Ebeling: Schnelle und exakte Fibrinogen-Bestimmungsmethode 205

J. Clin. Chem. Clin. Biochem.Vol. 14, 1976, pp. 205-211

Eine schnelle und exakte Fibrinogen-Bestimmungsmethode unter Berücksichtigung vonSpaltprodukten

Von H. Ebeling

Institut für Klinische Chemie und Klinische Biochemie (Direktor: Prof. Dr. H.-J. Dulce) am Klinikum Steglitz derFreien Universität Berlin

(Eingegangen am 1. Dezember 1975/5. Februar 1976)

Zusammenfassung: Mit einer mechanisierten nephelometrischen Meßtechnik werden immunologisch-faßbareFibrinogenäquivalente vor und nach Ausgerinnen des Fibrinogens aus Citratblut quantitativ bestimmt. Man erhältso einerseits die Summe aller Fibrinogenäquivalent-Konzentrationen und andererseits die „Spaltprodukt"-Konzen-trationen. Durch Differenzbildung aus beiden Messungen ergibt sich die Konzentration an gerinnbarem Fibrinogen.

Für eine Fibrinogen-Konzentration von 11,15 mg/1 ergeben sich Variationskoeffizienten von 2,81% pro Serie und3,31 % von Tag zu Tag.

Im Vergleich mit der einfachen radialen Immundiffusion und der „gerinnungsphysiologischen Schnellmethode zurBestimmung des Fibrinogens" nach Clauss ((1957), Acta Haematol. 17, 237—246) wird unter Fibrinogenolyse-Bedin-gungen und unter Heparin die „Richtigkeit" der mit der neuen Methode erhaltenen Werte überprüft.

Zusätzlich wurden aus 180 Citratblutproben eines gemischten Krankenguts im Methodenvergleich mit der ein-fachen radialen Immundiffusion und der Methode nach Clauss Fibrinogen-Bestimmungen durchgeführt.

Nur die neue Schnellmethode mißt offensichtlich plausible Fibrinogenwerte und läßt gut zwischen gerinnbaren undnicht gerinnbaren Fibrinogenäquivalenten unterscheiden. Sie empfiehlt sich für die Klinik.

A rapid and precise determination offlbrinogen and its cleavage products

Summary: A method is described for the quantitative determination of fibrinogen equivalents in citrated bloodbefore and after removal of the fibrinogen by coagulation. The method employs an immunological reaction, whichis measured by mechanized nephelometry. Thus the sum of all the fibrinogen equivalents can be compared with theconcentration of "cleavage products". The difference between the two readings represents the concentration of co-agulable fibrinogen. For a fibrinogen concentration of 11.15 mg/1, variation coefficients of 2.81 % in series and3.31 % for day to day were obtained.

The accuracy of the new method was tested under conditions of fibrinogenolysis, and in the presence of heparin, bycomparison with simple radial immunodiffusion^ and with the "coagulation physiological rapid method for the deter-mination of fibrinogen" after Clauss ((1957), Acta Haematol. 17, 237-246).In addition 180 citrated blood samples of different patients were compared with the simple radial immunodiffusion,the method of Clauss and the new method.Only the new rapid method appears to measure plausible fibrinogen values, and permits a clear differentiationbetween coagulable and non-coagiilable fibrinogen equivalents. It can be recommended for clinical practice.

Einleitung Und Fragestellung Bestimmungsmethoden als Labortests verwendet werdendürften.

Für die Klinik sind die Zustände der Verbrauchskoa- Anliegen dieser Arbeit war es, eine Methode zu ent-giilopathie und Fibrinogenolyse bei haemorrhagischen wickeln, die schnell, empfindlich und exakt Fibrinogen-Diathesen mehr und mehr in den Mittelpunkt des Inter- werte mißt, auch und gerade unter extremen Krankheits-esses gerückt. Dies bedingt, daß besonders in kritischen und Therapie-Bedingungen wie Fibrinogenolyse undSituationen nur verläßliche und empfindliche Fibrinogen- hoher Heparin-Dosierung.

