Dual-Bioaumentación estrategia para mejorar la Remediación de suelos contaminadosT. M. ROANE, * K. L. Josephson, e I. L. PIMIENTADepartamento de Suelos, Agua y Ciencias Ambientales de la Universidad de Arizona,Tucson, Arizona 85721 Recibido el 6 de noviembre de 2000 / Accepted 1 de mayo de de 2001

Aunque se cree que los metales para inhibir la capacidad de los microorganismos para degradar contaminantes orgánicos, varios Se sabe que existen mecanismos microbianos de resistencia a metal. Este estudio examinó el potencial de microorganismos resistentes a cadmio para reducir los niveles de cadmio solubles para aumentar la degradación de 2,4-diclorofenoxiacético ácido (2,4-D) en condiciones de cocontamination. Cuatro microorganismos del suelo cadmio resistente fueron examinados en este estudio. Resistente hasta una concentración de cadmio de 275 Capítulos 21 mg, estos aislados representado a la Arthrobacter común del suelo, Bacillus y Pseudomonas. Los aislados de Pseudomonas sp. Tensión H1 y Bacillus sp. cepa H9 tenía un mecanismo intracelular dependiente del plásmido de desintoxicación cadmio, la reducción de los niveles de cadmio solubles en un 36%. Los aislados cepa de Arthrobacter D9 y Pseudomonas cepa I1a tanto producido una capa de polímero extracelular que une y reduce los niveles de cadmio solubles en un 22 y un 11%, respectivamente. Aunque ninguno de los aislamientos resistentes a cadmio podría degradar 2,4-D, los resultados de doble bioaumentación estudios realizados tanto con cultivo puro y microcosmos del suelo de laboratorio mostraron que cada uno de cuatroaislamientos cadmio resistente apoyaron la degradación de 500-mg ML21 2,4-D por el cadmio sensible 2,4-D degradador Ralstonia eutropha JMP134. La degradación se produjo en presencia de hasta 24 mg de cadmio ML21 en cultivo puro y hasta 60 mg de cadmio en el microcosmos g21 suelo enmendado. En un estudio de campo experimental llevado a cabo con biorreactores de suelo de 5 galones, se evaluó de nuevo la estrategia de doble bioaumentación. Aquí, el cadmiumresistant aislar Pseudomonas cepa H1 degradación mejorada de 2,4-D en los reactores inoculados con R. eutropha JMP134 en presencia de 60 mg de g21 cadmio. En general, dual bioaumentación parece ser un viable enfoque en la remediación de suelos cocontaminated. Cocontaminated suelos, suelos contaminados con metales tanto y los compuestos orgánicos, se consideran difíciles de remediar debidola naturaleza mixta de los contaminantes. Una alternativa de tratamiento a la excavación caro y la incineración (9) de metal contaminado con suelos es bioaumentación con el metal-desintoxicante y / o microorganismos que degradan orgánicos (1, 3, 4, 6, 18). Muchos microorganismos son conocidos para degradar una variedad de compuestos orgánicos, yDel mismo modo, un número de microorganismos resistentes de metal son conocidos para desintoxicar los metales, como el selenio, mercurio y cadmio (23, 27). En los sitios cocontaminated, inhibe la toxicidad de metales la actividad de los microorganismos que degradan orgánicos (24). Por consiguiente, biorremediación esfuerzos se centran en la reducción de la toxicidad de metales en sitios con contaminantes mixtos. Hasta hace poco, la bioaumentación Los estudios se centraron en la introducción de una microorganismo que era a la vez un metal resistente y capaz de degradación orgánica. En condiciones de campo, este enfoque es a menudo sin éxito. Una razón puede ser que los requisitos de energía para mantener la resistencia a metales concurrente y orgánica la degradación son demasiado altos, y el organismo introducido no puede realizar ambas actividades en condiciones ambientales.El tema de la cocontamination es grave, ya aproximadamente el 37% de todos los sitios contaminados en los Estados Unidos solamente contienen tanto metales y contaminantes orgánicos (20; W. W. Kovalich, Jr., conferencia magistral, cuarto Mundial Congr. Chem.Eng., P. 281-295, 1991).El enfoque utilizado en este estudio fue coinoculate con una población-desintoxicante de metal y una población orgánico degradantes que forma cooperativa funcionado para remediar tanto metálicas y los contaminantes orgánicos en un sistema cocontaminated. La hipótesis que la población resistente de metal podría proteger la población sensible de metal orgánico de degradación a partir de metal toxicidad. Stephen et al. (27) que se utilizan bacterias resistentes de metal a proteger el suelo indígena b-subgrupo proteobacterium amoniaco oxidantes. Metales, entre ellos el cadmio, el plomo y el mercurio, son, en la mayoría casos, microcida; sin embargo, algunas bacterias han desarrollado la capacidad para resistir y desintoxicar estos metales. desintoxicación de metales estrategias, incluyendo los de cadmio, pueden incluir metales el secuestro y la

precipitación (2, 10, 14, 26), que reducen las concentraciones de metales solubles. A diferencia de los orgánicos, metales no puede degradarse, y por lo tanto la mayoría de los enfoques de remediación biológica de metalesconfiar en la desintoxicación y la inmovilización de la metales tanto para reducir la toxicidad biológica y para retrasar el metal transporte. El objetivo de este estudio fue determinar la eficacia de dual bioaumentación con el metal-orgánico desintoxicante y degradadorabacterias para facilitar la degradación orgánica dentro cocontaminated sistemas. Este objetivo fue examinado en coamended Los estudios de soluciones, en suelos cocontaminated en el laboratorio, y en un experimento de campo piloto. Cuatro diferentes cadmio resistenteaislados bacterianos que no degradan 2,4-diclorofenoxiacético ácido (2,4-D) se ensayaron para determinar la capacidad de permitir la degradación del 2,4-D a ocurrir en la presencia de niveles tóxicos de cadmio, utilizando Ralstonia eutropha JMP134 como el degradador de 2,4-D.

