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Resumo

As células Y-I pertencem a uma linhagem clonal de células fi-incionais de

córtex adrenal de camundongo, que respondem a ACTH.

Em células Y-I, ACTH promo;e a esteroidogênese (função) e tem efeitos

regulatórios complexos na transição GO+Gl+S do ciclo celular. ACTH

promove a transição GO+Gl, mas inibe a transição GI+S. É possível que a

regulação do ciclo celular por ACTH seja mediada pelo controle da expressão

dos proto-oncogenes das famílias fos, jun e myc. Nosso laboratório mostrou,

anteriormente, que ACTH induz a expressão dos genes fos e jun, mas inibe c-

myc.

O objetivo deste trabalho foi identificar pontos de controle na expressão dos

genes fos, jun e myc e na atividade dos fatores de transcrição AP-1 (dímeros

da proteínas Fos e Jun) por ACTH, derivados de cAMP (ativadores de PKA),

PMA (ativador de PKC) e FCS (soro fetal bovino).

ACTH, PMA e dcAMP aumentam a atividade de ligação de AP-1 a DNA,

independentemente de síntese protéica.

Ensaios de elongação de cadeia nascente de RNA (run off transcription)

mostram que ACTH, PMA e FCS são fortes indutores de c-fos, c-jun e junB,

enquanto dcAMP induz apenas c-fos e junB.

Hibridizações Northern permitiram estimar a meia-vida dos mRNAs de c-fos e

c-jun em 30 min, independentemente do tratamento com ACTH ou PMA.

Diferentemente de c-fos, o mRNA de fosB é superinduzido por ActinomicinaD

em células Y-I tratadas com ACTH e PMA.

Summary

The Y-I cells belong to a clonal lineage of functional mouse adrenocortical

cells, which are responsive to ACTH.

In Y-I cells, ACTH promotes esteroidogenesis (function) and has complex

effects on the GO+GI+S transition of the Y-1 cell cycle. ACTH induces the

GO+GI transition but inhibits the Gl+S transition. Probably, the cell cycle

regulation by ACTH is mediated by the expression control of the proto-

oncogenes from the fos, jun and myc families. Our laboratory has previously

shown that ACTH induces the fos and jun genes expression, but inhibits c-myc

expression.

The target of this work was to identify control points in the fos, jun and myc

genes expression and in the AP-1 transcription factors (Fos and Jun proteins

dirners) by ACTH, cAMP derivatives (PKA activators), PMA (PKC activator)

and FCS (Fetal Calf Serum).

ACTH, PMA and dcAMP raise the AP-1 DNA binding activity, independently of

protein synthesis.

Run off transcription assays show that ACTH, PMA and FCS are strong c-fos,

c-jun and junB inducers, while dcAMP induces only c-fos and junB.

Northern hybridisations allowed us to estimate the half life of the fos and jun

rriRNAs in about 30 min, independeritly of ACTH or PMA treatment. Differently

of c-fos, fosB mRNA is superinduced by ActinomicinD treatment in Y-I cells

treated with ACTH or PMA.

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e owoo wisse `uni-o a sod-o seule4wd se aguo° sodiooque ap oeõe[upio!w

ap s0! eau3 '(LM. le Ta oneig) sooRspapeieo sooRaup spad woo

Seue6 sa4sap seulalaid sep a sVNdw sol) oessaidxa ep epol!suall oe5npu!

weoonaid oluamosan ap salom no ocos woo oe5einw!isa waJod Saua6

sasap oessaidxa e emasqo as oeu Sepepualeo cic seiniao w3 . aunr a gunf

`unf-o saua600uo-oloid so apuam:Um unr ewwej e anb oluenbua `z-e.ij a 1,

-e4 Ssoj Sol-o saue600uo-o4oid so apueadwoo sol e!l!weJ V "(9966 Suall4eN1

'9 Ja PÁd !9961. ` 18 10 )10asÁd !9961. ` 1 8 10 Lidwal ! I7961. `42 '9 6.1aquaaJO

: 1786 6 le 10 uenpoo !Na le Ia oneJ8) IOCIJOl ep saiais? e OMS ep waie

`owamosaio ep saiolej sop?A Jod aluawalua!suail ep!znpu! a oessaadxa Orlo

`epawpd elsodsai ep saua6 oes saue6o3uo-oload sais3 • un[ e sol sewwel sep

saua600uo-oloid so oelsa soppaquoo siew saue600uo-opmd SO 0.14U3

vdy oxaidwoo o a unr a sol sewwej sy

-qdd a cgd oesa seue6 ep odn.i6 alsaN

.asaua6wowni e a Jeiniao oe5ewmjsueil e ep!doxl oeõemeu! ens e anbaod

`Jowni ep saiossaidns saua6 no saua600uoljue owoo soppaquoo oes saua6

sajs3 . 69 ap sanei4e oessaffloid e wein6aJ anb e oeõposue4 ep alcujuoo op

wedp!ped solnpoJd sorno Saua6 ep euo6eleo eilno ewn `owelua ou `?1-1

.oe5posue4 ep samel weowpoo anb Saue600uo-oToid Elsa `60-09

oeb!sueJ4 e eJed ewsseoau a oeánpu! efno `ep?wpd e}sodsai ep saua6

so ailua anb ap ieluawpadxa oe5e4e4suoo e woo opooe ep ?lsa oe5!sodoid

els3 • eopa6 oe5posuail ep oeõein6ai ep sowspeoew Jod opeupialap

a s<-60<-00 oeó!sueJT ep aloiluoo o anb awawienie as-e4paJoy

17i

.sao5erws sawalapp wa saua6 saluaJapp ap oessexixa

e Jeln6ai einiao e eied lliesJan eluawauai ewn 'oeõposueil ap JOM oiuenbua

opumsuoo 'oe5elpo4soi oldwaxa Jod l eu!alcud ep s!euopnpeii-sod saoSalaile

a euiaiald ep apepificieisa 'oe5npeil `VNdw op apepwcieisa 'oeõposuaii

:s!aniu SOIJEA W9 epein6a! JOS apod soxaldwoo sop apep!mie v

• (9661. l e e)locie51 9661-

ÁGSJOCI) VOIDOVOI osuasuoo epu?nbas e aoaquooei anb v51d-dinivo e!n

eiad opemie oe5posuaii ap Joiej o 'Egdo oidwaxa Jod `seu!alaid salino woo

salamp JewJoi apod unia oeõposueii ap salom swino woo iffieJaiu! wapod

seuialaid seisa anb ? aluepodw! oeõewJoiu! alino 'salawip ap soowoadsa

sod!i Jod aluawiepualajaid soppaquooaa ias wapod saiolowaid saluaJapp

wisse I ONE VNC1 o lad 1,-dv soaamp sop apepulie e weialle wagwei

eisap seiopeanbueg saoffial seu seõualapp a epuanbas ejsau sao5eJaTIV

.(L66 L 'mem NoasÁJ) epuanbas cisa iod sapepplie sawalapp wai

solawjp salualapp anb weilsow soapj4oalonuo6ilo e oe5e6!i ap so!esu3

.(886i `ezuald uauno)

,EV01 0/D VOLS a as-e6!! anb e OSUOSUO3 8101190bas v .(luawag

an!suodsad vaj) 3d _i_ owoo seppaquoo `(eleiaov-c ilocoolidiÁoueoapagai

-0-z i) vai. e semsuodsal saoffla! e ' ,Ma ou `as-c6 !1 1.-dV Joie4

"EWIOE

sepeip seu!alcud sep soiawip ap EAE4EJ4 as anb awawiopaisod as-opueowiaA

`oo!un oe5posueii ap Jolei wn assoj anb as-enel!pane aluawlep!u!

` le ja aai !L961. 'te ia la6uv) locpol ap saiais? woo sepeiali seinpo

wa sopeinwRsa saua6 ap alcuitioo ap saofflaa seu awasaid ?ise wagwei

i-dV `le ia laBuy !L86i ia aai) sopalqapan ap saua6 swino

sop?n ap a euewnq eulauopielaw ep aua6 op '017-AS sruin op alommo

ap sio oefflai eu „Jaouequa„ soluawala e `aluewemialas 'EB!! as anb euiaioad

ewn owoo seuewnq seinpo wa opagoosap aluawieu!6po !oi i-dv

.(986i 'I R ia n!q0) saua6 sop?A ap sapolowaid wa atopemiesueal

oeõe opuai 1 (i - upiaid Joiempv) i-dv opeweqo ? oe5posuali ap SOJOiej

ap odru6 assa Sopeuuoj "as ap s!anissod soxaidwoo ap alawou apueJ6

wn `oluepod ?H . sodiunr oe5eu!gwoo Janbienb wa sol seulaiald se woo

soJampoJaiaq wagwei a uni/uni oe5eu!ciwoo Janblenb wa Salawipowoq

Jewiol ap sazedeo oes uni seuialoid sv leseq oe5posueli ap oxeldwoo

91.

