Donatorul de grefărndvcsh.ro/files/documents/Donatorul de grefa...Caracteristicile Sistemului HLA Segregarea şi transmiterea în bloc-fiecare individ posedă maxim 2 alele pentru

Monica Dutescu, Ruxandra Caisan

Oradea, Noiembrie 2012

Donatorul de grefă Eligibilitate, Compatibilitate HLA

Genetica sistemului HLA

• Complexul Major de Histocompatibilitate (MHC) ansamblul de gene care codifică molecule HLA (“human leucocyte antigens”) exprimate pe membrana celulară = antigenele HLA

• cel mai polimorfic sistem uman

• gene de histocompatibilitate -pe braţul scurt al cromozomului

6

Genetica sistemului HLA

• MHC uman de clasa I - codifică pentru moleculele HLA-A,

HLA-B, HLA-C. Aceste gene de clasa I codifică glicoproteinele exprimate pe suprafaţa celulelor nucleate, principala funcţie fiind prezentarea peptidelor antigenice celulelor Tc(CD8+)

• MHC uman de clasa II - codifică pentru moleculele HLA-DR, DQ, DP, in principal pentru glicoproteinele exprimate pe celulele prezentatoare de antigen, unde prezinta peptidele antigenice celulelor Th(CD4+)

• MHC uman de clasa III codifică diferite proteine cu funcţii imune incluzând componente ale sistemului complement si molecule implicate in inflamaţie.

Caracteristicile Sistemului HLA

Polimorfismul - este determinat de numărul mare de alele existente pentru fiecare dintre genele sistemului HLA - Diversitatea alelelor existente pentru fiecare locus, operaţional separate - Excluderea reciproca a alelelor în timpul meiozei

Numarul de alele HLA ( 2010)

A B C

------ ------ ------ 1102 (24) 1724(49) 747(9)

E F G

------ ------ ------

9 21 46

DRA DRB DQA1 DQB1 DPA1 DPB1

------ ------ ------ ------ ------ ------

3 891(20) 35 110(7) 28 139


Codominanţa

- Fiecare alelă de pe fiecare cromozom se exprimă fenotipic la suprafaţa celulei

- Produşii pot fi detectaţi utilizând tehnici adecvate

- Un individ are doi cromozomi 6

->pentru fiecare locus vor exista 2 alele, câte una pentru

fiecare cromozom

- Homozigot = moşteneste două alele parentale identice pentru acelaşi

locus

- Heterozigot = moşteneste două alele parentale diferite pentru acelaşi

locus

= produşi prezenţi şi identificabili pe suprafaţa celulei

- Excepţii de la a regula a codominanţei - alele nule sau silenţioase


Segregarea şi transmiterea în bloc- fiecare individ posedă maxim 2 alele pentru acelaşi locus: una maternă şi una paternă.

-alelele de pe un cromozom=haplotip – se transmite in bloc -totalitatea antigenelor exprimate la suprafata celulelor unui individ=fenotip -Alele moştenite de la ambii parinti formează genotipul = 2 haplotipuri -copiii semiidentici cu parintii -3 combinatii intre frati: -25% HLA identici -25% HLA diferiti -50 % HLA semiidentici Transmiterea haplotipurilor într-o familie PĂRINŢI A1 B8 Cw7 DR3 DQ5 a c A1 B57 Cw6 DR7 DQ2 A2 B18 Cw3 DR4 DQ7 b d A11 B55 Cw3 DR6 DQ4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------ COPII 1 2 3 4 A1B8Cw7DR3DQ5 A1B8Cw7DR3DQ5 A2B18Cw3DR4DQ7 A2B18Cw3DR4DQ7 A1B57Cw6DR7DQ2 A11B57Cw3DR6DQ4 A1B57Cw6DR7DQ2 A11B55Cw3DR6DQ4 a a b b c d c d


Recombinarea - excepţii de la transmiterea în bloc, prin haplotipuri, a specificităţilor HLA - în cursul diviziunii meiotice pot surveni recombinări între cromozomii omologi Recombinare într-o familie - recombinarea a avut loc între locusul A şi locusul B PĂRINŢI A1 B8 A24 B35 A2 B51 A2 B51 COPII A2 B51 A1 B8 A24 B35 A1/B51 A2 B51 A2 B51 A2 B51 A1 B8 A24 B35 A24 B35