ATERIALES Y MÉTODOSCepas bacterianas. Cuatro bacterias del suelo altamente resistente cadmio fueron elegidos para este estudio: Arthrobacter sp. D9 cepa Bacillus sp. colar H9, Pseudomonas sp. cepa H1, y Pseudomonas sp. cepa I1a (Tabla 1). El aislamiento y la caracterización de estas cepas han sido descritos por Roane y Pepper (22). cadmio bacterias resistentes se cultivaron en un medio de sales minerales definido (HSH) modificado con cadmio solubles como CdCl2 en concentraciones 0-45 Capítulos 21 mg para representar las concentraciones observadas en los sitios contaminados. el MSM contenía lo siguiente: 0,5 g de citrato de sodio (C6H5Na3O7), 0,1 g de magnesio sulfato (z 7H2O MgSO4-), 1,0 g de sulfato de amonio [(NH4) 2SO4], 1,0 g de glucosa (C6H12O6), y 0,1 g de pirofosfato de sodio [Na4P2O7 (H2O) 10], tamponado a pH 6,0 con ftalato de potasio (KHC8H4O4). En la biodegradación 2,4-D estudios, un MSM modificada se utilizó en el que la glucosa se reemplazó con 500 mg de 2,4-D ML21, y ácido 2-etanosulfónico [N-morfolino] (C6H13NO4S) sustituido ftalato de potasio, que interfería con el 2,4-D las lecturas de absorbancia.Todo el cultivo posterior se llevó a cabo en 25 ml de MSM modificadas con cadmioy se incubaron a 28 ° C en un agitador rotatorio a 180 rpm. El nivel de resistencia máxima (MRL) se definió como la concentración más alta de cadmio en los que al menos 104 células cultivables ML21 se mantuvieron después de 48 h a partir de una inoculación inicial de 106 células ML21. El LMR de cadmio refleja la grado de resistencia al cadmio. Se determinaron las concentraciones de cadmio el uso de un espectrofotómetro de absorción atómica de llama después de la centrifugación en 10000 3 g por 20 min y la filtración de la muestra con un filtro de 0,2 mm de tamaño de poro. Ralstonia eutropha JMP134 (anteriormente Alcaligenes eutrophus JMP134) contiene el 80-kb PJP4 plásmido que codifica para la degradación de 2,4-D a 3-oxoadipate (13). La degradación de ácido succínico está parcialmente mediada por cromosómicamente enzimas codificadas (19, 25, 28).experimento destino cadmio. Después de la inoculación individuo con cada uno de los aislamientos, cualquier reducción en la cantidad de cadmio soluble en el caldo era medido usando absorción atómica. Por lo tanto, cualquier reducción en cadmio biodisponible debido a las interacciones microbianas específicas podrían ser

evaluados. En matraces replicados, cada aislado fue crecido en 25 ml de caldo de MSM durante 48 horas a 28 ° C en varios cadmio niveles de hasta el LMR. Precipitó y se recogió cadmio asociado a células Después de centrifugar a 10 000 3 g durante 20 min y se acidificó con HCl 1 N a solubilizar el cadmio. Una evaluación microscópica inicial se realizó para confirmar la lisis celular tras la acidificación. Tanto el sobrenadante y la célula acidifica la suspensión se examinaron para el cadmio. Mecanismo de resistencia al cadmio. (I) Detección del operón Cad. Cebadores desarrollado por Endo y plata (7) se utilizaron para detectar el operón cad, que codifica para una bomba de eflujo de cadmio. El ADN cromosómico fue extraído por medio de celular directa lisis a 98 ° C. El procedimiento de lisis alcalina de Kado y Liu (12) se utilizó para aislar y purificar ADN plasmídico.Touchdown PCR con temperaturas de recocido paso que van desde 54 hasta los 67 ° C se utilizó para amplificar las secuencias diana en extractos de células lisadas y del plásmido DNA. El primer concentración usada fue 7,7 pmoles por reacción. productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa Tris-borato-EDTA-1,2% a 100 V CM21, se tiñeron con bromuro de etidio (1 mg Capítulos 21), y se observa bajo luz UV.(Ii) Producción de polímeros extracelulares. Muchos microorganismos tienen extracelularcapas poliméricas que confieren resistencia a metales. Estas capas poliméricas son de naturaleza aniónica y por lo tanto atraen y secuestran metales catiónicos. El rápido método de cribado desarrollado por Liu et al. (17) se utilizó para detectar la cadmiumresistant aislamientos para la producción de dos exopolisacáridos bacterianos (EPSS), succinoglicano o galactoglucon (EPS II). El método se basa en el diferencial tinción de polímero que producen frente a organismos no poliméricos que producen. (Iii) TEM. Se utilizó microscopía electrónica de transmisión (TEM) para evaluar morfológica cambios en respuesta a la exposición al cadmio. Las bacterias (1,5 ml) cultivadas en MSM (pH 6,0) que contiene 20 mg de cadmio ML21 para Pseudomonas cepa I1a y Arthrobacter cepa D9 y 125 mg de cadmio para ML21 cepa de Pseudomonas H1 y cepa de Bacillus H9 fueron cosechadas durante el crecimiento logarítmico por granulación a 14.000 g durante 3 min 