VIM° op eoRaua6 oeõeanoju! ep oess!wsue4 eu

opuesuad sowelsa awawiewJou eoiue6 oessadxa wa sowelej opueno

e3luge oesseadu

.s wa aqUe cria° e anb aled ep?ssaoau á i,e ap w14 ou 3 eugop ap

oessaidxa e :(9661, 6ua0) essakixa eras 3 eugop anb wed opelpojsoi

eras qdd anb op?ssaoau á 'oldwaxa Jod .Jelniao opp op oessaffloid

e wed sawepodw! seuia4oid seAno ap a '(9661. 'ffiaqu!am) 3z3 owoo

oeõposue4 ap saknej ap JopeJlsar3bas wn owoo a6e qdd s!od Jena° opp op

oessafficud e eJed lewawepunj á qdd ap oeõen!leu! y . o-opuemieu! 'qdd ap

oeõelpolsoj ep oplui oiad ian?suodsaa e a smoo sens ap ewn woo awawewnr

1,a eullon • 1.zd e (uaNuy JealonN 1100 6u!TeJapaid) vNod 't»ipo no

Z woo soxaidwoo etwoj opuenb '60 ap apelaw ep Aped e apep!me wa;

euialaid ens waJod '1,0 ap oplu! ou ossaidxe á 1,0 eu!lop ep aue6 o

vipo woo as-eposse

3 eumop anb owenbua i gno o 17)1po woo as-weposse a seupp sv .3

eullop a Kl a za seunop :oes 1,0 ap se oseo ou Seo!Tspapeaeo seumop

ewasaide ase} epeo anb opuas `Jelniao olop op sepuljap sasej wa sessaidxa

oes eras no 'awapuadap opp oessaidxa wai seuipio sv . (17666 'uowolos)

emioadsal e exps aseu!nb ap apepme wal waqwel owoo epelpojsoj

9 eunop e os oeu L eu!uoail a eupas ap soogjoadse sonpisai wa oe5eipolsol

ap !GANI e 011000 oe5ein6aa Elsa `swaw?Jial Jet.wol opuapod `seuja4oJd

seAno iod epein6a, apepme e wa} oaamp O .(9661. ` -1 -1a1-1S ! t7661. `-1-1a4S)