Dezechilibrul de legare - Asociaţii genetice preferenţiale intre alelele de pe diferiţi loci ai aceluiasi

cromozom =>> apariţia, într-o populaţie luată la întâmplare, a unor

haplotipuri cu o frecvenţă semnificativ mai mare decât cea aşteptată dacă s-ar lua în consideraţie frecvenţa fiecarei alele luată separat în populaţia respectivă

- Haplotipuri frecvente : A1 B8 Cw7 DR3 ; B35 Cw4 - Haplotipuri rare : A1 B7 ; A2 B8 se întâlnesc neaşteptat de rar

- Grupa populaţională, regiunea geografică şi de procentul de recombinări * Caucazieni A1 B8 Cw7 DR3 ; A3 B7 Cw7 DR2 * Orientul Mijlociu : A26 B8 DR3; A30 B13 * Africa de Sud: A33 B14

Nomenclatura Sistemului HLA

In uz din 1 aprilie 2010 human leucocyte Testat delimitare Substitutie Expresie antigen ADN silentioasa

HLA - A * 02 : 01 : 01 : 02 L Locus / Grupa Subtip Diferente in afara Gena alelica regiunii codante

Grupa alelica – corespunde antigenului serologic sau familiei de alele Expresia – L = Low N = Null S = secretor Q = Questionable

TEHNICI DE LUCRU PENTRU STABILIREA SPECIFICITATILOR HLA

Tehnica serologica - de microlimfocitotoxicitate (Terasaki)

= Determinarea antigenelor HLA de pe suprafaţa limfocitelor se face prin incubarea

acestora cu o baterie de antiseruri în prezenţa complementului

Prezenţa antigenului corespunzător antiserului

-> produce reacţia antigen-anticorp

- > adăugarea complementului - > de activarea

- > permeabilizarea membranei celulare

TEHNICI DE LUCRU PENTRU STABILIREA SPECIFICITATILOR HLA

Tehnici de biologie moleculară • PCR-SSO / PCR-SSO inversată (Sequence Specific Oligoprobes) = amplificarea unei regiuni a ADN-ului genomic care prezintă un polimorfism care

interesează

• PCR-SSP (Sequence Specific Primers) = amplificarea porneşte de la primeri - secvenţe oligonucleotidie cu rol declanşator -

localizaţi în regiunile polimorfe = permite amplificarea specifică şi individuală a fiecărei alele / grup de alele

• PCR-SBT (Sequence Based Typing)

= secvenţarea directă a regiunii polimorfe a genei HLA în vederea unui tipaj de

înaltă rezoluţie

STABILIREA SPECIFICITATILOR HLA

Niel de rezolutie al tipizarii HLA

2 digits - ex : HLA-A*02 - tipaj recrutare donatori

/ cautare initiala in familie

4 digits - ex : HLA-A*02:01 - tipaj la selectie

Compatibilitatea HLA

• Compatibilitate / match = potrivire perfecta intre alele HLA

• Incompatibilitate / missmatch = una sau mai multe alele diferite

HLA- A,A / B,B; C,C; DRB1,DRB1; DQB1,DQB1 – 10 / 10

9 / 10

HLA- A,A; B,B; C,C; DRB1,DRB1 – 8 / 8

7 / 8

HLA- A,A; B,B; DRB1,DRB1- 6 / 6

4 / 6

• Element important pentru evolutia unei grefe

• Selectarea donatorului cel mai compatibil = donatorul ale carui celule determina un raspuns imun minim sau deloc la primitor, dupa transplantare

Standardele Federatiei Europene de Imunogenetica (EFI) 1. Tipizare initiala : pacient si toate rudele de gradul I (frati, parinti) – biologie moleculara - HLA-A, B, DRB1 - 2 digits

2. Tipizare extinsa

- Daca exista un donator potential in familie – frate identic 2 digits a. Transmiterea haplotipurilor este clara ->pacient + donator - probe noi de sange – HLA-A,B,C,DRB1,DQB1 – 2digits/4digits b. Transmiterea haplotipurilor nu este clara, parinti netestati, homozigotie -> pacient + donator - probe noi de sange – HLA-A,B,C,DRB1,DQB1 - 4 digits - Nu exista un donator potential in familie -> pacient - probe noi de sange – HLA-A,B,C,DRB1,DQB1 - 4 digits 3. Tipizarea de verificare – probe de sange pre-transplant -> HLA-A, B, DRB1 - 2 digits

