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GENETIQUE BACTERIENNE. Dr Christian CARRIERE Laboratoire de bactériologie Hôpital Arnaud de Villeneuve. A - Le chromosome bactérien. ADN double brin « Gènes de la vie » Protéines structurales Protéines enzymatiques. Le chromosome bactérien. Le chromosome bactérien Applications pratiques. - PowerPoint PPT Presentation
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Dr Christian CARRIERELaboratoire de bactériologieHôpital Arnaud de Villeneuve
GENETIQUE BACTERIENNE
A - Le chromosome bactérien
ADN double brin
« Gènes de la vie »
•Protéines structurales
•Protéines enzymatiques
Le chromosome bactérien
Le chromosome bactérienApplications pratiques
1 - Epidémiologie moléculaire
?? !
“épidémiologieconventionnelle”
“épidémiologie moléculaire”
Principe de l’épidémiologie moléculaire
But : Comparer des isolats bactériens entre eux
Même espèce bactérienne
Coupure par 1 endonucléase
Migration électrophorétique
Profils de restrictionComparaison des profils
= Technique d’électrophorèse en champ pulsé (ECP)
Variations observées sur les profils d’ECP
Profil de référence
Gain (B) et perte (C) d’un site de restrictionsur le fragment de 400 kpb
A B C D E
Insertion (D) et perte (E)
d’un fragment d’ADN sur le fragment de 400 kpb
400 kpb
500 kpb
200 kpb
50 kpb
Nombre de différences par rapport au profil de référence
3 3 2 2
Interprétation de profils d’ECP
Nombre de modifications génétiques par rapport à la souche épidémique
Nombre de fragments différenciant la souche testée de la souche épidémique
Interprétation microbiologique des profils
Interprétation épidémiologique
0 0 Semblables Souche faisant partie de l’épidémie
1 2 – 3 Très proches Souche faisant probablement partie de l’épidémie
2 4 – 6 Proches Souche faisant possiblement partie de l’épidémie
3 > ou = 7 Différents Souche non reliée à l’épidémie
M 1 2 3 4 5 6
48,5
436,5
194
kb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
48,5
436,5
194
kb
Isolats de Staphylocoques- service N° 1 (1 à 5) et - service N° 2 (6 à 9)
Isolats de Pseudomonas aeruginosa- 1 à 7 : 7 patients différents- 8 et 9 : fibroscope
Epidémiologie moléculaire
Ancienne dénaturation ou
fusion de l’ADN Tm : température de
fusion G - C %
Notion d’espèceTm et G-C %
proches
2 - Identification : genre et espèce (taxonomie)ex : Escherichia coli
Le chromosome bactérienApplications pratiques
=> Espèces rares ou difficiles à identifier par méthodes commercialisées
Séquençage Comparaison de séquences
banques de séquences
d ’ADN
Nom de l ’espèce
Culture PCR ADN r16S,
Taxonomie bactérienne moderne
Analyse d’une séquence sur Internet
1-Aller surun site spécifique
2- Copierla séquence à analyser
3- Envoyerla recherche
Identification d’une bactérie après séquençage
Si le pourcentage est < à 97 % = nouvelle espèce ou nouveau genre
Pourcentage d’identité entre la séquence analysée et la séquencela plus proche de la banque de données
Alignement des 2 séquences
Si le pourcentage est > à 97 % = même genre et espèce
Les plasmides
Fragments d’ADN double brin Circulaires Intra cytoplasmiques Auto réplicatifs Portent des gènes de « survie »
Adaptation à l’environnement Résistance aux antibiotiques +++
B – Les variations génotypiques
Ce sont des modifications du génome bactérien essentiellement dues à des mutations
Pour le clinicien, les applications : Virulence
Résistance acquise aux antibiotiques
Les variations génotypiques
Que se passe t-il au niveau génomique ? Microinsertions et microdélétions
Mutations faux sens : erreur Mutations non sens : codon stop
Mutations ponctuelles Idem ci-dessus
Macroinsertions et macrodélétions Séquence de type IS (séquences d’insertion) Transposons
Gain ou perte de gènes entiers (Résistance ATB)
La résistance a un support moléculaire(exemple des antituberculeux)
ISONIAZIDE katG, inhA, kasA, aphC
RIFAMPICINE rpoB
PYRAZINAMIDE pncA
ETHAMBUTOL embCAB