eowieleo apep!unqns e jpo e a epoieln6aa apep!unqns e euflop e °puas

`(1po) seugop ap sawapuadap saseu!nb woo saiam!) wa weuopunj anb

seuialoid oes seugop sv é,awepodw! 9 10 euflop ap apawoo o anb Jod

.oe5posue4

ap uniu e amo° oÁw Jod 1,a eullop ap oeõein6ai e anb as-nallsuowap

a (le s!slea) xeiNioÁvN ap oe5e6!I ap osuasuoo sepu sanbas c ewasaide 60

eunop ap aue6 op JolowoJd o 'ojej ea . asmdode ap saneJle 'apow e einiao

e enai awawietwou a 1,c1 eu!lop ap oessaidxa ep oe5Ru! anowoid (aios iod

11104 ` '17LdV2:1 'xnew e Sepepunqns z iod cnsodwoo á Jo}ej alse `VNG op

sao11914 sep oe5wedas eu (aded dliji J0481 o er . (g66 '6uno,k aNsaio>I

! t766 `6Jaqu!ad upidwa) oeõposue4 e aoawoo anb eied d81 woo no ap

oe5waw! e Jadwoi o oeSunj erno '(lm) II aswawuod ep ieuguai o o!uNuop

op oe5eipolsol eied lansuodsw o ias aowed H1131 'rui a H1131 '31131 'II

asalaw !lod VNH e woo 31131 ` 81131 :oes adi oxaidwoo oe weposse

as anb swoje4 so .vNa oe we611 as anb sopew.K4 ?f sopeuapo soxeidwoo

wals!xa as no yNci woo opuffiwaw! oeisa ?f anb se awawiepuanbas

as-weN sewizua se as opugap ?isa oeu wwod 'clamo° wapio

ewn An6as anap oeõeposse e 'alui oe as-weposse saunej sailno

.sawalapp

swolowoid Jaoaquooai wapod SdVI SaWalapp woo sopexaidwoo sdELL

ows o waoaquoow anb (woloed palepossv dgr sopeposse sdvi so

woo (uppad 6u!pu!8 Vivi) dEll apuawdwoo anb `s!ewawepunj oes

sais:4cl sun6iv • apepwie ens e opueinpow eumzueolog Elsa e as-weposse

anb oe5posue4 ap saioiej so!i?A ?H 'eia e sope6H swolej a H aswamiod VNH

ew!zuaolog ejad o4sodwoo ? ieseq oeõposue4 ap oxaidwoo o .sepwedas

weres VNG op saonaii se anb a Jolowaid oe wan6u as a weõaquooei

sieseq swo}el so anb op?ssaoau 9 oeõposuw4 e appi as anb eied

leseq leuopposuwi oxaidwoo

op owaweuop!sod o .1C1U91.10 eied amas a oeõposuail ep opwl ap owod oe

oe5elw wa gz- oeó!sod eu as-wwooue alUOWICW.JOU oefflei els3 'swolowoid

snas wa xoq ylyl owoo eppaquoo osuasuoo epuanbas e wewaswde

syNdw oes soinpoid sorno saua6 so sopol awaweoRwd Solopeona w3

.oebnpaqui eu seppawoj saoõewiowl se woo sol

-guopeial a sopemasqo sqaja so awawApalsod Anosup sowessod anb eied

`ama6esuaw yNd ap oe5posuwi e anionua anb ewels!s o awawieinoped

`opp awawepdoad oeõposuw4 ep owspeoaw op oeisanb e sowalepioqv

eop96 oe5posuaii

'oeõepafflap a oe5posue4 agua opqmnba wa wwooua

as anb einpo eu awasaid VNH ap oeõeindod e ?lsa `awawepe!pewJawi

91-

saio4ne `olej aa . ,£4-5 a ,54--,£ apep!me woo saseaionuoxa Jod awawelamp

opepafflap ias no ,g apepwaiixa e waqwel JapJad oelua aTsa opuapod

`olposueal op ,£ apepwalixa e epol wenno anb sasealonuopua iod sopeoele

oes aluawiewiou sopepea6ap WalaS eied sopepuepeap ias wespaid

oeu anb solposueil ',£<- 49 no ,s<—,c oelse6p iod aluawep!deJ opepei6ap

oeiva _ias apod ojuosueii a4sa `olposueil op ts apepwanxa ep epiad

?L.1 ossed ais° e opp6as l eu!souepe ap sonpisai os e sz eied `olposueil

op (v)nod ap epneo ep aped ap oe4saND e a owana amewpd o oeõenuepeap

ap aluapuedap oeõepefflep ap oseo oN 'vuod ap epneo ep oe5epefflap

ap aluepuadapul no awapuadap ias apod o4posue4 wn ap oe5epefflaP V

.saua600uo-op.id oidwaxe iod

`op9lein6ai iaded woo saua6 ap soinpoid isopepefflap aluawep!deJ syNdw

ap aluawiedpupd isolopeona wa vNdw ap oe5epei6ap ap owsiueoaw

olposep essa awawienw '(56a `nhis vg ualio ! 966 I. `Ja)ped 5. uewiaag

17661. `Ja/Jed 2 Ja)paci Z661, l e ia !AeNoS ! 1, 661, le P nÁt4s) sodni6 sown

ap opnTsa ap olafqo opas waT solopeona wa yNdw ap oe5epal6ap v

solopeona wa vNdw ap oeõepefflaa

'(966 I. l iqn4s) oe5posueil

ap opiui o opuRu! no 'oeõep!u!ai ep!d?.1 opumiwad amsniou! 'oe5posue4

ap opjul op epuapila e opueluawne 'alui woo oTuenb li aseJawnod

V N ti emzuaolog e woo oluel wa6eJawl saJoiej salsa 'VNG oe 41131

ap oe5e611 e opuezffiqesa a sowossoalonu opuezumeisasap 'euRewon eu

seo5eJalie `oowoadsa (vNa ou osuasuoo epuanbas) oluawaia wn e oe5e811

8A10Alla SeJ04ee alsap oe5e ap ows!ueoaw O . 1.-dV oldwaxa iod leseq

oxaidwoo op apepNe e Jeinpow ap sazedeo oes sew ` EJJ000 OBSIJOSUEJ4 e

anb eied s!ewawepunj oes oeu anb 'oe5posueJT ap saJoiej iod soppaquooal

oes SOTUGW919 sa4s3 . „Jaouequa„ SOWOW919 ` 00JOSUall. ap opiui op sai.ue4sp

sowawaia waoaquooaa anb seulaTaid iod epein6ai waqwe4 a sew 's!eseq

sais:4cl iod 9s oeu `epein6a, a aua6 opeu!wialap wn ap oe5posueil V

aomali eidnp ep einpaqe

anowoid anb emzua e opuas ` clIV ap aluapuadap aseo!iali ep epep!n!Te

6 I

!! aseu!nb

eu!aseo a °Nd `y5id Jod oe5eipojso4 ap sepuanbas ep?wpd einTnAsa ens eu

ewasaide HIOV ap Joldeoa, o . (z661, Ta Áob.unoiAj) e eulai.oid e eposse es

anb saleueiciwawsuan sao!laq L woo .undaoai wn opuelanai Sampeiocieloo

a sinal iod z661 • wa opepuanbas 9 opeuop pj os HIOV ap Joideow o

leualpe xapoo op

oluawpsaJo a oeõualnuew a sappJalsa so!uowiog ap oe5apas a asaluis ep

oeónpul oes sieueipe seinpu?, 16 se algos H .Lov ap sol!aja siediou!Jd so

.(L861• uewilea) opoupog

op oeõaJoas ap mn e aluaweme6au weluawneoilai HIOV ep olnwilsa

oe elsodsal wa sop!znpaid saKualsoo!poo so anb opues 'eo!6Jau!uolcuas

G eogJau!wedop se!A selad epelaiwoo G HIDY ep oe5apas

s!euewe seinpuel6 sep xapoo op seiniao

se oes HlOy ap 0Ale C) *(jdO) eugagoopoo ap JopeJeq! JOTej. oe eisodsai we

eaum6ues 01119JJ03 eu as!494 elad epelaJoas a anb ‘(o iniod) eu!pooelawo!do

-wd euie4aid ep wa6enuo ep oinpcud Sopp?ou!we 6C ap oo!pgdad

opowioq wn a 'eugoiloo4.1oo no ooLjoi400p000uaipe o!uowioq H1OV

HIOV

1110V ap ea!uabomul oe3e ep opnise ema oppoui um Et -A

'VN12:1w

op oeõepei6ap e apadwi waqwel anb o l oeánpeil ap oplu! o Ja6aioid Jod elas

Sasealonu ap ossaoe op oopalsa oluampadwl iod elas oe5epeJ6ap Equoo

olposue4 o a6alaid oe5eJawl eisa anb a opJosueil op ,s a ,£ sapep!waipca

se 9.141J9 oe5eia4u! ewn ?g anb á sodru6 salsep asawd ! LI V .(V)!Iod

ap epneo ep eped ? alen!nbe oeu ,£ apep!wagxa ep wa6engo e as walnosp

saluallawas soo!T9u!o swad wewasaide selnalaid semoadsei sv .yNdw ap

leniu e ossaidxa aluawemnAsuoo opuas 'oe5aoxa ewn á aunf loebeinw4sa

ap qz sode z-e.14 e 1-8.11 `sso4 a Hiov .10d oe5einwRsa ap q 1 sode oessaidxa

ap 030 wal sun( a unf-o i sol-o :salu!n6as so oes syNdw sop oessaidxa ep

oe5npu! ap soo!Taup su.iad so • Hiov woo sepeTail opuenb unf a soj selpwe,j

sep seuialoid a syNdw sop oessaidxa ep oe5npu! wewasaide iepuauodxa

oluamosaio wa seiniao anb weJlsow ( e£661 'R 0661. '9961. ` l e Te alnw!>1)

saiopelocieloo a einwN ap sogieciall so . (£661 le Ta pie!A) eopa6opoJe4sa

e!A ep sewgua sep seuede oeu e (1661 `.19111n GJOOIAJ) e011.1e6 oessaidxa

Jein6e1 ap zedeo á H_Loy anb weieaTsuowap sodni6 sailno .eopa6opoJalse

e!n ep semzua sep oe5posueiT e ein6al H1OV anb weJeAsow

UeWieleM e uosdw!S 9961 wa `eopa6 oe5posueiT ap awapuadapu!

asso] Hioy ap oeõe ap ows!ueoew o opol anb as-enelpene o!dioupd

1-A we uni e sob ep oessaidx3

- ( cl£661 ! £961. ` le Te einw !)4 LL61.

le Ta ugawJy) ap opoiJed wn s9de yNa ap asaluis e we!anboiq Hiov

woo sepe4e4 iepuauodxa 01119W1OSOJO we seiniao . (9661 'te Ta umawJy)

1 e wa minta° opp op o!enbon wanowaid is!ew no qi7 Jod oluaweleu

.sopno soTuaweTeil wa `1,-À seiniao algos eo!ua6ww oe5e we 1-110V

anb opueiTsow `Liz iod 0.10S woo sepele4 sao5!puoo sewsaw seu seiniao wa

epemasqo e opuenb awapija oel e oe5npu! els3 yZ ap osind wa seiniao se

oppawoj as 's wa Jaqua e sepepuemo seinpo i!znpu! ap zedeo á Hioy

- (9661 l ie Ta ufiawiy) opezwin 0.10S

ap oe5eiTuaouoo ?IeuopJodoid a s wa agua anb oe5eindod ep wa6eTuao.iod

e anb opuas 'minta° opto ou aTuawenou Weip.10 aios woo sepeinw!Tsa opuenb

`a oTs! `Jeiniao olop op lanisianai o!anboici waijos seiniao seTsap oe5eindod

ep %06 e 09 'oTuawpsaio ap saioTej no 0.10S ap oe5!pe was einTino ap o!aw

wa sepepuaieo ias wapod seiniao se `sepetwojsueiT ap JesadV

.(8961 'te Ta eJnwN) 1-/k ap ou6new opeTsa op

oe5uainuew e aied ep?ssaoau o sed-N-o ap oe5eowidwe e awawaluaiedy

'(9661 le Ta unawJy) eme oTueliod AID e epe6ii BW.101 eu awawalueisuoo

ZZ

•orçui

-o ap oessaidxa ep oe5!q!ul e a mima° olop op oianboiq o adua `opei onno

iod 'a un( a sol sewwel sep saua600uo-oloJd sop oebnpul e woo 1,0 asej eu

epaqua ep oe5einw!Tsa e adua oe5eianoo e `1,-À seiniao wa 'epolou

'Jena° olop op oessal6wd eu aluepodwi iaded wal waqwel

anb `oÁw-o ap oessaidxa agiu! sew 'oeõeJapaid woo sopeuopelai oelsa

anb 'Lin( a sol ap oe5npul anowad waqwel H1OV .Jeiniao olop o e!anbolq

so6uoi sowaweie4 wa anb owenbue 'oe5eJajnoid znpu! sopno sowawe4e4

wa : i,-,k algos lenp oi!aja wa} HIOV anb owewow o ale odeio eou

oeSeiamoad )( eoluge oessaidu ap aiwwoo o

.oÁw-o ap s!aniu

sop oe5!nu!wp e woo H.Lov Jod op!nowoad 1,-Â ap Jeiniao olop op o!anboiq

o MUOIOCIal as ap e!api e empelual alueiseq 9 •HlOV woo oluawele4

ap qz sode al.1000 oe5npai eTs3 (sopeouqnd oeu sopefinsal a q£666

le ia ainwN) oÁw-o ap euialoid a yNdw ap s!aniu sop oe5npaa weluasaade

H1OV woo sepe4eil opuenb lepueuodxa OW9WI3S8J9 wa `1.-A seinpo

.oÁw-o ap oessaidxa miou! onle ofno saseu!nb dvn ap evn e eme anb `sed-N

-o ap apepme eTie Jeluasaide empo elsap mel oe op!nap zaniel leminmsuoo

a lepueuodxa oluamosan we 1,-A seria° wa oÁw-o ap oessaidxa v

3ÁW-3 ap oessamixa e agiu! Hioy

.uni a sol ap oessaidxa ep sane4e 1.-dV oe5posue4

ap oxaldwoo op apep!me e Jeinpow ap zedeo ? HIDY anb waJa6ns

sopeiinsal 50153 ( e£66 I. le Ia emw!N) . oluawele4 ap qz sode ep!znpui a

waqwel aunr ap eulagud e isyNdw soe 0e5E18.1 wa osage ap qi, woo waiod

17Z

• LÁ seiniao wa cliAN0 ap sopenpap a vinjd Jod sopezRaw!w

oes anb soT9ja so a 'HIOV ap oeõe ap ows!ueoaw o algos oluawow

o ale s!amuodsup sao5eauoi.ui sep ap ownsaa wn ensow I, ao ! puadV O

ti \VOld

H1OVdINV°P

*Nnideomaid

----o. OSOU ,9, 6o/310194SeOSNUIS

Wid

SZ

.V>id JeAF

ap zedeo a dmop O aluewelanp 051d _leme ap zedeo a vind • Id oe5posue4

ap mole} ap oe5eipojsol ap sanage eope6 oeõposueal mi:pium zan ens

Jod anb `9>id JeinwRse epapod 'd `H_Loy ap Jo4daoal o 'opei olmo Jod •Egdo

oe5posuall ap Jolej. op oeõenRe ep saneile `eoKia6 oeõposueii ep oeõein6ei

iod waqwel a asaua6oppiaise 1,--A erma° ep oe5uni eiad ianasuodsai

l y5id ap e!A e eAge zan ens iod anb `o eu!alold ie Jemie ap zedeo `einiao

ep euexiwaw eu Joidaoai o 'd e as-opue6u Hioy cluasaidai eJn64 els3

eowa6 oe5posuei}

H1OV 3a OVÕV 3a OINSINVO3IN

• 1,-A seiniao wa Hioy ap oeõe ap ows!ueoen :1, ao!puadv

9Z

songarqo •II

LZ

(sÁesse uNdposuali4o um)

