Dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong vài loại thực phẩm tươi sống bằng LC/MS/MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

TRẦN THỊ HỒNG

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG

KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG

MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN

ĐỊA BÀN HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG KHỐI PHỔ LC/MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

---------------------

TRẦN THỊ HỒNG

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI DƢ LƢỢNG

KHÁNG SINH NHÓM NITROFURAN TRONG MỘT

SỐ LOẠI THỰC PHẨM TƢƠI SỐNG TRÊN ĐỊA BÀN

HÀ NỘI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

KHỐI PHỔ LC/MS/MS

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ THỊ HỒNG HẢO

Hà Nội – 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................... 3

1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran ....................................................... 3

1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì? ...................................................................................... 3

1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran ................................................................................. 3

1.2. Tác dụng cua các chất kháng sinh nhóm nitrofuran…………………………….6

1.3. Dƣ lƣợng khang sinh nhom nitrofuran trong thực phẩm ..................................... 6

1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV ....................................................... 6

1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay-

ELISA) ........................................................................................................................ 7

1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS .............................................. 8

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 11

2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu ..................................................... 11

2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu ...................................................................... 11

2.1.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 11

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 12

2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ................................................................. 12

2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu .................................................................................. 18

2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................ 23

2.3.1. Dụng cụ, thiết bị .............................................................................................. 23

2.3.2 Hóa chất, chất chuẩn ........................................................................................ 24

2.3.3 Pha chế chất chuẩn ........................................................................................... 25

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 27

3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS ......... 27

3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ ..................................................................... 27

3.1.2. Lựa chọn cột tách ............................................................................................ 29

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient ....................................................................... 30

3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu .......................................................................... 33

3.2. Thâm đinh phƣơng phap .................................................................................... 38

3.2.1 Tính đăc hiệu .................................................................................................... 38

3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn ............................................................................... 38

3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng cua phƣơng pháp ......................... 43

3.2.3. Độ lăp lại và độ thu hồi ................................................................................... 46

KẾT LUẬN ............................................................................................................... 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56

DANH MỤC CAC BẢNG

STT Nội dung Trang

Bảng 1.1 Câu truc hoa hoc cua môt sô chât nhom nitrofuran

đƣơc xac đinh trong đê tai

4

Bảng 3.1 Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 27

Bảng 3.2 Kết quả bắn phá các ion mẹ 28

Bảng 3.3 Năng lƣợng bắn phá và các ion con cua các chất

chuyển hóa nitrofuran

29

Bảng 3.4 Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng

chiết lỏng – lỏng

35

Bảng 3.5 Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng

chiết pha rắn

37

Bảng 3.6 So sanh độ thu hồi cua 2 quá trình chiết 37

Bảng 3.7 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn 41

Bảng 3.8 Phƣơng trình hồi quy 4 nitrofuran không sử dụng nội

chuẩn

43

Bảng 3.9 Giới hạn phát hiện cua AOZ trên nền mẫu thịt 44

Bảng 3.10 Giới hạn phát hiện cua AMOZ trên nền mẫu thịt 45

Bảng 3.11 Giới hạn phát hiện cua AHD trên nền mẫu thịt 45

Bảng 3.12 Giới hạn phát hiện cua SEM trên nền mẫu thịt 46

Bảng 3.13 Độ lăp lại và độ thu hồi cua các nitrofuran trên nền

mẫu thịt lợn tại 1 ppb

47


mẫu thịt lợn tại 1,5 ppb

48


mẫu thịt lợn tại 2 ppb

49

Bảng 3.16 Kết quả phân tích trên mẫu thực 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Nội dung Trang

Hình 2.1 Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ 13

Hình 2.2 Sơ đồ phân tích khối phổ 3 tứ cực 16

Hình 2.3 Các bƣớc cua quá trình chiết pha rắn 19

Hình 3.1 Săc đô hôn hơp chuân khi chay chê đô gradient

1 ở nồng đồ 20 ng/ml

30



31



31



32



32

Hình 3.6 Săc đô mâu thit lơn thêm chuân hôn hơp

nitrofuran tai mƣc nông đô 20 ng/ml sƣ dung

quy trinh chiêt long - lỏng

35


nitrofuran tai mƣc nông đô 20 ng/ml sƣ dung

quy trinh chiêt pha răn

38

Hình 3.8 Đƣờng chuẩn AOZ sử dụng nội chuẩn 39

Hình 3.9 Đƣờng chuẩn AMOZ sử dụng nội chuẩn 39

Hình 3.10 Đƣờng chuẩn SEM sử dụng nội chuẩn 40

Hình 3.11 Đƣờng chuẩn AHD sử dụng nội chuẩn 40

Hình 3.12 Đƣờng chuẩn AOZ không sử dụng nội chuẩn 41

Hình 3.13 Đƣờng chuẩn AMOZ không sử dụng nội chuẩn 42

Hình 3.14 Đƣờng chuẩn AHD không sử dụng nội chuẩn 42

Hình 3.15 Đƣờng chuẩn SEM không sử dụng nội chuẩn 43


nitrofuran tai mƣc nông đô 1 ng/g

47


nitrofuran tai mƣc nông đô 1,5 ng/g

48


nitrofuran tai mƣc nông đô 2 ng/g

49

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

CAD Collision Gas Presure Áp suất khí mang trong tứ cực Q2

CE Collision Energy Thế áp vào tứ cực Q

CUR Curtain Gas Khí mang

CXP Collision Cell Exit Potential Thế áp giữa tứ cực Q2 và Q3

DP Declustering Potential Thế đầu vào áp vào màn chắn

EP Entrance Potential Thế áp vào nguồn ion mẹ

ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử

EU European Union Liên minh châu Âu

GS1 Ion Source Gas 1 Áp suất khí hai bên đầu phun

GS2 Ion Source Gas 2 Áp suất cua luồng khí nóng

HPLC High performance liquid

chromatography Sắc kí lỏng hiệu năng cao

IP Identification point Điêm nhân dang

IS IonSpray Voltage Thế ion hóa

LC – MS Liquid chromatography –

mass spectrometry Sắc kí lỏng khối phổ

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quality Giới hạn định lƣợng

MeOH Methanol Methanol

MRPL Minimum required

performance limit

Yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ nhất

cua phƣơng pháp

RSD% Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối

SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn

TEM Temperature Nhiệt độ cua nguồn khí nóng thổi vào

1

MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm là vấn đề đang đƣợc cả xã hội quan tâm, đăc biệt

là ở đô thị và các khu công nghiệp, khi ngày càng có nhiều tác nhân độc hại bị phát

hiện trong thực phẩm khiến dƣ luận lo ngại. Tuy nhiên trong lĩnh vực sản xuất kinh

doanh nói chung và trong chăn nuôi gia súc, gia cầm nói riêng còn nhiều vấn đề

đáng lo ngại, nhƣ việc quản lý sử dụng thuốc kháng sinh còn lỏng lẻo, tình trạng sử

dụng các chất bổ trợ trong chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dƣ các hóa

chất, kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, gây nguy hại nghiêm trọng đến sức

khỏe ngƣời tiêu dùng.

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp thƣờng đƣợc sử dụng cho vao

thức ăn gia súc đê kích thích tăng trƣởng và là phƣơng pháp điều trị dự phòng, điều

trị các bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa gây ra bởi Escherichia và Salmonella trong

chăn nuôi gia súc, gia cầm. Chúng cũng đã đƣợc sử dụng để điều trị nhiễm trùng do

vi khuẩn và sinh vật đơn bào trong nuôi trồng thuy sản...Vì vậy sự tồn dƣ cua

chúng gây tác hại cho sức khỏe con ngƣời, đăc biệt là gây ung thƣ và đột biến ở

ngƣời. Năm 2002 – 2003 phát hiện dƣ lƣợng chất chuyển hóa cua nitrofuran trong

số lƣợng lớn các mẫu từ gia cầm và nuôi trồng thuy sản các sản phẩm nhập khẩu

vào Châu Âu từ một số khu vực Đông Nam Á và các nƣớc Nam Mỹ. Từ đó đã dẫn

đến lệnh cấm sử dụng nitrofuran trong sản xuất thực phẩm động vật tại nhiều quốc

gia bao gồm Mỹ, Canada và EU... Các nƣớc này đã đăt lệnh cấm trên tất cả các loại

thực phẩm nhập khẩu có chứa dƣ lƣợng nitrofuran. Tháng 3 năm 2003 EU đã quy

định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29]. Năm 2002, ở Việt Nam, Bộ nông

nghiệp và phát triển nông thôn đã quyết định cấm sản xuất, nhập khẩu, lƣu thông và

sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh doanh TACN trong

đó có nitrofuran [9].

Hiện nay việc sử dụng dƣ lƣợng kháng sinh sai mục đích đang ở mức báo động

ảnh hƣởng tới sức khỏe con ngƣời và động vật. Vì vậy với nhu cầu bức thiết về vấn

2

đề đảm bảo VSATTP, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phát triển phƣơng pháp

“Xác định đồng thời dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong một số loại

thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối

phổ LC/MS/MS”.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về kháng sinh nhóm nitrofuran

1.1.1. Nhóm nitrofuran là gì?

Nitrofuran là một nhóm kháng sinh tổng hợp có chứa nhóm 5-nitro, thƣờng

đƣợc sử dụng làm thức ăn gia súc kích thích sự tăng trƣởng, chu yếu đối với gia súc

(nhƣ gia cầm, lợn), nuôi trồng thuy sản (cá, tôm) và nuôi ong đê điều trị các vi

khuẩn và sinh vật đơn bào nhiễm trùng nhƣ viêm ruột tiêu hóa gây ra bởi

Escherichia coli và Salmonella spp, gia cầm bệnh tả và bênh cầu trùng màu đen đầu

[12].

1.1.2. Các chất nhóm nitrofuran

Các chất nhóm n itrofuran bao gôm Furazolidone, furaltadone, furazolidone,

nitrofurazone, khi đi vao cơ thê sinh vât nó tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng

ứng (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) liên kêt trong cac mô tôn tai trong nhiêu tuân sau

khi sƣ dung [12]. Ví dụ nhƣ quá trình chuyển hóa cua nitrofurazone nhƣ sau :

4

Bảng 1.1: Câu truc hoa hoc cua môt sô chât nhom nitrofuran đƣơc xac đinh trong đê tai

STT Các chất nitrofuran Công thƣc

phân tƣ

Khôi

lƣơng

phân

tƣ

(g/mol)

Công thƣc câu tao

1

AOZ

3-amoni-2-oxazolidinone

C3H6N2O2 102,09

2

NPAOZ

3-(2-nitrobenzylidenamino)-

2-oxazolidinone)

C10H9N3O4 235,2

3

AMOZ

3-amoni-5-morpholinomethyl

-1,3-oxazolidinone

C8H15N3O3 201,22

4

NPAMOZ

5-(morpholinomethyl)-3-(2-

nitrobenzylidenamino)-2-

oxazolidinone

C15H18N4O5 334,33

5 AHD

1-aminohydantoin C3H5N3O2 116,05

6

NPAHD

[3-(2-nitrobenzylidenamino)

-2,4-imidazolidinedione]

C10H8N4O4 248,19

5

7 SEM

semicarbazide

CH5N3O

75,08

8

NPSEM

3[(2-nitrophenyl)methylene]-

hydrazinecarboxamide

C8H8N4O3

208,174

1.2. Tác dụng của các chất kháng sinh nhóm nitrofuran

McCracken va cac công sƣ 1995, Nouws và Laurensen 1990 chỉ ra rằng các

hợp chất nhóm nitrofuran sau khi vào cơ thể tạo thành các chất chuyển hóa tƣơng

ứng liên kết trong các mô.

Về măt cơ chế tác dụng, các chất chuyển hóa tƣ nitrofuran đã kìm hãm hoăc

phá huy các hệ thống men điều hòa trao đổi chất ở vi khuẩn. Do đó vi khuẩn không

phát triển va không sinh sản đƣợc nữa. Tác dụng tốt với vi khuẩn gram âm và gram

dƣơng. Đồng thời còn tác dụng cả với nguyên sinh động vật, một số chất có tác

dụng tôt trong viêc giêt trƣ giun đũa [7].

Vơi n ồng độ thấp, nitrofuran có tác dụng kháng sinh, nồng độ cao có tác

dụng diệt khuẩn.

Theo nhiều báo cáo, nitrofuran tác dụng rất tốt trong viêc diêt khuân

salmonellosis, colisepticeamia. Nitrofuran còn có tác dụng kích thích dinh dƣỡng.