2. Las células se enjuagaron en agua desionizada estéril y se fijaron en 3% de glutaraldehído en tampón de cacodilato 0,1 M, pH 6,0, saturado con oxina (Sigma Inc.), utilizando la fijación de microondas (8, 16) para minimizar la lixiviación de cadmio asociada con la fijación tradicional. Oxina reacciona específicamente con metales pesados, aumentando el contraste bajo el TEM (30) de afirmación visual de los depósitos de metal. Las células se fijaron posteriormente en 2% de osmio en tampón cacodilato 0,1 M, pH 6,0. Siguiendo la fijación, las células se deshidrataron usando un gradiente de grado reactivo etanol-H2O en cada concentración: 30, 50, 70, 95, 100, 100, y 100% (11). Las células se infiltraron con resina Spurr a concentraciones de 50% y después 100% (Ted Pella Inc., Redding, Calif.). Las muestras se polimerizan durante la noche a 70 ° C, delgada seccionada con un RCM MT-7000 microtomo (Research Manufacturing Corp., Tucson, Ariz.), Y vistos a 60 kV con un TEM Philips 420 (Philips Electron Optics Inc., Mahwah, N. J.). acumulación de cadmio se confirmó usando Noran Voyager Series II X3 elemental espectroscopia de dispersión (Noran Instruments, Inc., Middleton, Wisc.). (Iv) los perfiles de plásmido y curado. Dado que la resistencia del metal se puede plásmido codificado, los cuatro aislamientos fueron examinados para la presencia de plásmidos que van en tamaño de 2,6 a 350 MDa después de la incubación en presencia de 3 o 12 mg de ML21 cadmio en función del nivel de resistencia de la cepa aislada. extracciones de plásmido usado el procedimiento de lisis alcalina de Kado y Liu (12). aislamientos resistentes a cadmio que contienen plásmidos fueron curados de sus plásmidos el uso de aumento de la temperatura y un medio no selectivo. Los aislados se sometieron cuatro transferencias sucesivas (0,1 ml de aislamientos en 25 ml de caldo nutriente) en caldo (Difco, Baltimore, Md.) que no contiene cadmio, eliminando de este modocualquier posible presión de selección. Los aislamientos fueron incubadas a 37 ° C en una rotativa agitador a 180 rpm. extracciones plásmido se realizaron al final de las cuatro transferencias. "Curado" aislados fueron entonces reinoculado en HSH con y sin cadmio estrés volver a evaluar el LMR de cada aislamiento al cadmio. Los estudios de degradación. R. eutropha JMP134 era cadmio sensible en este estudio en el que a niveles superiores a 3 mg de cadmio ML21, no hay células viables R. eutropha fueron detectados (, 102 células ML21 a partir de un inóculo inicial de 104 células ML21). Nota, sin embargo, que la sensibilidad de cadmio es la concentración inoculante dependiente, y concentraciones de células muy altas de R. eutropha JMP134 son más tolerantes cadmio (K. L. Josephson, comunicación personal). Dado que la degradación es a menudo inhibida en la presencia de metal (s), la capacidad de los aislados resistentes a cadmio para apoyar Se examinó la degradación de 2,4-D de R. eutropha JMP134. La degradación de 2,4-D por R. eutropha JMP134 fue controlado en la presencia de varios de cadmio los niveles de la inoculación con uno de los aislados de cadmio-resistente. Concentraciones de 2,4-D en los extractos de cultivo se midieron cada 24 horas a 230 nm siguiente

centrifugación a 14.000 3 g durante 2 minutos para eliminar los desechos celulares. La relación entre la concentración de 2,4-D y su absorbancia a 230 nm era lineal, con y un valor de 2 0.03x 0.07 (r2 5 0,991). (I) Cultivo puro. En experimentos con cultivos puros de réplica, 25 ml de MSM tamponadas a pH 6,0 con ácido 2-etanosulfónico [morfolino] (Sigma Inc.) fue modificado con 500 mg de 2,4-D ML21 y, o bien 12 o 24 mg de cadmio ML21 dependiendo en el LMR de cada aislado individual. Cada frasco de cultivo se inoculó con 104 CFU de cualquiera de las cepas Arthrobacter aislado de cadmio resistente a D9, Pseudomonas la cepa H1, Bacillus H9 cepa, cepa o Pseudomonas I1a Capítulos 21 y se incubaron a 28 ° C durante 48 horas a 180 rpm. (Ii) microcosmos del suelo. Una vez establecido en cultivo puro, las capacidades de éxito aislamientos para proteger R. eutropha JMP134 se examinaron de la toxicidad del cadmio en artificialmente suelo de metal contaminados. Para determinar si la degradación de 2,4-D podría se facilitará en el suelo contaminado con cadmio, 100 g de una Brazito no contaminada suelo franco arenoso fue modificada, con 1% (p / p) de glucosa, 500 mg de ML21 2,4-D, y 60 mg de cadmio ML21 (concentraciones finales). La glucosa se utiliza como un fácilmente fuente de carbono metabolizable para apoyar a las poblaciones de cadmio-resistente. Suelo microcosmos (500 ml frascos de boca ancha de polipropileno) se incubaron a 28 ° C y se mantiene a 14% (peso / peso) de