Protocolul pentru testarea HLA in vederea allo-

transplantului de celule stem hematopoietice

Testarea HLA a donatorilor voluntari de

celule stem hematopoietice

Standardele Federatiei Europene de Imunogenetica (EFI)

1.Tipizare initiala – donator nou – biologie moleculara - minim HLA-A, B, DRB1 - 2 digits - aditional HLA-C HLA-A*02 Avantaj HLA-C: identificare mai rapida si eficienta a unui donator dorit

Ex: perechi HLA-A,B,DRB1 match -˃ excludere la tipajul extins = 67% perechi HLA-A,B,C, DRB1 match -˃ excludere la tipajul extins = 19%

2. Tipizare extinsa - donator potential cuompatibil din registru - biologie moleculara– HLA-A,B,C,DRB1,DQB1 - 4 digits HLA-A*02:01 a. Probe sange/ ADN conservate

b. probe noi de sange

3. Tipizarea de verificare – probe noi pre-transplant - minim HLA-A, B, DRB1 - 2 digits

Selectarea unui donator neînrudit de CSH

Rolul compatibilităţii HLA

Locus HLA Inclus in

strategia de

cautare

Compatibilitate Rezolutie

A Da Da 4 digits

B Da Da 4 digits

C Da Da 4 digits

DRB1 Da Da 4 digits

DRB3,4,5 Da Necunoscut

DQB1 Da Neclar

DPB1 Nu Neclar

DQA1/DPA1 Nu Nu



• Nu există diferenţe semnificative între incompatibilitaţile alelice, 4 Digits şi cele antigenice, 2 digits – locusurile A,B,DRB1

• Locus C – incompatibilităţile antigenice sunt mai dăunatoare decât cele alelice

• Incompatibilităţile intra-CREG nu sunt acceptabile

• Incompatibilităţile B si C sunt mai puţin daunatoare decât cele pentru A si DRB1

• Incompatibilităţile DQB1 sunt cel mai bine tolerate

• Incompatibilităţile HLA-DPB1 pot determina o creştere a incidenţei GVHD sau a recăderilor după TX 10/10

• Incompatibilităţi cu risc crescut

4 HLA-A ; 1 HLA-B ; 7 HLA-C ; 1 HLA-DRB1 ; 1 HLA DPB1 ;

1 HLA-DRB1/DQB1

– >necesită studii pe un număr mare de cazuri



Populaţia caucaziană

Donator adult • A, B, C, DRB1 8 / 8 75% • A, B, C, DRB1 7 / 8 92% CBU • A, B, DRB1 6 / 6 40% • A, B, C, DRB1 7 / 8 92%

Efectul unui singur miss-match pe un locus

HLA asupra supravieţuirii JMDP

Japan Marrow Donor Program

NMDP NAtional Marrow Donor Program

NMDP NAtional Marrow Donor Program

FHCRC

Fred Hutchinson Cancer Research

Program

Locus BM BM PBC BM

A ↓ ↓ = =

B ↓ = = =

C = ↓ ↓ ↓

DRB1 = ↓ = =

DQB1 = = = =


Factori non- HLA

P / D P D

Sex

Vârstă

Greutate

Status CMV

Gene non-HLA

Diagnostic

Regim de

condiţionare

Interval Dr.-Tx

Sursa CSH -

MO/Perif

Tip donor –

Adult/CBU


Strategia de căutare / selecţie

• Nivelul de compatibilitate este în funcție de

pacient / boală

• Unii pacienţi / unele boli – se pot tolera mai

bine / mai multe incompatibilităţi

• Exista factori genetici şi non-genetici care

influenţează aceste diferenţe

• Nu există un algoritm fix de cautare –

adaptat fiecarui caz

Documents

Donatorul de grefărndvcsh.ro/files/documents/Donatorul de grefa...Caracteristicile Sistemului HLA Segregarea şi transmiterea în bloc-fiecare individ posedă maxim 2 alele pentru