Trộn nitrofuran với thức ăn, theo tỉ lệ thích hợp se giúp cho gà và lợn còn tăng trọng

nhanh.

Nitrofuran ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời nhƣ gây ung thƣ và đột biến

[7], khi thƣc phâm co tôn dƣ nitrofuran va cac dân xuât cua no .

Do đó hâu hêt cac nƣơc trên thê giơi đa câm sƣ dung khang sinh nhom

nitrofuran trong chăn nuôi. Ở Việt Nam, bô Nông nghiêp va phat triên nông thôn đa

quyêt đinh câm sƣ dung ni trofuran cho vao trong thƣc ăn chăn nuôi [9]. EU đã quy

6

định yêu cầu giới hạn nhỏ nhất cần thực hiện phƣơng pháp (MRPL) đối với các chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran là 1 µg/kg [29].

1.3. Dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran trong thực phẩm

Từ năm 2002 – 2003 nitrofuran thƣờng xuyên đƣơc phát hiện thây trong thịt

gia cầm và các sản phẩm nuôi trồng thuy sản nhập khẩu vào các nƣớc EU từ Thái

Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Việt Nam, Ecuador và Brazil [25].

Hơn nữa, dƣ lƣợng nitrofuran cũng đƣợc tìm thấy trong sản phẩm gia súc và

gia cầm ở Châu Âu nhƣ: Bồ Đào Nha, Ý, Hy Lạp, Romania và Bulgari. Sau đó EU

đã kiểm tra và cho thấy nitrofuran ô nhiễm trong các sản phẩm có nguồn gốc từ hơn

9 quốc gia trong năm 2007, tỷ lệ mắc cao nhất là từ Ấn Độ (37%), Trung Quốc

(37%), Bangladesh (10%) và Thái Lan (5%) trong một loạt cá sản phẩm bao gồm

tôm, mật ong và thịt hộp [25].

Từ tháng 10/2006 đến tháng 5/2007, FDA liên tục phát hiện thuy sản nhập

khẩu từ Trung Quốc có nhiễm nitrofuran. Kết quả lấy trên các sản phẩm tôm, cá trê,

cá ba sa..cho thấy, 22/89 mẫu (chiếm 22%) bị phát hiện có chất cấm nitrofuran

trong tôm [11].

Ở Việt Nam theo kết quả khảo sát cua TS . Nguyên Quôc Ân , phó trƣởng

phòng quản lý thuốc , cục thú y vào năm 2007 đa phát hiện 5 mâu thuy san nuôi lây

tại ao nuôi nhiễm SEM (3 mâu tôm, 1 mâu ca va 1 mâu cua lôt) vơi ham lƣơng tƣ 0

– 3,55 ng/g. Năm 2008 phát hiện 1 mâu tôm the chân trăng tai Phu My – Bình Định

nhiêm AOZ vơi ham lƣơng 12,6 ng/g; 2/754 mâu cua lôt tai Cân Guôc – Long An

nhiêm SEM vơi ham lƣơng tƣ 2 – 2,2 ng/g [1].

1.4. Các phƣơng pháp xác định kháng sinh nhóm nitrofuran

Hiên nay co nhiêu phƣơng phap đê xac đinh khang sinh nhom nitrofuran , bao

gôm: phƣơng phap săc ky long v ới detector UV , phƣơng phap vi sinh (kỹ thuật

Elisa), phƣơng phap săc ky long vơi detector MS/MS.

1.4.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector UV

Một số tác giả đã sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng với detector tử ngoại khả

kiến (HPLC-UV-VIS) để phân tích kháng sinh nhóm nitrofuran và các dẫn xuất cua

7

nó trong một số đối tƣợng thực phẩm. Horne và cộng sự, đã xây dựng phƣơng pháp

xác định AOZ, AMOZ trong gan lợn sử dụng HPLC – UV. Phƣơng pháp dựa trên

sự dẫn xuất các nitrofuran với 2-nitrobenzaldehyde, sau đó chiết với ethyl acetate,

làm sạch bằng n-hexan và phân tích bằng HPLC-UV sử dụng cột C18 kêt hơp vơi

detector UV ơ bƣơc song 275nm. Giới hạn phát hiện cua phƣơng pháp là 5 và 10

µg/kg tƣơng ứng cho AOZ và AMOZ vơi độ thu hồi trong khoảng 71-101% [18].

Tác giả Cooper và cộng sự cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định AOZ,

AMOZ, AHD, SEM trong gan và thận cua lợn dùng HPLC-UV đã tách đƣợc 4 chất

chuyển hóa nhóm nitrofuran. Giới hạn phát hiện cua phƣơng pháp là từ 2 – 5 µg/kg

[21].

Phƣơng pháp HPLC -UV co ƣu điêm là dễ thực hiện , và có thể ứng dụng

phân tich rông rai . Tuy nhiên phƣơng phap lai không đap ƣng đƣơc yêu câu vê đô

nhạy để phân tích các nitrofuran trong thực phẩm vì hiện nay giới hạn cần phải đạ t

tơi (MRPL) là 1 µg/kg.

1.4.2. Phƣơng pháp phân tích vi sinh (enzyme-linked immunosorbent assay-

ELISA)

Hiện nay, ELISA đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu nhƣ

y học, nông nghiệp và đăc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lƣợng

các sản phẩm sinh học. Nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đăc hiệu giữa

kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme, enzyme

se thuy phân thành một chất có màu .

Phòng thí nghiệm randox cua Anh đa nghiên cứu xác định các chất chuyển

hóa nhóm nitrofuran sử dụng phƣơng phap Elisa: mẫu đƣợc đồng nhất, thuy phân

và dẫn xuất bằng o-NBA trong môi trƣơng axit HCl , trung hòa axit bằng NaOH,

chiết và làm sạch mẫu bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện cua

phƣơng pháp từ 0,2 – 0,6 ng/g [28].

Vass và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật Elisa trực tiếp sử dụng kháng thể

đăc hiệu cho NPSEM, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định SEM trong trứng

với quy trình xử lý mẫu: mẫu đƣợc đồng nhất, thuy phân và dẫn xuất bằng o-NBA

http://vi.wikipedia.org/wiki/Y_h%E1%BB%8Dc

http://vi.wikipedia.org/wiki/N%C3%B4ng_nghi%E1%BB%87p

http://vi.wikipedia.org/wiki/Sinh_h%E1%BB%8Dc

8

trong môi trƣơng axit HCl , sau đo trung hòa bằng NaOH, chiết và làm sạch mẫu

bằng ethyl acetate và n-hexane. Giới hạn phát hiện cua phƣơng pháp là 0,13 µg/kg,

CCα = 0,3 µg/kg [25].

Diblikova và cộng sự (2005) giơi thiêu kỹ thuật Elisa trực tiếp, sử dụng

kháng thể đăc hiệu cho NPAOZ, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AOZ

trong tôm, thịt gà, thịt lợn, thịt bò với CCβ là 0,4 µg/kg, độ thu hồi từ 66 – 119%

[20].

Lui và cộng sự (2007) giơi thiêu kỹ thuật Elisa gián tiếp, sử dụng kháng thể

NFT, kháng thể đƣợc gắn 1 enzym HRP xác định AHD trong nƣớc. Giới hạn phát

hiện là 0,2 µg/l, độ thu hồi từ 88 – 103% [31].

Tƣơng tự Chang và cộng sự (2008) xác định trong gan lợn, gan gà và cá với

giới hạn phát hiện lần lƣợt là 0,19; 0,24; 0,18 µg/kg [15].

Phƣơng phap Elisa đap ƣng đƣơc yêu câu vê đô nhay , đơn gian dê thƣc hiên ,

tuy nhiên đô đăc hiêu bi giơi han vi phai đanh dâu cho tƣng khang thê chuyên biêt

cho tƣng đôi tƣơng.

1.4.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

Đây là một phƣơng pháp nhanh, nhạy để xác định đồng thời dƣ lƣơng

nitrofuran. Sau khi qua cột tách, chất phân tích đƣợc hóa hơi, các hợp chất hữu cơ

trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh cua phân tử mang điện

dƣơng hoăc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đƣa sang bộ phận tách theo

khối lƣợng. Từ các tín hiệu thu đƣợc, dựa vào khối lƣợng ion phân tử, dựa vào đồng

vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ

liệu các ion và mảnh ion, ngƣời ta định tính và định lƣợng đƣợc chất phân tích một

cách chính xác.

Ở Việt Nam năm 2004, Bộ Thuy sản (nay là Bộ Nông nghiệp và phát triển

nông thôn) đa ban hành TCN 194:2004 xác định các chất chuyển hóa thuộc nhóm

nitrofuran trong thuy sản và sản phẩm thuy sản bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối

phổ phân tich dƣ lƣợng liên kết với mô cua các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran

trong sản phẩm thuy sản đƣợc thuy phân bằng axit clohydric loãng để thu đƣợc

9

mạch nhánh cua các chất nhóm nitrofuran. Các mạch nhánh này đƣợc dẫn xuất bằng

2-nitrobenzaldehyde, sau đó đƣa pH đến 7 và đƣợc chiết bằng ethyl axetat. Dịch

chiết đƣợc thổi khô bằng N2 đến cạn, hòa tan căn, sau đó đo dung dich mâu nay

băng hệ thống LC/MS/MS vơi pha đông kênh A la axit acetic , kênh B la acetonitril .

Giới hạn phát hiện cua phƣơng pháp là 1 µg/kg [10].

Năm 2002 phòng thử nghiệm thức ăn chăn nuôi cua Thái Lan đƣa ra quy

trình phân tích 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran (AOZ, AMOZ, AHD, SEM)

bằng LC/MS/MS giới hạn phát hiện lần lƣợt cua từng chất là AHD 0,1 µg/kg; AOZ

0,04 µg/kg; SEM 0,15 µg/kg; AMOZ 0,02 µg/kg [29].

Tác giả Pascal Mottier và cộng sự, xác định 4 chất chuyển hóa nhóm

nitrofuran trong thịt bằng LC/MS/MS vơi pha đông kênh A la axit acetic 0,025%,

kênh B la acetonitril , sƣ dung quy trinh làm sạch bằng cột chiết pha rắn polymeric

trƣớc khi phân tích băng LC/MS/MS và thu đƣợc CCα từ 0,11 – 0,21 µg/kg, CCβ từ

0,19 – 0,36 µg/kg [26].

Trong tai liêu [25] cua tác giả M.Vass, tác giả Boket và cộng sự (2007) xác

định các chất chuyển hóa nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS, CCα lần lƣợt cua

từng chất AOZ, AMOZ, AHD, SEM là 0,03; 0,05; 0,22; 0,2. Độ thu hồi từ 95,2 –

102,1 %.

Leitner và cộng sự xác định các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt

gia súc, gia cầm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS vơi pha đông

kênh A la amoniacetat 10mM, kênh B la methanol , sƣ dung qua trinh lam sach bằng

cột chiết pha rắn SPE với chất hấp thụ polystyrene đƣợc kết hợp bằng cách thuy

phân các chất chuyển hóa hình thành liên kết trong các mô và đƣợc dẫn xuất bằng

2-nitrobenzaldehyde. Giới hạn phát hiện cua phƣơng pháp là 0,5 – 5 ng/g; giới hạn

định lƣợng từ 2,5 – 10 ng/g [12].

Verdon và cộng sự năm 2007 cũng giới thiệu phƣơng pháp xác định các

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thịt lợn bằng LC/MS/MS vơi côt C 18, pha

đông kênh A la amonifomiat 1mM, kênh B la methanol , sử dụng phƣơng phap chiêt

lỏng – lỏng thu đƣơc CCα = 0,08 – 0,54 µg/kg và CCβ = 0,10 – 0,66 µg/kg [19].

10

Tác giả C.Bock và cộng sự đã thẩm định phƣơng pháp xác định dƣ lƣợng 4

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong trứng bằng LC/MS/MS vơi CCα từ 0,03 –

0,22 µg/kg [14].

Các tác giả Chung-Wei Tsai, Chuan-ho Tang và Wei-Hsien Wang đã xác

định các chất chuyển hóa nitrofuran trên LC/MS/MS với pha đông kênh A la

amoniacetat 20mM, kênh B la methanol co giới hạn định lƣợng 1 µg/kg vơi CCα =

0,19 – 0,43 µg/kg. Khoảng tuyến tính từ 1 – 10 µg/kg [16].

