小麦 (ハルユタカ) 粒中のプロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI) の分離精製

誌名誌名 日本食品保蔵科学会誌

ISSNISSN 13441213

著者著者

野口, 智弘新井, 智美野口, 治子内野, 昌孝髙野, 克己

巻/号巻/号 37巻5号

掲載ページ掲載ページ p. 245-248

発行年月発行年月 2011年9月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

245

ド

[研究ノート〕

(ハルユタカ)粒中のプロテインジスルフイ

イソメラーゼ (PDI)の分離精製

2011 NO.5 VOL. 37 日本食品保政科学会誌

小麦

( 31 )

野口智弘*1 ~ .新井智美*2・野口治子叫

内野昌 孝 ヰ 高 野 克 己*2

* 1 東京農業大学};t、m生物科学部食品加工技術センター* 2 東京農業大学応用生物科学部生物応用化学科

Grain (Haruyutaka)

NOGUCHI Tomohiro*l~ ， ARAI Satomi*2， NOGUCI-II HarukoぺUCI-!INO Masataka叫 andTAKANO Katsumi*2

Wheat Disulfide Isomerase from of Protein Purification

Food Processing CenteJ; Facu!tア ofApplied Biosoence，あわoUniversity of Agriじu!tw'e，

J -J -J Sakuragaoka， Setagava-kll， Tokyo J 56-8502

Department (ゲAppliedBio!ogy and Chemi，¥-rr); Facu!ty ol App!ied Biosoenι'e， Tokyo University of Agricu!ture，

J -J -J Sakuraga口ka，Setagaya-ku，五?kyo 156-0-8502

* 1

* 2

The protein disulfide isomerase (PDI) enzyme is involved in th巴 formationof disulfide bonds. Here

we attempted to purify PDI from wheat grain (Triticumaestivum cv. Haruyutaka). As a. result of

DEAE-Sepharose Fast Flow and affinity chromatography purification， 30. 74units of PDI activity/100g

of wheat grain were observed in the adsorbed fraction from the affinity chromatography column. The

molecular weight of this fraction was63kDa as determined by SDS-PAGE analysis. N-terminal amino

acid sequencing of this63 -kDa protein showed that the sequences of wPDI and this63 -kDa protein

shared79%identity， On the basis of this result， we assumed that the63 -kDa protein that we purified

from wheat (Haruyutaka) grain is the same as wPDI， which we used for genetic information， and that

our expression of this protein was sL1ccessful.

CReceiv巴dMal¥31， 2011 ; Accept巴dJ ul. 21， 2011)

山川出生

Key words : Pnρtein Disu(fide Jsomerase， PDJ， Wheat， Disulfide Bond， Dough

プロテインジスルフィドイソメラーゼ， PDI，小麦，ジスルフィド結合，

タンパク質のリフォールデイングを触媒する酵素であるo

PDIは様々な生物でその存在が明らかにされており，小

麦のPDIについても様々な研究が行われている。近年，

小麦粉内在PDIをコードするcDNAが分離され，1さらに

小麦PDIについてその種類や詳細な遺伝子解析が行われ

ている九一方で、，小麦より部分精製されたPDIとアス

コルビン酸を同時に添加することで，生地の物性がl合L仁

することも示されている九 筆者らは，これまでに小麦

mRNAからリコンビナントPDI(wPDI)の発現・精製

に成功し，その性状を報告している6110 しかしながら，

小麦より PDIを分離精製し取得した報告は，これまでに

ない。そこで，匡l内産小麦のハルユタカを用い小麦粒か

らのPDIの分離精製を試みた。

小麦は主に製粉され小麦粉として利用されている。小

麦粉は水を加えて練ることで，他の穀類にはみられない

独特のあliiJit('I~I: を示す生地を形成することから， パ ンや麺，

菓子など株々な食品に加工されている。この生地は小麦

の主要構成タンパク質であるグリアジンとグルテニンに

水を加えて混担することで形成するグルテンによるもの

である。

グルテンの形成は，犠々な分子間相互作用や結合が関

与 していると考えられているが，中でもジスルフィド結

合が最も主要であると考えられている。しかしながら，

生地視担時の物理的作用のみでジスルフイド結合が形成

されるとは考えにくい。

Protein Disulfide Isomerase lま(PDI ; EC5. 3.4.1)