VNd ap alueoseu e!apeo ap oe5e6uoia ap so!esua ap saneJle i (ou!noq ielaj

aios) SOZI a dINV3P ` VINd 1-110V w00 sePel nw!isa 6-A seiniao we oÁw a unr

`sol saua600uo-o4oid sop oe5posue4 ap aio.quoo o 9 owoo Je01.W9A 'z

.ado a adi osuasuoo sepuanbas woo soapiloalonuo60

we oe5e6H ap soiesue ap sane.ge ` d1A1V0P a VINd `Hiov woo sepeinwRsa

6-A seinpo wa 1.-dv oe5posue4 ap saJoiej sop apepv nRe Jepnisa .1,

:oes somia(qo sossou `oÁw a uri! . Soi seula4oid sep apepne

a oessaidxa ep oe5ein6ai ap soTuod Jepalap iedpupd epw owoo opuai

.owsaw

op apepffielsa no oe5posueil ap leniu e as sowaqes oeu sew `vNdw op

oessaidxa ep oe5Ru! anowaid HIOV woo oluaweleil `1,-À ap s!epuauodxa

semlino wa anb sowaqes `oÁw-o aue600uo-o4oid oe oe5elai woo

.leuopnpeJT -sod

oe5einpow ap odi4 wn6ie eu as no seulalad se4sap apepne e axios opep

wnquau sowai oeu sew uni a sod seuialaid sep oe5npail ?g anb sowaqes

waqwei • oe5npali a oeõepefflap 'oe5posuei4 amua opqmnba wn wa eini90

ep 1 8404 VNd ap apepluenb e as-epaiap apuo lois waqpoN ap sowewpadxe

ap wanoid sopRqo sopelinsai so i dnvo ap sopenpap a VIAld 1-110V

woo sepeleJT lepueuodxa (nua/40%n wa 6-À seinpo wa saua6 salsap

oessaidxa e 9 owoo soweqes .s!euopnpeiT-sod sao5eowpow a seulaioid

sep oe5npei; l unf a sol saua6 sop oessaidxe eied epeinpow Jas apod

1.-dy oxaidwoo op apepne e 'oe5npoilui eu waqwel olposep owoo

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As preparações de larga escala seguiram também o procedimento de

lise alcalina (Sambrook et al, 1989), porém o DNA plasmidial foi isolado por

extração com fenol/clorofórmio (1:1), seguida de precipitação com 3M acetato

de sódio pH 5,2 e 3 volumes de etanol. O sedimento de DNA, após lavagem

com 70% etanol e secagem, foi submetido a digestão com 20pg/m1 RNase de

pâncreas bovino a 37°C por 1h e em seguida digestão com 10pg/m1

proteinaseK a 42°C por 30 min. Nova extração com fenol/clorofórmio foi feita e

o DNA foi precipitado sob as mesmas condições utilizadas anteriormente. O

sedimento final foi ressuspenso em H 2O MilliQ estéril ou TE estéril. Uma

alíquota foi retirada e a concentração foi determinada em gel de agarose por

comparação com um padrão ou por absorbância a 260nm.

As preparações de média escala foram feitas de acordo com a

metodologia de lise alcalina, porém o DNA foi isolado utilizando-se o "kit"

Sephaglas BandPrep Kit Pharmacia, onde o DNA plasmidial interage com

uma resina de sílica, é lavado e em seguida eluído com TE estéril. Ou ainda

utilizou-se o "kit" Hybaid Plasmid Midi Prep sample Kit, neste caso a lise

também é alcalina, utilizando reagentes do "kit".

Em todos os casos, os DNAs amplificados foram quantificados em gel de

agarose com 0,5pg/mI brometo de etídio.

Nos casos em que houve necessidade de extração de fragmento

contendo o gene de interesse, o plasmídeo foi submetido a digestão com as

enzimas de restrição apropriadas, o produto da digestão foi fracionado em gel

1% agarose com 0,5pg/ml brometo de etídio em 1x TBE. A banda

correspondente ao fragmento foi retirada do gel e o DNA foi extraído da

agarose utilizando-se o "kit" Sephaglas BandPrep Kit Pharmacia.

Ensaio de dose-resposta a ActinomicinaD

Células Y-1 foram semeadas em placas de 15 mm de diâmetro em

densidade de 5.104 células/placa em 1m1 de DME 10% FCS. Ao atingirem o

estado de subconfluência as células foram tratadas com ActinomicinaD em

concentrações de lpg/m1 ou 5pg/ml ou 10pg/m1 por períodos de 15 ou 30 min.

35

Em seguida fornecemos às células H 3 uridina (5pCi/ml) e estas foram

incubadas em estufa a 37°C por 30 min.

Após este período as células foram lavadas com PBS gelado 2 vezes e

fixadas com 10% TCA incubando-se 2 vezes, 10 min cada vez a 4°C. As

células foram lisadas com 0,5N NaOH e o lisado foi adsorvido em filtros de

celulose. Os filtros foram lavados uma vez em 10% TCA gelado por 10 min,

uma vez em etanol e uma vez em acetona. Em seguida foram colocados em

estufa (50°C) por pelo menos 2h para secagem. Uma vez secos, os filtros

foram colocados em frascos com 5 ml de líquido de cintilação e a

radioatividade incorporada foi dosada em cintilador.

Ensaio de retardamento de oligonucleotídeo em gel - Medida daatividade de AP-1

Preparação de extratos nucleares

As células Y-1 foram semeadas em placas de Petri de 100 mm de

diâmetro e ao atingirem o estado de subconfluência, crescendo

exponencialmente em DME 10% FCS, as células foram tratadas com ACTH,

PMA e dibutiril cAMP. Em alguns experimentos, Cicloheximida ou Puromicina

foram adicionadas ao meio 20 min antes das adições de ACTH, PMA e

dcAMP. Após o tratamento, foi feita a extração segundo o procedimento

descrito por Andrews & Faller (1991) baseado no procedimento descrito em

Ausubel et al, 1987, com algumas modificações. Este procedimento, que

consiste em lisar as células, separando-se o compartimento nuclear do

restante, para então fazer-se a extração das proteínas nucleares, é o

seguinte:

As células foram lavadas 2 vezes com PBSA, raspadas da placa, com o

auxílio de um "policial" (cell scraper) e transferidas para um tubo cônico com

PBSA.

As células foram sedimentadas por centrifugação a 1500 rpm por 5 min em

centrifuga analítica.

36

O sobrenadante foi descartado e o sedimento foi ressuspenso em 1 ml de

PBSA, a suspensão foi transferida para um tubo Eppendorf.

As células foram sedimentadas por centrifugação a 14.000 rpm por 15 s,

em microcentrífuga.

O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 400 pl

de tampão hipotônico, a suspensão foi deixada 10 min no gelo.

As células foram lisadas por adição de Ninodet P-40 (0,1%) e agitação em

"vortex" por 30 s (velocidade máxima).

A suspensão foi centrifugada a 14.000 rpm por 30 s, obtendo-se assim a

fração nuclear (sedimento) e a fração citoplasmática (sobrenadante).

A fração citoplasmática foi descartada e o sedimento de núcleos foi lavado

com 100 IA de tampão hipotônico.

O sedimento foi ressupenso em 100 ¡ai de tampão de extração nuclear onde

ficaram por 30 min, em gelo.

Os núcleos foram centrifugados a 14.000 rpm por 30 min, sendo o

sobrenadante o extrato nuclear.

11. O extrato nuclear foi aliquotado, congelado em nitrogênio líquido e

estocado a - 80°C.

Todo o processo foi feito a 4°C, sendo utilizados tampões e equipamentos

pré-resfriados. Utilizamos, em todos os tampões, como inibidores de

proteases: Pepstatina A (2 Leupeptina (0,6 vtM), Aprotinina (25 mU/m1) e

PMSF (0,5 mM).

Alíquotas foram retiradas da fração nuclear (núcleos ressuspensos em

tampão de extração nuclear), da fração citoplasmática, da suspensão de

células lisadas e do extrato nuclear para que fazer dosagem de proteína

(Método de Bradford,1976). Esta dosagem nos deu informações quanto ao

rendimento da extração nuclear, à reprodutibilidade dos diversos

experimentos, assim como uma noção da eficiência da lise celular.

37

As reações foram incubadas a 30°C por 15 min. Após este período as

mesmas foram recolocadas no gelo e receberam, cada uma 2 ial de uma

solução de Azul de Bromofenol em TE 50% glicerol. As amostras foram

aplicadas no gel, já pré-corrido e submetidas a eletroforese a 170 V,

amperagem não limitante.

Após a corrida o gel foi fixado em solução 10% ácido acético, 20% etanol

(2 lavagens de 20 min cada). Após a fixação, o gel foi seco sobre papel 3MM,

sob vácuo a 80°C. Sobre o gel seco foi exposto um filme de raioX, em um

cassete entre telas intensificadoras e deixado a -70°C, durante o período

desejado até a revelação do filme.

Os filmes de raioX foram analisados por densitometria.