humedad del suelo (75% de capacidad de campo). Similar a la pura experimentos de cultivo, cada microcosmos suelo se inoculó con una de las cadmio aislados resistentes (104 UFC G21) mediante la inclusión de la cepa con la inicial modificación de humedad (a la capacidad de campo 75%) seguido de una mezcla de suelo vigorosa. Tras una incubación de 48 h, microcosmos apropiadas se inocularon con 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21, de nuevo en relación con la enmienda a la humedad. microcosmos de control consistieron en suelo modificado con glucosa, 2,4-D, y cadmio sin inóculos y el suelo modificado con glucosa, 2,4-D, y el cadmio inoculado con solamente un aislado de cadmio-resistentes o R. eutropha JMP134. Las concentraciones de 2,4-D en extractos de suelo se midieron diariamente para un total de 50 días. Uno a diez suelos fangosos se realizaron utilizando 0,1% (peso / vol) de pirofosfato de sodio para neutralizar la carga de partículas de suelo, se centrifugó a 14.000 3 g durante 10 min, y leer espectrofotométricamente a 230 nm. Las muestras se analizaron por duplicado, y el experimento microcosmos del suelo se realizó tres veces. Las muestras de suelo sin 2,4-D se utilizaron como espacios en blanco para restar la absorbancia de fondo, que era, 1% de la absorbancia total. (Iii) biorreactores de campo. Los estudios de laboratorio microcosmos del suelo con el aislado Pseudomonas H1 cepa se repitieron en un nivel intermedio a escala de campo (otra aislamientos no fueron examinados a escala de campo). Se eligió la cepa Pseudomonas H1 debido a su resistencia de cadmio (a una concentración de 225 mg ML21) y culturability. El H9 aislado de la cepa de Bacillus no fue examinado a pesar de que era también altamente resistente (a una concentración de 275 mg ML21), a fin de evitar complicaciones que resulta de la formación de esporas. Biorreactores se establecieron bajo un campo condiciones para confirmar los resultados de microcosmos de laboratorio. Se inició el estudio de campo en junio de 1998 y concluyó en septiembre de 1998.biorreactores de cinco galones de polipropileno (45,7 por 76,2 cm), que se encuentra en la Universidad de la Estación Agrícola de Arizona Campbell Avenue, Tucson, se colocaron en virtud de un área sombreada construido de manera que se evite la luz solar directa, ya que durante el día las temperaturas fueron rutinariamente en exceso de 37,8 ° C (100 ° F). Cada reactor contenía aproximadamente 27 kg de arena arcillosa Brazito a 14% (peso / peso) contenido de humedad modificado con 500 mg de 2,4-D g21 y / o 60 mg de g21 cadmio. La Pseudomonas sp. aislado de la cepa H1 y el 2,4-D eutropha degradador R. JMP134 eran inoculado en 104 CFU g (peso seco) de soil21. Inoculantes y enmiendas del suelo se mezclaron a fondo en el suelo utilizando una mezclador de cemento (se aclaró con etanol al 70% entre tratamientos) antes del inicio de el experimento mientras que proporciona un período de incubación de 48 h entre la inoculación con Pseudomonas H1 tensión y la adición de R. eutropha JMP134. Tratos se crearon con el fin de reducir al mínimo la contaminación cruzada entre las enmiendas, por ejemplo, 2,4-D-únicos tratamientos seguidos por tratamientos de 2,4-D-plus-cadmio seguidos por 2,4-D-más-R. eutropha seguido de Pseudomonas H1 cepa y así sucesivamente. Hubo 7 tratamientos (ver Tabla 4), cada uno con dos repeticiones, para un total de 14 biorreactores. La humedad del suelo se mantuvo a 14% (peso / peso) en todo el experimento. Temperatura ambiente varió de 16,7 ° C (62 ° F) a 48,9 ° C (120 ° F). muestras de suelo (45 por 2,5 cm) se recogieron semanalmente y analizaron las concentraciones de 2,4-D. absorbancia de fondo a 230 nm se controló en los reactores sin enmienda 2,4-D y se restó de cada muestra de lectura de 2,4-D. A eliminar la contaminación cruzada, el extractor suelo fue desinfectada con lejía al 10%Después de cada toma de muestra. Cultivables microorganismos 2,4-D-degradantes se enumeraron en una eosina azul de metileno (EMB) desarrollado por medio DiGiovanni et al. (5). La acidez producida durante la