Tác giả Lech Rodziewicz (2008), xác định các chất chuyển hóa nitrofuran

trong sữa bằng LC/MS/MS vơi pha đông kênh A la amoniacet at 0,5mM, kênh B la

methanol. Phƣơng pháp có hê sô biên thiên nho hơn 9,3%, độ tái lập nội bộ nhỏ hơn

13%, CCα từ 0,12 – 0,29 µg/kg, CCβ từ 0,15 – 0,37 µg/kg [22].

Tác giả Caroline Douny và cộng sự (2012), đã xác định các chất chuyển

hóa nhóm nitrofuran, nghiên cứu ứng dụng để đánh giá furanzolidone trong tôm sú

ở Việt Nam. Mẫu đƣợc đồng nhất, thuy phân và dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte,

chiết lỏng – lỏng bằng etylacetat trƣớc khi xác định băng hệ thống LC/MS/MS vơi

pha đông kênh A la axit acet ic 0,1%, kênh B la acetonitril thu đƣơc CCα từ 0,08 –

0,36 µg/kg, CCβ từ 0,12 – 0,61 µg/kg [13].

Tóm lại: Các phƣơng pháp (phƣơng phap săc ky long vơi detector UV -VIS, phƣơng

pháp hóa sinh Elisa , phƣơng phap s ắc ký lỏng với detector MS /MS) đều có điểm

chung là thuy phân để đƣa các chất chuyển hóa nitrofuran liên kết trong các mô

thành dạng tự do sau đó sử dụng 2-nitrobenzaldehyde để chuyển nitrofuran thành

các dẫn xuất tƣơng ứng. Các dẫn xuất này sau đó đƣợc chiết lỏng lỏng hoăc chiết

pha rắn và phân tích bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ. Phƣơng pháp này có

ƣu điểm là có độ nhạy rất tốt, thƣờng từ 0,1 µg/kg có độ chọn lọc cao và có độ

chính xác đáp ứng để xác định nitrofuran trong thực phẩm. Do đó trong nghiên cứu

đề tài chúng tôi thống nhất lựa chọn phƣơng pháp LC-MS/MS với quá trình thuy

phân bằng axit clohydric và dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde để xác định các chất

chuyển hóa cua nitrofuran.

11

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu

2.1.1. Đối tƣợng, mục tiêu nghiên cứu

Đối tƣợng nghiên cứu là các chất chuyển hóa cua nitrofuran, bao gồm: AOZ,

AMOZ, SEM và AHD.

Vật liệu nghiên cứu là sản phẩm thực phẩm tƣơi sống bao gồm thịt và gan

cua gia súc gia cầm.

Mục tiêu chung cua đề tài là nghiên cứu xây dƣng phƣơng pháp xác định

đồng thời 4 chất chuyển hóa nhóm nitrofuran: AOZ, AMOZ, AHD, SEM trong thực

phẩm tƣơi sống bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS. Các mục tiêu cụ

thê nhƣ sau:

- Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời 4 chất chuyển hóa cua nitrofuran trong

thực phẩm tƣơi sống bằng LC-MS/MS.

- Ứng dụng phƣơng pháp để xác định các chất chuyển hóa cua nitrofuran trong thực

phẩm tƣơi sống cụ thể trong thịt lợn, thịt bò, thịt gà, gan.

2.1.2. Nội dung nghiên cứu

2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp

Khảo sát phƣơng pháp bao gồm:

Điều kiện và thông số vận hành máy LC/MS/MS,

Điều kiện tách chiết lây chât phân tich.

Thẩm định phƣơng pháp:

Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ,

Khoảng tuyến tính,

Độ chụm (độ lăp lại),

Độ đúng (độ thu hồi, độ chệch).

2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp

Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng kháng sinh nhóm

nitrofuran cụ thể là các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống

đang ban trên địa bàn Hà Nội.

12

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ

2.2.1.1. Nguyên tắc chung về phƣơng pháp sắc kí lỏng HPLC

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và

pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn). Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách

dƣới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phan tích đƣợc phân bố

liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc

phân tử và tính chất lí hóa cua các chất khác nhau, nên khả năng tƣơng tác cua

chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau. Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ

khác nhau và tách ra khỏi nhau thành từng lớp cua mỗi chất.

2.2.1.2. Pha tĩnh trong HPLC [8]

Trong LC, pha tĩnh (stationary phase) chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ

tách hỗn hợp chất phân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kích thƣớc hạt rất nhỏ, từ

3-7µm. Tuỳ theo bản chất cua pha tĩnh, trong phƣơng pháp sắc ký lỏng pha liên kết

thƣờng chia làm 2 loại: sắc ký pha thƣờng (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-

HPLC). Khi dùng chất nhồi cột có cỡ hạt nhỏ hơn đƣờng kính hạt 1,7 µm, chịu

đƣợc áp suất cao lên tới 700 atm làm tăng độ phân giải và giảm thời gian phân tích

đó là những ƣu điểm cua sắc ký lỏng UPLC (Ultra Performance Liquid

Chromatography).

2.2.1.3. Pha động trong HPLC [8]

Có thể chia pha động làm hai loại: là pha động có độ phân cực cao và pha

động có độ phân cực thấp.

Loại thứ nhất có thành phần chu yếu là nƣớc, tuy nhiên để phân tích các chất

hữu cơ, cần thêm các dung môi để giảm độ phân cực. Pha động loại này đƣợc dùng

trong sắc ký pha ngƣợc.

Loại thứ hai là các dung môi ít phân cực nhƣ cychlorpentan, n-pentan, n-

heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), CCl4, toluene…Tuy nhiên

pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng đƣợc khả năng rửa giải, ngƣời ta

13

thƣờng phối hợp 2 hay 3 dung môi để có đƣợc dung môi có độ phân cực từ thấp đến

cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động đôi khi diễn ra

theo thời gian, trƣờng hợp này ngƣời ta gọi là chƣơng trình rửa giải gradient.

2.2.1.4. Detector trong HPLC [5]

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy cua phƣơng pháp. Đối

vơi cac chât chuyên hoa nhom nitrofuran co khôi lƣơng phân tƣ thâp không co kha

năng hâp thu tia UV , có thể tạo dẫn xuất với 2-nitrobenzaldehyde tao san phâm co

khả năng hấp thụ tia UV và đƣợc xác định bằng detector HPLC -UV.

Hiên nay, detector có thể cung cấp thông tin định tính, định lƣợng và cấu trúc

cua các chất phân tích là detector khối phổ.

2.2.1.5. Hệ thống detector khối phổ (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lƣợng phân tử cua

các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lƣợng

và điện tích (m/z) cua chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích

cua chúng nhƣ loại bỏ electron, proton hóa,…Các ion tạo thành này đƣợc tách theo

tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lƣợng hoăc cấu trúc phân

tử cua hợp chất.

Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ

Cấu tạo cua một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị

phân tích khối và bộ phận phát hiện. Trƣớc hết, các mẫu đƣợc ion hóa trong nguồn

ion, sau đó đƣa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z. Các tín

hiệu thu đƣợc se chuyển vào máy tính để xử lí và lƣu trữ.

Ƣu điểm cua phƣơng pháp là:

Giúp phát hiện hầu hết các chất tan

14

Độ nhạy cao

Có thể giúp xác định đƣợc các chất tan ngay khi độ phân giải chƣa tốt.

Hữu hiệu cho nghiên cứu các hợp chất.

Cung cấp đầy đu thông tin về cấu trúc và khối lƣợng

2.2.1.5.1. Bô nguồn ion (Ion sources)

Chất phân tích ra khỏi cột sắc ký ở dạng lỏng, khó khăn lớn nhất ở đây là

phải chuyển chất phân tích từ pha lỏng sang pha hơi. Theo kỹ thuật ion hoá cua

LC/MS, năng lƣợng cua máy trực tiếp tác động vào pha lỏng hoăc rắn để tạo thành

ion ở thể hơi. Trong máy khối phổ, có rất nhiều cách để ion hoá phân tử và nguyên

tử cua mẫu ở trạng thái khí hoăc hơi. Sau đây là một số kỹ thuật thƣờng dùng:

a) Ion hóa bằng dòng electron (Electron Ionization – EI):

Trong phổ EI-MS, dòng electron có năng lƣợng cao đƣợc phát ra từ sợi dây

catot vonfram hoăc reni đƣợc đốt nóng sinh ra dòng electron chuyển động vuông

góc với mẫu về phía anot xảy ra sự va chạm biến các mẫu thành các ion phân tử

hoăc ion mảnh. Thông thƣờng các hợp chất hữu cơ có thế ion hóa nằm trong khoảng

8 eV đến 15 eV nhƣng để đạt đƣợc hiệu quả cao thƣờng áp dụng dòng 70 eV .

ABC + e → ABC+●

+ 2e (1) (ion phân tử)

ABC+●

→ A+ + BC

● (2) (ion mảnh, gốc tự do, mảnh trung hòa)

ABC+●

→ A+ + B +C

●

Ƣu điểm: áp dụng cho phân tử nhỏ, cho cơ sở dữ liệu phổ. Tuy nhiên, một số

hợp chất dễ phân mảnh thì thời gian sống ngắn, nhiều mảnh nhỏ hay ít hoăc không

thu đƣợc ion phân tử và đòi hỏi hợp chất phải dễ bay hơi.

b) Chế độ ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization- ESI)

Nguyên tắc: biến đổi ion ở thể lỏng thành ion ở thể hơi, dung dịch mẫu đƣợc

dẫn vào điện trƣờng mạnh và duy trì ở hiệu điện thế cao 4kV. Tại đây, dung dịch

mẫu bị chuyển thành các giọt nhỏ tích điện và đƣợc hút tĩnh điện tới lối vào cua bộ

15

phân tích khối phổ. Các giọt tích điện trƣớc khi vào bộ phân tích khối phổ se kết

hợp với dòng khí khô để làm bay hơi hết dung môi.

Ƣu điểm cua ESI là có hai chế độ bắn phá: bắn phá chế độ ion dƣơng và ion

âm, ESI-MS thích hợp cho cả phân tử có phân tử khối nhỏ (khoảng 100-150 amu)

cũng nhƣ phân tử khối lớn cua các phân tử sinh học, các hợp chất khó bay hơi,

không bền nhiệt, phân cực và không phân cực.

c) Chế độ ion hóa hóa học áp suất khí quyển (Atmospheric Presure Chemical

Ionization-APCI)

Sự ion hóa trong APCI phụ thuộc vào sự va chạm cua dòng ion dƣơng hay

âm với phân tử, mẫu bị ion hóa bởi phản ứng với các ion đƣợc tạo ra từ các chất khí

nhƣ methan (ở dạng CH5+), amoniac (ở dạng NH4

+)...

Khi sử dụng khí methan làm chất khí phản ứng ta có các quá trình ion hóa

nhƣ sau:

Quá trình 1:

CH4 + e → CH4+●

+ CH3+ + CH2

+

CH4+●

+ CH4 → CH5+ + CH3

●

CH3+ + CH4 → C2H5

+ + H2

Quá trình 2: ion mảnh va chạm trực tiếp với phân tử mẫu.

CH5+ + M → CH4 + (MH)

+ (chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1)

C2H5+ + M → (MH)

+ + C2H4

(chuyển proton thành dƣơng m/z = M+1)

C2H5+ + M → (MC2H5)

+ (thêm ái lực điện tử thành dạng m/z = M+29)

C2H5+ + M → (M-H)

+ (hydrua chuyển thành dạng m/z = M-1)

Sự thay đổi chất khí trong phản ứng APCI-MS cho phép thay đổi tính chọn

lọc cua sự ion hóa và mức độ phân mảnh. Đây là phƣơng pháp có độ nhạy cao cho

16

phép phân tích định lƣợng ở mức picomol tới femtomol, thích hợp cho những chất

có phân tử khối 1000 đơn vị nhƣng đòi hỏi chất phân tích phải dễ dàng bay hơi.

2.2.1.5.2. Bộ phận phân giải khối

Sau khi đƣợc ion hóa, chất phân tích đƣợc đƣa vào bộ phận phân giải khối.

