USA empfohlen (www.xenova.co.uk./dc_xr9576.html). Es
existieren kaum Daten über mögliche pharmakokokinetische Interaktionen mit
Tariquidar (MODOK et al., 2006). In der vorliegenden Kombinationsstudie wurden bei
Gabe von Tariquidar und dem Antiepileptikum Phenobarbital keine signifikant
erhöhten Nebenwirkungen festgestellt. Natürlich muss dabei beachtet werden, dass
diese Resultate nicht ohne weiteres auf Humanpatienten extrapoliert werden können.
Dennoch wäre es möglich, dass Tariquidar im Gegensatz zu der Studie mit den
Zytostatika die Nebenwirkungen von Antiepileptika beim Humanpatienten nicht
erhöht, da sich beide Arzneistoffklassen natürlich in ihrer Wirkweise unterscheiden.
Neben der beschriebenen Inhibition von P-gp existieren noch weitere Strategien,
Pharmakoresistenz zu umgehen, beispielsweise durch Vermeidung eines direkten
Kontaktes zwischen Antiepileptika und P-gp. Eine Möglichkeit besteht darin,
Antiepileptika in Immunoliposome zu verpacken, welche mit einem monoklonalen
Antikörper gekoppelt sind und an der Blut-Hirnschranke durch Endozytose
internalisiert werden, damit die P-gp Substrate effizient ins Gehirngewebe freigesetzt
werden können, ohne dass diese direkt mit P-gp oder anderen Transportern in der
Blut-Hirnschranke interagieren (HUWYLER et al., 2002). Eine ähnliche Strategie wird
Diskussion
122
mit dem Einsatz von Nanopartikeln, welche Antiepileptika enthalten, verfolgt
(FRICKER und MILLER, 2004).
Eine weitere Möglichkeit wäre der Einsatz von kurzer interferierender
doppelsträngiger RNA (siRNAs), welche sich sequenzspezifisch an die Ziel-mRNA
anlagert und zu dessen Degradation führt (IZQUIERDO, 2005). Diese Strategie der
„Gen-Stilllegung“ ist jedoch problematisch, da die siRNA nur eine kurze Lebensdauer
aufweist und außerdem ein ausreichender Ausschaltungsgrad erreicht werden muss
um einen therapeutischen Effekt zu erzielen (MODOK et al., 2006). SHAPIRO et al.
(1998) zeigen, dass eine Chemosensitizer-induzierte Freisetzung von
Medikamenten, die von P-gp in zytoplasmatischen Vesikeln gespeichert werden, bei
der Überwindung von Pharmakoresistenz eingesetzt werden könnte.
Versuche, existierende Arzneimittel chemisch dahingehend zu modifizieren, dass sie
nicht länger Substrate von Multidrug-Transportern darstellen, sind daran gescheitert,
dass zum einen die Struktur von Multidrug-Bindungsstellen noch nicht hinreichend
bekannt ist, zum anderen können Veränderungen eines Medikaments, die zu einer
verringerten Affinität gegenüber Transportern führen, dessen Fähigkeit, die
Zellmembran zu durchqueren und an das Ziel zu binden, drastisch vermindern
(HIGGINS, 2007).
Der Vollständigkeit halber soll erwähnt werden, dass neben genetischen mdr1a/b(-/-)
Knockout-Mäusen auch ein chemisches Knockout-Modell entwickelt wurde, in dem
bei Ratten, Mäusen und Meerschweinchen mittels Titration die optimale
Plasmakonzentration für den hochspezifischen P-gp Inhibitor Elacridar ermittelt
wurde (CUTLER et al., 2006).
6.3 GABAA-Rezeptoruntereinheiten Die Expression verschiedener GABAA-Rezeptoruntereinheiten wurde in diversen
Modellen untersucht und ergab teils kontroverse, teils konforme Resultate. Da es den
Rahmen dieser Arbeit sprengen würde, alle Ergebnisse einzeln aufzuführen, ist eine
Auswahl an Modellen in der untenstehenden Tabelle aufgeführt.
Diskussion
122
Tab. 9: Literaturübersicht zu Modifikationen von GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei
Epilepsiemodellen. Die grau markierten Untereinheiten kennzeichnen diejenigen
Untereinheiten, die auch in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Legende: DG
GC steht für die Körnerzellen im Gyrus dentatus (dentate gyrus granule cells).
Diskussion
123
Modell Region GABAA-Rezeptor-Untereinheiten Anmerkung Referenzen α1 α2 α3 α4 α5 α6 β1 β2 β3 δ ε γ1 γ2
Pilocarpin chronisch, Kindling DG GC ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↑ 0
vor spontan wiederkeh-
renden Anfällen
Schwartzkroin 1998, nach
Nusser, Brooks-Kayal, Review
Pilocarpin 1-4 Monate und nach SE DG GC ↓ 0 0e,↑l ↑ 0 0 ↓ ↑ ↑ ↑
Latenzphase (l) und
epileptische (e) Ratten; mRNA und
Patch-clamp Brooks-Kayal et
al., 1998
Pilocarpin CA1,
CA2,CA3 0 ↓ ↓ 0 0 mRNA Rice et al., 1996 1-2 Monate DG 0 0 (↑) 0 0 Pilocarpin CA1 0 ↓! Peptid und Houser und
2-3 Monate CA2 0 ↓!! mRNA Esclapez CA3 (↓) 2003 DG ↓ Hilus ↓
Pilocarpin CA1 ↓ Houser und
Esclapez 2-4 Monate CA2 ↓ 1996 Pilocarpin CA1 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Immunhisto- Fritschy et al., 6 Wochen CA3 0 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ chemie 1999
spontan wiederkehrende Hilus ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Anfälle DG (↑) ↑? ↑! ↑! ↓ ↓ ↑! Kainat CA1 ↓ ↓ ? ↓ ↓!! ↓ ↓ ↓ ? 0 ↓ mRNA Tsunashima et
CA3c 0 ↓ ? ↓ ↓! ↓ 0 ↓ ? ↓ ↓ Autoradio- al., 1997 7-30 Tage DG GC 0 0 ↑ 0 ↓! ↑ ↑ 0 ↓ 0 0 graphie
Diskussion
124
Modell Region α1 α2 α3 α4 α5 α6 β1 β2 β3 δ ε γ1 γ2 Anmerkung Referenzen Kainat CA3/CA4 ↓ Autoradio- Friedman et al.,
12+24 Std. DG 0 graphie 1994
24 Std.
langsam kindelnde
Ratten ↑ ↓ Hippocampus Kainat CA1 (↑) (↑) (↑) (↑) (↑) Immunzyto- Schwarzer et al.,
7-30 Tage CA3 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ chemie 1997 DG ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑
Kainat CA1 ↓ ↓ ↓ Immunhisto- Bouilleret et al.,
2000 4 Monate CA3 0 0 ↓ ↓ chemie
DG ↑ 0 ↑ ↑ ↑ Genetically inferiorer 0 0 ↓!! 3 audiogene Evans et al., 2006 epilepsy- Colliculus Anfälle prone rats Western blot (GEPRs)
laterale Amygdala CA3c ↓ 0 ↑ 0 In-situ- Laurèn et al., chronisch CA3a/b 0 0 ↑ 0 Hybridisierung 2003
12 Wochen CA1 0 ↓ ↑ 0 DG 0 0 ↑! 0 Hilus 0 0 ↑ 0
Humane Temporallappenepilepsie CA1 ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ Immunhisto- Loup et al., 2000
Hippocampal- CA2 ↓! ↑ ↓! 0 0 0 chemie sklerose CA3 ↓! ↑ ↓ ↓ ↓ ↓
Hilus ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ DG GC ↑ ↑! 0 ↑! ↑! ↑
Kindling
schnell-kindelnde
Ratten ↓ ↓ QPCR Gilby et al., 2005
Diskussion
125
Modell Region α1 α2 α3 α4 α5 α6 β1 β2 β3 δ ε γ1 γ2 Anmerkung Referenzen Kindling DG GC ? ↑ ↑ 0 ↑ ↑ ↑ ↓! (↑) mRNA Nishimura et al.,
CA1 ↓ ↑ ↓
24 Std.: CA3: alle Unterein-
heiten ↓ 2005
24 Std.+ 30 Tage CA3 ↓ Hippocampus
Kindling
schnell kindelnde
Ratten ↓! ↑ ↑ ↑ mRNA Poulter et al.,
langsam kindelnde
Ratten ↑! 0 0 0 Hippocampus 1999 Kindling DG ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ Immunzyto- Nusser et al.,
chemie 1998 SE DG GC 0 ↑ ↓ ↑ ↑ ↑ ↓! (↑) außer α1! Nishimura et al.,
Hippocampus CA1 ↓ ↑ ↓ ↓ 2005
24 Std + 30 Tage CA3 ↓ Review DG GC ↓ ↑ ↑ Coulter; 2000
Diskussion
126
Der GABAA-Rezeptor ist der dominierende liganden-gesteuerte Chlorid-Ionenkanal,
welcher die schnelle inhibitorische synaptische Transmission im
Zentralnervensystem vermittelt und deshalb einen geeigneten Kandidaten für die
Beteiligung an der Epileptogenese darstellt (BROWSER et al., 2002). Eine enorme
Diversität von GABAA-Rezeptoren wurde im Zentralnervensystem nachgewiesen. In
jedem Rezeptor werden mindestens drei verschiedene Untereinheiten exprimiert,
welche einer von insgesamt acht strukturell und genetisch verschiedenen Familien
angehören (COSTA, 1998; SPERK et al., 2004). Zwischen den einzelnen
Untereinheiten bestehen deutliche Unterschiede bezüglich der Bindungsprofile. So
korrespondiert beispielsweise die Untereinheit α1 mit Antikörpern für die
Benzodiazepinbindungsstelle I, die Untereinheiten α2 und α3 jedoch mit Antikörpern
für die Benzodiazepinbindungsstelle II (MCKERNAN et al., 1991; ZEZULA und
SIEGHART, 1991).