干156-8502 東京都世田谷灰桜丘 1-1 -1

Corresponding author. E-mail: tomo@nodai.ac.jp 〒156-8502 東京都世間谷区桜丘 1-1 -1

ームPAvdη/】

*

*

246 日本食品保蔵科学会誌 VOL. 37 NO.5 2011 ( 32 )

試料および実験方法

1. 試 事ヰ

試料には，北海道産ハルユタカ (1トitIιlImaestIvlIm cv

Haruyutaka) をよFJいた。

2.酵素の抽出

酵素の抽出はKMl¥UMt¥OI (1998) らの方法を用いた。

小麦全粒を，マルチビーズショッカーにて破砕し 4倍

容 (w/v)の 5mMジチオトレイトール (DTT)， 50mM

~k~化ナトリウム， 10mMエチレンジアミン-N.N， N， N-

テトラ商ド西空(EDTA)， 2 mMフッイヒフェニルメチルス

ルホニル (PMSF)，0.1% (w/v) Triton X-100を合む

50mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.0)を加え，ヒストコロ

ン(日本医理科機械製作所製)にてさらに破砕し，遠心

分離(10，000rpm，20min， 4'C) により得られた上澄

液を粗tJtlI:lJ，液 (F1 )とした。F1を20%飽和硫酸アン

モニウムにて塩析し，氷冷下で 1fJ寺問静置した後，遠心

分離 (15，000rpm，20分間， 4 'C)後，得られた上澄液

を分間分子量25，000の透析!院を別い， 20mMトリス血酸

(pH8.0) にて 1晩 (4'C)透析することで， PDI活性

に近似した活性を 示 す分子量13，000のタン パ ク質

Thioredoxin')や低分子の還元物質を取り除き，遠心分離

(15，000rpm， 20分間， 4 'C)後の上澄液を粗酵素 (F

2 )とした。

3. 小麦POIの精製

PDIの分離精製は， 20mMトリス塩般緩衝液 (pH

8.0) にて平衡化したDEAE-SepharoseFast Flowカラ

ム(中20x 160rnrn， GEヘルスケア社製)に， F 2を供し

た。溶I:U条件は1.Orne/min， 5.0rne/tubeにて行い，未l段

着回分をi容1:1:'1後，吸着画分をNaClを含む同緩衝液にて

ステッフ。ワイズ (0.1， 0.2， 1. OM) を行った。PDIi舌

性が確認された 匝l分は，さらにお'LPDI抗イ本 (mouse

Antiserum to wPDI) を用いたアフイニティークロマ

トグラフイーに供し精裂を行った。カラムにはHiTrap

NHS-activated HP (5 rnQ， GEヘルスケア社製)を用い，

遺伝子情報より発現調製した小麦リコンビナント PDIJl

を抗原として作成したPDIポリクローナル抗体をリガン

ドとして用いた。先のDEAE-SepharoseFast Flowに

てPDIの活性の得られた匝l分を20mMリン酸， 0.15M

NaCl， pH7.0にて平衡化したカラムにアプライ後，未

吸着画く分を溶出させた後， 1.0Mグリシン一塩酸， 0.5

M NaCl， pH4.0にてi容出を行った。なお， i容出は1.OrnQ

!min， 2.0rne/tubeにて行い，酵素活性の保持のため，

あらかじめフラクションチューブに1.0Mトリス塩酸緩

衝液 (pH7.0) を1.OrnQ入れi容出した。

4. POI活性測定法

PDIの活性測定は， ARNEらの方法汁叫に従いのインス

リンを用いた方法にて行った。基質である 1% (w/v)