J. din. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 14,1976 / No. 5 15

206 Ebeling: Schnelle und exakte Fibrinogen-Bestimmungsmethode

Material und Methoden

Apparate

Technicon Auto Analyzer, wie beschrieben (2, 3), hier zwei-kanalig. Fließschema s. Abbildung 1.Coagulometer nach Schnitger & Groß (Fa. H. Amelung, Lemgo-Brake).

ReagenzienStandard-Human-Plasma,Human-Plasmaprotein-Anti-Fibrinogen-Serum vom Kaninchen,Test-Thrombin,Test-Streptokinase (5000 I.E./2,5 ml) undImmundiffusionsplatten M-Partigen-Fibrinogen (Fa. Behring-werke AG, Maiburg).Natriumcitratlösung 3,8% (Fa. Dr. E. Fresenius KG, Bad Hom-burg v. d. H.).Trasylol 100 000 KIE/5 ml (Fa. Bayer AG, Leverkusen).Liquemin 20 000 USP-E. Heparin-Natrium/ml (Fa. Hoff-mann-La Röche AG, Grenzach, Baden).öwre/w-Veronal-Puffer pH 7,35, 175,5 mmol/1:NaCl 125,7 mmol/1,Baibital-Natrium p.a. 28,3 mmol/1 undHC1 21,5 mmol/1 (Fa. E. Merck, Därm-

stadt).6,00, 11 mmol/1 (2, 4).

Trasylol-Lösungen: Verdünnungen mit tfriifow-Äofcmso/i-Puffer-NaCl-Lösung 1:4 für Methode nach Clauss (l) und Partigen-platten-Methode (zitiert nach I.e. (5)), für das standardisierte'nephelometrische Vorgehen 1:200.Test-Thrombin-Lösung I für Methode nach Clauss: nach der Vor-schrift des Herstellers gelöst (£ 10 NIH-E./0,! ml).

Test-Thrombin-Lösung II für nephelometrische Methode: gelöstinBritton-Robinson-PrftetMzCl-Lösung (=2,5 NIH-E./50 ).Test-Streptokinase-Lösung: 5000 I.E./2,5 ml Britton-Robinson-PuffepNaCl-Lösung.Heparin-Lösungen: Liquemin-Verdünnungen mit Br it ton-Rob in·son-Puff er-NaCl-Lösung.Reagenzien zur zweidimensionalen Geldoppeldiffusion, wie be-schrieben (2).

ProbenmaterialCitratblut (= l Teil Natriumcitratlösung + 9 Teüe Blut) wird miteiner Plastikspritze entnommen und für 10 Minuten bei 1500 gin silikonisierten Glasröhrchen zur Citratplasma^Jewinnungzentrifugiert.Für die Methode nach Clauss und die einfache radiale Immun-diffusion auf der Partigenplatte diente als gemeinsames Aus-gangsmateriäl eine l^-Citratplasma^Vorverdunnung folgenderZusammensetzung: 500 Citratplasma

50 TrasyloWLösung (£ 250 KIE)450 tfw/wz^Verpnal-Puffer.

Für Fibrinogen-Konzentrationen außerhalb der Standardkurvenwurden mit Owrens- Verqnai-Puffer andere Verdünnungen angesetzt.Für die nephelometrische Arbeitsweise empfiehlt sich folgendesstandardisiertes Vorgehen beim .Ansetzen der Proben:

10 Citratplasma100 Trasylol-Lösung (* 5 KIE)

Lösung. Diese l:241rCitratplasma-Vorverdünriüng ist das Aus-gangsmaterial für die nephelometrische Fibrinogenäquivalent-Bestünmung. Es werden zusammengegebena) zur Fibrinogenäqüivalent-Bestimmung aus Citratplasma

1000 l:241-Citratplasma-Vorver-dünnung

50Lösung und

t_

>ZweikonolSchreiber

fl —

. - - , . . ^I ml /mm1.2 1 5 ' . .