Marcação de oligonucleotídeo

Esta reação consistiu em "marcar" o oligonucleotídeo através de

fosforilação das extremidades 5' com y32PATP. Esta reação é catalisada pela

enzima T4 Polinucleotídeo Kinase. O procedimento utilizado foi baseado no

procedimento descrito por Sambrook et al (1989). A reação contém:

5 a 20 pmol de oligonucleotídeo

y32 PATP (3000 Ci/mmol) 50pmol

5 a 10U T4 Polinucleotídeo Kinase

10 x tampão de PNK

H 2O até 20 gl

A reação foi incubada a 370C por 1 hora. Adicionou-se à mesma 80 gl de

TE 0,1 M NaCI, sendo este o volume final. Fez-se então uma extração com

100 1.11 de fenol/clorofórmio (1:1), adicionando-se estes à reação. Após

agitação, a mistura foi centrifugada a 14.000 rpm por 3 min. O

oligonucleotídeo, fração aquosa resultante da centrifugação anterior, foi

passado então por coluna de 1 ml de Sephadex G50, a 2700 rpm, por 4 min e

estocado a -20°C.

Alíquotas do oligonucleotídeo foram retiradas antes e depois da

passagem do mesmo pela coluna de Sephadex e submetidas a cintilação.

39

Este procedimento nos permitiu medir a atividade específica dos

oligonucleotídeos marcados.

Ensaio de Elongação de Cadeia Nascente de RNA - Cinética detranscrição de fos, jun e c-myc

Este ensaio foi utilizado com o propósito de medir-se a cinética de

transcrição dos genes de interesse em células Y-1 tratadas com diferentes

fatores. O ensaio consiste do isolamento dos núcleos de células tratadas, de

forma que eles continuem funcionais, ou seja capazes de transcrever, e

posterior continuação da polimerização de cadeias de RNA já iniciadas,

porém com fornecimento de um ou mais precursores marcados

radioativamente. O RNA marcado é então isolado e hibridizado com "slots" de

DNA dos genes de interesse (Ausubel et al, 1987).

Isolamento de núcleos

Células Y-1 foram semeadas em placas de 500 cm2 , ao atingirem a

densidade desejada as células foram carenciadas, ou se o experimento fosse

utilizar células em crescimento exponencial, o meio foi trocado 24h antes do

experimento.

As células foram submetidas aos seguintes tratamentos: ACTH, PMA ou

dibutiril cAMP por 15 min, 30 min, 1h, 2h e 3h, no caso de células em

crescimento exponencial; ou ACTH, PMA , dibutiril cAMP ou 10% soro fetal

bovino por 15 min, 30 min, 1h, 2h e 3h, no caso de células carenciadas. Após

os citados tratamentos as células foram lisadas e os núcleos isolados como

descrito a seguir:

Cada placa foi lavada 2 vezes com PBS-A gelado.

As células foram raspadas em PBS-A com o auxílio de um "cell scraper" ou

"policial" e transferidas para um tubo cônico.

3. As células foram sedimentadas por centrifugação a 1500 rpm em centrífuga

clínica.

40

O sedimento foi disperso por agitação em "vortex", em velocidade máxima.

Sobre o sedimento, ainda em agitação, pipetou-se 4m1 de solução de lise,

agitou-se por mais 10s.

A suspensão foi incubada em gelo por 5 min.

A suspensão, agora de núcleos foi sedimentada em centrífuga analítica a

3000 rpm por 5 min.

O sobrenadante foi descartado, o sedimento de núcleos foi disperso sob

agitação máxima em "vortex". Procedeu-se como no passo (5).

A suspensão foi sedimentada como no passo (7).

10. O sobrenadante foi descartado e o sedimento nuclear foi ressuspenso em

150p1 de tampão de estocagem e imediatamente congelado em nitrogênio

líquido.

Observação: todos os reagentes utilizados foram esterilizados e

utilizados a 4°C ou mantidos em gelo, assim como a centrífuga foi pré-

resfriada e utilizada à temperatura de 4°C.

Alíquotas foram retiradas da suspensão de núcleos no tampão de

estocagem e o número de núcleos foi determinado por contagem em

hemocitômetro (Câmara de Neubauer). O procedimento fornece de 2,0 a

2,5.108 núcleos por placa.

Tampão de lise: 10,0 mM Tris HCI, pH 7,4

10,0 mM NaCI

3,0 mM MgCl2

0,5% Nonidet P-40

Tampão de estocagem: 40% glicerol

5,0 mM MgCl2

50,0 mM Tris HCI, pH 8,0

0,1 mM EDTA

41

Preparação das membranas com o DNA fixado ("Siot biot")

Cada preparação de RNA nuclear foi hibridizada com uma tira de

membrana de nitrocelulose contendo amostras de DNA desnaturado. No caso

utilizou-se 2pg de fragmento dos plasmídeos correspondentes aos genes de

interesse. Os fragmentos isolados, conforme descrito anteriormente, foram

desnaturados, em tubos Eppendorf incubados em água fervendo por 10 min.

Os fragmentos desnaturados foram diluídos em solução 8x SSC e fixados na

membrana utilizando-se o aparato "The Convertible Filtration Manifold

System" da Gibco BRL. Após a aplicação dos fragmentos, as membranas

foram fornadas a 80°C por 2h, estando prontas para a hibridização.

Reação de elongação das cadeias nascentes de RNA

Esta parte do experimento é a polimerização das cadeias de RNA já

iniciadas que possibilitará a marcação do RNA através da incorporação de

precursor marcado.

Os núcleos foram descongelados à temperatura ambiente e

imediatamente diluídos em 1 volume de tampão de reação, recém preparado,

em seguida a suspensão foi levada a banho a 37°C, com agitação periódica.

Após 30 min de incubação, adicionou-se 10mM ATP e 10mM UTP em cada

reação e incubou-se mais 5 min a 37°C. Imediatamente os núcleos foram

lisados por adição de 1m1 de 4M guanidina isotiocianato com 1mM (3-

mercaptoetanol. A partir deste lisado foi feita a extração do RNA nuclear.

Tampão de reação:

2x tampão de reação sem precursores

40 U/ml RNasin (Pharmacia)

10 mM CTP

10mM GTP

0,40 mCi a32P UTP

0,40 mCi a32P ATP

42

0,1 mM DTT

Tampão de reação sem precursores: 10,0mM Tris HCI pH 8,0

5,0mM MgCl2

0,3 M KCI

Extração e purificação do RNA nuclear

A extração do RNA nuclear foi feita de acordo com procedimento

descrito por Sambrook et al, 1989, que utiliza ultracentrifugação do lisado em

colchão de cloreto de césio. As amostras de RNA obtidas após a extração e

purificação foram imediatamente diluídas em solução de hibridização e

hibridizadas. Alíquotas de cada amostra foram retiradas, as atividades dos

RNAs obtidos foram determinadas em cintilador, em média a atividade das

preparações de RNA, em diferentes experimentos, oscilou entre 0,5.10 6 a

5.106 cpm/preparação de RNA.

Pré-hibridização, hibridização, lavagem e exposição das membranas

As membranas foram hibridizadas e pré-hibridizadas em solução

contendo: 50% formamida, 5x SSPE, 5x Denhardt, 0,1% SDS e 0,1 mM

NaPPi. As membranas foram pré-hibridizadas por 3h a 42°C e hibridizadas

por 24h à mesma temperatura.

Após a reação de hibridização as membranas foram lavadas 4x em 2x

SSPE, 0,1% SDS e 1mM NaPPi, 2x por 5 min e 2x por 15 min, à temperatura

ambiente. E em seguida lavadas 2x em 0,1x SSPE e 0,1% SDS por 15min

cada vez, a primeira à temperatura ambiente e a segunda a 50°C.

As membranas foram parcialmente secas em papel de filtro,

embrulhadas em filme PVC, e colocadas em cassete com um filme de raioX

exposto em freezer -70°C por períodos entre uma semana e um mês.

Os filmes foram revelados e fixados (revelador e fixador Kodak) e os

filmes de raioX foram quantificados por densitometria e análise de imagem

pelo programa Image Analyst - Bio Rad.

43

Ensaios de Northern Blot - Medida da meia-vida dos mRNAs fos ejun

Este ensaio foi utilizado com o propósito de detectar alterações na meia-

vida do mRNAs dos genes das famílias fos e jun em células estimuladas por

ACTH, PMA, dibutiril cAMP (dcAMP). Para isto as células foram semeadas em

placas de 100mm de diâmetro, carenciadas, tratadas com os fatores citados

acima, segundo o seguinte protocolo de estimulação: a partir do tempo 0, fim

do carenciamento, as células são tratadas por 1h ou 2h com ACTH, PMA ou

dcAMP, nos tempos 1h ou 2h de tratamento adiciona-se 5pg/ml ActinomicinaD

em cada placa. As coletas são feitas então de 15 em 15 min até 1h e após 2h

e 3h de tratamento com ActinomicinaD.

Extração de RNA total

Após os tratamentos, as células foram lavadas com PBSA gelado 2

vezes e sobre a camada de células pipeta-se 0,5 ml de solução 4M guanidina

isotiocianato com 1 mM p-mercaptoetanol. As células foram usadas e o usado

foi transferido para um tubo Eppendorf estéril e congelado a -20°C até o

momento da extração.

A extração de RNA total foi feita como descrito no procedimento abaixo:

Os Usados foram descongelados.