Tại đây, các ion đƣợc tách ra khỏi nhau theo tỉ số m/z. Bộ phận phân tích khối đƣợc

chia thành 4 loại: bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích bẫy ion tứ cực

và bộ phân tích thời gian bay. Trong đó bộ phân tích tứ cực (Quadrupole Analyser)

và bộ phân tích bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) đƣợc sử dụng

phổ biến.

a) Bộ phân giải tứ cực (Quadrupole Analyser)

Tứ cực đƣợc cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một khoảng

trống để các ion bay qua. Một trƣờng điện từ đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng

một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF). Các tứ cực đƣợc đóng vai trò nhƣ một

bộ lọc khối. Khi một trƣờng điện từ đƣợc áp vào, các ion chuyển động trong nó se

dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trƣờng RF. Chỉ những ion có tỉ số m/z

phù hợp mới có thể có thể đi qua đƣợc bộ lọc này.

Bộ phân giải tứ cực đƣợc phát triển và cho ra đời bộ phận phân giải khối phổ

ba tứ cực (Triple Quadrupole).

Hình 2.2: Sơ đồ bộ phân giải khối phổ ba tứ cực

17

Bộ phân tích khối phổ ba tứ cực gồm một buồng va chạm (collision cell,

đƣợc xem là tứ cực thứ hai Q2) đăt ở giữa 2 tứ cực (Q1 và Q3).

Ở buồng Q1: Các ion đƣợc tách.

Ở buồng Q2: Với áp suất cao, các ion bị phân ly do va chạm với khí trơ

có măt nhƣ nitơ, argon, heli nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion

nhỏ hơn (ion con).

Ở buồng Q3: Làm nhiệm vụ tách các ion con.

b) Bộ phân giải bẫy ion tứ cực (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser)

Loại thiết bị này bao gồm một điện cực vòng (ring electrode) với nhiều điện

cực bao xung quanh, điện cực đầu cột (end-cap electrode) ở trên và ở dƣới. Trái với

lại thiết bị tứ cực ở trên, các ion sau khi đi vào bẫy ion theo một đƣờng cong ổn

định đƣợc bẫy lại cho đến khi một điện áp RF đƣợc đăt trên điện cực vòng. Các ion

khác nhau m/z sau đó trở nên không ổn định và se có hƣớng đi về phía detector. Do

điện áp RF khác nhau trong hệ thống này mà thu đƣợc một phổ khối lƣợng đầy đu

Các ion tồn tại trong bẫy có thể đƣợc chọn riêng và phân tích theo sự khác

nhau về m/z, đồng thời có thể chọn riêng và thực hiện quá trình bắn phá để thu đƣợc

các mảnh ion con từ đó thực hiện phân tích theo m/z cua ion con (khối phổ 2 lần).

Về nguyên tắc các ion con có thể tồn tại trong bẫy thời gian đu lâu để có thể thực

hiện đến MS n lần, tuy nhiên trong thực tế thƣờng chỉ có khả năng thực hiện đến

khối phổ 3 lần.

2.2.1.5.3. Bộ phận phát hiện

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân giải khối lƣợng, các ion đƣợc đƣa tới phần

cuối cua thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận phát hiện cho phép khối

phổ tạo ra một tín hiệu cua các ion tƣơng ứng từ các electron thứ cấp đã đƣợc

khuếch đại hoăc tạo ra một dòng do điện tích di chuyển. Có hai loại bộ phận phát

hiện phổ biến: bộ phận phát hiện nhân electron và bộ phận phát hiện nhân quang.

Bộ phận phát hiện nhân electron là một trong những detector phổ biến nhất,

có độ nhạy cao. Các ion đập vào bề măt dinot làm bật ra các electron. Các electron

18

thứ cấp sau đó đƣợc dẫn tới các dinot tiếp theo và se tạo ra electron thứ cấp nhiều

hơn nữa, tạo thành dòng electron.

Bộ phận phát hiện nhân quang cũng giống nhƣ thiết bị nhân electron, các ion

ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng electron. Khác với detector nhân electron,

các electron sau đó se đập vào một màn chắn photpho và giải phóng ra các photon.

Các photon này đƣợc phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động nhƣ thiết bị nhân

electron. Ƣu điểm cua phƣơng pháp này là các ống nhân quang đƣợc đăt trong chân

không nên loại bỏ đƣợc các khả năng nhiễm bẩn.

2.2.2. Phƣơng pháp xử lý mẫu

2.2.2.1. Xử lý mẫu bằng chiết lỏng lỏng [8]

Chiết lỏng – lỏng là kỹ thuật dựa trên sự phân bố khác nhau cua chất tan vào

2 pha không trộn lẫn, từ đó tách chiết chất phân tích ra khỏi nền hoăc tách các tạp

chất ra khỏi chất phân tích. Cho nên, nguyên tắc cua kỹ thuật chiết này là cho chất

tan (chất phân tích) ƣu tiên tan vào một trong hai pha lỏng không trộn lẫn, còn tạp

chất hay các chất khác ở lại trong pha kia.

Để có đƣợc kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm

bảo đƣợc các yêu cầu nhất định sau đây:

- Dung môi chiết và dịch chât mâu cân chiết gọi tắt là hai pha không đƣợc

trộn lẫn vào nhau , trong đó dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo

không làm nhiễm bẩn chất phân tích.

- Hệ số tách 1DB

DA

K

K và hiển nhiên là α càng khác 1 càng tốt. Điều

kiện tối ƣu là KDA . KDB = 1.

- Cân bằng chiết đạt đƣợc nhanh và thuận nghịch, sự phân lớp phải rõ ràng

để tách hai pha đƣợc tốt.

- Phải chọn đƣợc điều kiện chiết tối ƣu bao gồm: pH cua dung dịch mâu,

nồng độ tác nhân chiết, nồng độ thuốc thử, chất phụ gia…

2.2.2.2. Xử lý mẫu bằng chiết pha rắn [8]

19

Chiết pha rắn là một phƣơng pháp chuẩn bị mẫu để tách làm giàu và làm

sạch mẫu phân tích từ dung dịch mâu bằng cách hấp phụ lên cột chiết pha rắn. Sau

đó chất phân tích đƣợc rửa giải bằng một lƣợng nho dung môi thích hợp. Các chất

ảnh hƣởng đƣợc loại bỏ.

Cột SPE đƣợc nhồi chăt bằng những vật liệu xốp, hạt nhỏ có các nhóm chức

khác nhau. Chất lỏng qua cột dƣới tác dụng cua áp suất hoăc chân không.

Các bƣớc tiến hành trong quá trình chiết pha rắn:

Hình 2.3: Các bước của quá trình chiết pha rắn

1. Hoạt hóa chất hấp phụ pha rắn

Làm ƣớt vật liệu nhồi, solvat hóa các nhóm chức cua chất hấp phụ,

Loại không khí trong các khoảng trống trong lớp chất hấp phụ,

Không đƣợc để chất hấp phụ bị khô.

1. Mẫu và chất phân tích được chảy qua cột

Chất phân tích đƣợc làm giàu trên chất hấp phụ,

Một vài thành phần ảnh hƣởng khác cũng có thể bị giữ lại,

20

Các thành phần không bị hấp phụ bị loại ra làm sạch chất phân tích.

2. Loại bỏ các chất gây ảnh hưởng ra khỏi cột

Giữ lại chất phân tích,

Nếu mẫu là dung dịch nƣớc, sử dụng dung dịch đệm hoăc hỗn hợp nƣớc-

dung môi hữu cơ,

Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa cột có thể sử dụng

chính dung môi hữu cơ.

3. Giải hấp chất phân tích bằng dung môi thích hợp

Dung môi đƣợc chọn đăc trƣng đê phá vỡ tƣơng tác giữa chất phân tích

và chất hấp phụ với mục đích rửa giải đƣợc chất phân tích với hiệu quả

cao,

Dung môi sử dụng rửa giải đồng thời càng ít chất gây ảnh hƣởng tới phép

phân tích càng tốt.

Chất hấp phụ chiết pha rắn thƣờng đƣợc sử dụng gồm các loại:

- Chất hấp thụ pha thƣờng: Các silica trung tính, oxit nhôm,

- Chất hấp phụ pha ngƣợc: Các silica đã đƣợc ankyl hóa nhóm OH,

- Chất có khả năng trao đổi ion,

- Chất rây hay sàng lọc phân tử theo độ lớn, kích thƣớc,

- Chất hấp phụ pha khí-rắn,

Hiện nay, phƣơng pháp chiết pha rắn ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ

biến do những ƣu điểm vƣợt trội sau:

- Hiệu suất thu hồi cao,

- Khả năng làm giàu, làm sạch các chất phân tích lớn,

- Giảm lƣợng dung môi sử dụng,

- Có khả năng kết hợp các phƣơng pháp phân tích,

- An toàn, đơn giản, dễ sử dụng, có thể tiến hành hàng loạt,

Oasis HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấp phụ kết hợp cơ

chế tƣơng tác pha đảo và tƣơng tác ƣa nƣớc. Pha tĩnh này đƣợc trùng hợp từ hai

monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ƣa nƣớc và divinylbenzen

21

có tính kỵ nƣớc. Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lỗ rỗng là

1.3 cm2/g), có diện tích bề măt trên một đơn vị khối lƣợng pha tĩnh cao (810 m

2/g).

Các nhóm chức phân cực cua monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân

cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lƣu giữ tốt đối với các chất phân tích phân cực đồng

thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng.

2.2.3. Thẩm định phƣơng phap

2.2.3.1. Tính đăc hiệu

Sƣ dung cac p hƣơng phap xac nhân (confirmation method ) là một cách rất

tôt đê đam bao tinh đăc hiêu cua phƣơng phap . Hôi đông châu Âu quy đinh cach

tính điểm IP (điêm nhân dang – identification point) đôi vơi cac phƣơng phap khac

nhau đê khăng đinh chăc chăn sƣ co măt cua cac chât . Cách tính điểm IP đƣợc chỉ

ra ơ phu lục 3.

2.2.3.2. Khoảng tuyến tính

Tiến hành thực nghiệm: Chuẩn bị dãy nồng độ chuẩn cua chất phân tích . Xác

định các giá trị đo đƣợc y theo nồng độ x. Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có

khoảng khảo sát đƣờng biểu diễn là một phƣơng trình:

y = ax + b

và hệ số tƣơng quan:

Nếu 0,995 < r2 ≤ 1 : Có tƣơng quan tuyến tính

Khi đã xác định đƣợc khoảng tuyến tính, có thể xây dựng phƣơng trình hồi quy cua

khoảng này, tức là xác định hệ số a và b. Trên đƣờng hồi quy, lấy đoạn tuyến tính

làm khoảng xác định (kể cả hai điểm đầu và cuối).

2.2.3.3. LOD, LOQ

Tính LOD va LOQ theo biêu thƣc:

)()(

))((

2 YyXx

YyXxr

ii

ii

22

Tính giá trị trung bình

x , và độ lệch chuẩn SD

LOD = 3 x SD

LOQ = 10 x SD

Vơi 1n

)xx(SD

2

i

Đánh giá LOD đã tính đƣợc: tính R =

x / LOD là hệ số đánh giá LOD

Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD

tính đƣợc là đáng tin cậy.

Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đăc hơn, hoăc thêm

một ít chất chuẩn vào dung dịch thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và

tính lại R.

Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoăc pha loãng

dung thử đã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R.

2.2.3.4. Độ lăp lại, đô thu hôi

Độ thu hồi và độ lăp lại đƣợc xác định theo các đại lƣợng SD và RSD nhƣ

công thức dƣới đây:

Trong đó:

Stb : Diện tích pic trung bình.

Si : Diện tích píc thứ i

n: Số lần đo.

SD: Độ lệch chuẩn

RSD: Độ lệch chuẩn tƣơng đối (%).

Độ thu hồi cua phƣơng pháp theo công thức sau :

23

100)(

%

C

CCH mcm

Trong đó: Cm+c : nồng độ nitrofuran xác định đƣợc trong mẫu có thêm chuẩn (ng/g).

Cm: nồng độ nitrofuran có trong mẫu (ng/g).

C: nồng độ chuẩn nitrofuran đƣợc thêm vào (ng/g).

H: độ thu hồi (%).

2.2.4. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Các kết quả phân tích trên LC-MS/MS đƣợc tính toán và xử lý bằng phần mềm

Analyst, Excel, origin 6.0.

Các công thức thống kê tinh đô lăp lai, đô thu hôi, tính LOD, LOQ…

2.3. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu

2.3.1. Dụng cụ và thiết bị

2.3.1.1. Thiết bị

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL cua

Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ cua Aplied Biosystem: bộ phận bơm dung

môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt.

- Cột sắc ký Agilent C18 (150mm x 2,1mm x 3,5µm).