* kj |

,1 0.6 4·- °·1 ' 3<

Fluoronephelo- l5*™uv.n9en.H3| |01 1.2 Q 2'

meter TABS I 071 A ! r

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°J

Kanal

Probennehmer

KanalA '

Abb. 1. Fließschema zum Vorgehen bei Fibrinogenäquivalent-Bestimmungen aus Plasma und Serum:Kanal A: Antigen-Antikörper-Reaktion,Kanal B: Proben-Eigenstreuung.Dosier-Pumpenschläuche:1 und l' = Antigenprobe („a" = Plasma-, „b" = „Serumu-Fibrinogenäquivalente),2 und 2' = Puffer-Lösung,3 = Anti-Humanfibrinogen-Serum-Lösung,3' = Puffer-Lösung,4 und 4' = Luft über Luftschleusen,5 und 5' = Küvettenabsaugung,6 = Puffer-Lösung zum Probennehmer-Zwischenspülgefaß.Vor den Bestimmungen ist auf exaktes nephelometrisches Abgleichen beider Fluoronephelometer streng zu achten.

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Ebeling: Schnelle und exakte Fibrinogen-Bestimmungsmethode 207

b) zur Fibrinogenäquivalent-Bestimmung aus Citratserum1000 l:241-Citratplasma-Vorver-dünnung

50 Test-Thrombin-Lösung II(* 2,5 NIH-E.).

Nach mindestens 5 Minuten Reaktionszeit bei Raumtemperaturweiden die Proben a) und b) in der Ecco-Zentrifuge bei 11 000 gfür 10 Minuten zentrifugiert. Die sich ergebenden Überstände desnun 1:253,05 vorverdünnten Citratplasmas werden als Proben a)und b) bei der mechanisierten, immunologisch-nephelometrischenMethode eingesetzt (siehe auch Fließschema, Abb. 1). Sofern einesofortige Bestimmung der Proben nicht durchgeführt werdenkann, empfiehlt sich Stapelverarbeitung, die hier besonders ausVergleichsgriinden mit den Methoden untereinander zweckmäßigwar. Dazu wurden auf Abruf bis zu vier Wochen die beschriebe-nen 1:2- bzw. l:241-Citratplasma-Vorverdünnungen bei - 20°Ceingelagert.

Fibrinogenäquivalente-Bestimmung mit der neuen mecha-nisierten immunologisch-nephelometrischen MethodeIm Prinzip werden die Bestimmungen mit gegenüber früher be-schriebenen leicht modifizierten Fließschemata durchgeführt(2, 3). Auch beim Zweikanal-Betrieb (siehe Abb. 1) wird sinn-gemäß so vorgegangen, wie bereits für andere Systeme beschrie-ben (2-4). Als standardisiertes optimales Reaktionsmilieu hatsich wiederum Bnrrow-Äöftmso/i-Puffer-NaCl-Lösung mit pH 6,00und einer Gesamtsalzkonzentration von 11 mmol/1 bewährt. AlsAntikörper diente auch hier Kaninchenserum, monospezifischfür Human-Plasma-Fibririogen. In Abhängigkeit von den verwen-deten Chargen benutzten wir 1:6- bis l:12-Antiserum-Vorver-dünnungen in Britton-Robinson-Puffei-NaCl-Lösung.

Ebenso wie für die einfache radiale Immundiffusion auf der Par-tigenplatte und die Methode nach Clauss wurde hier mit Stan-dard-Human-Plasma die Fibrinogen-Kalibrierung vorgenommen.Für die Eichung empfehlen sich Fibrinogenäquivalent-Konzen-trationen im Bereich von 40 bis 0,5 mg/1. Dabei sollten beson-ders im unteren Konzentrations-Bereich ab 4,0 mg/1 die Verdiih-nungsschritte kleiner sein, um vor allem die Serum-Fibrinogen-äquivalente in diesem Konzentrationsbereich genau zu erfassen.

Erfahrungen wurden mit dem ein- wie dem zweikanaligen,mechanisierten Fibrinogen-Bestimmungs-System gesammelt. Daaber pro Patientenmaterial zwei Proben, a) und b), anfallen undkorrekterweise beide Proben-Eigenstreuungen ebenfalls bestimmtwerden müssen, erbringt ein zweikanaliges Vorgehen doppeltenZeitgewinn. So empfiehlt sich z. B. auf Kanal „A" die Antigen-Antikörper-Reaktion ablaufen zu lassen und über Kanal „B" diedazugehörige Proben-Eigenstreuung zu bestimmen.