FRITSCHY und MÖHLER (1995) konnten zwölf verschieden Kombinationen von
Untereinheiten in definierten Neuronen nachweisen. Die vorherrschende
Kombination besteht dabei aus α1/β2,3/γ2, welche in zahlreichen Zelltypen im
gesamten Gehirn detektiert wurde und teilweise mit einer zusätzlichen Untereinheit
(α2, α3, δ) assoziiert ist (FRITSCHY und MÖHLER, 1995). Die häufigsten
Untereinheiten sind α1, β2 und γ2, welche in 60-90% der GABAA-Rezeptoren im
adulten Gehirn vorkommen (BENKE et al., 1991a, 1994; DUGGAN et al., 1992;
RUANO et al., 1994). Die Untereinheiten α2, α3, α5, β3 und δ kommen in moderaten
Anteilen von 15-30% vor (BENKE et al., 1991b, 1994; MCKERNAN et al., 1991;
ENDO und OLSEN, 1993; MARKSITZER et al., 1993; MERTENS et al., 1993). Die
verbleibenden Untereinheiten (α4, α6, β3, γ1, γ3) sind nur geringfügig vertreten und
repräsentieren weniger als 10 % der GABAA-Rezeptoren (QUIRK et al., 1994;
TOGEL et al., 1994). Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit darauf
verzichtet, die Untereinheiten α6, β3, γ1 und γ3 zu charakterisieren. Die Untereinheit
α4 kommt im Thalamus und Hippocampus verbreitet vor (WISDEN et al., 1992),
weshalb die hippocampale Expression dieser Untereinheit in der vorliegenden Arbeit
ebenfalls untersucht werden sollte.
Diskussion
127
Die hippocampale Formation stellt eine derjenigen Regionen dar, die im Gehirn am
deutlichsten gefärbt sind, und zeigt hierbei eine besonders starke Färbung für die
Untereinheiten α2, α5, β2/3 und γ2, eine moderate Färbung für α1 und nur eine
schwache Färbeintensität für α3 und δ (FRITSCHY und MÖHLER, 1995). Diese
Ergebnisse stimmen mit den vorliegenden Resultaten überein, obgleich die
Untereinheit α1 hier auch relativ intensiv gefärbt war.
Als wichtigstes Ergebnis der vorliegenden Arbeit lässt sich sagen, dass sich die
Phenobarbital-Nonresponder in 36 von insgesamt 50 Datensets signifikant von den
Respondern unterschieden, welche nur in 15 von 50 Sets Unterschiede zeigten
(p<0.0001), was die bemerkenswerte Differenz zwischen pharmakoresistenten und
pharmakosensitiven Tieren bezüglich der Expression von GABAA-
Rezeptoruntereinheiten zum Ausdruck bringt. Einer der deutlichsten Unterschiede
war die Expression der α1-Untereinheit, welche in allen untersuchten Regionen von
Nonrespondern runterreguliert war, sich bei den Respondern jedoch nicht von den
Kontrollen unterschied. Weitgehende Reduktionen wurden bei den
pharmakoresistenten Tieren auch für Untereinheiten α2 und γ2 gefunden. Im Gyrus
dentatus (Körnerzellschicht, Str. molekulare) wurden signifikante Unterschiede zu
Kontrollen nur bei den Nonrespondern beobachtet. Allgemein handelte es sich bei
allen Veränderungen der Expression von GABAA-Rezeptoruntereinheiten um
Reduktionen der Immunreaktivität. Es wurde keine erhöhte Immunreaktivität
festgestellt, bis auf einen tendenziellen Anstieg der Färbung für α4 in der
Pyramidenzellschicht der CA1 von Nonrespondern, welcher jedoch bei der
verwendeten Messmethode nicht signifikant war.
Meines Wissens nach ist dies die erste Studie, welche die Expression von GABAA-
Rezeptoruntereinheiten bei resistenten und nicht-resistenten Tieren in einem
elektrischen Rattenmodell für chronische Epilepsie untersucht hat. Ein ähnlicher
Versuch wurde von VOLK et al. (2006) durchgeführt, indem bei Phenobarbital-
Respondern und Phenobarbital-Nonrespondern desselben Post-SE-Modells mittels
Autoradiographie Diazepam-insensitive von Diazepam-sensitiven Bindungsstellen
unterschieden wurden. Dabei zeigte sich, dass die Diazepam-Insensitivität bei
Phenobarbital-Nonrespondern in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus
Diskussion
128
gegenüber Respondern und Kontrollen signifikant erhöht war. Die Diazepam-
Sensitivität nahm dagegen im Hilus der Phenobarbital-Nonresponder signifikant ab.
Die Hochregulation der Diazepam-Insensitivität ist wahrscheinlich dadurch bedingt,
dass die Rezeptoren die Untereinheiten α4 und δ enthalten (WHITING et al., 2000),
welche zu der Haupteinheit gehören, die tonische Inhibition im Gyrus dentatus
vermittelt (PENG et al., 2004; STELL und MODY, 2002; WEI et al., 2003) und
frequent, wenn nicht gar obligatorisch, zusammen exprimiert werden (SUR et al.,
1999). Ein Anstieg von Diazepam-insensitiven GABAA-Rezeptoren wurde bereits für
epileptische Ratten im Pilocarpin-Modell der Temporallappenepilepsie beschrieben
(BROOKS-KAYAL et al., 1998; COULTER, 2000). Die Diazepam-Insensitivität dieser
Rezeptoren, scheint auch mit einer erhöhten Zink-Sensitivität einherzugehen (BUHL
et al., 1996; BROOKS-KAYAL et al., 1998). Insensitivität gegenüber toxischen
Zinkkonzentrationen erfordert die Präsenz einer γ2-Untereinheit, da rekombinante
Rezeptoren ohne die γ2-Untereinheit hochsensitiv auf Zink reagieren (DRAGUHN et
al., 1990; SMART et al., 1991). Die Expression der δ-Untereinheit erhöht jedoch die
Sensitivität der Rezeptoren gegenüber der Blockade durch Zink (SAXENA und
MACDONALD, 1994). Die Untereinheiten γ2 und δ scheinen komplementär
exprimiert zu werden, und die Präsenz eines Rezeptors kann zum Ausschluss der
jeweils anderen Untereinheit führen (SHIVERS et al., 1989; QUIRK et al., 1995;
ARAUJO et al., 1998).
Diese Veränderungen könnten zur Pharmakoresistenz bei der
Temporallappenepilepsie beitragen. Es wäre daher anzunehmen, dass der starke
Anstieg an Diazepam-insensitiven GABAA-Rezeptoren, welcher in der
Körnerzellschicht des Gyrus dentatus von Phenobarbital-resistenten, jedoch nicht bei
Phenobarbital-sensitiven Tieren vorhanden war, in den fehlenden antikonvulsiven
Effekt von Phenobarbital bei den Nonrespondern involviert ist (VOLK et al., 2006). Es
wurde berichtet, dass Phenobarbital sich bei den Nonrespondern nicht nur als
uneffektiv erwies, die Anfälle zu unterdrücken, sondern die Anfälle bei der Mehrzahl
der Tiere sogar noch steigerte (BRANDT et al., 2004). Das deutet darauf hin, dass
die Pharmakologie dieses Antiepileptikums als Antwort auf die beobachteten
Veränderungen der GABAA-Rezeptoren stark modifiziert ist (VOLK et al., 2006). Da
Diskussion
129
es sich beim Phänomen der Pharmakoresistenz aller Wahrscheinlichkeit nach um
einen multifaktoriellen Prozess handelt, schließen sich die Multidrug-Transporter-
Hypothese und die Veränderung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten wie oben
beschrieben nicht gegenseitig aus und können gegebenenfalls gemeinsam
vorkommen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von P-gp,
Zellverlust und Modifikationen der GABAA-Rezeptoren gemeinsam in der
hippcoampalen Formation auftreten und zusammen die Effizienz von Antiepileptika
bei Nonrespondern senken (VOLK und LÖSCHER, 2005; VOLK et al., 2006). Es ist
bislang noch nicht bekannt, welche GABAA-Rezeptoruntereinheit den antikonvulsiven
Effekt von Phenobarbital vermittelt und ob der Gyrus dentatus dabei eine Rolle spielt
(VOLK et al., 2006). Die Tatsache, dass die Responder und Nonresponder sich
bezüglich der Schwere oder der Dauer des SE sowie in Typ oder Frequenz der
spontan wiederkehrenden Anfälle nicht signifikant unterscheiden, deutet darauf hin,
dass die genomische Variabilität darüber entscheidet, ob ein Tier hippocampale
Neurodegeneration und Veränderungen der GABAA-Rezeptorcharakteristik als
Antwort auf den SE zeigt oder nicht (VOLK et al., 2006). So konnte anhand von
Zuchtstudien mit Respondern und Nonrespondern gezeigt werden, dass die
Fähigkeit gekindelter Ratten, auf ein Antiepileptikum anzusprechen oder nicht,
genetisch determiniert ist, obwohl es keinem einfachen Vererbungsschema folgt
(LÖSCHER, 2002). Bei gekindelten Ratten weitet sich die Resistenz gegenüber
einem Standard-Antiepileptikum (Phenytoin) auf alle anderen Antiepileptika,
einschließlich Phenobarbital aus, was darauf hinweist, dass die genetischen
Faktoren, die dieser Pharmakoresistenz zugrunde liegen, eine Multidrug-Resistenz
vermitteln (LÖSCHER, 2002). Es ist daher anzunehmen, dass die Tatsache, dass
zwei Patienten mit einem identischen Epilepsietyp mit gleicher Anfallsfrequenz sich
in ihrer Ansprechbarkeit auf Antiepileptika unterscheiden, auf genetischen Faktoren
beruht (VOLK et al., 2006).
