Asbeste ve Erionite Bağlı Maliğn Plevral Mezotelyoma Patogenezinde Apoptosis ve Apoptosis Regüle Edici Proteinlerin Rolü

Dr. Nurdan KöktürkDr. Salih EmriDr. Pınar FıratDr. Hadi AKAYDr. Cem KadılarDr. Can ÖztürkDr. Faruk ZorluDr. Yücel Güngen

TUBITAK Proje No:SBAG-2567(102S045)

Kokturk N, Emri S, Firat P, et al. Prognostic significance of Fas Ligand and Bax in erionite and asbestos induced Turkish malignant pleural mesothelioma.Submited for publication to Lung Cancer.

Gazi ÜniversitesiHacettepe ÜniversitesiAnkara Üniversitesi

Kooperatif Çalışma Grubu

Türkiye’de Malignant Plevral Mezotelyoma(MPM)

• Türkiye’de endemik lifsel-yapılı plevral ve pulmoner hastalıkların prevalansı yüksektir (fiber-related pleuropulmonary disease).

• Yol açan nedenler:– Aşırı nüfus kalabalığı– Jeoloji

• Asbest madeni yığınları• Orta Anadolu’da Kapadokya bölgesinde 3 köyde

tanımlanan diğer bir mineral lif; Erionite varlığı

1. Baris YI. Asbestos and erionite related chest diseases. Ankara, Semih Ofset Matbaacılık, 1987.

Giriş

Erionite ve Tremolite MPM’leri Arasındaki Farklılıklar : Ras Oncoprotein Ekspresyonu

• Erionite mezotelyomaların da Ras oncoprotein ekspresyonu % 27, tremolite mezotelyomaların da ise %6 olarak bulunmuştur (P=0.17).

Fig 1. Positively stained tumor cells in case 3İndicating Ras expression.Inset: Positive control showing dense staining

Fig 2. Representative immunoblots of p21 ras-negative plasma (Lane 1), p21ras-positive plasma (Lane 3,4,5) and molecular marker (Lane M).

1. Olut A, et al. Respir Med 2001; 95: 697-698.

Erionite ve Tremolite MPM’leri Arasındaki Farklılıklar :Prognostik faktörler

• Akım sitometrik DNA analizi ile Erionite mezotelyomalarında aneuploidy oranı istatiksel olarak önemli derecede yüksek bulunmuştur [erionite MPM %72.7(8/11) vs. Tremolite MPM %13.8(4/29)].

• İstatiksel olarak önemli olmasa da Erionite MPM’da proliferasyon hızı [proliferation rate (SPF)] daha yüksektir.

1. Emri S, and et al. Lung Cancer 2001;33: 109-114.

Erionite ve Tremolite MPM’leri Arasındaki Farklılıklar:Tedaviye Yanıt ve Survi

Median OS(ay± %95CI):10±(6-14)Erionite: 8±2(3-13), 1-y sur % 30.0Asbestos: 14 ±3(9-19), 1-y sur % 51.9

1. Emri S, and et al. Lung Cancer 2001;33: 109-114.

• Tremolite MPM’lerinde survi avantajı gösterilmiştir.

• Erionite MPM’lerinin tedaviye yanıtları daha kötüdür.

Erionite’in karsinojenik özellikleri ve/veya genetik faktörler erionite mezotelyomalarının bu değişik

biyolojik davranışından sorumlu olabilir.

Mineral Lif Karsinogenezi

DNA HASARI p53

GrowthArrest/Survival

APOPTOSIS

p21

bax

1.Serbestradikal2.Mekanik etki

(cyclin-dependent kinase inhibitor)

Asbest veya Erionite

Ölüm ve Yaşam Kararı Malignant Transformasyonun kalbini teşkil etmektedir!

G1/SG2/MS

bcl

APOPTOSİS

• Apoptosis “programlı hücre ölümü”; hücrenin kendi ölümünü sağlayan ve o hücre tarafından başlatılan ve sürdürülen bir dizi genetik olay için kullanılan bir terimdir.

• Programlı hücre ölümü (apoptosis) gelişmesindeki defektlerin tümör gelişimi ve kemoterapiye olan dirençte mojör rolü olduğuna inanılmaktadır.

1. Xia C ,and et al. Mol Cancer Ther 2002; 1: 160-166.

2. LaCasse EC, and et al. Oncogene 1998; 275: 5315-5320.

APOPTOSİS

• Apoptosisi belirleyen iki büyük protein grubu vardır: – bcl-2 ailesi ve – caspase ailesi.