Bei einer Probennehmer-Frequenz von 80 pro Stunde, einemzeitlichen Probe-Ansaug- und Zwischen-Spüi-Verhältnis von 1:1und einer reinen Reaktionszeit von 90 Sekunden erhält man beimZweikahal-Betrieb in 320 Sekunden nach Ansaug-Beginn derersten Probe sowohl die beiden „Antigen-Antikörper-plus-Eigenstreuungs"-Peaks als auch die dazugehörigen beiden„Eigenstreuungs"rPeaks auf dem Schreiberpapier registriert.Durch Peaklängen-Differenzbildung zwischen den ,jAntigen-Antikörper-plus-Eigenstreuungs"-Peaks und den „Eigenstieu-ungs'VPeaks ergeben sich

a) die „reinen" Antigen-Aiitikörper-Peaks der Citratplasma-Fibrinogenäquivalent-Bestimmung und

b) die der Citratserum^Flbrinogenäquivalent-Bestimmung, hierauch als „Spaltprodukte" bezeichnet.

Anhand der mitgefahrenen Standardwerte werden die Konzen-trationen der „reinen" Peak-Längen ermittelt. Multiplikationmit den Verdünnungsfäktoren ergeben die Fibrinogenäquiva-lent-Konzentrationen im Vollplasma und Vollserum. Subtrak-tion a) minus b) ergibt die gesuchte gerinnbare Fibrinogen-Konzentration im Vollplasma.

Ergebnisse und Diskussion

Aus Tabelle l sind die für diese Arbeit ermitteltenmethodenspezifischen Qualitätskontroil-Angaben für

die drei Fibrinogen-Bestimmungsmethoden zu entneh-men. Mit einer Präzision pro Serie von 2,81% und einerPräzision von Tag zu Tag mit 3,31% zeigt die neue Me-thode eine gute Reproduzierbarkeit.

Beim Erarbeiten dieser neuen, mechanisierten, immuno-logisch-nephelometrischen Fibrinogen-Bestimmungs-methode wurde darauf geachtet, nicht eine Methode zupräsentieren, die auf Grund von Bestimmungen aus Nor-malplasmen zu offensichtlich „richtigen" Fibrinogen-Konzentrationen kommt. Vielmehr sollte sie vor allemunter extremen Bedingungen geprüft sein. Dazu gehörtedas Testen unter Fibrinogenolyse (Abb. 2). Wie die Ab-bildung zeigt, nimmt unter Plasmin-Aktivierung pro

Tab. 1. Präzision der Fibrinogen-Bestimmungsmethoden mitStandard-Human-Plasma (Batch No. 1174):

Konzentration der VKN Präzisionskontrolle [%]

Methode nach Clauss 10Partigenplatte 34neue Methode 40neue Methode 10

1,381,22

g/lg/l

11,15 mg/1

5,16 +3,43 +2,81 +3,31 ++

+ = pro Serie•H- = von Tag zu Tag

5 -

30 60 90Fibrinogenolysezeit [min]

Abb. 2. Bestimmungen von Fibrinpgenäquivalenten unter Fibrino-genolyse in Abhängigkeit von der Zeit im Methoden-Vergleich:Inkubationsansätze bei 37°C:Zu je 500 Citratmischplasma

+ 500 Test-Streptokinase (= 1000 I.E.)Zugabe von

500 Trasylol (= 10 000 KIE) zu den jeweiligenAnsätzen nach 0, 5, 10, 15, 22,5, 32,5, 45, 60, 90 und120 Minuten Inkubationszeit1 = einfache radiale Immundiffusion auf M-Partigen-

platte,4 = SchneJl-Fibrinogengerinnungs-Methode nach Clauss.Neue, mechanisierte, ünmunologisch-nephelometrischeSchnellmethode:2 = Plasma-Fibrinogenäquivalente (= „a"),3 = Serum-Fibrinogenäquivalente (= „Spaltprodukte")

5 = Differerizkurve = 2-3 = gerinnbares Fibrinogen.