インスリン溶液はインスリン(和光純薬社製)を50mM

トリス塩酸緩衝i夜 (pH8.0) に懸濁し， 1 Nt昆般を加え

溶解後， 1 N水酸化ナトリウムにてpH8.0に調整後， 50

mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.0) にて定谷し調製した。

試験管に0.4Mリン酸カリウム緩衝液 (pH7.5) 0.25

rnQ， 8 mM EDT AO. 25rne，インスリンi容i夜O.1rnQ，純水

0.284rnQをとり，小麦粒から抽出した酵素溶液0.05rnQを

加えた後， 5 mM DTTO.066rnQを力11え， 会 長 を1.OrnQ

(終j農度:0.lM1)ン酸カリウム緩衝液 (pH7.5)， 2 mM

EDT A， 1 rng/rnQインスリン， 0.33mM DTT) とし

て， 25'Cで60分間酵素反応を行った。生じたインスリン

の濁度を l吸収波長650nmにてiJW定した。酵素力伯iはpH

7.5， 25'CでDTT存花下において 1mg/rnQのインスリン

のA650を1分間に0.01変化させる 力価を 1Uとした。

なお，酵素i夜中のタンパク質量は， Coomassie'!!> Plus

Protein Assay Reagent Kit (PIERCE担:事:g)および

Lowryの改良法にて測定したD

5. SOS-PAGEおよびウエスタンブロットによる解析

アフィニティークロマトグラフィーで分離した四分は，

SDS-PAGEに供しタンパク質の分子量の解析を行うとと

もにウエスタンブロットにてPDIの4食出を1Tった。タンパク質の染色は銀染色(銀染色 Eキットワコー，和光純

薬工業社製)にて行い，ウエスタンプロットの検出には，

l次抗体に小麦PDIポリクローナル抗体 (mouse

Antiserum to wPDI)を用い 2次抗体は， MouesIgG，

I-Iorseradish Peroxidase Linked Whole antibody from

sheep (GE Healthcare社 製)，検出試薬はAmersham

ECL Plus Western blotting reagent pack (GE

Healthcare社製)をmいて，引iられたシグナルを化学蛍光検問機 (Gel-DocBio Rad 社製)にて検出した。

6. N末端アミノ酸配列解析

SDS-PAGE後のゲルをセミドライブロッテイングによ

りPVDF膜に転写， CBB染色した。得られた精製酵素バ

ンドを切り出した後，プロテインシークエンサー (PPSQ

21/23， shimadzu社製)に供しEdmani.去にてN末端ア

ミノ酸配列を解析した。

結果および考察

1. 陰イオン交換体クロマトグラフィーおよび抗POI抗

体アフィニティーク口マトクラフィーを用いた小麦

POIの分離精製

DEAE-Sepharose Fast FlowカラムにF2を供し分離

精製を行った結果，未l段着画分 (A1)および吸着画分

(A 2， ~ 4) の計4つのタンパク質ピークが得られ

(Fig.l) ，これら各画分 (A1 ~ 4) のPDI活性を測定

したところ (Table1 )， A 3にて156.6units/小麦粒100

gと最も高し、活性を確認した。そこで，次に小麦PDIポ

リクローナル抗体 (mouseAntiserum to wPDI)をリ

ガンドさせたがしPDI抗体アフイニティークロマトグラフ

ィー (HiTrap NHS-activated HP) をmい， A 31由i分のさらなる精製を試みたところ，未l吸着画分 (C1)お

よび吸着回分 (C2) にタンパク質 ピークを確認した

( 33 )

3.5

3

2，5

〈号2

0，5

O

O

〔研究ノート〕 小麦粒PDIの分離精製 247

1.2

0，8 a

0，6 ~ Z

0，4

0，2

O

190

A-2 : A-4

A-3

50 100 150

Fraction No， (5 me!tub巴)

Fig. 1 DEAE -Sepharose chromatography of PDI

extracted from Haruyutaka grain

Column : DEAE-S巴pharoseFast Flow (中20x160mm)

BlIffer : 20miVl Tris-HCl bll任巴1・(pH8.0)

Speed : 1 me/min

20 m~句hosphate ， O.lS 1.0 ¥，1 glycindlCI. 0，5 1.0 111 glycine-I-ICI. 0，5 M NaCI (pH iO) 111 l¥aCl (pH .¥0) ~l NaCI (pH 30)

.‘・

006F;

0，05

0，04

e、，‘，言a ・

0，02

0，01

O

O 5 10

'‘

15 20

Fraction No， (2mIVtube)