degradación de 2,4-D causó la eosina azul para teñir la colonia morado oscuro. Estudios previos en nuestro laboratorio han confirmado que el color púrpura aparición de colonias es indicativo de la degradación de 2,4-D (5). Algunos de los aislados a partir del medio EMB se rastrearon además para identificar posibles transconjugantes. El proceso de selección incluyó la realización de intragenic enterobacteriasconsenso PCR para huellas genómicas (29) y PCR para amplificar el gen tfdB encontrado en PJP4 (5), un perfil de plásmido para detectar la 80-kb PJP4 (12), y el análisis de la degradación de 2,4-D usando cromatografía de líquidos de alta presión o espectroscopia a 230 nm. Comparación de los resultados del proceso de selección de los con R. eutropha JMP134 permitido enumeración transconjugante. RESULTADOSLa resistencia al cadmio. Como se resume en la Tabla 1, los cuatro los aislados eran resistentes a una amplia gama de concentraciones de cadmio, de 20 a 275 mg ML21. Sólo H1 cepa de Pseudomonas y la cepa de Bacillus H9 tenía plásmidos, de 18,5 y 10,4 kb, respectivamente. Al plásmido curado, ni H1 ni H9 se mantuvo cadmio resistentes, y eran incapaces de crecer en el presencia de 125 mg de ML21 cadmio (niveles de aproximadamentela mitad de los LMR), respectivamente. El operón Cad no era identificado en cualquiera de los aislados. mecanismos observados de resistencia cadmio incluyen extracelular y el secuestro intracelular. extracelular de unión de cadmio fue observado con la cepa Arthrobacter D9 y cepa de Pseudomonas I1a (datos mostrados para I1a; Fig. 1a yb). Después de la producción de EPS en la cepa de Pseudomonas aislado era I1a confirmado con la tinción, la respuesta del aislado de 20 mg de ML21 cadmio se observó bajo el TEM. el secuestro de cadmio por la capa de EPS fue evidente como un precipitado oscuroque rodea las células (Fig. 1b).Por el contrario, la acumulación intracelular de cadmio en Pseudomonas H1 cepa y cepa de Bacillus culturas H9 fue observados (datos de H1 se muestra; Fig. 1C y D). Para Pseudomonas cepa H1, bajo TEM y en presencia de 125 mg de cadmio ML21, grandes acumulaciones intracelulares de cadmio fueron confirmados con EDS (Fig. 1d). También hubo un aumento en la densidad celular indicativa de la unión a cadmio no específica las celdas. Los controles negativos incluyeron células cultivadas en ausencia de cadmio. El efecto del crecimiento bacteriano y la resistencia del metal sobre el cadmio También se examinó la solubilidad en un experimento de destino cadmio (Tabla 2). La cantidad de cadmio presente en la solución disminuido con aislamientos I1a, D9, H1, H9 y con el crecimiento de 104 a 108 CFU ML21. Las disminuciones más dramáticas en los niveles decadmio solubles fueron vistos con Pseudomonas H1 tensión y Cepa de Bacillus H9, tal que un promedio de 36% se perdió con crecimiento. El crecimiento de la cepa Arthrobacter D9 y Pseudomonas I1a cepa resultó en el 22 y el 11% disminuye en cadmio solubles.Sobre la base de los controles con metal y sin inóculos, 0,99% de el total de cadmio permaneció soluble. Los estudios de degradación. Se realizaron varios experimentos para determinar el método de coinoculación. Se encontró que si una población de cadmio resistente y R. eutropha JMP134 eran coinoculado al mismo tiempo, no se produjo degradación y R. eutropha JMP134 no era recuperable. El mismo resultado se si se encuentra R. eutropha JMP134 se inoculó 24 h después de la población cadmio resistente se añadió a la cadmio medio de cultivo de 2,4-D. Sin embargo, después de 48 h después de la inoculacióncon una población de cadmio-resistentes, los frascos de cultivo inoculado con 104 UFC de R. eutropha JMP134 ML21 lo demostró degradación. A la biomasa de inoculación pequeño se utilizó tanto en el cultivo puro y los experimentos de suelo para evaluar las capacidades de las poblaciones inoculadas crezcan y se realizan bajo contaminada y, en el suelo, las condiciones no estériles. Aumento con una biomasa más pequeño en escenarios de campo puede ser deseable. También se encontró que las células .105 ML21 "artificialmente" disminuyó niveles de de metal soluble debido a una mayor unión celular. Para que la degradación de 2,4-D-cadmio sensible a ocurrir en la presencia de cadmio, las concentraciones de cadmio biodisponibles tuvo que ser desintoxicado. Las habilidades de los cuatro cadmio suelos resistentes aislados, D9 cepa de Arthrobacter, Pseudomonas la cepa H1, Bacillus H9 cepa y cepa Pseudomonas I1a (Tabla 1), para desintoxicar cadmio tal que JMP134 R. eutropha podría degradar ML21 500 mg de 2,4-D se determinó por primera vez en el caldo (Figura 2). Los experimentos demostraron que 104 CFU de R. eutropha JMP134 ML21 solo en la presencia de .3 mg de cadmio ML21 no degradar 2,4-D, presumiblemente a causa de la toxicidad del cadmio. Además, ninguno de los aislados de cadmio resistente podría degrada 2,4-D (datos no mostrados). En consecuencia, la doble-bio- enfoque de aumento se examinó inicialmente con caldo de MSM modificado con 500 mg de ML21 2,4-D y cadmio, en el que el caldo contaminado se inoculó con 104 CFU de un cadmio resistente ML21 aislar, se incubaron durante 48 horas a 28 °

