DOSAGGIO ACIDI NUCLEICI

Per dosaggio di acidi nucleici si intende la determinazionedella quantità di un acido nucleico in un determinatomateriale biologico.

E' possibile dosare gli A.N. essenzialmente con tre metodiche:

1) METODO SPETTROFOTOMETRICO

2) METODO COLORIMETRICO

3) METODO FLUORIMETRICO

SPETTROFOTOMETRO E CUVETTE

METODO SPETTROFOTOMETRICO

Il metodo spettrofotometrico sfrutta la capacità degli acidi nucleici diassorbire la luce UV con un massimo di assorbimento ad unalunghezza d'onda di 260 nm, lo spettro di assorbimento varia da 230nm a 280 nm.

D.O.

nm230 260 290

Gli A.N. hanno il massimo di assorbimento a 260 nm

1 nm 400 nm

La misurazione dell’assorbimento ottico è uno strumento importanteper l’analisi dei nucleotidi ed acidi nucleici.La frazione della luce incidente (I°) assorbita da una soluzione ad unadata lunghezza d’onda (λ) è correlata al cammino ottico (l) ed allaconcentrazione (c) della specie assorbente.Queste due relazioni sono combinate nella :

LEGGE DI LAMBERT e BEER

I°Log----------- = ε l c

IDove I ° = luce incidente

I = luce trasmessae = coefficiente di estinzione molarel = cammino otticoc = concentrazione

I° I

Quarzo per UVPlastica per visibile

l

La legge presuppone che la luce incidente sia parallela emonocromatica (di una sola lunghezza d’onda) e che le molecole disoluto e di solvente siano orientate in modo casuale.

L’espressione log I0/I viene detta Assorbanza e indicata con A, oDensità ottica ed indicata con D.O.

I°Log----------- = ε l c

I

A= D.O. = ε l c

L’Assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione delsoluto che sta assorbendo la luce.Il coefficiente di estinzione molare ε varia con:- La natura chimica del composto- Il solvente- La lunghezza d’onda

A= D.O. = ε l c

D.O.

ε l

Se l = 1cm (di solito le cuvette hanno lati di 1 cm)

Se c = 1M

Allora D.O. ed ε hanno lo stesso valore:

D.O. = εIl coefficiente di estinzione molare ε rappresenta l’Assorbanza (odensità ottica) di una soluzione a concentrazione 1M e a camminoottico unitario.

C=

M= n/V n= g/PM

M= g/PM Vg = M PM V

Non è possibile stabilire a priori il peso molecolare di un acido nucleicodopo la sua estrazione e purificazione.!!!!!Ma anche se si sapesse non è possibile preparare una soluzione 1M diun acido nucleico in quanto occorrerebbero grandi quantità.

Es.: tRNA = PM 50.000 daltonPer fare una soluzione 1M bisognerebbe sciogliere 50.000 g in 1litro(ovvero 50 gr in 1 ml).

Quindi non è possibile usare il coefficiente di estinzione molare (ε) neldosaggio degli Acidi Nucleici

Per gli acidi nucleici si usa il :

coefficiente di estinzione specifico (K)

Che sostituisce ε.K è stato determinato sperimentalmente ed esprime l’assorbanzadi una soluzione a concentrazione 1mg/1ml alla lunghezza d’ondadi 260 nm

K = 21 (DNA nativo a doppia elica ds)

K = 23 (DNA denaturato a singola elica ss)

K = 25 RNA

Quindi (a 260 nm): c = D.O./ K

DETERMINAZIONE PUREZZA

L'interferenza dovuta a contaminanti può essere evidenziatamediante il calcolo dei "rapporti".

Il rapporto A260/A280 è usato per stimare la purezza degli acidinucleici, dal momento che le proteine assorbono a 280 nm.

Un DNA puro dovrebbe avere un rapporto di circa 1.8, mentre unRNA puro dovrebbe dare un valore di approssimativamente 2.0.