Fig. 2 Antibody affinity chromatography of poolcd

eluates (A 3 ) from thc DEAE -Sepharos巴

25

chromatography column

Column : HiTrap :¥iHS-acti¥'at巴dIIP (5 me)

Speed : 1 me/min

Table 1 Purification summary of PDI fromHaruyutakagrain

PDI Activity Protein Step

(0) (mg)

Fl 642，2 2948.8

F2 323.9 1565.4

A1 N，D 714，8

A2 59. 1 259.8

A3 156.6 150.6

A4 N，D， 21. 1

C1 N，D， 8.5

C2 30.7 0.4

Specific Purifica tion Yield

actlvlty rate (%)

(U/mg)

0.22 1 100

0.21 0.95 50.4

0.23 1. 04 9.2

1. 04 4.77 24.4

74.8 341 4.8

(Bas巴don lOOg ¥Yh巴atgrain)

(Fig.2)0 C 1およびC2のPDIi丹性測定を行った結果 (Fig.4)。その結果， 63kDaタンパク質のN末端配列は，

(Table 1 )，アフィニティークロマトグラフィーの吸着 筆者らがi宣伝情報より発現に成功したリコンビナント小

l町分であるC2において30.74units/小麦粒100g の活'I~I: 麦PDI (wPDI)射の26残基白からと 79%の相向性を示し

がfljられた。 たことから， 63kDaタンパク質は，小麦粒1"1'に存在する

2. SDS-PAGEおよび‘ウエスタンフロットを用いた解析 PDIであることが明らかとなった。

アフィニティークロマトグラフィーによって伴られた

各画分をSDS-PAGE (Me +)に供し銀染色にてタンパ

ク質のf食出を行ったところ (Fig.3A)， C 2にて50および、63kDaのタンパク質バンドを確認した。さらに，小麦

PDIおV木を用いたウエスタンブロ ットにて， PDIのシグ

ナルを官'(g認したところ (Fig.3B)， 63kDaに強いシグナ

ルが得られ，この63kDaのバンドが小麦粒1-1:1のPDIであ

ることが示唆された。

3. N末端アミノ酸配列解析

SDS-PAGEおよびウエスタンブロッドにて確認した63

kDaタンパク質のN末端アミノ椴配列を解析 し た

要 約

囲内産パン用小麦で、あるハルユタカの小麦粒より，

Protein Disulfide Isomeraseの分離精製を試みたO

DEAE-Sepharose Fast Flowおよび子元PDHJtイ本アフイニ

ティークロマトにて4食言すを行ったところ，アフィニティークロマトグラフィーの吸着四分に， 30. 7 4uni ts/小麦

粒100gのPDI活性が得られた。さらに， SDS-PAGEおよ

びPDI抗体を用いたウエスタンブロットにより 63kDaの

タンパク質にPDIのシグナルが俄認された。また，この

63kDaタンパク質のN末端アミノ般配列を解析したとこ

248 日本食品保蔵科学会誌 VOL. 37 NO.5 2011 ( 34 )

180 .回・・

= dl骨山 . ー'.崎|骨63kDa ..11 58 ー圃.=円を

39 ー・29

1・U圃.20

A

(kDa) C1 C2

ハHVA川U

ハ川VFhd

-hピh

d

n

U

7

4

つ41i1i

50

37

25

20

B

(kDa) おI C1 C2

(T=12.5% : Me+)

Fig. 3 SDS -PAGE (A) and western blot (B) of antibody affinity

chromatography ofHaruyutaka grain

;¥11: lvlolecular slandard. C 1 and C 2 Eluled fraclions by A.ntibody affinily chromatography

Puri五edPDI from Haruyutaka grain: C2 (63 kDa)

Recombinant PDI

N-terminal amino acid homology: 79%

Fig.4 N-Terminal amino acid sequ巴nceof recombinant PDI and pllrified PDI from

HaruYlltaka grain

ろ，小麦遺伝情報より取得したwPDIの配列と79%の相

向性がfぜられたことから，ハルユタカ粒より取得した63

kDaタンパク質は，小麦PDIであることが明らかとなっ

た。

文 献

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( rl~成23年 3 月 31 日 受付， 平成23年 7 月 21 日受理)