Cada tubo recebeu seqüencialmente, 50 pl de 2M acetato de sódio pH 4.0,

0,5ml de fenol saturado com H 2O e 100 pl de solução de clorofórmio/álcool

isoamílico (49:1) recém preparada.

Os lisados foram agitados em "vortex", velocidade máxima por 10s e

resfriados em gelo por 15 min.

Os lisados foram centrifugados em microcentrífuga a 10000 rpm por 20 min

a 4°C.

44

A fase aquosa foi coletada e transferida para um tubo limpo e estéril (o DNA

e as proteínas do lisado ficaram na interface e na fase fenólica e foram

descartados).

À fase aquosa, adicionou-se 0,5 ml de isopropanol, misturou-se bem e

deixou-se a -20°C por 45 min.

Centrifugou-se a mistura em microcentrífuga a 10000 rpm por 15 min.

O sobrenadante foi descartado e cada tubo foi emborcado sobre papel

absorvente estéril e deixado por alguns minutos até que o sedimento secasse.

O sedimento foi ressuspenso em 0,3 ml da solução utilizada para a lise das

células.

À solução adicionou-se 0,3 ml de isopropanol e incubou-se a mistura a -

20°C por 45 min.

A mistura foi novamente centrifugada a 10000 rpm por 15 min.

O sedimento (RNA) foi lavado com 0,5 ml de etanol 75% gelado, seco e

ressuspenso em até 100 pl de H 2O MilliQ estéril.

Os RNAs foram estocados a -20°C, sua concentração foi determinada

através de medida de absorbância a 260 nm em espectrofotômetro e

calculada através da relação 1 unidade de A260 = 45 pg/ml RNA. O grau de

pureza foi calculado pela relação A260/A280 que deve ser 2,0 ou próximo deste

valor.

Fracionamento de RNA em gel de agarose / formaldeído

Amostras de 15 pg de RNA foram diluídas em solução 16% formaldeído,

44% formamida, 9% tampão de amostra (10% glicerol, 2 mM EDTA, 0,025%

azul de bromofenol, 0,025% xileno cianol), 1x MOPS. Cada amostra foi

submetida a aquecimento a 65°C por 20 min, em seguida resfriada em gelo e

aplicada em gel de 1% agarose contendo 18% formaldeído, 1x MOPS e

0,5pg/ml brometo de etídio.

A eletroforese foi efetuada em tampão 1x MOPS, sob uma diferença de

potencial de 5 V por cm de distância entre o polo positivo e o negativo.

45

Após a corrida os géis foram lavados 3 vezes com H 2O destilada por 30

min, sob agitação, para a remoção do formaldeído. O brometo de etídio

permitiu visualizar os RNAs ribossômicos 18S e 28S em ultravioleta, podendo-

se monitorar a quantidade de RNA aplicado no gel.

O conteúdo de cada gel foi transferido por capilaridade para membrana

de nitrocelulose em 15x SSC durante — 17h. Após a transferência as

membranas foram lavadas em 6x SSC e fornadas por 2h a 80°C.

Pré-hibridização, hibridização, lavagem das membranas e exposição

As membranas de nitrocelulose foram pré-hibridizadas por —3h a 42°C

na solução: 50% formamida, 5x Denhardt 5x (ficoll 0,1%, polivinilpirridolina

0,1% e BSA 0,1%), 5x SSPE, 0,1% SDS, 50pg/m1 DNA de esperma de

salmão previamente desnaturado a 100°C.

A reação de hibridização foi incubada a 42°C de 36 a 40h na solução:

50% formamida, 5x Denhardt, 5x SSPE, 0,1% SDS, 50pg/m1 DNA de esperma

de salmão (previamente desnaturado), 5% sulfato dextrana e sonda (100 a

200 ng DNA marcado).

Após a hibridização, as membranas foram lavadas 3 vezes em solução

1x SSC e 0,1% SDS 15 min cada lavagem à temperatura ambiente, sob

agitação. Em seguida as membranas foram lavadas com solução 0,1x SSC e

0,1% SDS, em 1 lavagem de 15 min à temperatura ambiente, sob agitação e

uma lavagem de 15 min a 50°C, sob agitação.

Após as lavagens as membranas ainda úmidas foram envolvidas em

filme de PVC e colocadas em cassetes, onde filmes de raioX ficaram expostos

a cada uma, entre telas intensificadoras, a -70°C, por períodos variáveis.

A quantificação das bandas dos filmes foi feita por densitometria e

análise de imagem pelo programa Image Analyst - Bio Rad.

46

Tratamento estatístico dos dados

Ensaio de Elongação de Cadeia Nascente de RNA

Os dados obtidos sobre os níveis de transcrição de c-myc em células Y-1

em crescimento exponencial, foram analisados através do teste ANOVA: Fator

Único. Esta abordagem executa uma simples análise de variãncia (anova)

para testar a hipótese de que médias de 2 ou mais amostras são iguais.

Já os resultados obtidos em células Y-1 carenciadas, foram analisados

pelo teste de x 2 . Neste caso, utilizamos um grupo de resultados esperados e

um grupo de resultados observados. Lançamos a hipótese de que o grupo de

resultados esperados é igual ao grupo de resultados obtidos e testamos. O

resultado do teste fornece para cada caso, um valor p, que se for menor que o

P crítico nos leva a aceitar a hipótese, caso contrário a hipótese é rejeitada. É

importante ressaltar que os resultados provém de um único experimento, ou

seja, esta análise é preliminar e poderá ser desviada por resultados de novos

experimentos.

49

Ensaio de atividade de AP-1 em células Y-1

Os experimentos de ensaio de atividade de AP-1 foram feitos em células

Y-1 em crescimento exponencial, tratadas com ACTH, PMA ou dcAMP. Nota-

se que há um nível basal de atividade de AP-1 em células Y-1 em crescimento

exponencial. Esta atividade basal é sensível ao bloqueio da síntese de

proteína, pelos inibidores Cicloheximida e Puromicina. A figura 1, mostra que

a queda de atividade de AP-1 em células Y-1 (figura 1 B), correlaciona com a

inibição de síntese proteica medida pela incorporação de 35S metionina (figura

1C): Cicloheximida causa 92,3% e Puromicina 68,5% de inibição de síntese

proteica, enquanto que a atividade de AP-1 é reduzida de mais de 95% com

Cicloheximida e cerca de 35% com Puromicina, depois de 5h de tratamento.

Células Y-1 tratadas com ACTH, PMA e dcAMP apresentam aumento da

atividade de AP-1 tanto com oligonucleotídeo TRE, como CRE. Curiosamente,

tratamento simultâneo com Cicloheximida não é capaz de anular

completamente a atividade de AP-1. Ao contrário, apesar do tratamento com

Cicloheximida, há ainda aumento da atividade de AP-1, em escala menor do

que em células tratadas apenas com ACTH, PMA e dcAMP. Estes resultados

estão apresentados nas figuras 2, 3, 4, 5, 6 e 7.

51

Controle

—e— PMA

—à— Ciclohex.

<z 2ocoogoo. 1.5 –cac»

a)"O

W'OCO

3:35

<:•-r. 0.5 –

O

2.5

Figura 6: Atividade de ligação de AP-1 em CRE, em células tratadas com

PMA.

Oh 1h 2h 3h 5h

Tempo de tratamento com PMA

Perfil de indução da atividade de ligação de extratos nucleares de

células Y-1 tratadas com 10 ng/ml PMA ao oligonucleotídeo CRE. Controle

equivale à atividade basal de células em crescimento exponencial não

tratadas, PMA corresponde a atividade em células em crescimento

exponencial tratadas com PMA por 1h, 2h, 3h e 5h; Ciclohex. corresponde às

mesmas condições de PMA porém com células submetidas a tratamento com

10pg/ml Cicloheximida por 20 min, antes da adição de PMA. Os valores

obtidos são a média dos valores obtidos por densitometria (área do pico de

transmitância integrada) de 3 experimentos independentes.

57

1h 3hOh 2h 5h

2.2

2 -Zo

1.8 -o

:ca1 6 —

rn

a)

Ri

co 1.2 —:(3

1

1.4 —

0.8

Controle

--EF— dcAMP

—á-- Cic lohex.

Tempo de tratamento com dcAMP

Figura 7: Atividade de ligação de AP-1 em CRE em células Y-1 tratadas

com dcAMP

Perfil de indução da atividade de ligação de extratos nucleares de

células Y-1 tratadas com 0,5mM dcAMP ao oligonucleotídeo CRE. Controle

equivale à atividade basal de células em crescimento exponencial não

tratadas, dcAMP corresponde a atividade em células em crescimento

exponencial tratadas com dcAMP por 1h, 2h, 3h e 5h; Ciclohex. corresponde

às mesmas condições de dcAMP porém com células submetidas a tratamento

com 10pg/m1 Cicloheximida por 20 min, antes da adição de dcAMP. Os

valores obtidos são a média dos valores obtidos por densitometria (área do

pico de transmitância integrada) de 3 experimentos independentes.