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208 Ebeling: Schnelle und exakte Fibrinogen-Bestimmungsmethode

Zeiteinheit die gerinnbare Fibrinogen-Konzentrationdieses Mischplasmas sehr schnell ab und ist nach 120 Mi-nuten mit der neuen, mechanisierten Methode nichtmehr nachweisbar. Zum Zeitpunkt 0 Minuten bestandeine Konzentration von 3,09 g/l und war nephelome-trisch nach 120 Minuten unter die Nachweisgrenze ab-gesunken. Gleichzeitig ist aus der Abbildung das ent-sprechende Ansteigen der nicht gerinnbaren Fibrinogen-äquivalent-Konzentrationen (= „Spaltprodukte'') ersicht-lich, die gleichfalls mit der neuen, mechanisierten Me-thode ermittelt wurden. Zum Zeitpunkt 0 Minuten nochnicht nachweisbar, stiegen sie nach 120 Minuten auf1,32 g/l an. Mit dem gleichen fib rinogenolytischenProbenmaterial wurden ebenfalls Fibrinogen-Bestim-mungen mit der einfachen radialen Immundiffusion aufder Partigenplatte und mit der Methode nach Claussdurchgeführt. Wie Abbildung 2 deutlich zeigt, mißt diePartigenplatten-Methode unter Fibrinogenolyse imGegensatz zur Methode nach Clauss und der neuen,mechanisierten, immunologisch-nephelometrischenMethode völlig divergierende Werte. Denn trotz ähn-licher Antiserum-Qualität aller hier durchgeführten im-munologischen Methoden ergab die auf dem Prinzip derradialen Immundiffusion basierende Methode bei fibri-nogenolytischem Probenmaterial scheinbar höhere„Fibrinogen"-Werte. Offensichtlich kann die Partigen-platten-Methode nicht zwischen Fibrinogen und Fibri-nogen-Spaltprodukten differenzieren, so daß längereDiffusionsstrecken der niedermolekulareren Fibrino-genolyse-Produkte höhere „Fibrinogen"-Werte vortäu-schen. In dem Maße, in dem etwa die „Spaltprodukte"zunehmen, nimmt die „Fibrinogen"-Konzentration beider Partigenplatte zu. Zum Zeitpunkt 0 Minuten beträgtdie Konzentration 3,13 g/l und nach 120 Minuten4,41 g/l. Ebenfalls mit dem fibrinogenolytischen Mate-rial durchgeführte zweidimensionale Geldoppeldiffu-sions-Teste nach Ouchterlony zeigten, wie zu erwartenwar, Mehrbandigkeit in der Fibrinogenolyse-Zeit ab 10bis 60 Minuten. Ganz im Gegensatz dazu und widerErwarten zeigten die Partigenplatten-Versuche jeweilsnur einfache Präzipitationsringe. Im Gegensatz zu derhier vorgestellten neuen immunologisch-nephelo-metrischen Fibrinogen-Bestimmungsmethode kanndie Partigenplatten-Methode nach dem herkömmlichenVorgehen sowieso nicht zwischen gerinnbarem Fibri-nogen und anderen nicht gerinnbaren Fibrinogenäqui-valenten unterscheiden. Zu erwarten waren von vorn-herein auf der Partigenplatte unkorrekte Werte aus fibri-nogenolytischem Probenmaterial, da bei dem Vorgehenalle immonologisch-faßbaren Fibrinogenäquivalentemitreagieren. Andererseits aber ist die Partigenplatten-Methode zu unempfindlich, um ein ähnliches Vorgehenwie bei der Nephelometrie mit getrennten Plasma- undSerum-Proben zu realisieren. So mißt sie aus Materialunter Fibrinogenolyse-Bedingungen weder Fibrinogen,noch Fibrinogen-„Spaltprodukte", noch Plasma-Fibri-nogenäquivalente korrekt. Dies ist bedingt durch unter-schiedliche Molekülgrößen von Fibrinogen und Fibri-

nogenolyseJProdukten mit ungleichen Diffusionsstreckenund deren gegenseitiger positiver und negativer Beeinflus-sung bezüglich Diffusion. Wie aus Abbildung 2 ersichtlich,nehmen die immunologisch-nephelometrisch bestimmtenPlasma-Fibrinogenäquivalente unter Fibrinogenqlyse ab.Hinzu kommt, daß die Partigenplatte erst nach Tagenablesbar und deshalb gleichfalls für eine akute Diagnostikunbrauchbar ist.