C, y luego reinoculado con 104 UFC de R. eutropha JMP134 ml 21. completa degradación 2,4-D por R. eutropha JMP134 se produjo en presencia de 12 mg de cadmio ML21 con el cadmio resistente aislar Pseudomonas cepa I1a y 24 mg de cadmio con ML21 el cadmio-aislados resistentes Arthrobacter cepa D9, Bacillus H9 cepa, y Pseudomonas H1 cepa. Curiosamente, cuando los niveles de cadmio soluble tras el crecimiento de cada uno de los aislados resistentes a cadmio analizada en la Tabla 2 fueron examinados, parecía que los niveles de solubilidad cadmio seguía siendo demasiado alto como para soportar la degradación de 2,4-D por R. eutropha JMP134. Puede que haya habido adicional mecanismos de desintoxicación no identificados que el cadmiono redujo las concentraciones de cadmio solubles pero que rinden el cadmio no tóxico, como se ve con quelación. El suelo no contaminado utilizado en el microcosmos del suelo laboratorio era un suelo franco arenoso con arcilla Brazito 12%, 0,21% orgánico materia, pH 8,2, y no se conoce ningún exposición a metales anterior. Indígena el número de microbios en el suelo fueron de 3,2 3 107 6 9,1 3 106 cultivables g21 UFC de peso seco en medio R2A (Difco, Baltimore, Md.) Y 7,2 3 107 6 3,2 3 106 células totales de g21 peso seco, determinado por microscópico directo de naranja de acridina número de reproducciones. En el microcosmos del suelo de laboratorio, las cepas resistentes a cadmio Pseudomonas cepa H1, la cepa de Bacillus H9, Arthrobacter cepa D9, y Pseudomonas cepa I1a aparecieron para desintoxicar cadmio, protegiendo de esta manera R. eutropha JMP134 de cadmio toxicidad como la degradación del 2,4-D se produjo en presencia de 60 mg de cadmio G21. cadmio Soluble no era detectable en los suelos enmendados; Sin embargo, los efectos de toxicidad de cadmio eran observado en los suelos contaminados como R. eutropha JMP134se inhibió la degradación de 2,4-D. Tabla 3 resume la específica las tasas de degradación para cada aislamiento. Dentro de 50 días, el cadmio resistentes a Pseudomonas cepas H1 y I1a permitido la degradación completa de 500 mg de 2,4-D ML21. Tras la adición H9 de la cepa de Bacillus cadmio resistente y Arthrobacter cepa D9, la degradación se produjo dentro de los 35 días. Curiosamente, ni la flora microbiana indígena ni el cadmio resistente aislados podrían degradar 2,4-D en el cadmio contaminado sistema del suelo dentro del plazo de 50 días. Bajo la condiciones de este experimento, R. eutropha JMP134 tampoco lo hizo degradar el 2,4-D cuando estaba presente el cadmio. En el suelo Brazito modificada solamente con 2,4-D, completa degradación 2,4-D por R. eutropha JMP134 se produjo dentro de los 5 días. Se debería notar que el suelo Brazito utilizada en este estudio no era estéril y en consecuencia, presenta retos competitivos para el introducida organismos, y sin embargo la degradación todavía se produjeron en el suelos cocontaminated sobre la inoculación con el cadmio resistente aislamientos.También probamos la estrategia de doble bioaumentación en un intermedio experimento a escala de campo. En el campo intermedio escala, más variabilidad era evidente que en la escala de banco estudios (Fig. 3). Sin embargo, varias conclusiones pueden seguir siendodibujado. Cuando se añadió 2,4-D para el suelo sin Brazito cadmio, bajas tasas de degradación en última instancia, se produjeron sin bioaumentación con R. eutropha JMP134 (Fig. 3a), como

HIGO. 1. micrografías TEM de la cepa Pseudomonas I1a en ausencia de cadmio (a) y cuando se exponen a 20 mg de ML21 cadmio (b). Nota el precipitado oscuro (ep) asociado con la capa de EPS de los alrededores (b), confirmado como el cadmio por análisis de rayos X elemental. Las micrografías TEM de Pseudomonas H1 cepa en ausencia de cadmio (c) y cuando se exponen a 125 mg de ML21 cadmio (d) se muestran. Tenga en cuenta las acumulaciones densas (GR), confirmados para ser cadmio con el análisis elemental. Tanto en los paneles B y D, la densidad celular total aumentó debido a la unión no específica de metal. Bares iguales a 0,5 mm. En el espectro proporcionado, el cobre (Cu) picos eran de la rejilla de cobre, el silicio (Si) pico fue de la incrustación Spurs medianas, y el pico de osmio (Os) era de tinción con OsO4. Los cadmio (Cd) picos confirmaron la presencia de cadmio

HIGO. 2. En el caldo, cadmio desintoxicación por cepas Arthrobacter cepa D9, la cepa de Bacillus H9, Pseudomonas cepa H1, y la cepa de Pseudomonas I1a permite la degradación de 2,4-D por el cadmio sensible R. eutropha JMP134 en presencia de 12 mg de ML21 cadmio para el aislado I1a y 24 mg de ML21 de cadmio para aislamientos D9, H1, y H9. Dentro de los 120 h, todos los aislados permiten la degradación de 500-mg ML21 2,4-D a niveles indetectables. Los tiempos que se indican fueron de 48 h después de la inoculación con la cepa resistente a cadmio.