Alpha1 ist die primäre adulte Untereinheit des GABAA-Rezeptors und die
Expressionslevel für die Transkripte sowohl von α1 als auch von α4 scheinen die
pharmakologische Ansprechbarkeit gegenüber vielen aktuell verwendeten
Antiepileptika zu bestimmen (WISDEN et al., 1991). Die Transkripte von α1 und α4
Diskussion
130
werden bei Nagetieren und Humanpatienten mit Temporallappenepilepsie
nachgewiesenermaßen durch den Prozess der Epileptogenese verändert (BROOKS-
KAYAL et al., 1998). Die verminderten Expressionen von α1 und die erhöhten
Expressionen von α4 im Gyrus dentatus von adulten Ratten mit
Temporallappenepilepsie beginnen innerhalb von 24 Std. nach einem Pilocarpin-
induzierten SE und dauern für Monate an, wenn die Tiere epileptisch werden
(BROOKS-KAYAL et al., 1998, 1999)
GABAA-Rezeptoren, welche eine γ2-Untereinheit enthalten, bilden zusammen mit
bestimmten α-Untereinheiten die Benzodiazepin-Bindungsstelle (WHITING et al.,
2000). Alpha-Untereinheiten beeinflussen die Affinität des GABAA-Rezeptors zu
Benzodiazepin-Liganden dahingehend, dass Rezeptoren, welche die Untereinheiten
α1,2,3 und 5 enthalten, alle eine hohe Affinität für eine Reihe von Benzodiazpinen,
einschließlich Diazepam, Flunitrazepam und Clonazepam, aufweisen (PRITCHETT
et al., 1989; LUDDENS und WISDEN, 1991). Rezeptoren, welche die Untereinheit α4
enthalten, besitzen dagegen keine Affinität für Agonisten der
Benzodiazepinbindungsstelle (WISDEN et al., 1991). Diese Erkenntnisse werden
gestützt von einem Versuch, bei dem ein adenoassoziierter Virus Typ 2, welcher
dem Transfer eines α1-Transgens, gesteuert von einem α4-Promotor, diente, als
Vektor bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten eingeschleust wurde (RAOL et al.,
2006). Diese Tiere hatten zuvor mittels Pilocarpin einen SE entwickelt. Durch den
Gentransfer des α1-Gens in den Gyrus dentatus erhöhte sich die anfallsfreie Zeit
nach dem SE um das dreifache und die Anzahl der Epilepsie-entwickelnden Ratten
sank um 60 % (RAOL et al., 2006). Diese Studie liefert auch den ersten direkten
Hinweis darauf, dass Veränderungen von GABAA-Rezeptoruntereinheiten, welche
sich nach einem SE entwickeln, in den Prozess der Epileptogenese involviert sind
und nicht nur ein Epiphänomen darstellen. Der antikonvulsive Effekt der
erfolgreichen Expression von mRNA und Protein der α1-Untereinheit im Gyrus
dentatus war jedoch leider nur transient und nach zwei bis vier Wochen nicht mehr
nachzuweisen, da der Promotor des verwendeten Vektors entweder transkriptionell
herunterreguliert oder „stillgelegt wurde“ (RAOL et a., 2006).
Diskussion
131
Es konnte nicht bestimmt werden, ob die erhöhte Expression von α1 die Anfälle
schlichtweg unterdrückt, also einen antikonvulsiven Effekt ausübt, oder ob der
Entwicklung von Epilepsie vorgebeugt werden kann, d. h. ob ein antiepileptogener
Effekt vorliegt (RAOL et a., 2006).
GILBY et al. (2005) beschreiben ein Modell, bei dem mittels der Kreuzung von Long
Evans Hooded- und Wistar-Ratten anfallsempfindliche (schnell kindelnde) und
anfallsresistente (langsam kindelnde) Tiere herausgezüchtet wurden. Bei diesen
Tieren wurde durch Kainat ein SE ausgelöst, und 24 Std. nach dem SE wurden die
Ratten getötet, um die Expression von α1 und α4 mittels mRNA-Analyse im
Hippocampus und in der Amygdala zu verifizieren. Die langsam kindelnden Ratten
zeigten eine längere Latenzphase bis zum SE-Beginn und weniger generalisierte
Anfälle als die schnell-kindelnden Tiere. Es stellte sich heraus, dass sich die
Expression von α1 und α4 im Hippocampus und der Amygdala zwischen den
Stämmen nicht unterschied und die Expression von α4 24 Std. nach dem SE
gleichermaßen reduziert war. Jedoch war bei den schnell kindelnden Ratten eine
Kainat-induzierte Reduktion der α1-Untereinheit in beiden untersuchten Strukturen zu
beobachten, wohingegen langsam kindelnde Tiere eine signifikante Erhöhung der
α1-Untereinheit zeigten. Dieses Ergebnis steht jedoch in Kontrast zu der Studie von
BROOKS-KAYAL et al. (1998), bei welcher der SE durch Pilocarpin induziert wurde.
Hierbei wurde mittels Einzelzelluntersuchungen gezeigt, dass die mRNA von α4 24
Std. post-SE vermehrt und die α1-Untereinheit reduziert exprimiert wurde.
Unterschiede zwischen den Studien sind jedoch nicht verwunderlich, da zahlreiche
Differenzen bezüglich der verwendeten Methoden, einschließlich der
unterschiedlichen konvulsiven Agenzien, des Rattenstamms, der Examinierung des
gesamten Hippocampus versus einzelne Körnerzellen und den molekularen
Techniken bestehen.
Bei dem Versuch, die Ergebnisse in die vorliegende Arbeit zu integrieren, fällt auf,
dass die α4-Untereinheit hier zwar nicht hochreguliert wird wie bei vielen anderen
Studien, jedoch diejenige Untereinheit darstellt, die am wenigsten oder gar nicht in
ihrer Expression herabgesetzt ist. Bei zwei Nonrespondern war die
Pyramidenzellschicht gegenüber den Kontrollen, Shams und Respondern sogar
Diskussion
132
deutlich für α4 angefärbt. Leider war es bei der Auswertung aus technischen
Gründen nicht möglich, nur die Pyramidenzellschicht zu analysieren, daher könnte
eine eventuelle Hochregulation der Untereinheit α4 in der Pyramidenzellschicht
durch die simultane Messung der umgebenden Schichten (Str. oriens, Str. radiatum)
verschleiert worden sein.
Die Veränderungen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei Tieren mit
wiederkehrenden Anfällen sind komplex und beinhalten sowohl die Hoch- als auch
die Runterregulierung von verschiedenen Untereinheiten sowie regionale
Unterschiede bezüglich der Veränderungen der Untereinheiten zwischen Gyrus
dentatus und Hippocampus (KAMPHUIS et al., 1995; OLSEN et al., 1999; COULTER
und DELORENZO, 1999).
Eine Hochregulation von einigen GABAA-Rezeptor-Untereinheiten im Gyrus dentatus
wurde in verschiedenen Tiermodellen für Epilepsie beschrieben. Die Untereinheiten
mit den meisten beobachteten Hochregulationen des Proteins oder der mRNA sind:
α2, α3, α4, α5, β3 und γ2 (SCHWARZER et al., 1997; TSUNASHIMA et al., 1997;
NUSSER et a., 1998; BROOKS-KAYAL et al., 1998; FRITSCHY et al., 1999). Diese
erhöhte Expression der GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in den Epilepsiemodellen
wird im Allgemeinen als kompensatorisch angesehen (BROOKS-KAYAL et al., 1998;
FRITSCHY et al., 1999), obwohl bekannt ist, dass weitere simultane Effekte den
kompensatorischen Effekt einschränken können (BUHL et al., 1996; NUSSER et al.,
1998). Im vorliegenden Versuch wurden keine kompensatorischen Hochregulationen,
wie in anderen chronischen Modellen häufig beobachtet, detektiert.
Herunterregulationen von GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in Neuronen sind von
besonderem Interesse, da diese zu einer verringerten funktionellen Inhibition und
somit zur Anfallsaktivität beitragen können (Houser und Esclapez, 2003).
Die höchste Herunterregulierung von GABAA-Untereinheiten wurde in der CA1
Region des Hippocampus nachgewiesen, was auch bei der vorliegenden Studie
zutrifft, und vor allem die α2 und die α5 oder deren mRNA wurde vermindert
exprimiert (RICE et al., 1996; SCHWARZER et a., 1997; FRITSCHY et al., 1999). Im
vorliegenden Versuch war, bezogen auf den gesamten Hippocampus, auf der Seite
kontralateral zur Elektrode die α5-Untereinheit bei Respondern
Diskussion
133
(α5>γ2>α3>α1=α2=α4) und Nonrespondern (α5>γ2=α1=α2>α3>α4) am stärksten
herunterreguliert und auf der ipsilateralen Seite sowohl bei pharmakoresistenten
(α2>α1=α5=γ2>α3>α4) als auch bei pharmakosensitiven (α2>α1=α5=γ2>α3>α4)
Tieren die Untereinheit α2. Die deutliche Runterregulation von α5 passt zu einer
Studie von HOUSER und ESCLAPEZ (2003), welche beschreibt, dass bei chronisch
epileptischen, Pilocarpin-behandelten Ratten mit wiederholten Anfällen die α5-
Untereinheit in der CA1 substantiell vermindert und in der CA2 nahezu vollständig
eliminiert ist (HOUSER und ESCLAPEZ, 2003).
Da die α5-Untereinheit bei der vorliegenden Arbeit über alle Regionen gesehen am
signifikantesten herunterreguliert war, soll die Bedeutung dieser Untereinheit hier
genauer diskutiert werden. Eine Verminderung der Expression der α5-Untereinheit
wurde bereits für das Kainat- und das Pilocarpinmodell der Temporallappenepilepsie
für die chronische Phase beschrieben, jedoch wurde diese Runterregulation dem
Zellverlust in der CA1-Region zugeschrieben (SCHWARZER et al., 1997; FRITSCHY
et al., 1999). Da die α5-Untereinheit vornehmlich von Pyramidenzellen des
Hippocampus exprimiert wird (FRITSCHY und MOHLER, 1995) würde ein Verlust
dieser Neurone unweigerlich mit einer verminderten α5-Expression in dieser Region
verknüpft sein. Die α5-Untereinheit könnte jedoch auch in den Pyramidenzellen, die
noch im Hippocampus verbleiben, herunterreguliert werden (HOUSER und
ESCLAPEZ, 2003). Im Gegensatz zu einigen anderen GABAA-Rezeptor-
Untereinheiten kennzeichnet sich die α5-Untereinheit dadurch, dass sie bei adulten
Tieren auf die Region des Hippocampus beschränkt ist und hier besonders in den
dendritischen Regionen der CA1 und CA2 zu finden ist (KHRESTCHATISKY et al.,
1989; MALHERBE et al, 1990; WISDEN et al., 1992; FRITSCHY und MOHLER,
1995; SPERK et al., 1997; PIRKER et al., 2000). Alpha5 ist eine der am höchsten
exprimierten α-Untereinheiten im Hippocampus (SPERK et al., 1997).