Entsprechend kritische Einwände wurden schon 1971 vonBrittin et al. (6) bei der Bewertung der einfachen radialenImmundiffusion zur Ermittlung von korrekten Fibrino-gen-Werten aus fibrinogenoly tischem Patientenmaterialerhoben.

Ebenso können immunologischrjiephelometrische Metho-den ohne differenziertes Vorgehen beim Bestimmen vonFibrinogenäquivalenten nicht den Anspruch auf „Rich-tigkeit" erheben, sofern es sich um spaltprodukt-haltigesMaterial handelt (2,7, 8).

Die Abbildung 2 zeigt zudem die „Fibrinogen"-Wertenach der Cta/ss'scheü Methode aus dem fibrinogeno-lytischen Probenmaterial. Zum Zeitpunkt 0 Minutenbeträgt die FibrinogenJConzentration 3,52 g/l und nach120 Minuten nur noch 0,38 g/l. In der „Fruhphase" derPlasminolyse laufen die Werte der Ctetfs'schen Methoderecht gut übereinstimmend mit dem nephelometrischermittelten gerinnbaren Fibrinogen. In der „Spätphase"der Plasminolyse jedoch mißt die Clauss'sche Methodeim Vergleich zur Nephelometrie höhere „Fibrinogen"-Werte. Wie die Abbildung zeigt, ergeben sich nach derCÄwss'schen Methode in der späteren Phase Mittelwerte,die etwa zwischen den nephelometrisch ermittelten ge-rinnbaren Fibrinogen-Werten und den Vollplasma-Fibri-nogenäquivalenten liegen. Unsere Befunde über höheregemessene „Fibrinogen"-Werte in der Fibrinogenolyse-„Spätphase" mit der Cfauss'schen Methode im Gegen-satz zur neuen, immunologisch-nephelometrischen Me-thode könnten damit erklärt werden, daß thrombin-gerinnbare Fibrinogen-Deriväte, vor allem aber dieSpaltprodukte X (9), hier erfaßt wurden. Auf Grund desbis zu 85-fach konzentrierteren Proben-Ansatzes für dieMethode nach Clauss geht besonders dieser Fehler beiniedrigen Fibrinogen-Konzenträtionen, sprich wenigvorverdünnten Proben, ein.

Da bekannt ist, daß Fibrinogen-Werte durch hohe Hepa-rin-Konzentratiqnen im Plasma falsch-niedrig bei derMethode nach Clauss ausfällen können, wurden ebenfallsmit den drei zur Diskussion stehenden Methoden Fibri-nogen-Bestimmungen mit steigenden Heparin-Zusätzendurchgeführt (Abb. 3). Wie deutlich zu erkennen ist,sind beide immunologischen Methoden über den aus^getesteten Bereich von fast 40 USP-Eiiiheiten Heparin proml Vollplasma unbeeinflußt. Im Gegensatz dazu kommtes bei der Ctowss'schen Bestimmungsmethode ab 10 USP-Einheiten Heparin pro ml Vollplasma (ausgehend voneiner l: 10-Vorverdünnung des Citratplasmas) zu schein-bar verminderten Fibrinogen-Konzenträtionen infolge der

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Ebeling: Schnelle und exakte Fibtinogen-Bestinunungsmethode 209

£5.£Äl

f

fl -

4,58 9,17 18,33Heparin in Vollplasma (USPE/ml)

36.67

Abb. 3. „Fibrinogen"-Bestimmungen im Methodenvergleich beiverschiedenen Heparin-Konzentrationen :Ansätze: Zu je 500 Citratmischplasma

+ 500 1 Trasylol (* 10 000 KIE)wurden verschieden konzentrierte Heparin-Lösungen in

100 -Pipettierungen dazugegeben. Esresultierten Heparin-Konzentrationen von 0,0 bis 36,67USP-Einheiten pro ml Vollplasma,o o Partigenplattenmethode• · neue Methode

Methode nach Clauss.