- Cột chiết pha rắn SPE (Oasis HLB).

- Máy lắc vortex VELP.

- Máy đồng nhất mẫu.

- Máy li tâm MIKRO 22R.

- Cân phân tích (có độ đọc 0,1mg và 0,01mg).

- Cân kĩ thuật (có độ đọc 0,01g).

- Máy thổi khí N2 làm khô có điều nhiệt.

- Bể điều nhiệt

2.3.1.2 Dụng cụ

- Cốc có mỏ dung tích 50, 100, 200 ml.

- Ống đong dung tích 10, 100, 200 ml.

- Pipetman, pipet nhựa, pipet pasteur 200 µl; 1000 µl; 5 ml…đầu côn.

24

- Ống ly tâm 50 ml, màng lọc 0,2 µm.

- Vial loại 1,8 ml.

- Bình định mức loại A dung tích 10, 25, 50, 100 ml.

- Ống nghiệm thuy tinh…

2.3.2 Hóa chất và chất chuẩn

Các loại hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

2.3.2.1 Chất chuẩn

- AOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AMOZ 10 mg/l (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- AHD.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- SEM.HCl (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99,5%

- d4-AOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d5-AMOZ (Dr.EhrenstorferGmbH), độ tinh khiết 99%

- d2-AHD.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 99%

- 13

C15

N2-SEM.HCl 10 mg/l (USA), độ tinh khiết 98%

2.3.2.2 Hóa chất

- Methanol (Merck hoăc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- Amoni acetate (Merck hoăc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 98%)

- 2-NBA (Merck hoăc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)

- K2HPO4.3H2O (Merck hoăc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99%)

- NaOH (Merck hoăc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 37% (Merck hoăc tƣơng đƣơng, độ tinh khiết 99,9%)

- HCl 0,2M: Hút 17 ml HCl 37% vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch

bằng nƣớc cất.

- 2-NBA 1000 mg/l: cân 100 mg 2-NBA hòa tan và định mức vào bình 10 ml bằng

methanol. Dung dịch chuẩn bị hằng ngày.

- K2HPO4 0,2 M: cân 45,7 mg K2HPO4.3H2O hòa tan và định mức vào bình 1000

ml bằng nƣớc cất 2 lần.

25

- NaOH 2 M: cân 8 g NaOH hòa tan và định mức vào bình định mức 1000 ml bằng

nƣớc cất 2 lần.

- CH3COONH4 10 mM: cân 0,077 g CH3COONH4 hòa tan và định mức vào bình

định mức 1000 ml bằng nƣớc cất 2 lần.

2.3.3 Pha chế chất chuẩn

- Chuẩn AHD 1000 mg/l: cân 13,2 mg ± 0,1 mg chuẩn AHD.HCl hòa tan và định

mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc

trong 6 tháng.

- Chuẩn AHD 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn AHD 1000 mg/l định mức bằng methanol

vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc trong 6 tháng.

- Chuẩn SEM 1000 mg/l: cân 14,9 mg ± 0,1 mg chuẩn SEM.HCl hòa tan và định

mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.

- Chuẩn SEM 10 mg/l: hút 100 µl chuẩn SEM 1000 mg/l định mức bằng methanol


- Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 1 mg/l: hút lần lƣợt 1 ml chuẩn

AOZ 10 mg/l, AMOZ 10 mg/l, AHD 10 mg/l, SEM 10 mg/l định mức bằng

methanol vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc trong 3 tháng.

- Hỗn hợp chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) 20 µg/l: hút 200 µl hỗn hợp

chuẩn 4 chất (AOZ, AMOZ, SEM, AHD) định mức bằng methanol vào bình định

mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc trong 1 tháng.

- d4-AOZ 1000 mg/l: Cân 10 mg ± 0,1 mg d4-AOZ định mức bằng methanol vào

bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc trong 6 tháng.

- d4-AOZ 10 mg/l: hút 100 µl d4-AOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào bình

định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc trong 6 tháng.

- d5-AMOZ 1000 mg/l : Cân 10 mg ± 0,1 mg d5-AMOZ định mức bằng methanol


- d5-AMOZ 10 mg/l: Hút 100 µl d5-AMOZ 1000 mg/l định mức bằng methanol vào

bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc trong 6 tháng.

26

- Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13

C15

N2-SEM.HCl) 1 mg/l:

hút lần lƣợt 1 ml chuẩn d4-AOZ 10 mg/l, d5-AMOZ 10 mg/l, d2-AHD.HCl 10 mg/l

và 13

C15

N2-SEM.HCl 10 mg/l định mức bằng methanol vào bình định mức 10 ml.

Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc trong 3 tháng.

- Hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl,13

C15

N2-SEM.HCl) 20 µg/l:

hút lần lƣợt 200 µl hỗn hợp nội chuẩn (d4-AOZ, d5-AMOZ, d2-AHD.HCl, 13

C15

N2-

SEM.HCl) 1 mg/l vào bình định mức 10 ml. Bảo quản ở - 200C sƣ dung đƣơc trong

1 tháng.

27

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khảo sát điều kiện xác định các chất nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS

Phân tích dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran dựa trên việc phân tích các

chất chuyển hóa cua nhóm nitrofuran. Các chất chuyển hóa cua nitrofuran có khối

lƣợng phân tử thấp gây nhiễu phổ nền cao, hiệu quả ion hóa thấp và không đăc hiệu

cho sự phân mảnh (chu yếu là mất nƣớc, NH3, CO2), độ nhạy phát hiện băng MS

tƣơng đối thấp. Vì vậy sử dụng 2-nitrobezaldehyte để dẫn xuất các chất chuyển hóa

nhóm nitrofuran để có đƣợc các hợp chất dân xuât (NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD,

NPSEM) với nhiều đăc tính thuận lợi.

3.1.1. Khảo sát các điều kiện đo phổ khôi

3.1.1.1. Khảo sát ion mẹ

Các chất NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM có khối lƣợng phân tử nhỏ

và phân cực. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23,

26], chúng tôi tiến hành khảo sát xác định NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM

bằng kỹ thuật ion hóa phun điện tử ESI với chệ độ bắn phá ion dƣơng. Để tối ƣu

hóa điều kiện khối phổ, dùng xylanh 500 µl bơm từng chuẩn AOZ, AMOZ, AHD,

SEM 500 ng/ml đã đƣợc dẫn xuất bằng 2-nitrobenzaldehyte , sau đó đƣa vào

detector để khảo sát. Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng chất, tối ƣu hóa

từng ion mẹ, thu đƣợc điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI ở bảng 3.1.

Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI

Khí màn (CUR) 20 psi

Khí va chạm (CAD) 8 psi

Thế ion hóa (IS) 5000 V

Nhiệt độ mao quản (TEM) 4000C

Áp suất khí 2 bên đầu phun (GS1) 50 psi

Áp suất cua luồng khí nóng (GS2) 40 psi

28

Trong kỹ thuật ion hóa phun điện tử với chế độ bắn phá ion dƣơng, các ion

mẹ có dạng (MH)+ vơi sô khôi m = (M+1) theo phan ƣng:

M0 + H

+ → (MH)

+

Tiến hành khảo sát bắn phá tạọ các ion mẹ, kết quả đƣợc chỉ ra ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ

Chuyển hóa nhóm

nitrofuran Khối lƣợng phân tử M Ion mẹ (M+H)

NPAOZ 235 236

NPAMOZ 334 335

NPSC 208 209

NPAHD 248 249

d4-AOZ 239 240

d5-AMOZ 339 340

13C-

15N2 SEM.HCl 211 212

D2-AHD.HCl 250 251

3.1.1.2. Khảo sát điều kiện bắn phá ion me đê thu đƣơc ion con

Detector sử dụng trong nghiên cứu này là hê khối phổ 2 lần, do đó để phát

hiện đúng chất phân tích thì việc lựa chọn đƣợc ion con là rất quan trọng. Ion con

phải có tín hiệu gấp ít nhất 10 lần so với ion mẹ. Để thu đƣợc mảnh ion con có tín

hiệu cao cần phải chọn đƣợc mức năng lƣợng bắn phá thích hợp. Dùng xylanh 500

µl bơm từng chuẩn đã đƣợc dẫn xuất vào detector khối phổ và lựa chọn 2 ion con

đăc trƣng có cƣờng độ tín hiệu cao nhất để định tính và định lƣợng. Mảnh ion con

m/z có cƣờng độ lớn nhất dùng để định lƣợng, mảnh ion con thứ 2 có cƣờng độ thấp

hơn dùng để xác nhận chất phân tích. Đối với các chất nội chuẩn, lựa chọn 1 ion

con đăc trƣng có cƣờng độ cao nhất. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.3

29

Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá và các ion con của các chất chuyển hóa nitrofuran

Chuyển hóa

nhóm

nitrofuran

Ion mẹ

(M+H)+

Ion con DP (V) CE (eV) CXP (V)

NPAOZ 236 134 80 15 10

104 80 27 14

NPAMOZ 335 291 80 15 16

262 80 21 16

NPSEM 209 192 80 11 18

166 80 13 14

NPAHD 249 134 80 15 18

104 80 27 14

d4-AOZ 240 134 80 17 16

d5-AMOZ 340 296 80 15 16 13

C-15

N2

SEM.HCl 212 168 80 13 12

d2-AHD.HCl 251 134 80 15 14

Nhân xet:

Theo qui đinh cua Châu Âu 2002/657/EC, sô điêm nhân dang (IP) đƣơc tinh đôi vơi

kỹ thuật LC/MS/M, tƣơng ƣng vơi 1 ion me va 2 ion con, sô điêm nhân dang (IP) là

4. Nhƣ vây phƣơng phap đa đap ƣng đƣơc yêu câu cua Châu Âu [phụ lục 4]. Phù

hơp vơi cac nghiên cƣu khac cua môt sô tac gia nhƣ tac gia Leitner , tác giả D.Tyler

cua phòng thí nghiệm cua Anh…

3.1.2. Lựa chọn cột tách

Các chất nhóm nitrofuran là các chất phân cực, đồng thời theo khuyến cáo

cua nhà sản xuất thiết bị khối phổ thì hệ pha động sử dụng an toàn với thiết bị là các

dung môi phân cực và phân cực trung bình nhƣ methanol, acetonitrile, nƣớc, acid

formic (0 đến 1%, amoni acetate (0 tới 1%)…cột tách nên sử dụng là cột tách pha

đảo. Do đó chúng tôi lựa chọn cột tách pha đảo C18 vơi cac thông sô dƣơi đây cho

các nghiên cứu tiếp theo:

- Cột C18 cua Agilent có:

30

- Chiêu dai 150mm,

- Đƣờng kính 2,1mm,

- Cơ hat 3,5µm.

3.1.3. Khảo sát chƣơng trình gradient pha đông

Các dẫn xuất cua nhóm nitrofuran có cấu trúc gần giống nhau, nên sử dụng

chế độ rửa giải đẳng dòng (isocratic) không phù hợp. Chúng tôi tiến hành khảo sát

một số chƣơng trình rửa giải gradient. Qua tham khảo một số tài liệu [12, 16, 17,

24] chúng tôi sử dụng pha động kênh A: Amoniacetat 10 mM, kênh B là methanol.

Cố định các điều kiện sắc ký:

- Cột C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm),

- Pha động: kênh A: amoniacetat 10 mM, kênh B: methanol,

- Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút,

- Mẫu phân tích: hỗn hợp dân xuât nitrofuran, nồng độ: 20 ng/ml.

Tiên hanh thí nghiệm theo:

a) Chƣơng trinh Gradient 1, thu đƣơc săc đô nhƣ trong hinh 3.1 :

Thời gian (phút) 0,01 12,00 14,00 15,00 20,00

% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.1: săc đô hôn hơp chuân khi chay chê đô gradient 1 ở nông đô 20 ng/ml

31

b) Chƣơng trinh Gradient 2, thu đƣơc săc đô trong hinh 3.2:

Thời gian (phút) 0,01 5 8 9 12

% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.2: săc đô hôn hơp chuân khi chay chê đô gradient 2 ở nồng độ 20 ng/ml

c) Chƣơng trinh Gradient 3, thu đƣơc săc đô trong hinh 3.3 :

Thời gian (phút) 0,01 8 10 13 13,01

% MeOH 20 90 90 20 20

Hình 3.3: săc đô hôn hơp chuân khi chay chê đô gradient 3 ở nồng độ 20 ng/

32

d) Chƣơng trinh Gradient 4, thu đƣơc săc đô trong hinh 3.4:

Thời gian (phút) 0,01 10 12 15 15,01

% MeOH 20 90 90 20 20


e) Chƣơng trinh Gradient 5, thu đƣơc săc đô trong hinh 3.5:

Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00

% MeOH 20 90 90 20 20


33

Bàn luận :

- Khi tăng nồng độ MeOH trong khoảng thời gian ngắn (chƣơng trinh gradient 1,

gradient 2, gradient 3, gradient 4) píc cua AOZ rất xấu và bị chẻ píc. Hiên tƣơng

chẻ pic này là do hàm lƣợng MeOH cao , AOZ tôn tai đông thơi ơ hai dang la amin

bâc nhât R -NH2 và dạng R -NH3+. Do đo, nông đô MeOH cân phai đƣơc không chê

phù hợp, đông nghia vơi tăng nông đô CH3COONH4 để chuyển toàn bộ dạng amin

thành dạng R-NH3+.