Pharmakologisch ist α5 im Vergleich mit anderen Untereinheiten charakterisiert
durch eine starke Insensitivität gegenüber Zolpidem (PRITCHETT und SEEBURG,
1990; MCKERNAN et al., 1991; MERTENS et al., 1993), zeigt jedoch eine hohe
Affinität für Diazepam und Flunitrazepam (WHITING et al., 2000). Des Weiteren
scheint die α5-Untereinheit primär extrasynaptisch lokalisiert zu sein (FRITSCHY et
Diskussion
134
al., 1998; BRÜNIG et al., 2002; CRESTANI et al., 2002) und könnte bei der
tonischen Inhibition im Hippocampus involviert sein (MODY, 2001). Obwohl eine
Hochregulation von diversen GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in chronischen
Epilepsiemodellen beschrieben wurde, finden sich viele dieser Untereinheiten,
einschließlich α2, β2/3 und γ2 vorwiegend in den Synapsen der hippocampalen
Formation (SOMOGYI et al., 1996; BRÜNIG et al., 2002) und werden dort für eine
phasische Inhibierung verantwortlich gemacht (MODY, 2001; BRÜNIG et al., 2002).
Die δ-Untereinheit spielt wie α5 eine große Rolle bei der tonischen Inhibition im
Gyrus dentatus (MODY, 2001) und kommt hier hauptsächlich perisynaptisch in den
Dendriten der Körnerzellen vor, wo sie durch einen GABA-Überschuss aus dem
synaptischen Spalt aktiviert wird (WEI et al., 2002). Außerdem weisen Rezeptoren
mit einer δ-Untereinheit eine 50-fach höhere Affinität für GABA auf als Rezeptoren
mit der γ-Untereinheit (SAXENA und MACDONALD, 1996). Die Untereinheiten α5
und δ weisen also einige Gemeinsamkeiten auf, darunter eine extrasynaptische
Lokalisation und Beteiligung bei tonischer Inhibition. Außerdem unterliegen beide
Untereinheiten im Hippocampus und Gyrus dentatus bei manchen Modellen für
Temporallappenepilepsie einer Herunterregulation. OLSEN et al. (1997)
beschrieben, dass δ-knockout-Mäuse epileptische Anfälle exprimieren. Für weitere
Erkenntnisse diesbezüglich müsste die Rolle der tonischen GABAA-Rezeptor
vermittelten Inhibition bei chronischen Epilepsiestadien weitergehend untersucht
werden (HOUSER und ESCLAPEZ; 2003). Es bestehen jedoch auch Unterschiede
zwischen α5 und δ: Substitutionen der Untereinheiten γ mit der δ-Untereinheiten
produzieren Rezeptoren, welche eine hohe Affinität für den GABA-Agonisten
Muscimol, aber keine Benzodiazepinbindungsstellen aufweisen (SHIVERS et al.,
1989; SAXENA und MACDONALD, 1994, 1996). Demgegenüber erweisen sich
GABAA-Rezeptoren mit der α5-Untereinheit als sensitiv gegenüber klassischen
Benzodiazepinen (MERTENS et al., 1993).
Die im vorliegenden Versuch beobachtete, sehr schwache Färbung der Untereinheit
δ, welche eine Auswertung mittels optischer Dichtemessung ausschloss, passt zu
Ergebnissen von FRITSCHY und MÖHLER (1995), welche beschreiben, dass die δ-
Untereinheit im Hippocampus nahezu fehlt, ausgenommen einer blassen und
Diskussion
135
diffusen Färbung der Molekularschicht des Gyrus dentatus und isolierten
Interneuronen.
Da in der vorliegenden Arbeit der relative Vergleich der GABAA-Rezeptor-
Untereinheiten zwischen Respondern, Nonrespondern und Kontrollen im
Vordergrund stand, soll hier nicht weiter darauf eingegangen werden, in welcher
hippocampalen Subregion welche Untereinheiten mit welcher Intensität gefärbt
wurden. Für Details siehe Ergebnisse. Des weiteren wurde bei der Auswertung nicht
zwischen Subtypen wie Neuronen oder Astrozyten und einzelnen
Neuronenbereichen wie Axon, Soma oder Dendriten unterschieden, sondern die
Gesamtheit aller Zellen einer Region bei der optischen Dichtemessung erfasst. Es
konnte jedoch in vorgehenden Studien gezeigt werden, dass GABAA-Rezeptoren in
somatodendritischen Abschnitten (α1, α2, α3, α5) und initialen Axonsegmenten (α2,
α3) exprimiert werden (BRÜNIG et al., 2002). Weiterhin wurde die Expression von
Untereinheiten unter anderem in Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD – GABA-
synthetisierendes Protein) - positiven Interneuronen (α1), in Pyramidenzellen (α2, α5)
und hilären Zellen (α3) nachgewiesen (BRÜNIG et al., 2002).
FRITSCHY und MÖHLER (1995) beobachteten eine kontinuierliche und
hervortretende Färbung der Membranen, welche mit synaptischen und
extrasynaptischen Rezeptoren korrespondieren könnte. Extrasynaptische
Rezeptoren sind dabei diffus verteilt, während synaptische Rezeptoren als intensiv
gelabelte Punkte erscheinen (BRÜNIG et al., 2002).
Eine ebenfalls detektierte, intrazelluläre Färbung wird mit Rezeptorbiosynthese oder
Degradation oder schlicht einer verfügbaren Reserve, welche für schnelle
Veränderungen der Rezeptoranzahl, die in die Membran eingefügt wird, in
Verbindung gebracht (FRITSCHY und MÖHLER, 1995). Die Tatsache, dass GABAA-
Rezeptoren auch in Astrozyten exprimiert werden, konnte erstmals im visuellen
Kortex von Katzen nachgewiesen werden (ROSIER et al., 1993).
Bei der Auswertung der vorliegenden Ergebnisse muss berücksichtigt werden, dass
die verwendeten Phenobarbital-Nonresponder eine signifikante Neurodegeneration
in verschiedenen Regionen aufwiesen. So detektierte Christina Fuest bei den hier
untersuchten Phenobarbital-Nonrespondern einen signifikanten Neuronenverlust im
Diskussion
136
ipsi- und kontralateralen Hilus. Außerdem wurden von Frau Fuest anhand eines
Score-Systems bei den Phenobarbital-Nonrespondern auf beiden Seiten
geringgradige bis schwerwiegende Läsionen in der CA1, CA3a/c, Amygdala sowie im
piriformen und entorhinalen Kortex festgestellt. Die Phenobarbital-Responder zeigten
bis auf ein Tier keine Läsionen in den oben genannten Regionen. Bei den Sham- und
Kontrolltieren waren ebenfalls keine Läsionen zu sehen. Diese Befunde sprechen
dafür, dass die Anzahl der GABAA-Rezeptor-Untereinheiten bei Nonrespondern
alleine deshalb reduziert ist, weil aller Wahrscheinlichkeit nach GABAerge Neurone
absterben. In der CA1, der CA3 und dem Hilus waren die Modifikationen der GABAA-
Rezeptoren jedoch nicht nur durch einen Zellverlust bedingt, da Veränderungen der
Zusammensetzung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten auch bei dem Nonresponder
NIH13 detektiert wurden, welcher keine offensichtliche Neurodegeneration in der
hippocampalen Formation aufwies. LAURÉN et al. (2003) beschreiben passend dazu
in dem gleichen Post-SE-Modell wie dem hier verwendeten, dass der
Neuronenverlust zumindest teilweise die verminderte Expression der Untereinheiten
α2 und α4 erklären kann. Die von LAURÉN et al. (2003) gefundene simultane
Hochregulation der β3-Untereinheit in der CA1 und CA3, also Regionen mit einem
hohen Neuronenverlust, spricht jedoch dafür, dass die verminderte Expression von
GABAA-Rezeptoruntereinheiten in epileptischem Gewebe nicht nur einen Indikator
für Neuronenverlust darstellt, sondern reale Veränderungen der überlebenden
Neurone reflektiert. Die langfristige Hoch- beziehungsweise Runterregulation der
GABAA-Rezeptoren könnte eine kompensatorische Antwort auf die Anfallsaktivität in
den verbleibenden Zellen widerspiegeln (LAURÈN et al., 2003). So beschreiben
einige Gruppen eine kompensatorische Hochregulation der Untereinheiten β2/3 im
Gyrus dentatus bei unterschiedlichen Modellen (LOUP et al., 2000; NISHIMURA et
al., 2005; TSUNASHIMA et al., 1997). Leider funktionierte die Färbung für die β2/3-
Untereinheiten im vorliegenden Versuch nicht.
Ein Hinweis darauf, dass die verminderte Expression der Untereinheiten nicht nur
schlichtweg auf den Neuronenverlust zurückzuführen ist, könnte darin liegen, dass
die α4-Untereinheit im vorliegenden Versuch auch bei den Phenobarbital-
Nonrespondern kaum herunterreguliert wurde bzw. in der Pyramidenzellschicht bei
Diskussion
137
zwei Nonrespondern sogar hochexprimiert wurde. Weiterhin traten Veränderungen
von GABAA-Rezeptoruntereinheiten auch bei Phenobarbital-Respondern auf, welche
keine Neurodegeneration aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die verminderte
Expression einiger Untereinheiten im epileptischen Gewebe nicht lediglich ein
Hinweis für Neuronenverlust darstellt, sondern eine Runterregulation von
Untereinheiten in unbeschädigten Strukturen beschreibt. Die Unterschiede bei der
Modifikation von Untereinheiten zwischen Respondern und Nonrespondern sind
wahrscheinlich, zumindest teilweise, die Konsequenz einer Neurodegeneration im
Hippocampus, welche bei Nonrespondern gefunden wurde, bei den Respondern
jedoch nicht auftrat.
Die Veränderungen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei den hier verwendeten
resistenten Ratten zeigen ebenso wie Humanpatienten mit Hippocampalsklerose
(LOUP et al., 2000) eine verminderte Färbung für einige Untereinheiten, was den
Zellverlust in der CA1, CA3 und im Hilus reflektiert. Im Gyrus dentatus von Patienten
mit refraktärer Temporallappenepilepsie war eine erhöhte Färbung für die
Untereinheiten α2 und teilweise α1 und γ2 in der Körnerzellschicht und in der
Molekularschicht detektierbar, welche bei dem vorliegenden Rattenmodell nicht zu
beobachten war.