L'assorbanza a 230 nm riflette la contaminazione del campionedovuta a sostanze come carboidrati, fenoli, peptidi o compostiaromatici.Per campioni puri il rapporto A260/A230 dovrebbe essere circa 2.2.Le proteine sono comunque la principale fonte di contaminazione,per cui dopo la lettura occorre sottrarre l’assorbimento a 280.

METODO COLORIMETRICO

Anche il metodo colorimetrico utilizza lo spettrofotometro per ladeterminazione del dosaggio.

Il metodo si basa sulla formazione di complessi colorati diparticolari sostanze in maniera specifica con il ribosio o con ildeossiribosio dello scheletro degli Acidi Nucleici.

Ci permette di valutare esattamente la quantità di DNA o RNApresenti in soluzione, anche se la soluzione contiene entrambigli ac. Nucleici.

La reazione colorimetrica è altamente specifica in quanto:La DIFENILAMMINA (DFA) reagisce con il deossiribosio (DNA).L’ORCINOLO reagisce con il ribosio (RNA).

Una reazione specifica per il DNA prevede l'uso di difenilammina, cheforma un complesso di colore celeste complessandosi con il DNA.La miscela è così composta:

- DNA.- DIFENILAMMINA (DFA) (che viene sciolta in acido acetico).- ACIDO PERCLORICO.- ALDEIDE ACETICA.

Il tutto viene incubato a 37°C over night.La densità ottica viene letta a lunghezza d'onda di 595 nm. (VISIBILE)Dopo l’incubazione si ottiene una colorazione celeste.

DIFENILAMMINA (DFA) per il DNA

Per l’ RNA la reazione colorimetrica si svolge in presenza di:- ORCINOLO- TRICLORURO FERRICO (sciolto in acido cloridrico)

Si incuba a 40°C over night. La densità ottica si legge a 670 nm. (VISIBILE)Si ottiene una colorazione verde.

ORCINOLO per l’RNA

Per poter risalire alla concentrazione dell'acido nucleico, inentrambi i casi, è necessario approntare un sistema di taraturacostituito da concentrazioni crescenti note di DNA o RNA.

L'intensità colorimetrica è direttamente proporzionale allaconcentrazione degli acidi nucleici.

E' possibile quindi con una retta di taratura interpolare il valore diD.O. del campione sconosciuto per poterne determinare la suaconcentrazione.

D.O.595 nm

concmg/ml

RETTA DI TARATURA

2 4 8

X

0.2

0.4

0.8

Y

In questo caso la concentrazione può essere stimata in base allafluorescenza emessa dall’ Etidio Bromuro.

Quantità crescenti e a concentrazione nota di acido nucleicovengono poste su gel accanto al nostro campione a concentrazioneincognita.

Dopo la corsa elettroforetica il gel viene immerso in una soluzione diEtidio Bromuro che si intercala tra le basi dell'acido nucleicorendendolo fluorescente alla luce UV.

METODO FLUORIMETRICO

Conc. X10 ng 50 ng 100 ng 300 ng 1000 ng

SPOT TESTNei casi in cui la concentrazione del DNA non è sufficiente < 250 ng/ml o quando non ènecessaria troppa precisione si preferisce un metodo rapido, chiamato spot test, basatosulle proprietà del bromuro di etidio di intercalarsi tra le basi azotate emettendofluorescenza quando eccitato dalla luce ultravioletta (tra 260 e 320 nm )

Poiché l’intensità della fluorescenza è proporzionale alla massa del DNA (o RNA)utilizzato, è possibile stimare la concentrazione del campione in esame comparandolocon una serie di standard a concentrazione nota compresi tra 2 e 100 ng.

5ng12,5ng25ng50ng

100ngx

piastra di agarosio all 1% contente EtBr 0,5 µg/ml

E’ il caso di ricordare che, sia la lettura spettrofotometrica che lo spot test,non danno alcuna informazione sull’integrità strutturale degli acidi nucleici.Sia acidi nucleici integri che forme degradate a vario livello, sino a singolinucleotidi, saranno stimate allo stesso modo. Per avere informazioni sullaqualità del DNA o RNA, quindi, gli acidi nucleici devono essere analizzatiper elettroforesi su gel