Bcl-2 Ailesi

Anti-apoptotic

Pro-apoptotic

HR3Homology Only

Bcl-2 Bax Bad

Bcl-XL Bak Bid

Bcl-W Bcl-XS Bik

Mcl-1 Bok/Mtd Bim/Bod

Boo/Diva

NR-13

Hrk

Nix

Bcl-2 Kanser Hücre Ölümünü Önler

Bcl-2/bax: Kötü prognoz Ve yüksek tümör grede’i

↓Bcl-2/Bax :Düşük tümör Grade’i ve kemoterapiyeDaha iyi cevap ve relapsazlığı

• Apoptosis intracellüler proteinlerin yıkımı ile gerçekleşir. Caspase(Cysteinyl-aspartic acid proteases) ailesi bu proteinleri yıkan proteazlara verilen isimdir.

• Caspase yolu bir kez aktive olduğunda, birbirini tetikleyen bir dizi reaksiyon başlatılmış olur.

Apoptosis-Caspase

Caspase Activation

Cell Death

Apoptpsis Sık Görülen Yolak

Cytochrome c

Apoptosis- CD 95

• Fas (CD95/APO 1) hücre yüzey reseptörüdür, spesifik ligandı olan Fas ligand ile bağlanarak Caspase 8 yolunu aktive ederek apoptotic hücre ölümünü indükler.

Çalışmanın Amacı

• Bu çalışmada apoptosis de en güçlü yolaklardan ikisine ait belli başlı proteinlerin; Bcl-2, Bax, Fas/Fas Ligan’ın erionit ve asbestle indüklenmiş MPM’lı olgulardaki ekspresyonlarının değerlendirilmesi ve bunun yaşam süreleri ile olan ilişkisinin ortaya konması hedeflenmiştir.

Materyal ve Metod-1

– Çalışma Populasyonu

• 16 (%30.7) erionit ve 19 (%36.5) asbeste bağlı mezotelyoma olgularından oluşan toplam 35 malign plevral mezotelyoma (MPM) ve 17 (%32.6) adenokarsinomalı hasta çalışmaya alındı. – Patolojik İnceleme

• Formalinde sabitlenmiş parafine gömülü dokular 5 mikronluk kesitler şeklinde kesildi. Dokular önce H&E boyası ile boyandı. MPM hücre tiplendirmesi yapıldı. Daha sonra immunhistokimyasal analiz için immun boyamalar yapıldı.

Materyal ve Metod-2

Boyanmalar:

0= boyanma yoğunluğu (yok: hiç boyanma yoksa), 1=hafif boyanma varsa,

2= orta düzeyde boyanma varsa,

3= kuvvetli boyanma varsa

Boyanan hücrelerin tüm tümoral dokuya oranına göre, boyanma alanı (%) olarak semi kantitatif olarak değerlendirildi.

Materyal ve Metod-3

– İstatistiksel Analiz

• İstatistiksel değerler ortalamastandard sapma olarak verildi. İstatistiksel analiz için SPSS “Windows Sürüm 10.01 (1999)” paket programı kullanıldı. Ki kare, Fisher’in ki kare testi, Kruskal Wallis ANOVA ve Mann Whitney U testi karşılaştırmalar için kullanıldı. Survi analizi için Kaplan Meier analizi yapıldı. P<0.05 olması hali istatistiksel fark olarak kabul edildi.

Sonuçlar-1

Hasta Karakteristikleri

Erionit MPMN=16(%)

Asbest MPMN=19 (%)

AdenokarsinomaN=17 (%)

E/K 11/5 10/9 14/3

Ort. yaş(yıl) 48.7312.42 47.8911.73 53.8811.25

Evre

Evre I 2 (14.3) 8 (42.1) 3 (18.8)

EvreII 2 (14.3) 1 (5.3) 1 (6.3)

Evre III 6 (42.9) 7 (36.8) 8 (50.0)

Evre IV 4 (28.6) 3 (15.8) 4 (25.0)

Tümör tipi

Epitelyal 10 (62.5) 12 (63.2)

Sarkomatöz 3 (18.8) 2 (10.5)

Mikst 3 (18.8) 5 (26.3)

Sonuçlar-2

Tanısal metod Erionit MPM

N=16(%)

Asbest MPM

N=19 (%)

Adenokarsinoma

N=17 (%)

Torakotomi+açık biyopsi 8 (50) 16 (84.2) 8 (47)

Torakoskopi 4 (25) 3 (15.8) 0

Kapalı plevra biyopsisiBronkoskopik biyopsiTrucut kör biyopsi

4 (25) 000

3 (17.6)3 (17.6)3 (17.6)

Sonuçlar-3

Erionit MPMN=16 (%)

Asbest MPMN=19 (%)

Cerrahi 9 (56.3) 16 (84.2)

Cerrahi tipi

Palyatif tümör küçültücü cerrahi

Ekstrapulmoner plörektomi

0 1 (5.3)

Plörektomi+dekortikasyon

3 (18.8) 11 (57.8)

Palyatif minör cerrahi

Torakoskopi+intra kaviter sisplatin

6 (37.5) 4 (21)