58

Transcrição dos proto-oncogenes fos, jun e c-myc em células Y-1

Os níveis de transcrição dos referidos genes em células Y-1 foi analisada

a partir de ensaios de elongação de cadeia nascente de RNA (run off

transcription). A análise destes resultados mostra que em células carenciadas,

praticamente todos os genes sofrem indução de transcrição, ainda que

pequena. Os genes cuja transcrição é diferencialmente regulada são c-fos, c-

jun, junB e c-myc. FCS e PMA são fortes indutores destes 4 genes, enquanto

que ACTH é forte indutor de c-fos, c-jun e junB e dcAMP é forte indutor

apenas de c-fos e junB.

Estes resultados estão representados nas figuras 8, 9, 10 e 11.

59

B.

c-fos1.00 -

fosB1.00

fra-11.00

0.80

0.60

0.40

0.20

- .

,- ------_

0.80

0.60

0.40-

0.20 ---,..,.,

-

-

0.80-

0.03

0.40-

a2°

-

n,\*0.00 OCO

Tempo

--- 0.00 --0 1 2 3 0 1 2 3 O 1 2 3

de tratamento com ACTH(h) Tempo de tratamento com ACTH(h) Tempo de tratamento com ACTH(h)

fra-21.00

c-jun junB1.00 1.03

0.60

0.60

0.40

0.20

0.80

0.60

0.40

0.20

Q00 ---

Q80

0.03

0.40

0.20

0.00 - -I-- -0.00 ,,O 1 2

Tempo de tratamento com ACTH(h)3 O 1 2 3

Tempo de tratamento com ACTH (h)O 1 2 3

Tempo de tratamento com ACTH(h)

junD1.00

c-myc1.00

0.e00.60-0.400.20

-

-

a,„-•

0.830.60 -

0.400.200.00

-

;/\__4_________n'•--0.03

O 1 2 3Tempo de tratamento com ACTH(h)

O 1 2 3Tempo de tratamento com ACTH(h)

B. Quantificação do autorradiograma apresentado em A. As ordenadas

representam a velocidade de transcrição relativa de cada gene, obtida a partir

de densitometria do filme de raio X. Os valores representados foram

calculados conforme especificado em Materiais e Métodos. Os resultados de

indução de transcrição de c-fos e junB são significativos, segundo o teste de

X2, para a=0,01, também descrito em Materiais e Métodos.

61

3.000.00 1.00 2.00

1.00 2.00 3.00

0.00 1.00 2.00 3.00Tempo de tratamento com PMA (h)

0.00 1.00 2.00 3.00Tempo de tratamento com PMA (h) Tempo de tratamento com PMA (h)

fra-21

F-0.8 -

0.6

0.4 -

0.2 -

0.00 1.00

Tempo de tratamento com PMA (h)

junD1

0.8

0.6

0.4

0.2

-0.00 1.00 2.00 3.00Tempo de tratamento com PMA (h)

c-myc

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0.00Tempo de tratamento com PMA (h)

c-fos

0.8

0.6

0.4

0.2

fosB1

0.8

0.6

0.4

02

junB

0.8

0.6

0.4

0.2

0.00 1.00 2.00 3.00Tempo de tratamento com PMA (h)

2.00 3.00

fra-11 T-

0.8 -

0.6

0.4

0.2

B.

B. Quantificação do autorradiograma apresentado em A. As ordenadas

representam a velocidade de transcrição relativa de cada gene, obtida a partir

de densitometria do filme de raio X. Os valores representados foram

calculados conforme especificado em Materiais e Métodos. Os resultados de

indução de transcrição de c-fos, c-jun e junB são significativos segundo o

teste de x2 , para a=0,01.

63

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

c-fos

0.8

0.6

0.4 1-

0.2

—O 1 2

Tempo de tratamento com cAMP (h)O 1

Tempo de tratamento2 3

com dAMP (h)

fra-21

c-jun1—

0.8

0.6

0.40.2

o3

0.8 T

0.6 ri

0.4 +

0.2

OO 1 2 O 1 2

Tempo de tratamento com cAMP (h)

*a-11-

0.80.8

0.6 -

0.4 -

0.2 47.--4—___+___--•-----____+O _.

O 1 2Tempo de tratamento com cAMP (h)

junB1

0.8

0.6

0.4

0.2

O 1 2 3Tempo de tratamento com cAMP (h)Tempo de tratamento com cAMP (h)

Tem po de tratamento com cAMP (h)

c-myc1

0.8 -

0.6

0.4 -0.2

o r1 2

Tempo de tratamento com dAMP (h)

B.

B. Quantificação do autorradiograma apresentado em A. As ordenadas

representam a velocidade de transcrição relativa de cada gene, obtida a partir

de densitometria do filme de raio X. Os valores representados foram

calculados conforme especificado em Materiais e Métodos. Os resultados de

indução de transcrição de junB, são significativos, segundo o teste de x2, com

a=0,01.

65

B.

c-fos1 —

fra-11.01

0.8

0.6

0.4 -

0.2

---____1 _ _

i 0.8

0.6

0.4

0.2 4efr_...

0.4

0.8

0.6

°20.0 INNINNagghkl.

(0.2) livO 1 2 3Tempo de tratamento com FCS (h)

OO 1 2

Tempo de tratamento com FCS (h)

3Tempo de tratamento com FCS (h)

fra-21 - ---

ojun junB

0.8-

0.6 -

0.4 -

02-

O

0.8

0.6

0.4

0.2

O 1 2Tempo de tratamento com FCS (h)

-

1

0.8

0.6

0.4

0.2

-

-

-

-

O 1 2 3Tempo de tratamento com FCS (h)

3 O 1 2 3Tempo de tratamento com FCS (h)

junD1

c-inyc1

0.8

0.6 -

0. 4 -

0.2 -

0.8

0.6

-

-

0.4

0.2

O

-

-

, -0 +

0 1 2 3Tempo de tratamento com FCS (h)

O 1 2

Tempo de tratamento com FCS (h)

B. Quantificação do autorradiograma apresentado em A. As ordenadas

representam a velocidade de transcrição relativa de cada gene, obtida a partir

de densitometria do filme de raio X. Os valores representados foram

calculados conforme especificado em Materiais e Métodos. Os resultados de

indução de transcrição de c-fos, c-jun e junB são significativos, segundo o

teste de x2 , para a=0,01.

67

Examinamos também os níveis de transcrição de c-myc em células Y-1

em crescimento exponencial. As figuras 12, 13 e 14 mostram os resultados

obtidos a partir dos experimentos de elongação de cadeia nascente de RNA

em células estimuladas com ACTH, PMA e dcAMP. Estes resultados nos

mostram que os tratamentos não induzem alterações significativas nos níveis

de transcrição de c-myc em células em crescimento exponencial.

68

Níveis de mRNA dos proto-oncogenes fos e jun em células Y-1carenciadas, detectados por hibridizacões tipo Northern

A figura 15 mostra as cinéticas de degradação do mRNA de c-fos em

células Y-1 carenciadas e estimuladas com ACTH e PMA. Após estimuladas,

as células foram tratadas com ActinomicinaD para bloquear a síntese de RNA.

Observamos nesta figura que a meia-vida do transcrito de c-fos é de 35 min

em células tratadas com ACTH e 28,8 min em células tratadas com PMA, ou

seja, a meia vida dos transcritos de c-fos em células tratadas com PMA é 27%

menor que a meia vida dos transcritos de c-fos em células tratadas com

ACTH. Os sinais de transcritos de c-fos em células Y-1 tratadas com dcAMP

estiveram abaixo dos níveis de detecção e quantificação.

A figura 16 mostra a cinética de degradação de c-jun em células Y-1

carenciadas, estimuladas com PMA e após 1h, tratadas com ActinomicinaD

por períodos variados.

Na figura 17 são apresentadas as estimativas dos níveis de mRNA de

fosB de células tratadas com ActinomicinaD além de ACTH. Nota-se um

acentuado aumento dos níveis de mRNA causado pelo tratamento com

ActinomicinaD, seguido de progressiva redução. Nesta fase de redução foi

possível fazer uma estimativa da meia-vida do mRNA de fosB, determinada

em 31 min.

A figura 18A mostra que ActinomicinaD inibe 97% da incorporação de 3H

uridina em RNA em células Y-1, indicando que nestas condições há um

eficiente bloqueio da transcrição. Por outro lado, a figura 18B mostra que

tratamento prévio com ActinomicinaD elimina a indução de fosB por ACTH,

PMA e dcAMP, em células Y-1, coerente com a idéia de bloqueio de

transcrição. Portanto o efeito "superindutivo" de ActinomicinaD sobre o mRNA

de fosB, quando adicionada após 1h ou 2h de ACTH, em células Y-1

(conforme mostrado na figura 17), deve-se, necessariamente, a mecanismos

pós-transcricionais.

Cabe assinalar que ActinomicinaD não tem efeito "indutivo" sobre a

expressão de fosB em células não estimuladas, o que se explicaria por níveis

72

muito baixos do mRNA nestas condições, ou porque este efeito só aparece na

presença de indutores como ACTH e PMA.