HIGO. 3. La degradación de 500 mg-g21 2,4-D y la aparición de poblaciones microbianas 2,4-D-degradantes con el tiempo en semanas, como se detecta en biorreactores a escala piloto de campo que contenían tierra Brazito modificarse sólo con el 2,4-D (Tratamiento 1) (a); 2,4-D y 60 mg de g21 cadmio (Tratamiento 2) (segundo); 2,4-D y 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21 (Tratamiento 3) (c); 2,4-D, 60 mg de g21 cadmio, y 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21 (Tratamiento 4) (d); 2,4-D, 60 mg de g21 cadmio, 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21, y 104 CFU de la cepa de Pseudomonas resistentes a cadmio g21 H1 (tratamiento 7) (e). El número original de microorganismos degradadores de 2,4-D fue menos de 102 UFC g21 del suelo antes de la bioaumentación. Tratamiento 5 (2,4-D y Pseudomonas cepa H1) y Tratamiento 6 (2,4-D, 60 mg de cadmio G21, y Pseudomonas H1 cepa) no se muestran poblaciones microbianas indígenas aclimataron a la 2,4-D. Sin embargo, incluso después de 10 semanas, la degradación fue incompleta, y los niveles de 2,4-D no disminuyeron entre las semanas 5 y 10. El degradación aparente observada en ausencia de la inoculación enel campo indica la presencia de una población nativa de 2,4- microorganismos D-degradante que no fueron detectados en el suelo experimentos de microcosmos. En presencia de 60 mg de cadmio g21, la degradación indígena parecía ser inhibida en el ausencia de bioaumentación (Fig. 3b) a pesar de que degradadores de 2,4-D eran cultivables en el suelo después de 8 semanas. En virtud de todo las condiciones de tratamiento, en ausencia de R. eutropha JMP134 inoculación, 2,4-D que degradan los organismos no aparecieron hastasemana 8. La ocurrencia de estos microorganismos degradadores puede haber sido debidoal microsite variación en las concentraciones de cadmio en el suelo o el el uso de fuentes de carbono alternativas disponibles en el suelo. En el laboratorio, hemos observado que las poblaciones bacterianas eran resistente cadmio y podría degradar 2,4-D que no pudieronpara resistir cadmio y degradar 2,4-D simultáneamente, posiblemente debido a la demanda de energía se coloca sobre el organismo. Por consiguiente, los microorganismos degradadores indígenas 2,4-D pueden no haber sido capaces de degradar 2,4-D en presencia de cadmio, ya el medio EMB utiliza para seleccionar los organismos 2,4-D-degradarno contenía cadmio. En los reactores inoculados con R. eutropha JMP134, el número de 2,4-D-degradar organismos cayó desde el inoculado 104 UFC de R. eutropha JMP134 g21 a, 102 CFU de 2,4-D-degradar organismos g21 durante semana 1 a 3. Por semana 4 o 5, sin embargo, el número de degradadores de 2,4-D aumentaron de manera espectacular, a 107 UFC G21 (fig. 3c de correo).En Tratamiento 3 (Fig. 3c), con 2,4-D y R. eutropha JMP134, como se observa en todos los reactores inoculado con R. eutropha JMP134, una población de 2,4-D-degradantes era evidente por semana 5 (105 UFC G21). La

concentración de 2,4-D en Tratamiento 3 se redujo a 300 mg kg21 en las primeras 4 semanas y luego se mantuvo estable, indicador de una degradación incompleta o bajas tasas de degradación. Curiosamente, la degradación ocurrido antes de la aparición de microorganismos degradadores de 2,4-D, probablemente debido en parte a algunos microorganismos degradadores no cultivables en el OE medio. El tratamiento en 4 reactores (cadmio y R. eutropha JMP134; Higo. 3d), la degradación fue menos aparente, e incluso aunque por semana 6, 107 2,4-D degradadores g21 podrían ser recuperados, cadmio parecía tener un efecto sobre la degradación de 2,4-D.