TSUNASHIMA et al. (1997) beschreiben, dass der mRNA-Level der α1-Untereinheit
in der CA3 sieben bis 30 Tage nach einem Kainat-induziertem SE sich gegenüber
der Kontrollgruppe nicht signifikant unterscheidet. Das könnte darauf hindeuten, dass
die überlebenden Pyramidalneurone eine kompensatorische Hochregulation der α1-
mRNA im chronischen Stadium der Kainat-induzierten Temporallappenepilepsie
zeigen. Im gleichen Modell wird beschrieben, dass ein extremer Verlust an α2- und
α4-mRNA in der CA1 das Ausmaß der Neurodegeneration in pyramidalen Neuronen
zu übersteigen scheint und eine Herunterregulierung auch in unbeschädigten Zellen
auftritt (TSUNASHIMA et al., 1997).
SCHWARTZKROIN (1998) beschreibt, dass bei chronisch epileptischen Tieren eine
veränderte Komposition der Untereinheiten beibehalten wird, und die Anzahl der
GABAA-Rezeptoren pro Synapse erhöht wird. Dabei ist sowohl die Dichte der
Rezeptoren erhöht als auch die Fläche der synaptischen Verbindung. Diese
Diskussion
138
Veränderung trägt wahrscheinlich zu einer gesteigerten Effizienz von GABA in den
Neuronen bei (BROOKS-KAYAL et al., 1998; NUSSER et al., 1998). Die
Abwesenheit einer solchen Hochregulation in der vorliegenden Studie weist
daraufhin, dass die GABA-Synapsen in den dentaten Körnerzellen in dem
verwendeten Rattenmodell nicht hyperaktiv sind, wie bei SCHWARTZKROIN (1998)
beschrieben. Mögliche neurophysiologische Studien bei Phenobarbital-Respondern
und –Nonrespondern könnten Aufschluß über diesen Aspekt liefern.
Die ausgeprägte Runterregulierung der Färbeintensität für GABAA-Rezeptor-
Untereinheiten in der CA1 und CA3 sowie im dentaten Hilus, sprich Regionen, in
denen der Neuronenverlust am gravierendsten ist, stimmt mit den Ergebnissen
anderer Studien überein (OLSEN et al., 1992; WOLF et al., 1994; KOEPP et al.,
1996; HAND et al., 1997; LOUP et al., 2000). NISHIMURA et al. (2005) postulieren,
dass, bedingt durch die variablen Neurodegenerationsgrade im Ammonshorn, bei
verschiedenen Tiermodellen die Resultate wesentlich schwerer zu interpretieren sind
als in den Körnerzellen des Gyrus dentatus, welche in experimentellen Tiermodellen
relativ gut erhalten bleiben. Die GABAerge Innervierung der Körnerzellen des Gyrus
dentatus spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung des Informationsflusses
zwischen dem entorhinalen Kortex und dem Hippocampus (BROOKS-KAYAL et al.,
2001), weshalb dieser Region ohnehin eine Schlüsselrolle beim Epilepsiegeschehen
zukommt.
Wenn man darauf basierend im vorliegenden Versuch lediglich den Bereich des
Gyrus dentatus betrachtet, ergibt sich folgendes Bild: Bei den Respondern ist weder
auf der ipsi- noch auf der kontralateralen Seite eine Herunterregulierung der GABAA-
Rezeptor-Untereinheiten zu erkennen. Bei den Nonrespondern sind auf der
ipsilateralen Seite Verluste der α1 und α2-Untereinheiten zu erkennen und auf der
kontralateralen Seite sind die Untereinheiten α1, α2, α5 und γ2 signifikant vermindert.
Die Untereinheiten α3 und α4 ändern sich nicht. Dieser Befund entspricht der oben
beschriebenen Theorie, nach der die Benzodiazepin-sensitive α1-Untereinheit beim
epileptischen Geschehen herunterreguliert und die Benzodiazepin-insensitive
Untereinheit α4 hochreguliert wird (beziehungsweise im vorliegenden Fall gleich
bleibt). Die Untereinheit α3 wird in erster Linie im zerebralen Kortex und im
Diskussion
139
Riechzentrum exprimiert (PERSOHN et al., 1992) und scheint im Hippocampus und
beim Epilepsiegeschehen keine große Rolle zu spielen.
Es gilt zu bedenken, dass im aktuellen Versuch das Barbiturat Phenobarbital als
selektierendes Antiepileptikum verwendet wurde und kein Benzodiazepin. Es wurde
zwar nicht gezeigt, ob die Tiere sich auch als resistent gegenüber Benzodiazepinen
zeigen, jedoch gibt es zwischen pharmakosensitiven und pharmakoresistenten
Tieren signifikante Unterschiede bezüglich der Runterregulation von GABAA-
Rezeptoruntereinheiten, welche auch bei der Resistenz gegenüber dem Barbiturat
Phenobarbital eine Rolle zu spielen könnten. Da jedoch die Pharmakoresistenz der
hier verwendeten Phenobarbital-Nonresponder durch die oben beschriebene
Kombinationstherapie behoben werden konnte, scheint dieser Mechanismus bei der
Phenobarbital-Resistenz eine größere Rolle zu spielen als die Runterregulierung von
GABAA-Rezeptoruntereinheiten. Es wäre daher interessant gewesen, die Expression
der Untereinheiten β2/3 zu untersuchen, da gerade die beta-Untereinheiten eine
Schlüsselrolle bei der Wirkung von Barbituraten zu haben scheinen (DRAFTS und
FISHER, 2006). So beschreiben einige Gruppen Hochregulationen der Untereinheit
β3 im Kainat- und elektrischen Modell (SCHWARZER et al., 1997; LAURÉN et al.,
2003), wohingegen beim Pilocarpinmodell eine Runterregulierung der Untereinheiten
β2/3 zu beobachten war (FRITSCHY et al., 1999; siehe auch Tab. 9). Hier besteht
noch weiterer Klärungsbedarf. Da die signifikante Runterregulierung, gerade der
Benzodiazepin-sensitiven Untereinheit α1 bei den hier verwendeten Nonrespondern,
jedoch bei der Resistenz gegenüber Benzodiazpinen eine wichtige Rolle spielen
könnte, wäre es interessant, in dem gleichen Modell in einer Folgestudie ein
Benzodiazepin statt Phenobarbital einzusetzen und bei gleichzeitiger P-gp Inhibition
zu verifizieren, welcher Mechanismus einen größeren Einfluss bei der
Pharmakoresistenz innehat.
Die Tatsache, dass bei den Respondern im aktuellen Versuch keine
Runterregulierung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten im Gyrus dentatus vorliegt,
spricht dafür, dass bei diesen Tieren im Gegensatz zu den Nonrespondern eine
kompensatorische Hochregulation bzw. ein Erhalt der vorhandenen GABAA-
Rezeptor-Untereinheiten als Antwort auf die Anfallsaktivität stattgefunden hat.
Diskussion
140
Möglicherweise sind die Mechanismen, welche die kompensatorische
Hochregulation bzw. den Erhalt von GABAA-Rezeptoren steuern, bei den
Nonrespondern nicht in ausreichendem Maße vorhanden oder in ihrer Funktionalität
gestört.
So beschreiben auch FRITSCHY et al. (1999), dass der Verlust einer kritischen
Anzahl von Interneuronen im Gyrus dentatus eine mögliche Ursache für die
Anfallsinitiation darstellen könnte, wohingegen die langfristige Hochregulation der
GABAA-Rezeptoren in den Körnerzellen eine kompensatorische Antwort auf die
Anfallsaktivität bedeuten könnte.
Die möglichen Implikationen der veränderten GABAA-Rezeptorzusammensetzung für
die Pathophysiologie der Temporallappenepilepsie basiert auf der im folgenden
beschriebenen „dormant basket cell„-Hypothese von SLOVITER et al. (1991): der
Verlust der hilären Interneurone und Korbzellen führt zu einer verminderten Inhibition
im Gyrus dentatus, was durch den Verlust von hilären Mooszellen noch verstärkt
wird. Diese Modifikationen scheinen ausreichend, um spontan wiederkehrende
Anfälle zu generieren. Das Auswachsen von Moosfasern zu einem späteren
Zeitpunkt erzeugt eine Schleife wiederkehrender Erregung, welche die anhaltende
Anfallsaktivität angesichts der graduellen Degeneration von Pyramidenzellen noch
fördert. Die insgesamt gesteigerte Aktivität resultiert in einer kompensatorischen
Hochregulation von GABAA-Rezeptoren in den Körnerzellen des Gyrus dentatus.
Damit verbunden ist eine veränderte Zusammensetzung der GABAA-Untereinheiten.
Trotz dieses kompensatorischen Mechanismus könnte das Auftreten von Rezeptor-
untereinheiten die empfindlich auf Zink reagieren, welches von aberranten
Moosfasern, die in die Körnerzellschicht aussproßen, freigesetzt wird, den
epileptischen Zustand weiter konsolidieren (FRITSCHY et al., 1999). Eine erhöhte
Zink-Sensitivität von GABAA-Rezeptoren konnte in Körnerzellen von epileptischem
Gewebe nachgewiesen werden (BUHL et al., 1996; BROOKS-KAYAL et al., 1998).
GABAA-Rezeptoren, welche die Untereinheit α1 enthalten (sowie γ2), neigen dazu,
eine geringe Zink-Sensitivität zu zeigen (COULTER, 2000). Im umgekehrten Fall
resultieren geringe Expressionen von α1 und γ2 enthaltenden GABAA-Rezeptoren in
einer hohen Zink-Sensitivität (WHITE und GURLEY, 1995; BURGARD et al., 1996;
Diskussion
141
FISHER und MACDONALD, 1998), wie in Körnerzellen des Gyrus dentatus von
epileptischem Gewebe beobachtet wurde. Da diese beiden Untereinheiten auch im
vorliegenden Versuch bei den Phenobarbital-Nonrespondern im Gyrus dentatus
signifikant runterreguliert waren, ist anzunehmen, dass die Zinksensitivität auch bei
den hier verwendeten Tieren gesteigert war.
Beim Seitenvergleich (siehe Tabelle 8) fällt auf, dass keine deutlichen Unterschiede
zwischen der ipsi- und der kontralateralen Seite bestehen. Jedoch ist die
Herunterregulation der GABAA-Rezeptoruntereinheiten auf der kontralateralen Seite
insgesamt deutlich ausgeprägter als auf der ipsilateralen Seite. Möglicherweise
greifen auf der ipsilateralen Seite, bedingt durch den Insult der
Elektrodenimplantation und die Lokalisation des epileptischen Fokus in der
ipsilateralen basolateralen Amygdala, bereits früher und/oder verstärkt
kompensatorische Mechanismen wie Hochregulationen von bestimmten GABAA-
Rezeptor-Untereinheiten. Diese Annahme ist jedoch spekulativ und müsste genauer
untersucht werden.