Boyanma Hasta sayısı Yoğunluk %

Bcl-2 Erionite MPM 2 zayıf 5Asbestos MPM 1 zayıf 5

Adenocarcinoma

0

Fas Erionite MPM 1 zayıf 60Asbestos MPM 1 orta 80

Adenocarcinoma

3 weak 54060

Sonuçlar-4

Sonuçlar-5

Boyanma

Yoğunluk Erionite MPM No (%)

Asbestos MPMNo (%)

AdenocarcinomaNo (%)

Bax Yok 10 (33.3) 12 (40) 8 (26.7)

Zayıf 2 (15.4) 5 (38.5) 6 (46.2)

Orta 4 (44.4) 2 (22.2) 3 (33.3)

Fas Ligand

Yok 4 (57.1) 2 (28.6) 1 (14.3)

Zayıf 6 (50) 5 (41.7) 1(8.3)

Orta 6 (19.4) 10 (32.3) 15 (48.4)

Kuvvetli 2 (100)

Fas Ligand Ekspresyonu ve Survival Analizi(Tüm Grup)

Survival time (months)

50403020100

Pro

ba

bili

ty o

f S

urv

iva

l

1,2

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

-,2

FAS LIGAND

Exp

Alive

No exp

Alive

•Fas Ligand ile pozitif boyanan hastalar ise Fas Ligand negatif hastalara göre tüm MPM grubu dikkate alındığında daha uzun yaşarlar (15-12 ay, p=0.05).

• Erionite MPM’lerinde Bax negatif hastaların survisi daha uzun bulunmuştur(18 vs. 14 ay; p=0.06).

Survival time (months)

403020100

Pro

ba

bili

ty o

f S

urv

iva

l

1,2

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

-,2

BAX

Exp

Alive

No exp

Alive

Erionite MPMP’lerinde Bax ekspresyonu ve survival

.

Tartışma-1

• Şu ana kadar yapılan ilk çalışmadır.

• Bizim çalışmamızda da Bcl-2 uygun boyanan pozitif kontrole ve pozitif iç kontrole rağmen sadece birkaç dokuda pozitif saptanmıştır.

• Bax boyanma ise yaygındır, ancak boyanma yoğunluk ve yüzde olarak 3 grup arasında farklı değildir.

• Bax daha önce hücre dizilerinde yapılan bir çalışmada tüm MPM dizilerinde yüksek bulunmuştur ancak, proapoptotik bir protein olmasına rağmen, fonksiyonel olarak yetersiz olduğu gibi bir yorum yapılmıştır.

Tartışma-2

• Şu ana dek yapılan çalışmalarda protein ekspresyonları ile yaşam süresi arasındaki ilişki sadece bir çalışmada işlenmiştir. Buna göre Bax ya da Bcl-2 ile yaşam süresi arasında bir ilişki kurulamamıştır.

• Bizim çalışmamızda ise Bax ekspresyonu ile yaşam süresi arasında yalnızca erionit grubunda ters bir ilişki saptanmıştır.

Tartışma-3

• Bax’ın proapoptotik bir protein olması nedeniyle bu bilgi beklenmeyen bir bulgu gibi algılanabilir ancak daha önce Narasimhan ve ark.nın bulgularını destekler biçimde Bax’ın özellikle erionitle oluşan MPM’de nonfonksiyonel olması ya da diğer antiapoptotik proteinlerin bu yolu ara yol olarak kullanıyor olması muhtemeldir.

• Bu erionit grubunda apoptotik mekanizmalardaki olası bir farklılığa işaret edebilir ve ileri araştırmaların gerekliliğini vurgular.

Tartışma-4

• Fas sisteminin MPM deki etkilerini çalışan yayınların sayısı son derece azdır. Stewart ve ark. Fas/Fas L yolunun MPM’de intakt olduğunu ve kemoterapötikler ile indüklenebileceğini belirtmişlerdir.

• Bizim çalışmamızda Fas ekspresyonu yok denecek kadar sınırlıdır. Bu bulgu adenokarsinomlar için de geçerlidir. Fas ligand ise oldukça iyi eksprese olmuştur.

Sonuç

• Sonuç olarak bulgularımız Bcl-2’nun MPM tümör biyolojisine katkıda bulunmadığını, Bax ekspresyonunun sadece erionit grubunda kötü prognoz kriteri olduğunu göstermektedir.

• Bu bulgu erionitle oluşan MPM’nın asbestle oluşan MPM’dan farklı olduğuna işaret edebilir.

• Artmış Fas Ligand ekspresyonu MPM grubunda iyi prognoz ile ilişkilidir.

• Bu bulguların desteklenmesi amaçlı erionit ve asbestle indüklenmiş MPM hücre dizilerinde yapılan ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.