Sin embargo, cadmio afectó a la degradación por el aumento de la la variabilidad de las lecturas, y en el tratamiento 7 (Fig. 3d), el Además de Pseudomonas H1 cepa aumentó significativamente la velocidad de degradación de 2,4-D (P 5 0,015). degradación significativa se observó en los tratamientos tanto con la cepa Pseudomonas H1 y R. eutropha JMP134 (Tratamiento 4 frente al Tratamiento 7 Tratamiento y 6 frente Tratamiento 7). No era la degradación observado en los tratamientos con Pseudomonas cepa H1 sola (Tratamiento 1 Tratamiento contra 5 y 2 frente al Tratamiento Tratamiento 6).DISCUSIÓNEste estudio ha demostrado el uso de un doble bioaumentación estrategia en la rehabilitación de los sistemas contaminados. Esta estrategia involucró la coinoculación de un metal resistente población microbiana con una población orgánica-degradantes, el principal modo de acción de desintoxicación de ser de metal, tales que la degradación orgánica ya no se inhibió. Residencia en resultados prometedores en experimentos de laboratorio con tanto pura cultivo y del suelo microcosmos, que examinaron esta estrategia en una prueba de campo. Las tasas de degradación de 2,4-D de R. eutropha JMP134 en presencia de Pseudomonas H1 cepa eran sorprendentemente similar en ambos el microcosmos del suelo laboratorio y en el estudio de campo (aproximadamente 50 días), aunque la degradación del 2,4-D no fue completa en el estudio de campo. También fue interesante la observación de que muchas de las 2,4-D-degradantes aislamientos preliminarmente examinaron para el plásmido PJP4 recuperado en el campo experimento no eran R. eutropha JMP134. Esto y la observación que la degradación indígena 2,4-D no fue significativa con cadmio sugerido que la transferencia del plásmido PJP4 a poblaciones indígenas se produjeron. El estudio de campo demostró que bioaumentación usando coinoculants es una opción viable para la remediación de metal- y orgánicamente contaminada suelos.Mientras que el operón Cad no se encontró en ningúna de las cepas aisladas, esto no excluye la presencia de un sistema de flujo de salida de cadmio; Sin embargo, los aislados examinados reducen las concentraciones de cadmio solubles, indica el uso de un mecanismo alternativo de resistencia. Como el metal soluble se piensa que es más tóxico que el consolidado o el metal precipitado, cada uno de los cuatro aislamientos efectivamente reducción de la toxicidad del cadmio. De los cuatro aislamientos, Pseudomonas H1 cepa y cepa de Bacillus H9 parecían utilizar una mecanismo intracelular de secuestro de cadmio. mientras intracelular acumulación de cadmio microbiana no ha sido así documentado, el aumento observado en la densidad de la membrana externa

tras la exposición a cadmio indicado unión de metal para lipopolisacáridos, tal como se encuentra por Landley y Beveridge (15). Metalotioneína producción y precipitación polifosfato representan dos posibles explicaciones en el que el cadmio es secuestrado intracelularmente. Sin embargo, el mecanismo exactode la acumulación intracelular de cadmio méritos investigación más a fondo. Las otras dos cepas resistentes a cadmio, Pseudomonas I1a cepa y cepa Arthrobacter D9, mostraron evidencia de EPS la producción de la tinción y bajo el TEM mostró cadmio acumulación externo a las células. Del mismo modo, un estudio de Roane (21) encontraron que la producción de EPS resultó en extracelular el secuestro de plomo. la unión a exopolímeros metal se conoce para reducir la toxicidad de metales. Aunque, en general asociada con adherencia y protección contra la desecación, actúan como exopolímeros fuertes atrayentes iónicos y, por lo tanto, se unen fácilmente los metales. Fue interesante que los dos mayoría de los aislados resistentes a cadmio fueron H1 cepa de Pseudomonas (resistente hasta 225 mg Capítulos 21) y H9 cepa de Bacillus (resistente hasta 275 mg Capítulos 21), que ambos mostraron una acumulación de cadmio intracelular. Los mecanismos de resistencia de estos dos organismos también se plasmídico codificado. Por último, los descensos más dramáticos en solubles cadmio en el crecimiento fueron vistos con Pseudomonas H1 cepa y la cepa de Bacillus H9, en que había una pérdida de 36% en soluble cadmio con el crecimiento. Arthrobacter cepa D9 y Pseudomonas I1a cepa mostró menos desintoxicación, con una disminución resultante de 22 y 11% en cadmio soluble con el crecimiento. Este estudio encontró que mientras que la doble bioaumentación con metal- desintoxicante y orgánica de degradación de las poblaciones microbianas se efectivo en la remediación cocontaminant, debe darse tiempo para la desintoxicación de metal que se produzca antes de la degradación orgánica es observado. No se observó evidencia de esto en las 48 h se necesitan entre la inoculación con la población en la desintoxicación de metales y la inoculación con la población orgánico degradantes. Encontramos que la viabilidad de la población orgánico degradantes disminuyó cuando se añade al sistema antes de la desintoxicación de metales.Sólo con este enfoque gradual con el fin BIOAUMENTO fue la recuperación de un suelo cocontaminated éxito.