LOUP et al. (2000) weisen darauf hin, dass bei der Extrapolation der Befunde von
Tiermodellen auf den Menschen Vorsicht geboten ist, da hinsichtlich der GABAA-
Rezeptor-Untereinheiten folgende Unterschiede nachgewiesen wurden und
möglicherweise noch andere bestehen können: 1) Die α3-Untereinheit ist im
Hippocampus von Nagetieren kaum nachweisbar, wird beim Menschen jedoch in der
CA1 und mit variablen Graden auch in den Körnerzellen des Gyrus dentatus
exprimiert. 2) Beim Menschen ist in den Pyramidenzellen der CA3 die α1-
Untereinheit nur gering oder gar nicht detektierbar, kommt jedoch bei Nagetieren in
moderatem Maße vor. 3) Die hilären Mooszellen exprimieren beim Menschen in
hohem Maße α1 und α2-Untereinheiten, beim Nager jedoch nicht (LOUP et al., 2000)
4) Die basalen Dendriten der dentaten Körnerzellen sind beim Menschen intensiv
gefärbt, wohingegen normale Körnerzellen von Ratten gar keine basalen Dendriten
aufweisen (SERESS und MRZLJAK, 1987; LIM et al., 1997).
Die Expression der GABAA-Rezeptor-Untereinheiten scheint chronologischen
Schwankungen zu unterliegen und sich im Lauf der Epileptogenese zu verändern. So
beschreiben beispielsweise KOKAIA et al. (1994) biphasische Veränderungen der
Diskussion
142
mRNA-Level von GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in den Körnerzellen des Gyrus
dentatus nach 1, 10 und 40 Kindling-induzierten Anfällen. Die schnellen und
transienten, biphasischen Modifikationen der Untereinheiten nach wiederholten
Anfällen könnten eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Erregbarkeit von
Körnerzellen spielen und dadurch die Anfallsempfindlichkeit senken (KOKAIA et al.,
1994). Übereinstimmend berichten auch SCHWARZER et al., (1997) nach einem
Kainat-induzierten SE innerhalb von 12-24 Std. nach dem SE Runterregulationen
von α2 und δ sowie leichte Anstiege der Expression von α1, β2 und β3 im Gyrus
dentatus. Diese Veränderungen wurden sieben bis 30 Tage nach dem Kainat-SE
gefolgt von einer deutlich erhöhten Expression an α1, α2, α4, α5, β1, β3, γ2 und δ in
der gleichen Region (SCHWARZER et al., 1997).
Da im vorliegenden Versuch die Untereinheiten lediglich zu einem einzigen Zeitpunkt
detektiert wurden, können hier keine Vergleiche gezogen werden. Es ist jedoch
vorstellbar, dass die Zusammensetzung der GABAA-Rezeptoren zu einem früheren
Zeitpunkt ganz anders gestaltet war. Die akuten Veränderungen scheinen dabei
ganz anderer Natur zu sein als die chronischen. So beschreiben NAYLOR et al.
(2005), dass es innerhalb einer Stunde nach einem SE zu einem funktionellen
Verlust von postsynaptischen GABAA-Rezeptoren und einer markanten
Internalisierung von GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in der Körnerzellschicht des
Gyrus dentatus kommt, verbunden mit einem deutlichen Verlust von GABAerger
synaptischer Inhibierung. Es wird angenommen, dass die Synapsen von mindestens
zwei Untereinheiten (β2/3, γ2) während des SE in das Zellinnere transloziert werden,
einschließlich einer Untereinheit, welche Benzodiazepinsensitivität vermittelt
(mutmaßlich γ2), und damit zur Resistenz gegenüber Benzodiazepinen beiträgt
(NAYLOR et al., 2005). Die Internalisierung erfolgt dabei entweder über Endozytose
oder ein vermindertes Recycling zur Oberfläche hin. Es konnte gezeigt werden, dass
bereits ein kleiner Anstieg der extrazellulären GABA-Konzentration (um 5-10 μM)
während des SE ausreicht, um eine Erhöhung der extrasynaptischen tonischen
Inhibition (wahrscheinlich vermittelt durch die δ-Untereinheit) herbeizuführen. Eine
erhöhte GABA-Konzentration an Synapsen kann dann eine Desensitivierung und
Diskussion
143
Internalisierung von postsynaptischen GABAA-Rezeptoren zur Folge haben
(NAYLOR et al., 2005).
BROOKS-KAYAL et al. (1998) sowie COHEN et al. (2002) fanden eine Veränderung
der GABAA-Rezeptoren nach SE lange vor Beginn der spontanen Anfälle und
postulieren daher, dass die modifizierte Rezeptorzusammensetzung einen
fundamentalen epileptogenen Mechanismus darstellt. Es wurde gezeigt, dass bereits
während eines Pilocarpin-induzierten SE ein substantieller Verlust der
antikonvulsiven Wirkung von Antiepileptika, welche die GABAA-vermittelte Inhibition
verstärken, wie Benzodiazepine und Phenobarbital, besteht, was für eine rasche
Veränderung der funktionellen Eigenschaften von GABAA-Rezeptoren in den
Körnerzellen des Gyrus dentatus spricht (JONES et al., 2002).
Anfälle können die Funktion von GABAA-Rezeptoren auch durch Mechanismen wie
postranslationale Modifikationen, z. B. Phosphorylierung oder die Ausschüttung
endogener Benzodiazepin-ähnlicher Substanzen modifizieren (LIN et al., 1994;
MACDONALD und OLSEN, 1994; MACDONALD, 1995).
Es ist bekannt, dass GABA im sich entwickelnden Gehirn mittels einer veränderten
Chlorid-Homeostase durchaus als exzitatorischer Neurotransmitter wirken kann, und
es wird vermutet, dass depolarisierende GABA-Antworten auch eine Eigenschaft
einiger Neurone im epileptischen Gehirn darstellen (COHEN et al., 2002; WOZNY et
al., 2003). Da während der frühen postnatalen Entwicklung nur geringe Mengen an
vesikulärem Zink im Gyrus dentatus vorhanden sind, führt die beobachtete
Zinksensitivität von GABAA-Rezeptoren in postnatalen Körnerzellen jedoch nicht zu
einer pathologischen Hyperexzitabilität, wie sie bei adulten Tieren mit
Temporallappenepilepsie beobachtet wird (BROOKS-KAYAL et al., 1998). Dieser
interessante Aspekt wurde in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht, könnte aber
möglicherweise auch eine Rolle beim Pharmakoresistenzgeschehen spielen.
Ein Nachteil bei der hier verwendeten Auswertung könnte darin liegen, dass bei der
optischen Dichtemessung keine Schwelle festgelegt wurde. Eine Schwelle konnte bei
dem verwendeten Programm nicht definiert werden, da es sich bei der Färbung der
GABAA-Rezeptoruntereinheiten um eine kontinuierliche Färbung handelt, im
Gegensatz beispielsweise zur P-gp Färbung, bei welcher sich die markierten Gefäße
Diskussion
144
deutlich vom hellen Hintergrund abzeichnen und Schwellen relativ einfach festgelegt
werden können. Dadurch, dass im vorliegenden Versuch keine Schwelle definiert
wurde, ist mutmaßlich bei der optischen Dichtemessung auch viel Hintergrundsignal
detektiert worden. Der Gesamtaussage des Gruppenvergleichs sollte dadurch jedoch
nicht beeinflusst worden sein, da für alle Tiere der gleiche Messbereich erfasst
wurde.
Schlussfolgerungen und Ausblick
145
7 Schlussfolgerungen und Ausblick
Das hier verwendete Tiermodell liefert einen proof-of-principle dafür, dass die
Überexpression von P-gp im epileptischen Fokus durch hochselektive Inhibitoren
gehemmt werden kann, was in der Folge zu höheren Konzentrationen von
Antiepileptika im Gehirn führt und zu einer Überwindung der Pharmakoresistenz
beiträgt. Ein möglicher nächster Schritt wäre der Einsatz weiterer Antiepileptika,
welche wie Phenytoin und Phenobarbital P-gp Substrate darstellen (z. B. Lamotrigin,
Carbamazepin), in Kombination mit Tariquidar oder einem anderen hochselektiven
P-gp-Inhibitor, um die Hypothese zu untermauern und ihre Gültigkeit für andere
Antiepileptika zu zeigen. Die zeitaufwendige EEG- und Videoanalyse könnte dabei
eventuell durch den Einsatz von Telemetrie optimiert werden. Nach weiterer
Konsolidierung der Multidrug-Transporter-Hypothese könnten dann möglicherweise
klinische Untersuchungen bei epileptischen, pharmakoresistenten Humanpatienten
iniitiert werden. Eine Relevanz für die Veterinärmedizin, hier vor allem für die
Epilepsietherapie bei Hund und Katze, scheint dabei auch gegeben.
Das von mir verwendete Tiermodell ist aller Wahrscheinlichkeit nach ebenfalls
geeignet für die Untersuchung weiterer Mechanismen, die an Pharmakoresistenz
beteiligt sein könnten.
Außer der hier durchgeführten Behandlung mit Phenytoin und Phenobarbital könnten
weitere Antiepileptika getestet werden. Auch könnten neue Antiepileptika mit
unterschiedlichen Wirkmechanismen bei den Nonrespondern getestet werden. Viele
Antiepileptika weisen eine Halbwertszeit auf, die zu kurz ist, um ausreichende
Plasmakonzentrationen mit zweimal täglicher Applikation aufrecht zu erhalten. Hier
könnten möglicherweise osmotische Minipumpen mit definierter Freisetzungsrate
Verwendung finden.