Thrombin-Inhibierung. Obwohl klinisch auch diese Hepa-rin-Konzentrationen praktisch nicht vorkommen, sindfalsche Laborwerte denkbar. Im Reagenzglas-Versuchsind höhere Heparin-Konzentrationen, die das Meßergeb-nis nach der Cta/ss'schen Methode verfälschen können,durchaus möglich, wenn heparin-haltiges Probenmaterialbei niedrigen Fibrinogen-Konzentrationen sehr viel kon-zentrierter (z. B. 1:2) eingesetzt werden muß oder dieAbnahme-Spritze heparin-kontaminiert war.

Zum Überprüfen der neuen Methode gehörte auch dasUntersuchen von Patientenmaterial. Dazu wurde aus 180Citratblutproben gemischten Krankenguts gleichfalls imMethodenvergleich mit der einfachen radialen Immun-diffusion auf der Partigenplatte und der Methode nachClauss das gerinnbare Fibrinogen mechanisiert, immurio-logisch-nephelometrisch bestimmt. Tabelle 2 gibt die Er-gebnisse der Methodenvergleiche untereinander mit Kor-relationskoeffizienten und bivariaten Regressionsgeradenwieder. Aus Tabelle 3 sind die Methoden-Mittelwerte mit

Tab. 3. Methodenmittelwerte (x), Standardabweichungen (± s)und Mittelwertsabweichung in % vom nephelometrischermittelten gerinnbaren Fibrinogen (= 100%) aus 180 Pa-tientenproben gemischten Krankengutes:

ClaussPartigenplatteBA

neue Methode:

X[g/n2,9433,5003,3702,943

± s[g/11

1,2681,2081,2351,297

Mittelwertsabweichung[%] von A

- 0,02+ 18,92+ 14,51

A = gerinnbares FibrinogenB = Plasma-Fibrinogenäquivalente

Standardabweichung der 180 Patienten-Fibrinogen-Werteund zusätzlicher Angabe der prozentualen Mittelwerts-Abweichung vom Mittelwert des nephelometrisch-ermittelten, gerinnbaren Fibrinogen ersichtlich.

Tabelle 4 gibt die Signifikanz-Berechnungen, die aus denjeweiligen Methoden-Mittelwerten und deren Standard-abweichung nach dem t-Test errechnet wurden, wieder.

Die graphischen Darstellungen (Abb. 4 und 5) geben dieermittelten Einzelwerte des nephelometrisch-bestimmten,gerinnbaren Fibrinogens in Gegenüberstellung zu Parti-genplatten-Werten (Abb. 4) und denen der Clauss'schenMethode (Abb. 5) wieder.

Zu den Fibrinogen-Bestimmungen aus 180 Patienten-proben kann durch das statistische Auswerten der Ver-suchsergebnisse eine ähnliche, wenn auch nicht ganz sokrasse, Schlußfolgerung wie bei den beschriebenen Fibri-nogenolyse-Versuchen gezogen werden.

Für die Partigenplatte ergab sich auch hier ein statistischhoch signifikanter, höherer Mittelwert gegenüber denWerten nach der Clauss'schen und der nephelometrischenMethode. Dies ist eindeutig durch das Miteingehen vonfibrinogen-äquivalenten „Spaltprodukten" bedingt.

Die Werte nach der Clauss'schen und der nephelo-metrischen Methode ergaben im Mittel gleiche Ergeb-nisse. Im Einklang mit den Befunden aus dem Fibrino-genölyse- und dem Heparin-Versuch heben sich bei derClauss'schen Methode hier offensichtlich im Mittel die,

Tab. 2. Fibrinogen-Methodenvergleiche mit Korrelationskoeffi-zient (r) und bivariater Regressionsgerade (y = ax ± b):N = 180 Patientenproben gemischten Krankenguts:

A / ClaussA / PartigenplattePartigenplatte / ClaussB / PartigenplatteB / Clauss

I

0,8310,8120,7700,8640,874

y =a

0,9780,9321,0500,9781,027

ax±bb

+ 0,064+ 0,759-0,733+ 4,778-0,518

neue Methode: A = gerinnbares FibrinogenB = Plasma-Fibrinogenäquivalente

Tab. 4. Signifikanz-Berechnungen (p) nach dem t-Test mit unds der benutzten Fibrinogen- bzw. Fibrinogenäquivalent-Bestimmungs-Methoden aus 180 Patientenprobengemischten Krankenguts:

P

A / ClaussA / PartigenplattePartigenplatte / ClaussB / PartigenplatteB / ClaussA / B

> 0,995< 0,001< 0,001>0,30< 0,005< 0,005

nicht signifikanthoch signifikanthoch signifikantnicht signifikantsignifikantsignifikant

neue Methode: A = gerinnbares FibrinogenB = Plasma-Fibrinogenäquivalente

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 14,1976 / No. 5 ISA

210 Ebeling: Schnelle und exakte Fibrinogen-Bestimmungsmethode

£5

*

0 1 2 3 4 "5 6 7 8Gerinnbares Fibrinogen (neue Methode) [g/l]

Abb. 4. Fibrinogen-Methodenvergleich mit 180 Patientenprobengemischten Krankengutes: *

bivariate Regressionsgerade— = y.

nach unserer Meinung, falsch-höheren „Fibrinogen"-Werte der „Spätphase"-Fibrinpgenolyse gegen die falsch-niedrigen unter Heparin-Einflüß wieder gegeneinanderauf,

Schon 1964 forderte Groß (10) eine zuverlässige undschnelle Fibrinogen-Besturunungsmethode für die Klinik.Gefragt sind dabei Methoden, die sowohl das gerinnungs-aktive wie auch das immunölogisch^erfaßbare Fibrinogenkorrekt und plausibel bestimmen. Diese Forderung istbis heute auch in der einschlägigen Literatur immer nochaktuell. So stellen auch Stevens et al. (11) 1973 undBartheh (12) 1975 Diskrepanzen bei ihren durchge-führten Methoden-Vergleichen fest und kommen zu demunbefriedigenden Ergebnis, daß nur unter „bestimmten"Voraussetzungen eine „bestimmte" Methode in „be-stimmten" Fällen vielleicht zu „richtigen" Fibrinogen-Werten kommt.

Hier muß nochmals festgestellt werden, daß sich ausunseren Normalplasmen-Untersuehungen praktisch keineFibrinogen-Wertedifferenzen bei den untersuchten dreiMethoden zeigten. Aus diesem Grund sind in dieserArbeit zur Beurteilung der zitierten Fibrinogen-Bestim-mungsmethoden bewußt Maßstäbe angelegt worden, wiesie bei Patienten herrschen öder herrschen könnten.

Abschließend kann gesagt werden, daß fibrinogeno-lytisches Probenmaterial sogar tendentiell falsch von derPartigenplatten-Methode bestimmt wird. Ganz im Gegen-satz dazu erhält man mit der Schnellmethode nach CÄZMSSplausible Werte in der fibrinögenolytischen „Frühphase".In der „Spätphase" liegen die Werte zu hoch, wenn auchtendentiell richtig. Jedoch kommt es bei der Cta/ra'schenMethode, im Gegensatz zu den immunologischen Bestim*mungen, zu falsch-niedrigen Fibrinogen-Werten bei Hepa-rin-Korizentrationen ab 10 USP-Einheiten Heparin/mlVöllplasma. Die neue immunölogisch^nephelometrischeSchnellrnethode unterscheidet und mißt quantitativgerinnbare und nicht gerinnbare Fibrinogenäquivalente,wobei unter gerinnbaren Fibrinogenäquivälenten nur dasgerinnbare Fibrinogen zu verstehen ist. Die neue Methodemißt korrekte und tendentiell plausible Fibrinogen-Werte,auch unter Fibrinogenölyse und Heparin-Einfluß.

1 2 3 4 5 6 7 8Gerinnbores Fibrinogen (neue Methode) [g / l ]

Abb. 5. Fibrinogen-Methodenvergleich mit 180 Patientenprobengemischten Krankengutes:- bivariate Regressionsgerade— x = y.

Fräulein Sabine Krone danke ich für sorgfältiges technischesMitarbeiten. *

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Ebeling: Schnelle und exakte Fibrinogen-Bestimmungsmethode 211

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Dr. H. EbeiingInstitut für Klinische Chemie undKlinische Biochemie amKlinikum Steglitz derFreien Universität BerlinHindenburgdamm 45D-1000 Berlin 45

J, Clin. Chem. Oin. Biochem. / Vol. 14* 1976 / No. 5ISA*

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