- Chƣơng trình gradient 5 pic nhọn, cân xứng va co tin hiêu pic ro rang . Do đó

chúng tôi lựa chọn chƣơng trình gradient 5 cho các nghiên cứu tiếp theo.

Tóm lại : Các thông số phu hơp cho quá trình tách sắc ký là :

- Cột Agilent C18 (150 mm x 2,1 mm x 3,5 µm)

- Pha động kênh A (amoniacetat 10 mM) ; kênh B (methanol) theo chƣơng

trình gradient 5:

Thời gian (phút) 0,01 12,00 13,00 13,01 16,00

% MeOH 20 90 90 20 20

- Tốc độ pha đông: 0,4 ml/phút,

- Thể tích bơm mẫu : 10 µl,

- Nhiệt độ cột: 300C.

3.1.4. Khảo sát quy trình chiết mẫu

Qua tham khảo một số tài liệu [12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 26] có

một số quy trình đã và đang đƣợc ứng dụng để tách chiết các chất nhóm nitrofuran

bao gồm : quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng, quy trình xử lý mẫu bằng

chiết pha rắn. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát 2 quy trình chiết mẫu sau đây đê

tiên hanh thi nghiêm.

3.1.4.1. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng – lỏng

Dự kiến quy trình xử lý mẫu nhƣ sau:

34

Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm

Thêm 10 ml HCl 0,2M và 240 µl 2-NBA 10mg/ml

Thêm 100 µl hỗn hợp nội chuẩn vào mỗi ống

Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa axit bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc

vortex 20 giây

Ly tâm ở 4500 rpm trong 15 phút lây dung dich mâu

Chiết lặp 2 lần mỗi lần bằng 4 ml ethylactetate, ly tâm hút lấy lớp trên thổi khô

bằng N2

Hòa tan căn bằng 1 ml H2O:MeOH (60:40)

Chuyển mẫu vào vial và đem phân tích băng LC/MS/MS

Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợn, sử dụng quy trình chiết lỏng

– lỏng nói trên làm lăp lại 3 lần cho kết quả chỉ ra ở bảng 3.4 và săc đô ơ hinh 3.6:

35

Bảng 3.4: Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng chiết lỏng – lỏng

Chất

phân tích

Lần 1

(ng/g)

Lần 2

(ng/g)

Lần 3

(ng/g)

TB

(ng/g) SD % RSD H (%)

AOZ 8,51 7,66 9,11 8,43 0,729 8,65 42,1

AMOZ 9,32 10,2 7,55 9,01 1,38 15,3 45,0

AHD 6,82 5,89 7,43 6,71 0,776 11,6 33,7

SEM 6,12 6,27 5,98 6,12 0,145 2,37 30,6

Hình 3.6: Săc đô mâu thit lơn thêm chuân hôn hơp nitrofuran ơ mƣc nông đô 20

ng/g sƣ dung quy trinh chiêt long – lỏng.

3.1.4.2. Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng chiết pha rắn

Thƣc hiên theo sơ đô sau:

36

Cân 2 g mẫu vào ống ly tâm



Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sáng để qua đêm trong bể điều nhiệt 400C

Trung hòa mẫu bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc

vortex 20 giây


Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O

Nạp mẫu vào cột, rửa loại chất bẩn bằng 2 x 2,5 ml H2O

Hút chân không cho khô cột SPE

Rửa giải chât phân tich bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm

Thổi khô bằng N2



Tiến hành thêm chuẩn 20 ng/g vào mẫu thịt lợn, sử dụng quy trình chiết pha

rắn làm lăp lại 3 lần cho kết quả chỉ ra ở bảng 3.5 và hình 3.7:

37

Bảng 3.5: Độ thu hồi mẫu thịt lợn thêm chuẩn 20 ng/g sử dụng chiết pha rắn

Chất

phân tích

Lần 1

(ng/g)

Lần 2

(ng/g)

Lần 3

(ng/g)

TB

(ng/g) SD % RSD H (%)

AOZ 17,3 18,4 16,9 17,5 0,777 4,43 87,7

AMOZ 19,3 18,5 17,8 18,5 0,750 4,04 92,7

AHD 15,7 14,8 13,5 14,7 1,11 7,54 73,3

SEM 14,3 13,2 14,8 14,1 0,818 5,80 70,5

Hình 3.7: Săc đô thit lơn thêm chuân hôn hơp nitrofuran ơ mƣc nông đô 20 ng/g sƣ

dụng qui trình chiết pha rắn SPE

Bảng 3.6: So sanh đô thu hồi của 2 quy trình chiết:

Thịt lợn thêm chuẩn Chiết SPE Chiết lỏng-lỏng

H (%) H (%)

AOZ 20 ng/g 87,7 42,1

AMOZ 20 ng/g 92,7 45,0

AHD 20 ng/g 73,3 33,7

SEM 20 ng/g 70,5 30,6

38

Nhân xet: Nhìn vào bảng trên ta thấy quy trình chiết SPE cho độ thu hồi cao

hơn so với quy trình chiết lỏng lỏng và đáp ứng đƣợc quy định cua Châu Âu

2002/657EC. Do đó chúng tôi chọn quy trình chiết SPE cho các nghiên cứu tiếp

theo

3.2. Thâm đinh phƣơng phap

3.2.1 Tính đặc hiệu

Phƣơng phap trên sƣ dung ky thuât săc ky long khôi phô 2 lân, thƣc hiên băn

phá ion mẹ m/z, đinh lƣơng theo ion con tao thanh . Theo cach tinh điêm IP thi vơi 1

ion me va 2 ion thu đƣơc 4 điêm IP, nhƣ vây phƣơng phap co tinh đăc hiêu đap ƣng

đƣơc yêu câu cua châu Âu 2002/657/EC [32].

3.2.1. Khảo sát lập đƣờng chuẩn

3.2.1.1. Đường chuẩn của các chất nhóm nitrofuran sử dụng nội chuẩn (để phân

tích mẫu thực)

Chúng tôi khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính cua diện tích píc sắc kí, tỷ lệ diện

tích píc nitrofuran/nội chuẩn vào nồng độ chất phân tích ở các nồng độ khác nhau

xác định hệ số tƣơng quan va phƣơng trình đƣờng chuẩn. Theo quy định cua Châu

Âu các chất nhóm nitrofuran là chất cấm, MRPL về yêu cầu giới hạn hiệu năng nhỏ

nhất cua phƣơng pháp đối với các chất dẫn xuất nhóm nitrofuran là 1 µg/kg, do đó

chúng tôi khảo sát xây dựng khoảng đƣờng chuẩn từ 0,5 – 5 ppb, sử dụng các nội

chuẩn ở cùng nồng độ 2 ppb để phân tích mẫu thực. Sƣ dung phân mêm origin 6.0

để xây dựng đƣờng chuẩn cua các kháng s inh nhom nitrofuran thu đƣơc cac hinh

3.8, 3.9, 3.10, 3.11 và bảng 3.7 dƣơi đây:

39

0 1 2 3 4 5

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8 Y = 0.12426 + 0.31607 * X

Parameter Value Error

------------------------------------------------------------

A 0.01426 0.0141

B 0.31607 0.00606

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99927 0.02411 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Ana

lyte

are

a/IS

are

a

Analyte conc/IS conc

Hình 3.8: Đƣờng chuẩn xác định AOZ sử dụng nội chuẩn

0 1 2 3 4 5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Y = 0.01807 + 0.45988 * X


------------------------------------------------------------

A 0.01807 0.01616

B 0.45988 0.00695

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99954 0.02764 6 <0.0001

------------------------------------------------------------Ana

lyte

are

a/IS

are

a


Hình 3.9: Đƣờng chuẩn xác định AMOZ sử dụng nội chuẩn

40

0 1 2 3 4 5

-1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Y = 0.26595 + 1.44626 * X


------------------------------------------------------------

A 0.26595 0.09471

B 1.44626 0.0407

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99842 0.16193 6 <0.0001

------------------------------------------------------------An

aly

te a

rea

/IS

are

a


Hình 3.10: Đƣờng chuẩn xác định SEM sử dụng nội chuẩn

0 1 2 3 4 5

0

1

2

3

4

5

6

7Y = 0.12446 + 1.22034 * X


------------------------------------------------------------

A 0.12446 0.04298

B 1.22034 0.01847

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99954 0.07348 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Ana

lyte

are

a/IS

are

a


Hình 3.11: Đƣờng chuẩn xác định AHD sử dụng nội chuẩn

Dƣa vao đƣơng chuân xây dƣng phia trên kêt hơp tra bang gia tri chuân t vơi

bâc tƣ do f=4, đô tin cây 95% có t = 2,776 nên phƣơng trinh hôi quy y = (a ± t.Sa) +

(b ± t.Sb)x co dang nhƣ dƣơi đây:

41

Bảng 3.7: Phương trình hồi quy 4 nitrofuran sử dụng nội chuẩn

TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R

1 AOZ y = (0,21426 ± 0,039142) + (0,31607 ± 0,016822)x 0,9992

2 AMOZ y = (0,01807 ± 0,044860) + (0,45988 ± 0,019293)x 0,9995

3 AHD y = (0,12446 ± 0,119312) + (1,22034 ± 0,051273)x 0,9995

4 SEM y = (0,26595 ± 0,262915) + (1,44626 ± 0,112983)x 0,9984

Nhận xét: tỉ lệ diện tích pic nitrofuran/diện tích pic nội chuẩn (IS) trong khoảng 0,5

– 5 ng/ml có hệ số tƣơng quan R2 > 0,99.

3.2.1.2. Đường chuẩn của các chất nhóm nitrofuran không sử dụng nội chuẩn (để

đánh giá hiệu suất thu hồi)

Lập mối tƣơng quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ các chất nhóm

nitrofuran, thu đƣợc đƣờng chuẩn cua các chất nhóm nitrofuran chỉ ra ở hình 3.12,

3.13, 3.14, 3.15 và bảng 3.8:

0 1 2 3 4 5

-200000

0

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000Y = 14569.47368 + 307751.51579 * X


------------------------------------------------------------

A 14569.47368 11729.11536

B 307751.51579 5039.63638

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99946 20053.27825 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Are

a

conc AOZ (ppb)

Hình 3.12: Đƣờng chuẩn cua AOZ không sử dụng nội chuẩn

42

0 1 2 3 4 5

0

500000

1000000

1500000

2000000

Y = 42232.68421 + 363894.58947 * X


------------------------------------------------------------

A 42232.68421 19272.12625

B 363894.58947 8280.63376

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99897 32949.57021 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Anal

yte

area

conc AMOZ (ppb)

Hình 3.13: Đƣờng chuẩn cua AMOZ không sử dụng nội chuẩn

0 1 2 3 4 5

0

50000

100000

150000

200000

Y = 6879.15789 + 36694.50526 * X


------------------------------------------------------------

A 6879.15789 1594.06733

B 36694.50526 684.92119

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.9993 2725.37823 6 <0.0001

------------------------------------------------------------Ana

lyte

Are

a

conc AHD (ppb)

Hình 3.14: Đƣờng chuẩn cua AHD không sử dụng nội chuẩn

43

0 1 2 3 4 5

-20000

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

180000

200000

Y = 592.13158 + 35485.42105 * X


------------------------------------------------------------

A 592.13158 1504.30234

B 35485.42105 646.35197

------------------------------------------------------------

R SD N P

------------------------------------------------------------

0.99934 2571.90695 6 <0.0001

------------------------------------------------------------

Ana

lyte

are

a

conc SEM (ppb)

Hình 3.15: Đƣờng chuẩn cua SEM không sử dụng nội chuẩn

Dƣa vao đƣơng chuân xây dƣng phia trên kêt hơp tra bang gia tri chuân t vơi

bâc tƣ do f=4, đô tin cây 95% có t = 2,776 nên phƣơng trinh hôi quy y = (a ± t.Sa) +

(b ± t.Sb)x co dang nhƣ dƣơi đây:

Bảng 3.8: Phương trình hồi quy của 4 nitrofuran không sử dụng nội chuẩn

TT Chất Phƣơng trình hồi qui Hệ số R

1 AOZ y = (14569 ± 32560) + (307751 ± 13990)x 0,9994

2 AMOZ y = (42233 ± 53499) + (363895 ± 22988)x 0,9989

3 AHD y = (6879 ± 4425) + (36695 ± 1902)x 0,9993

4 SEM y = (592 ± 4175) + (35485 ± 1793)x 0,9993

Nhận xét: Diện tích nitrofuran với nồng độ trong khoảng 0,5 – 5 ng/ml có hệ số

tƣơng quan R2 > 0,99.