Weiterhin konnten bei Phenobarbital-resistenten Tieren deutliche Runterregulationen
einiger GABAA-Rezeptoruntereinheiten im Gyrus dentatus nachgewiesen werden,
welche bei Phenobarbital-sensitiven Tieren nicht präsent waren. Da die Resistenz
der Phenobarbital-resistenten Ratten durch Inhibition von P-gp fast vollständig
aufgehoben werden konnte, scheint die Überexpression von P-gp im vorliegenden
Modell für die Wirkung von Phenobarbital wichtiger zu sein, als die veränderte
Schlussfolgerungen und Ausblick
146
Expression von GABAA-Rezeptoruntereinheiten. Möglicherweise kommt der
veränderten Zusammensetzung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei
Pharmakoresistenz gegenüber Benzodiazepinen jedoch eine wichtigere Rolle zu, als
die Hochregulation von Multidrug-Transportern.
In einem folgenden Versuch könnten daher Benzodiazpine zum Einsatz kommen, da
die Herunterregulierung der Untereinheit α1, welche auch in vorliegender Arbeit bei
Phenobarbital-Nonrespondern beobachtet werden konnte, mit einer erhöhten
Benzodiazepin-Insensitivität einhergeht, wie aus anderen Studien bekannt ist.
Da die Immunzytochemie allenfalls ein semiquantitatives Bild liefern kann, sollten
deshalb in möglichen Folgeversuchen gleichzeitig Modifikationen der mRNA-
Expression untersucht werden.
Eine Möglichkeit zur Überwindung der GABA-Rezeptor-vermittelten Resistenz könnte
in dem vektorbasierten Gentransfer von Benzodiazepin-Sensitivität-vermittelnden
Untereinheiten wie α1 bestehen, welcher in einer anderen Studie erfolgreich
durchgeführt wurde (RAOL et al., 2006).
Eine weitere Möglichkeit zur Verbesserung der Auswertung könnte darin bestehen,
die einzelnen Schichten (z. B. die Pyramidenzellschicht, Körnerzellschicht) gesondert
zu umfahren und einzeln auszuwerten, was mit dem vorliegenden Programm nicht
möglich war. Anhand der Analyse einzelner Bereich anstelle von Feldern, welche
mehrere Schichten (z. B. Körnerzellschicht und Molekularschicht gemeinsam)
umfassen, könnten detailliertere Aussagen über die Modifikationen in bestimmten
Subregionen getroffen werden. Nichtsdestotrotz sollten im vorliegenden Versuch
tendenzielle Gruppenunterschiede im Vordergrund stehen, welche in einem zweiten
Schritt in weitergehenden Studien noch genauer untersucht werden könnten.
Die Vielzahl der Veränderungen in pharmakoresistenten Ratten gestaltet es
prinzipiell schwierig, die funktionelle Signifikanz jeder dieser Modifikationen zu
determinieren. Dennoch könnte die Betrachtung der individuellen Unterschiede den
Schlüssel zu der zellulären Basis von refraktärer Epilepsie liefern und zu neuen
Therapieansätzen führen.
Zusammenfassung
147
Zusammenfassung
Kerstin Bethmann Ein enormes Gesundheitsproblem bei der Therapie vieler Krankheiten, darunter auch
Epilepsie, stellt die Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Medikamenten dar.
Besonders gravierend gestaltet sich die Situation bei der häufigsten Epilepsieform,
der Temporallappenepilepsie, da sich hier bis zu 80 % der Patienten refraktär
gegenüber Antiepileptika zeigen. Es ist daher vorteilhaft, dass für die vorliegende
Studie ein elektrisches Post-Status epilepticus-Modell an Ratten zur Verfügung
stand, welches die Entwicklung von spontan wiederkehrenden Anfällen nach einem
initialen Insult ermöglicht und damit die Situation beim Menschen widerspiegelt, wo
eine Temporallappenepilepsie beispielsweise nach einem Schädel-Hirn-Trauma
auftreten kann.
Nur zirka 10 % der Patienten, die auf eine Therapie mit einem ersten Antiepileptikum
nicht ansprechen, antworten auf die Gabe eines zweiten antikonvulsiven
Medikaments, auch wenn beide Substanzen sich in ihrer Wirkweise komplett
unterscheiden. Ein Patient wird dann als pharmakoresistent eingestuft, wenn die
Anfälle nach Gabe von zwei oder mehr Antiepileptika nicht um mindestens 50 %
gesenkt werden können. Die vorliegende Studie ist meines Wissens nach die erste,
welche im Tiermodell dieser klinischen Definition von Pharmakoresistenz gerecht
wird, da durch die subsequente Gabe der Antiepileptika Phenobarbital und Phenytoin
pharmakosensitive von pharmakoresisteten Tieren selektiert werden konnten. Das
Modell wird daher als adäquat für Pharmakoresistenzstudien angesehen und für die
weitere Untersuchung der kausalen Mechanismen der Resistenz und möglicher
Behandlungsstragien empfohlen.
Die zugrunde liegenden Ursachen der Pharmakoresistenz sind multifaktoriell. Eine
favorisierte Hypothese ist die Überexpression von Multidrug-Transportern, wie dem
P-glykoprotein (P-gp), in der Blut-Hirnschranke, welche nachgewiesenermaßen den
Zutritt vieler gängiger Antiepileptika ins Gehirn, und somit zum epileptischen Fokus,
limitieren. Dieser Theorie zufolge sollte durch die Hemmung der Transporter die
Zusammenfassung
148
Konzentration von Antiepileptika im epileptischen Gewebe erhöht werden können.
Diese Hypothese konnte durch die Gabe des selektiven P-gp-Inhibitors Tariquidar in
verschiedenen Dosierungen kurz vor der Applikation des Antiepileptikums
Phenobarbital bestätigt werden, da die Phenobarbital-Resistenz der Ratten dadurch
behoben werden konnte. Die vorliegende Arbeit liefert somit einen wichtigen Beleg
dafür, dass wie auch von Krebspatienten bekannt, die Hochregulierung von
Multidrug-Transportern in der Blut-Hirnschranke eine Hauptrolle beim
Resistenzgeschehen spielt, und dass durch die Hemmung dieser Mechanismen die
Konzentration der Medikamente im Gehirn steigt, und diese somit effizienter wirken
können.
Eine weiterer häufiger Befund beim Epilepsiegeschehen ist die veränderte
Zusammensetzung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten hin zu Benzodiazepin-
insensitiven Rezeptoren. Die Ergebnisse aus vorhergehenden Studien sind dabei
nicht immer konform. Meines Wissens nach, ist dies die erste Arbeit, welche
Modifikationen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei pharmakoresistenten und
pharmakosensitiven Tieren mit immunhistochemischen Methoden verglichen hat.
Dabei zeigte sich bei den refraktären Tieren im Gyrus dentatus eine deutliche
Herunterregulierung der Untereinheiten α1, α2, α5 und γ2, wohingegen bei den
Respondern keine solche Veränderung zu detektieren war. Da der Gyrus dentatus
eine wichtige Rolle bei der Weiterleitung von exzitatorischem Input aus anderen
limbischen Regionen in den Hippocampus, innehat, könnte gerade die veränderte
Zusammensetzung der Untereinheiten beziehungsweise deren Runterregulierung in
dieser Region zur Pharmakoresistenz beitragen. Der Gyrus dentatus ist für
Aussagen über Modifikationen von GABAA-Rezeptoruntereinheiten besonders
geeignet, da er nicht, wie CA1, CA3 und Hilus von starker Neurodegeneration bei
Temporallappenepilepsie betroffen ist. Letzteres kann die Bewertung von
veränderten Kompositionen der Untereinheiten erschweren, da die Untereinheiten
schlichtweg durch einen Neuronenverlust reduziert sein können und somit die
Resultate mit Vorsicht interpretiert werden müssen.
Da es sich bei der Pharmakoresistenz aller Wahrscheinlichkeit nach um einen
multifaktoriellen Prozess handelt, schließen sich die Hypothesen zur Überexpression
Zusammenfassung
149
der Multidrug-Transporter in der Blut-Hirnschranke und die Veränderung der GABAA-
Rezeptor-Untereinheiten nicht gegenseitig aus und können zusammen am
Resistenzgeschehen mitwirken bzw. die Behandlungsprognose verschlechtern. Bei
der Vermittlung der Resistenz von Barbituraten wie dem hier verwendeten
Phenobarbital scheint die Überexpression von P-gp eine wichtigere Rolle zu spielen
als Veränderungen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten, da die Resistenz durch die
Inhibition von P-gp komplett behoben werden konnte. Bei Benzodiazpinen könnte
das umgekehrte Szenario der Fall sein, was durch weitere Untersuchungen geklärt
werden müsste.
Summary
150
9 Summary
Kerstin Bethmann Pharmacoresistance against a variety of drugs constitutes a major health problem for
the therapy of a plethora of diseases, e. g. epilepsy. The situation is worst in the most
frequent type of epilepsy, the temporal lobe epilepsy because up to 80 % of the
patients are refractory to treatment with antiepileptic drugs. Therefore it was
advantageous, that for the recent study we had an electric model for post-status
epilepticus in rats which allowed the development of spontaneous recurrent seizures
after an initial insult and therefore resembles the situation in humans where epilepsy
could appear e.g. after an head trauma.
Only about 10 % of the patients which do not respond to a therapy with the first
antiepileptic drug, can be successfully treated with a second anticonvulsive drug,
even if both substances differ markedly in their mechanism of action. A patient is
defined to be pharmacoresistent when the seizures can not be reduced for at least
50 % after application of two or more antiepileptic drugs. To my knowledge this is the
first study which fulfils this clinical definition of pharmacoresistance, because it was
possible, due to the subsequent application of the antiepileptic drugs phenobarbital
and phenytoin, to select pharmacoresistent and pharmacosensitive animals. This
model is therefore proposed to be adequate for studies of refractoriness and for the
further investigation of the causal mechanisms of pharmacoresistance as well as for
new treatment opportunities.
The basal reasons for pharmacoresistance are most likely multifactorial. One
favoured hypothesis is the overexpression of multidrug transporters like P-
glycoprotein (P-gp) in the blood brain barrier which limits, as is well known, the
entrance of many main antiepileptic drugs into the brain and therefore to the epileptic
focus.
In accordance with this theory, the inhibition of this transporter should increase the
concentration of antiepileptic drugs in the epileptic tissue. This assumption was
confirmed by the application of the selective P-gp inhibitor tariquidar in different
Summary
151
dosages shortly before the injection of phenobarbital because it was possible to
abolish the refractoriness against phenobarbital of the rats.