STREPTOMYCINE rpsL, rrs
Gènes mutés dans la résistance aux anti-tuberculeux (connus…)
Mode d’action : La rifampicine se fixe à la sous-unité de l’ARN
polymérase Empêche l'initiation de la transcription perturbe la synthèse des ARN messagers
Mécanisme de résistance : 95% des souches portent des mutations ponctuelles
dans le gène rpoB entre les codons 511 et 533 Diminution de l'affinité de l'ARN polymérase pour la
rifampicine
Exemple : Mécanisme de résistance à la rifampicine
rpoB511 533
511 533513 516 526 531
Gln Asp His Ser
LeuPro
TyrVal
TyrAspLeuArg
LeuTrp
Mutations dans le gène rpoB
522
LeuPro
Leu
Ser Leu
Pro
Propriétés des variations génotypiques
1 - Spontanéité le mutant résistant préexiste à
l’utilisation de l’antibiotique qui le sélectionne
ATB
ATB
Bactéries sensibles
Population bactérienne
Population bactériennedevenue résistante
Bactéries résistantes à l’antibiotique
Propriétés des variations génotypiques
2 - Rareté Taux de mutation = probabilité d’avoir un mutant
résistant dans une population bactérienne ex : 10-5
Probabilité d’avoir 2 mutants résistants à 2 ATB = produit des probabilités de chaque mutation
Application : Caverne pulmonaire=108 bacilles Rifampicine : Tx mut. = 10-7
Isoniazide : Tx mut. = 10-5
Mutant isoniazide et rifampicine « spontané » = 10-7 x 10-5 = 10-12
Propriétés des variations génotypiques
3 - Stabilité transmissible à la descendance
4 - Inductibilité U.V., mutagènes…
Résistance naturelle : chromosomique
Résistance acquise :
- chromosomiques, secondaires à une mutation
- extra-chromosomiques par acquisition de gènes ex : plasmides
SUPPORT GENETIQUE DE LA RÉSISTANCE
C - Transferts de matériel génétique
Transformation Conjugaison Transduction
Caractéristiques communes à tous ces mécanismes de transfert
Ces transferts d’ADN doivent être suivis de recombinaison génétique
I – La Transformation
Transfert d’un fragment d’ADN en solution d’une bactérie donatrice à une bactérie réceptrice
Ce modèle avait permis de démontrer que l’ADN était le support de l’hérédité en 1944
Expériences de Griffith
La transformation
Exemple : transformation des pneumocoques par de l’ADN provenant de Streptocoques ORL
Les Streptocoques ORL Sont des commensaux de la gorge,
salive… Peuvent porter des gènes de résistance
aux antibiotiques Sont sélectionnés par l’antibiothérapie Transforment les Pneumocoques
= DANGEREUX car les Pneumocoques deviennent à leur tour résistants
II – Conjugaison Processus sexuel strict Contact et appariement Sexes différents, pili sexuels Pont cytoplasmique Transfert d’ADN
chromosomique à sens unique, en général partiel
La conjugaison
La conjugaison : schéma
La conjugaison bactérienne
Intéresse surtout les bactéries à Gram négatif
N’importe quel gène peut être transféré : résistance, virulence …
Principal facteur d’évolution bactérienne
Intéresse aussi l’ADN plasmidique (plasmides conjugatifs)
Transfert de plasmides de résistance par conjugaison
III - La transduction
Transfert de fragments d’ADN bactérien par l’intermédiaire de vecteurs : bactériophages ou « phages »
Les bactériophages sont des virus infectant de façon spécifique les bactéries
Se répliquent dans la bactérie Utilisent la « machinerie cellulaire » Peuvent lyser la bactérie
La transduction
soit conversion lysogéniqueExpression du gène = prophage
Soit cycle lytiqueRéplication du phage
Exemples de conversion lysogénique
Production de toxines = virulence Corynebacterium diphteriae
Toxine diphtérique : diphtérie
Streptococcus pyogenes (groupe A)
Toxine érythrogène : scarlatine
RESISTANCE BACTERIENNE
NATURELLE ACQUISE
Mutations Extra-Chromosomique
ChromosomiqueFixeConstante1 espèce bactérienne1 ATB ou 1 familleTransm. Verticale
ChromosomiqueRareStableSpontanée1 ATB ou 1 familleTransm. Verticale
Éléments Génétiques Mobiles (Plasm., Tn.)FréquentContagieuxPlusieurs ATB = MultiRTransm. Horizontale
Qq souches d’une espèceTend à se répandre