73

Atividade de AP-1 em células Y-1

Os resultados mostram que há, em células Y-1 em crescimento

exponencial, um nível basal de atividade de AP-1, cujos valores aumentam

significantemente em células tratadas com ACTH, PMA e dcAMP. Este

aumento não surpreende uma vez que ACTH e PMA induzem os genes fos e

jun e levam ao aumento das proteínas Fos e Jun.

No entanto, o aumento de atividade de AP-1 não é conseqüência do

aumento da concentração das proteínas Fos e Jun causado pela indução dos

respectivos genes por ACTH e PMA. Isto porque: a) tratamento com

Cicloheximida leva a uma acentuada redução nos níveis basais de atividade

de AP-1, b) tratamento concomitante de ACTH, PMA ou dcAMP com

Cicloheximida é capaz de ativar AP-1.

Portanto, a modulação da atividade de AP-1 é complexa. Assim, a

indução dos genes fos e jun permite mudança da composição relativa do

estoque de proteínas Fos e Jun e também dos níveis de concentração total.

Há ativação do complexo ao nível das proteínas. E finalmente, a alta

sensibilidade da atividade de AP-1 à inibição da síntese protéica, sem que isto

possa ser explicado pela redução da concentração das proteínas, sugerem

um mecanismo refinado pós traducional regulando atividade deste grupo de

fatores de transcrição.

Observamos também que os resultados obtidos em reações com o

oligonucloetídeo CRE são bastante semelhantes aos obtidos com o

oligonucleotídeo TRE. Sabe-se que os complexos AP-1 reconhecem e ligam

em sequências CRE (Ryseck & Bravo, 1991), dependendo da composição do

dímero e também das regiões flanqueadoras da sequência CRE consenso.

Não apenas isso, fatores de transcrição CREB também ligam-se a sequências

TRE, sendo que alguns autores sugerem que os fatores de transcrição AP-1 e

CREB/ATF poderiam ser classificados em apenas uma super-família de

fatores de transcrição (Masquilier & Sassone-Corsi, 1992; Hai & Curran, 1991;

Sassone-Corsi et al, 1990). Sabe-se também que as proteínas Jun formam

dímeros com CREB (CRE Binding Protein) e estes dímeros podem

79

reconhecer tanto sequências AP-1 quanto sequências CRE (DeCesare et al,

1995; Dorsey et al, 1995).

CREB/ATF é uma família de fatores de transcrição cuja atividade é

modulada por fosforilação pela subunidade catalítica de PKA. As proteínas do

fator AP-1, Fos e Jun, são reguladas a nível de expressão dos mRNAs e

proteínas e a nível de modificações pós-traducionais, principalmente

fosforilação. A principal via conhecida pela qual há indução da transcrição e

atividade das proteínas de AP-1 é a via Raf/MAP quinases. Esta via é ativada

por Ras e também por PKC.

Os resultados de indução da atividade de AP-1 em células Y-1 sugerem

que tratamento com dcAMP, que obrigatoriamente ativa a via de PKA, deve

promover indução da atividade de AP-1 por ativação de CREB que estaria

reconhecendo elementos TRE e CRE, ou ainda por fosforilação de complexos

AP-1 já formados embora não se saiba se PKA fosforila outros fatores de

transcrição que não os da família CREB/ATF. PMA obrigatoriamente ativa a

via de PKC, que por sua vez ativa a cascata de MAP quinases que levam à

expressão dos proto-oncogenes fos e jun promovendo aumento da atividade

de AP-1 (Burgering & Bos, 1995). Vale lembrar que a via de MAP quinases

não só promove transcrição de fos e jun como também promove fosforilação

de resíduos de serina das proteínas aumentando a atividade do complexo AP-

1, independentemente de síntese de proteína. ACTH apresenta efeito

semelhante ao de PMA.

O receptor de ACTH é um receptor capaz de ativar proteína G e muito

provavelmente a via de MAP quinases (não só pela estrutura do receptor, mas

também por induzir transcrição dos proto-oncogenes fos e jun), neste caso, a

via de MAP quinases promoveria expressão de Fos e Jun e também

fosforilação do complexo AP-1 aumentando a sua atividade. Sabe-se também

que ACTH ativa a via de PKA, sendo capaz portanto de ativar, em células Y-1,

vias de transdução de sinal diferentes mas que podem se cruzar ou convergir

para um ponto em comum.

Corrobora a idéia de ativação de vias que podem convergir para um

mesmo ponto, resultados obtidos no laboratório com um clone mutante de Y-1

PKA- , onde ACTH não é capaz de induzir expressão de fosB, PMA é capaz de

80

induzir pequena expressão de fosB, mas tratamento simultâneo com ACTH e

PMA tem efeito sinergístico sobre a indução de fosB, mostrando que há uma

colaboração entre a ação de ACTH e PMA sobre a indução de fosB.

Cinética de indução da transcrição dos proto-oncomenes fos, jun e c-mycem células Y-1

Observamos em alguns casos, que há transcrição de genes mesmo em

células carenciadas, chamamos esta condição de nível basal de transcrição.

No caso, c-myc e junD apresentam níveis basais altos, uma vez que são

constitutivamente expressos (referência à transcrição gênica), apesar de

serem estimulados por alguns tratamentos. No caso dos outros genes das

famílias fos e jun o nível basal de transcrição é tão pequeno que se confunde

com o "background" do filme, tornando imprecisas as medidas nestas

condições.

A nível de transcrição, os genes que se destacam por serem

diferencialmente expressos são c-fos, c-jun, junB e c-myc. Os resultados

mostram que junB é o gene melhor induzido por ACTH, PMA e dcAMP,

enquanto que c-jun é o gene melhor induzido por soro (FCS). c-fos é bem

induzido por ACTH e PMA, mas também é induzido por dcAMP e soro, em

uma escala menor. c-myc é bem induzido por soro e PMA, mas não por

dcAMP e ACTH. A análise estatística destes resultados, mostra que os

resultados de indução de c-myc por FCS e PMA, de c-fos por dcAMP não são

significativos, porém observa-se, pelo menos qualitativamente que há indução

da transcrição nestes casos. Devemos relembrar o fato desta análise ter sido

feita sobre um resultado único, sendo uma análise preliminar.

O restante dos genes analisados apresentam pequena indução em

tempos curtos de tratamento com todos os fatores utilizados.

81

A regulação de c-myc.

Células em crescimento exponencial apresentam expressão constitutiva

de c-myc que não é alterada pelos tratamentos utilizados, sugerindo que o

controle de transcrição de c-myc neste caso está bastante relaxado. O teste

ANOVA: Fator Único, mostra que as variações observadas não são

significativas.

Trabalhos anteriores do laboratório, descritos na Introdução, mostram

que tratamento com ACTH e dcAMP promovem diminuição da expressão de

c-myc em células carenciadas, provavelmente, esta diminuição é devida a um

grande aumento da instabilidade do transcrito, uma vez que não há bloqueio

da transcrição, ou ainda a transcrição pode ser abortiva e não gerar um

transcrito detectável. Dados da literatura descrevem este tipo de regulação na

expressão de c-myc (Krumm et al, 1995; Eick et al, 1994).

No caso de células carenciadas, observamos que há transcrição basal

de c-myc relativamente alta, principalmente se compararmos vários modelos

de células normais descritos por vários grupos onde o carenciamento

promove total bloqueio da expressão de c-myc. Porém este basal é

aumentado, qualitativamente, por tratamentos com soro e PMA, enquanto que

tratamentos com ACTH e dcAMP não têm efeito sobre a transcrição de c-myc.

Estes resultados mostram-se de acordo com dados anteriores, onde ACTH e

dcAMP inibem expressão de c-myc e PMA aumenta a expressão de c-myc em

células Y-1 em crescimento exponencial.

Regulação dos níveis dos mRNAs dos proto-oncogenes fos e jun

O uso de ActinomicinaD reafirmou a importância do controle de

transcrição na regulação dos níveis de mRNA dos genes fos e jun.

Primeiro, tratamento prévio com ActinomicinaD elimina a indução de

fosB por ACTH e PMA. Segundo, a meia-vida dos mRNAs de c-fos e c-jun

foram estimadas em aproximadamente 30 min, sugerindo que a velocidade de

degradação não é importante no controle dos níveis destes mRNAs. Terceiro,

82

observamos um efeito "superindutivo" de ActinomicinaD sobre o mRNA de

fosB. Este efeito, que já foi descrito por outros grupos para mRNAs das

famílias fos e jun e também de outros proto-oncogenes (Chen & Shyu, 1994;

Schiavi et al, 1992); parece ser artefactual ao promover a redução da

velocidade da degradação do mRNA embora seja um efeito indicador da

ocorrência de mecanismos pós-transcricionais relevantes na transmissão da

informação genética do gene à proteína, ainda não esclarecidos. A hipótese

levantada para explicar este efeito, por este grupo, foi a de que, sequências

específicas do mRNA seriam reconhecidas por proteínas que são

translocadas do núcleo para o citoplasma quando a célula é tratada com

inibidores de transcrição, estas proteínas são capazes de estabilizar o

transcrito por competirem com outras que sinalizariam, ou iniciariam a

degradação do mesmo.

É interessante notar que ActinomicinaD diferencia os mRNAs de c-fos e

fosB quanto à degradação.

83

.178

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