Like it is known from cancer patients, the recent study provides a proof of principle
that the upregulation of multidrug transporters in the blood brain barrier plays a major
role in the event of epilepsy and that through the inhibition of this mechanism, the
concentration of drugs in the brain increases, so that they can act more efficiently.
Another frequent finding in epilepsy is the changed composition of GABAA-receptor
subunits towards receptors which are insensitive against benzodiazepines. The
results from former studies are not always concurring.
To my knowledge this is the first study which compares modifications of GABAA-
receptor subunits between pharmacoresistant and pharmacosensitive animals with
immunhistochemical methods. It could be shown that the refractory animals express
a significant downregulation of the subunits α1, α2, α5 and γ2 in the dentate gyrus,
whereas such a loss could not be detected in responders. As the dentate gyrus plays
a major role in the passing of excitatory inputs from other limbic regions into the
hippocampus, the modified composition of subunits respectively their downregulation
in this area could contribute to pharmacoresistance. The dentate gyrus is especially
suited for studies on changes in GABAA-receptor subunits because this region is not
concerned from neurodegeneration in temporal lobe epilepsy like the CA1, CA3 or
the hilus. Neurodegeneration can complicate the estimation of changed compositions
of subunits because subunits could be plainly and simply reduced due to a loss of
neurons, so that the results have to be interpreted with caution.
Due to the fact that pharmacoresistance is probably a multifactorial process, the
hypotheses of the overexpression of multidrug transporters in the blood brain barrier
and the changed composition of GABAA-receptor subunits did not exclude each other
but may act in concert to mediate resistance respectively to worsen the prognosis of
treatment.
The overexpression of P-gp seems to play a major role in the mediation of resistance
against barbiturates compared to changes in the subunits of the GABAA-receptor,
because the resistance could be overcome completely by inhibition of P-gp. The
Summary
152
contrary scenario could be the case for benzodiazepines, which should be verified in
further studies.
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Publikationsliste Kerstin Bethmann Institut für Pharmakologie, Toxikologe und Pharmazie Publikationen in Zeitschriften/Originalarbeiten: 1. Antonio P. Silva, Kerstin Bethmann, Friedrich Raulf & Herbert A. Schmid Regulation of ghrelin secretion by somatostatin analogs in rats European Journal of Endocrinology (2005) 152: 887-894 2. Holger A. Volk, Dimitrula Arabadzisz, Jean-Marc Fritschy, Claudia Brandt, Kerstin Bethmann & Wolfgang Löscher Antiepileptic drug-resistant rats differ from drug-responsive rats in hippocampal neurodegeneration and GABAA receptor ligand binding in a model of temporal lobe epilepsy Neurobiology of Disease 21 (2006): 633 – 646 3. Claudia Brandt, Kerstin Bethmann, Alexandra Gastens & Wolfgang Löscher The multidrug transporter hypothesis of drug resistance: Proof-of-principle in a rat model of temporal lobe epilepsy Neurobiology of Disease 24 (2006): 202 – 211 4. Kerstin Bethmann, Claudia Brandt & Wolfgang Löscher Resistance to phenobarbital extends to phenytoin in a rat model of temporal lobe epilepsy Epilepsia 48 (4) (2007): 816-826 5. Claudia Brandt, Maike Glien, Alexandra Gastens, Maren Fedrowitz, Kerstin Bethmann, Holger A. Volk, Heidrun Potschka & Wolfgang Löscher Treatment with levetiracetam after status epilepticus: effect on epileptogenesis, neuronal damage, and behavioural alterations in rats Neuropharmacology (angenommen) 6. Kerstin Bethmann, Jean-Marc Fritschy, Claudia Brandt & Wolfgang Löscher Antiepileptic drug resistant rats differ from drug responsive rats in GABAA-receptor subunit expression in a model of temporal lobe epilepsy (eingereicht bei Neurobiology of Disease) Kongressberichte: Kerstin Bethmann „Brainstorming II – Internationaler neurowissenschaftlicher Kongress in Hannover“ TiHo-Anzeiger 4/September 2006
Abstracts/Poster: 1. Marc W. Nolte, Wolfgang Löscher, Kerstin Bethmann & Manuela Gernert High frequency stimulation in epilepsy – a therapeutic alternative for pharmacoresistant epilepsy? 46. Frühjahrstagung der DGPT in Mainz, März 2005 Veröffentlicht in: Naunyn-Schmiedeberg`s Arch. Pharmacol. 371 (Suppl.1): R78 2. Kerstin Bethmann, Claudia Brandt & Wolfgang Löscher Resistance to antiepileptic drug treatment can be counteracted by inhibition of P-glycoprotein in a rat model of temporal lobe epilepsy Special platform session for late breaking data of the 26th International Epilepsy Kongress in Paris Aug./Sep. 2005 3. Marc W. Nolte, Wolfgang Löscher, Kerstin Bethmann & Manuela Gernert Subthalamic nucleus – a feasible target for high frequency stimulation in epilepsy? American Epilepsy Society, Washington DC, Dezember 2005 Veröffentlicht in: Epilepsia 46 (Suppl.8): 332 4. Kerstin Bethmann, Claudia Brandt, Alexandra Gastens & Wolfgang Löscher Combination therapy with the selective P-glycoprotein inhibitor tariquidar in phenobarbital-resistant epileptic rats FENS, Wien, 8.-12.07. 2006 5. Kerstin Bethmann, Jean-Marc Fritschy, Claudia Brandt & Wolfgang Löscher Änderungen der Expression von GABAA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus von epileptischen Ratten, welche sensitive oder resistent auf die Behandlung mit Phenobarbital reagieren 48. Frühjahrstagung der DGPT in Mainz, März 2007
Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Charakterisierung eines elektrischen
Rattenmodells für pharmakoresistente Epilepsie“ selbständig verfasst habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
Claudia Brandt, Ph.D. (Wissenschaftliche Angestellte am Institut für Pharmakologie,
Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) etablierte das
System zur EEG- und Videoüberwachung und implantierte die Elektroden.
Christina Fuest (ehemalige Ph.D.-Studentin des Instituts für Pharmakologie,
Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) führte das
Scoring und die Zählungen zur Erfassung der Neurodegeneration durch.
Das Protokoll für die immunhistochemischen Untersuchungen der GABAA-
Rezeptoruntereinheiten wurde von Prof. J.M. Fritschy vom Institut für
Humanpharmakologie in Zürich etabliert.
Die Methodik der optischen Dichtemessung wurde von Holger Volk, Ph.D.
(ehemaliger Doktorand des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover) und Jens Peter Bankstahl (Doktorand)
etabliert.
Nicole Ernst (technische Mitarbeiterin) half mir bei der Auswertung der Video- und
EEG-Auswertungen.
Martina Gramer und Maria Hausknecht (technische Mitarbeiterinnen) führten für mich
die Analyse der Plasmakonzentrationen mittels HPLC durch.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt: 1) Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover;
2) Gastaufenthalt am Institut für Humanpharmakologie der Universität Zürich.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Danksagung
Herrn Prof. Dr. W. Löscher gilt mein größter Dank für die Bereitstellung des Themas,
die jederzeitige wissenschaftliche Diskussionsbereitschaft, die Anleitung zur
experimentellen pharmakologischen Forschung und der Abfassung dieser
Dissertation sowie die fortwährende konstruktive Unterstützung meines beruflichen
Werdegangs.
Meinen Co-Supervisoren Prof. Dr. Dr. hc. H. Nau und Prof. Dr. M. Stangel danke ich
für die kompetente Betreuung während meiner Doktorarbeit sowie dem Interesse und
den konstruktiven Diskussionen zu dieser Arbeit.
Besonderer Dank gilt C. Brandt, PhD, für ihre kompetente Anleitung bei der
Durchführung der Versuche, ihre Motivation und ihre Geduld bei der Beantwortung
unzähliger Fragen.
Dr. A. Gastens möchte ich für ihre engagierte Unterstützung während der
Überwachungsphase danken.
N. Ernst danke ich für die unermüdliche und unschätzbare Hilfe beim Analysieren der
EEG- und Videoaufzeichnungen.
M. Gramer und M. Hausknecht danke ich herzlich für die Durchführung der
Plasmaanalyse mittels HPLC.
Ein großes Dankeschön gebührt Prof. Dr. J. M. Fritschy von der Universität Zürich für
die Möglichkeit, die Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten in seinem Labor
durchführen zu können. Vielen Dank für die hilfreichen und kompetenten
Diskussionen. C. Sidler, ebenfalls von der Uni Zürich, danke ich für die engagierte
und freundliche Hilfe bei der praktischen Durchführung der Immunhistochemie.
M. Weissing, E. Meier, N. Thonig, D. Pieper-Matriciani sowie allen anderen
Institutsmitgliedern danke ich für vielfältige Unterstützung und ein nettes
Arbeitsklima.
Besonders danken möchte ich auch dem Doktorandenteam (Ina, Jens, Marion,
Saskia, Kathrin, Anton, Marc, Marko, Carlos, Kamilla) für die unterhaltsame und
freundliche Arbeitsatmosphäre, in der ich mich sehr wohl gefühlt habe, und die
Beantwortung jedweder Fragen.
Dank gilt auch meinen Kommilitonen aus dem Ph.D.-Studiengang des ZSN (Gunnar,
Robert, Rainer, Yohannes, Susann, Ina, Kirsten, Maren und vor allem Jirawat „Bo“
Kumnok, der uns sehr fehlt und den wir nie vergessen werden) für den
Zusammenhalt während des Studiums und die großartige Zusammenarbeit beim
Kongress „Brainstorming II“.
Herzlicher Dank gebührt den National Institutes of Health (NIH, Bethesda, USA) für
die finanzielle Unterstützung während der gesamten Arbeit.
Insbesondere danke ich Ina Gröticke, Saskia Kücker, Gunnar Hargus, Mona
Gwendolyn Behrendt und Katharina Laubstein für ihre unschätzbare Freundschaft
und die Motivation die mir so vieles erleichtert hat.
Ganz besonderer Dank gilt den wichtigsten Menschen in meinem Leben: meiner
Mutter Christa Bethmann und meinem viel zu früh verstorbenen Vater Holger Uwe
Bethmann, meiner Großmutter, meinem Bruder und meinem Freund für ihre Liebe,
ihr Vertrauen und die großartige Unterstützung, ohne die ich nicht dort wäre, wo ich
heute bin. Ihr seid die beste Familie die man sich wünschen kann. Danke für alles.