3.2.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp

Giới hạn phát hiện đƣợc định nghĩa là nồng độ nhỏ nhất cua chất phân tích

mà phƣơng pháp phân tích có thể phát hiện đƣợc, có tín hiệu sắc ký lớn gấp 3 lần

tín hiệu đƣờng nền. Đây là một thông số đăc trƣng cho độ nhạy cua phƣơng pháp.

Chất nào nhạy hơn se có giới hạn phát hiện nhỏ.

44

Cũng theo phƣơng pháp này giới hạn định lƣợng là nồng độ nhỏ nhất chất

phân tích mà có tín hiệu lớn gấp 10 lần tín hiệu nhiễu đƣờng nền hay mẫu trắng

(S/N = 10).

Chúng tôi tiến hành thêm chuẩn trên nền mẫu thử không chứa chất phân tích,

làm 10 lần song song. Bảng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 chỉ ra giới hạn phát hiện cua AOZ,

AMOZ, AHD, SEM

Bảng 3.9: Giới hạn phát hiện của AOZ trên nền mẫu thịt

Số TT

Thêm

chuẩn

AOZ 0,5

ng/ml

x SD LOD

(ng/g)

LOQ

(ng/g) LOD

x

Lần 1 0,386

0,434 0,0333 0,100 0,300 4,34

Lần 2 0,463

Lần 3 0,483

Lần 4 0,459

Lần 5 0,419

Lần 6 0,432

Lần 7 0,395

Lần 8 0,412

Lần 9 0,456

Lần 10 0,436

45

Bảng 3.10: Giới hạn phát hiện của AMOZ trên nền mẫu thịt

Số TT

Thêm

chuẩn

AMOZ

0,5 ng/ml

x SD LOD

(ng/g)

LOQ

(ng/g) LOD

x

Lần 1 0,405

0,485 0,0398 0,119 0,357 4,06

Lần 2 0,504

Lần 3 0,520

Lần 4 0,508

Lần 5 0,432

Lần 6 0,489

Lần 7 0,532

Lần 8 0,465

Lần 9 0,491

Lần 10 0,502

Bảng 3.11: Giới hạn phát hiện của AHD trên nền mẫu thịt

Số TT

Thêm

chuẩn

AHD 1

ng/ml

x SD LOD

(ng/g)

LOQ

(ng/g) LOD

x

Lần 1 1,01

1,06 0,0743 0,223 0,669 4,73

Lần 2 1,13

Lần 3 0,983

Lần 4 1,10

Lần 5 0,94

Lần 6 1,15

Lần 7 1,11

Lần 8 1,01

Lần 9 1,12

Lần 10 0,997

46

Bảng 3.12: Giới hạn phát hiện của SEM trên nền mẫu thịt

Số TT

Thêm

chuẩn

SEM 1,5

ng/ml

x SD LOD

(ng/kg)

LOQ

(ng/g) LOD

x

Lần 1 1,57

1,53 0,126 0,378 1,13 4,04

Lần 2 1,32

Lần 3 1,37

Lần 4 1,60

Lần 5 1,65

Lần 6 1,70

Lần 7 1,60

Lần 8 1,58

Lần 9 1,40

Lần 10 1,52

Trong đo:

-

x là trung bình của 10 lần làm lặp lại

-

x / LOD là hệ số đánh giá LOD

Bàn luận:

- LOD cua cac chât khang sinh nhom nitrofuran năm trong khoảng từ 0,100 – 0,378

ng/g; LOQ tƣ 0,300 – 1,13 ng/g đap ƣng đƣơc yêu câu cua Châu Âu 2002/657/EC

vê đô nhay cua phƣơng phap . Phù hợp với các nghiên cứu tƣơng tự.

3.2.3. Độ lặp lại và độ thu hồi

Thực hiện thêm chuẩn vào mẫu thịt lợn không chứa nitrofuran ở các mức nồng

độ (MRPL; 1,5MRPL; 2MRPL) đối với mỗi chất là: 1 ng/g; 1,5 ng/g; 2 ng/g. Phân

tích lăp lại 6 lần mỗi mẫu. Các kết quả thu đƣợc ở bảng 3.13 đến 3.15:

47

Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền mẫu thịt lợn tại 1 ng/g

Chất Thông

số

Mẫu

1

Mẫu

2

Mẫu

3

Mẫu

4

Mẫu

5

Mẫu

6

Trung

bình SD

%

RSD

AOZ

C

(ng/g) 0,994 0,979 1,06 1,10 0,985 0,991 1,02 0,050 4,89

H (%) 99,4 97,9 106 110 98,5 99,1 102

AMOZ

C

(ng/g) 1,03 1,07 0,998 1,04 1,06 1,03 1,038 0,025 2,45

H (%) 103 107 99,8 104 106 103 104

AHD

C

(ng/g) 0,859 0,986 0,814 0,992 0,885 1,00 0,923 0,079 8,55

H (%) 85,9 98,6 81,4 99,2 88,5 100 92,3

SEM

C

(ng/g) 0,805 0,732 0,859 0,781 0,659 0,992 0,805 0,076 9,42

H (%) 80,5 73,2 85,9 78,1 65,9 99,2 80,5

Hình 3.16: Săc đô mâu thit lơn thêm chuân hôn hơp nitrofuran tai mƣc nông đô 1 ng/g.

AHD

AOZ

48

Bảng 3.14: Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền mẫu thịt lợn tại 1,5 ng/g.

Chất Thông

số

Mẫu

1

Mẫu

2

Mẫu

3

Mẫu

4

Mẫu

5

Mẫu

6

Trung

bình SD

%

RSD

AOZ

C

(ng/g) 1,56 1,15 1,60 1,25 1,32 1,59 1,41 0,196 13,0

H (%) 104 76,7 106 83,3 88,0 106 94

AMOZ

C

(ng/g) 1,56 1,54 1,55 1,57 1,60 1,58 1,57 0,023 1,46

H (%) 104 103 103 105 107 105 105

AHD

C

(ng/g) 1,44 1,61 1,54 1,60 1,63 1,67 1,58 0,077 4,87

H (%) 96 107 103 107 109 111 106

SEM

C

(ng/g) 1,37 1,60 1,17 1,69 1,4 1,72 1,49 0,205 13,7

H (%) 91,3 107 78,0 113 93,3 115 99,6

Hình 3.17: Săc đô mâu thit lơn thêm chuân hôn hơp nitrofuran tai mƣc nông đô 1,5 ng/g.

49

Bảng 3.15: Độ lặp lại và độ thu hồi của các nitrofuran trên nền mẫu thịt lợn tại 2 ng/g.

Chất Thông

số

Mẫu

1

Mẫu

2

Mẫu

3

Mẫu

4

Mẫu

5

Mẫu

6

Trung

bình SD

%

RSD

AOZ

C

(ng/g) 2,14 1,98 1,73 2,05 2,15 2,17 2,04 0,171 8,41

H (%) 107 99,0 86,5 102 108 109 102

AMOZ

C

(ng/g) 2,06 2,07 2,11 2,09 1,87 1,98 2,03 0,097 4,78

H (%) 103 104 105 93,5 99,0 102 101

AHD

C

(ng/g) 2,04 1,89 1,76 2,24 1,84 1,90 1,95 0,171 8,80

H (%) 102 94,5 88,0 112 92,0 95,0 97,2

SEM

C

(ng/g) 1,77 2,04 2,00 2,06 1,,82 2,04 1,96 0,125 6,47

H (%) 88,5 102 100 103 91,0 102 99,8

Hình 3.18: săc đô mâu thit lơn thêm chuân hôn hơp nitrofuran tai mƣc nông đô 2 ng/g

Bàn luận: Ta thây đô thu hôi trung binh cua cac chât tƣ 80,5 – 106%, đô lăp lại tốt

(%RSD < 13,7%) đat yêu câu theo quy đinh cua Châu Âu 2002/657/EC. Tƣ cac

50

điêu kiên đa đƣơc tôi ƣu ơ trên đu đam bao cho phep phân tich xác định 4 chât

nhóm nitrofuran.

Từ những kết quả khảo sát và thẩm định phƣơng pháp, chúng tôi đƣa ra

phƣơng pháp phân tích các chất chuyển hóa cua nitrofuran nhƣ sau:

Cân 2 g mẫu/blank/QC vào ống ly tâm



Thêm dung dịch chuẩn làm việc vào mẫu thêm chuẩn chỉ tính trên mẫu

Đậy ống, lắc vortex, tránh ánh sang để qua đêm trong bể điều nhiệt 40

0C

Trung hòa mẫu bằng 10 ml K2HPO4 0,2M, sau đó thêm 800 µl NaOH 2M, lắc

vortex 20 giây


Hoạt hóa cột SPE (Oasis HLB): 3 ml EtAc → 3 ml MeOH → 2 x 2,5 ml H2O

Nạp mẫu vào cột chiêt rửa bằng 2 x 2,5 ml H2O

Hút chân không cho khô cột SPE

Rửa giải chât phân tich bằng 4 ml EtAc vào ống nghiệm

Thổi khô dung dich mâu bằng N2



51

3.3. Ứng dụng phƣơng pháp trong phân tích thực phẩm

Trên cơ sở phƣơng pháp đã xây dựng và thẩm định, chúng tôi ứng dụng để

phân tích một số loại thực phẩm tƣơi sống trên địa bàn Hà Nội. Các kết quả đƣợc

trình bày ở bảng 3.16

Bảng 3.16: Kết quả phân tích mẫu thực theo phương phap thêm chuân

STT Mẫu Nitrofuran Lƣợng thêm

vào (ng)

Lƣợng tìm

thấy (ng) R%

1 Thịt lợn chợ

Nguyễn Cao

AOZ 0 KPH -

1 0,87 87

AMOZ 0 KPH -

1 0,96 96

AHD 0 KPH -

1 0,78 78

SEM 0 KPH -

1 0,72 72

2 Thịt gà chợ

Nguyễn Cao

AOZ 0 KPH -

1 1,12 112

AMOZ 0 KPH -

1 1,02 102

AHD 0 KPH -

1 0,95 95

SEM 0 KPH -

1 0,89 89

3 Thịt bò chợ Mai

Động

AOZ 0 KPH -

1 0,99 99

AMOZ 0 KPH -

1 1,05 105

52

AHD 0 KPH -

1 1,03 103

SEM 0 KPH -

1 1,09 109

4 Gan chợ Mai

Động

AOZ 0 KPH -

1 0,88 88

AMOZ 0 KPH -

1 0,97 97

AHD 0 KPH -

1 0,75 75

SEM 0 KPH -

1 0,69 69

5 Thịt lợn chợ Cầu

Giấy

AOZ 0 KPH

1 1,02 102

AMOZ 0 KPH

1 0,79 79

AHD 0 KPH

1 1,01 101

SEM 0 KPH

1 1,03 103

6 Thịt bò chợ Cầu

Giấy

AOZ 0 KPH

1 0,92 92

AMOZ 0 KPH

1 0,88 88

AHD 0 KPH

1 0.79 79

SEM 0 KPH

1 1,06 106

53

7 Thịt lợn chợ Ngọc

Hà

AOZ 0 KPH

1 1,05 105

AMOZ 0 KPH

1 1,11 110

AHD 0 KPH

1 0,98 98

SEM 0 KPH

1 0,67 67

8 Thịt gà chợ Ngọc

Hà

AOZ 0 KPH

1 0,76 76

AMOZ 0 KPH

1 0,82 82

AHD 0 KPH

1 0,97 97

SEM 0 KPH

1 0,73 73

KPH: không phát hiện < LOD của phương pháp,

R %: Phần trăm độ thu hồi.

Bàn luận:

Qua quá trình phân tích một số mẫu thực trên địa bàn Hà Nội, không phát

hiện mẫu nào có chứa các chất nhóm nitrofuran.

Độ thu hồi hâu hêt cac chât tƣ 67 – 112% đap ƣng đƣơc qui đinh cua Châu

Âu 2002/657/EC. Tƣ kêt qua đô thu hôi nay cho t hây co thê mơ rông phƣơng phap

cho cac san phâm thƣc phâm tƣơi sông khac.

3.4 Hƣớng phát triển của đề tài

Trong bản luận văn này, do điều kiện còn hạn chế nên chúng tôi chỉ xác định

đƣợc dƣ lƣợng kháng sinh nhóm nitrofuran bằng LC/MS/MS trong một số mẫu thực

phẩm tƣơi sống (thịt gà , thịt lợn , thịt bò , gan). Phƣơng pháp còn có thể đƣợc mở

rộng phân tích trong những dạng nền mẫu khác nhau nhƣ: thức ăn chăn nuôi, mẫu

54

sinh học, mẫu sữa…Vì vậy rất cần có những nghiên cứu tiếp theo để phát triển

phƣơng pháp và áp dụng phuc vu phân tich mâu vao thực tiễn.

55

KẾT LUẬN

Trên cơ sở nghiên cứu các điều kiện thực nghiệm, với mục đích ứng dụng ky

thuât sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS để tách và xác định các kháng sinh nhóm

nitrofuran trong mẫu thực phẩm tƣơi sống, chúng tôi đa thu đƣợc các kết quả sau:

1. Đã nghiên cứu đƣợc các điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ để xác định 4

chất chuyển hóa nhóm nitrofuran bao gồm:

- Khảo sát đƣợc các điều kiện đo phổ khôi (thế phân nhóm (DP), năng lƣợng

va chạm (CE)..) để thu đƣợc các ion khôi đăc trƣng cua từng chất nitrofuran.

- Khảo sát chọn đƣợc các điều kiện sắc ký lỏng: cột sắc C18 Agilent (150mm

× 2,1mm × 3,5µm); pha động vơi kênh A amoniacetat 10mM trong nƣớc va

kênh B là metanol; chƣơng trình rửa giải gradient.

2. Đã khảo sát đƣợc điều kiện tách và làm sạch các nitrofuran ra khỏi nền mẫu

thịt lợn bằng chiết pha rắn với cột chiết oasis HLB.

3. Đã thẩm định các thông số cua phƣơng pháp bao gồm:

- Khoảng tuyến tính: trong khoảng từ 0,5 – 5 µg/kg với hệ số tƣơng quan

tuyến tính R2 > 0,996.

- Giới hạn phát hiện AOZ (0,100 µg/kg), AMOZ (0,119 µg/kg), AHD (0,223

µg/kg), SEM (0,378 µg/kg), đáp ứng yêu cầu về độ nhạy để phân tích các

chât nhom nitrofuran.

- Độ thu hồi trung binh tƣ 80,5 – 106% cho thấy phƣơng pháp có độ đúng tốt.

- Độ lệch chuẩn tƣơng đối thấp (RSD% < 13,7%) cho thấy phƣơng pháp có độ

lăp lại va chinh xac cao.

4. Đã ứng dụng phƣơng pháp để phân tích các mẫu thực phẩm tại các chợ trên

địa bàn Hà Nội, cho thấy phƣơng pháp có thể ứng dụng để phân tích xác định

dân xuât nhom nitrofuran trong thực phẩm tƣơi sống.

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Nguyên Quôc Ân (2009), Sư dung khang sinh trong chăn nuôi thu y ơ Viêt Nam ,

Cục thú y.

2. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2007), Hóa

học phân tích, phần 2: Các phương pháp phân tích công cụ, Nhà xuất bản Khoa học

và Kỹ thuật, Hà Nội.

3. Nguyễn Đức Huệ (2005), Các phương pháp phân tích Hữu cơ, Nhà xuất bản Đại

học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.

4. Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC),Nhà xuất

bản Đại học Quốc Gia Hà Nội.

5. Nguyễn Đình Thành (2011), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học

trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

6. Tạ Thị Thảo (2010), Giáo trình Thống kê trong Hóa học phân tích, khoa Hóa học

trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

7. Bùi Thị Tho (2003), Thuốc kháng sinh và nguyên tắc sử dụng trong chăn nuôi,

Nhà xuất bản Hà Nội.

8. Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, khoa Hóa học trƣờng

Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

9. Số 54/2002/QĐ-BNN, ngày 20 tháng 06 năm 2002 về việc cấm sản xuất, nhập

khẩu, lưu thông và sử dụng một số loại kháng sinh hóa chất trong sản xuất và kinh

doanh thức ăn chăn nuôi cua Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn.

10. 28 TCN 194:2004,Các chất chuyển hóa thuộc nhóm nitrofuran trong thủy sản

và sản phẩm thủy sản – Phương pháp định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ - khối

phổ, Bộ Thuy Sản.

57

11. Trang web (2008), http//vietbao.vn/Kinh-te/My-kiem-tra-thuy-san-nuoi-Trung-

Quoc-Viet-Nam-lo-ngai/55154852/93. Việt Báo

Tiếng Anh

12. Alexander Leitner, Peter Zollner, Wolfgang Lindner (2001),“Determination of

the metabolites of nitrofuran antibiotics in animal tissue by high-performance liquid

chromatography–tandem mass spectrometry”, Journal of Chromatography A,

Volume 939, pp. 49-58.

13. Caroline Douny, Joelle Widart, Edwin De Pauw, Frederic sivestre, Packtrick

Kestemont, Huynh Thi Tu, Nguyen Thanh Phuong (2012), Development of an

analytical method to detect metabolites of nitrofurans: Application to the study of

furazolidone elimination in Vietnamese black tiger shrimp (Penaeus monodon),

Aquaculture, Volume 376-379, pp. 54-58.

14. C. Bock, C. Stachel, P.Gowik (2007), Validation of a confirmatory method for

the determination of residues of four nitrofurans in egg by liquid chromatography-

tandem mass spectrometry with the software interval, Analytica Chimica Acta,

Volume 586, pp. 348-358.

15. C. Chang, D.P. Peng, J.E. Wu, Y.L. Wang, Z.H. Yuan (2008), Development of

an indirect competitive ELISA for the detection of furazolidone marker residue in

animal edible tissues. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol.53, pp

8934-8939.

16. Chung-Wei Tsai, chuan-ho tang and Wei-Hsien wang (2010), “Quantitative

Determination of Four Nitrofurans and Corresponding Metabolites in the Fish

Muscle by Liquid Chromatography-Electrospray Ionization-Tandem Mass

Spectrometry”, Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 18, No. 2, pp. 98-106.

17. D. Tyler (2009), Analysis of nitrofurans in animal tissues a food of animal

origin by LC/MS/MS, sop FSG341.

18. E. Horne, A. Cadogan, M. OKeeffe, Hoogenboo, L.A.P. (1996), Analysis of

protein-bound metabolites of furazolidone and furaltadone in pig liver by high

58

performance liquid chromatography and liquid chromatography mass spectrometry.

Analyst, Vol.121, 1463-1468.

19. E. Verdon, P. Couedor, P. Sanders (2007), Multi-residue monitoring for the

simultaneous determination of five nitrofurans (furazolidone, furaltadone,

nitrofurazone, nitrofurantoine, nifursol) in poultry muscle tissue through the

detection of their five major metabolites (AOZ, AMOZ, SEM, AHD, DNSAH) by

liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass spectrometry – Inhouse

validation in line with Commission Decision 657/2002/EC. Analytica Chimica Acta,

Vol.586, pp 336-347.

20. I. Diblikova, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, M. Franek (2005), Monoclonal

antibody-based ELISA for the quantification of nitrofuran metabolite 3-amino-2-

oxazolidinone in tissues using a simplified sample preparation. Analytica Chimica

Acta, Vol.540, 285-292.

21. K.M. Cooper, P.P. Mulder, van Rhijn J.A. van Rhijn, L. Kovacsics, R.J.

McCracken, P.B. Young, D.G. Kennedy (2005), Depletion of four nitrofuran

antibiotics and their tissue-bound metabolites in porcine tissues and determination

using LC-MS/MS and HPLC-UV. Food Additives and Contaminants, pp 405-414.

22. Lech Rodziewicz (2008), Determination of nitrofuran metabolites in milk by

liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Journal

of chromatography, Vol.864, pp. 156-160.

23. Mayda I.Lopez (2007), “Determination and confirmation of Nitrofuran residues

in honey using LC-MS/MS”, Journal of agricultural and food chemistry, Vol.55,

pp. 1103-1108.

24. M. O’Keeffe , A. Conneely, K.M. Cooper, D.G. Kennedy, L. Kovacsics, A.

Fodor, P.P.J. Mulder, J.A. van Rhijn, G. Trigueros (2004), Nitrofuran antibiotic

residues in pork the FoodBRAND retail survey. Analytical Chimica Acta, Vol.520,

125-131.

59

25. M. Vass*, K. Hruska, M. Franek (2008), “Nitrofuran antibiotics: a review on the

application, prohibition and residual analysis”, Veterinarni Medicina, Vol.53, pp.

469–500.

26. Pascal Mottier, Seu-Ping Khong, Eric Gremaud, Janique Richoz, Thierry

Delatour, Till Goldmann, Philippe A.Guy (2005), Quantitative determination of

four nitrofuran metabolites in meat by isotope dilution liquid chromatography-

electrospray ionization-tandem mass spectrometry, Journal of chromatography A,

Volume 1067, pp. 85-91.

27. P. Vinas, N. Campillo, L. Carrasco, M. Hernandez-Cordoba (2007), Analysis of

nitrofuran residues in animal feed using liquid chromatography and photodiode-

array detection, Chromatographia, Vol.65, pp. 85-89.

28. Randox laboratory (2008), “Measurement of four nitrofuran metabolites with

elisa kits using multi-analyte reagents”, Randox life sciences.

29. Sujittra Phongvivat, Bangkok, Thailand (2004), “Nitrofurans Case Study:

Thailand’s experience”, Joint FAO/WHO Technical Workshop on, Residues of

Substances without ADI/MRL in Food.

30. Tao Ding, Jingzhong Xu, Chongyu Shen and Kefei Wang (2007),

“Determination of trace level nitrofuran metabolites in crawfish meat by

electrospray LC-MS/MS on the TSQ quantum discovery MAX, Thermo fisher

scientific, San Jose, CA, USA.

31. W. Lui, C. Zhao, Y. Zhang, S. Lu, J. Liu, R. Xi (2007), Preparation of

polyclonal antibodies to a derivative of 1-amonihydantoin (AHD) and development

of an indirect competitive ELISA for the detection of nitrofurantoin residue in

water. Journal of Agriculture and Food Chemistry, Vol.55, 6829-6834.

32. 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the

performance of analytical methods and the interpretation of results.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Săc đô cua hôn hơp chuân.

P 1.1: Sắc đồ hôn hơp chuẩn nitrofuran 1 ppb.

P 1.2: Săc đô hôn hơp chuẩn nitrofuran1,5 ppb.

P 1.3: săc đô hôn hơp chuẩn nitrofuran 2 ppb.

P 1.4: săc đô hôn hơp chuẩn nitrofuran 5 ppb.

Phụ lục 2: Săc đô mâu thêm chuân

P 2.1: săc đô mâu thit lơn thêm chuân hôn hơp nitrofuran tai mƣc nông đô 1 ng/g.



P 2.4: săc đô mâu thit lơn thêm chuân hôn hơp nitrofuran tai mƣc nông đô 1,5 ng/g.






Phụ lục 3: cách tính điểm IP

P 3.1: Quan hê giƣa cac ky thuât khôi phô va sô điêm IP đat đƣơc

P 3.2: Ví dụ về số điểm IP đạt đƣợc đối với các kỹ thuật khối phổ khác nhau

Phụ lục 4:

P 4.1: Bảng qui định hệ số biến thiên tại các cấp nồng độ

P 4.2: Bảng qui định về độ thu hồi tại các cấp nồng độ

Documents

Dư lượng kháng sinh nhóm nitrofuran trong vài loại thực phẩm tươi sống bằng LC/MS/MS