Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
従来の薬剤探索法では見出すことができなかった
新規抗HCV剤グアンファシンの同定
鹿児島大学 大学院医歯学総合研究科
難治ウイルス病態制御研究センター
センター長 池田 正徳
従来技術とその問題点
C型肝炎ウイルス(HCV)に感受性のある唯一動物モデルはチンパンジーのみであるが、霊長類であるチンパンジーを使った研究は現在、倫理的経済的問題からなされていない。
現在、すべての抗HCV剤は、唯一HCVを高率良く増殖させることが可能なヒト肝癌細胞由来のHuH-7細胞株のみを使って開発されている。
HuH-7細胞株という特殊な細胞内環境でのみの、抗ウイルス活性の
評価を行っていると、人体では無効な薬剤が過大評価されたり、人体で有効な薬剤が過小評価されてしまう可能性がある。
新技術の特徴・従来技術との比較
HuH-7細胞株とは異なる、ヒト肝癌細胞株であるLi23細胞株を第2のHCV感受性細胞株として樹立し、HuH-7細胞株では見いだすことができなかった、抗HCV活性を有するGuanfacineを見出した。
現在開発されている、Direct Acting Antivirals (DAAs)は驚異的な治療成績を示す一方で、1) ウイルス排除後の肝発癌、2) DAA治療のHBV再活性化など、新たな課題が出現した。
従来技術(DAAs)の問題点
1. HuH-7細胞株のみによる評価
2. 薬価が高額で医療経済を圧迫(12週間の治療で約700万円)
3. 薬剤耐性変異を有するHCVの出現
4. ウイルス排除後の肝発癌
5. ウイルス排除後にHBVが再活性化
想定される用途
HuH-7では見出すことのできなかった抗HCV剤の評価が可能
従来のDAAsに対して耐性を示すHCVに対する薬剤候補
Drug repositioningにより見いだされた薬剤なので安全性が保証されている
実用化に向けた課題
1. 前臨床試験におけるPOCの取得
1. 化合物の最適化
企業への期待
1.Guanfacineをリード化合物とする類似化合物の合成
2. 薬剤ライブラリーの提供と、Li23細胞株を用いた抗HCV剤のスクリーニング
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 :抗HCV活性を有する薬剤
• 出願番号 :特願2016-048508• 出願人 :国立大学法人鹿児島大学、
国立大学法人岡山大学
• 発明者 :池田正徳、武田緑、加藤宣之
A型肝炎ウイルス (HAV: Hepatitis A Virus)
B型肝炎ウイルス (HBV: Hepatitis B Virus)
C型肝炎ウイルス (HCV: Hepatitis C Virus)
D型肝炎ウイルス (HDV: Hepatitis D Virus)
E型肝炎ウイルス (HEV: Hepatitis E Virus)
肝炎ウイルスの種類
肝炎ウイルスには5種類ある
これ以外にTTV、HGV(=GBV-C)などが報告されたが現在では肝炎ウイルスからは除外されている
HDVは単独では増殖できずHBVの存在により増殖が可能
CB DA E
5種類の肝炎ウイルス
HBV(HDV)、HCV
慢性肝炎:6ヶ月以上肝臓に肝炎が持続している状態
HBVとHCVの感染者は世界人口の約8%と推定されており、死に至る最大のウイルス感染症といえる。
慢性肝炎に進展する肝炎ウイルス
CB D
急性肝炎 慢性肝炎 肝硬変
肝がん
70%
7%/年
HCV感染は慢性肝炎、肝硬変、肝がんへ進行する
HCV感染による肝疾患の疫学
慢性肝炎 肝硬変 肝癌3.5万人/年
HCVキャリア200万人
アルコール、NASHなど
肝不全消化管出血1.7万人/年
肝臓に関連した病気で年間5万人以上の方が死亡している
HBVキャリア110万人
予防
抗ウイルス療法
ウイルスの排除
抗ウイルス剤の標的部位
PEG: PEG-IFNRBV: Ribavirin
TPV: TelaprevirSPV: Simeprevir
C型肝炎ウイルス治療成績
0102030405060708090
100
6%
34%
55%
75%89%
1991 2000 2004 2011 2013
C型肝炎に対するDAA製剤の開発状況
2014
daclatasvir (NS5A)+asunaprevir (NS3)
ledipasvir (NS5A)+sofosbuvir (NS5B)
ombitasvir (NS5A)+paritaprevir (NS3)
2013
PR: PEG-IFN/RBV
PR+simeprevir (NS3) ヤンセンファーマ社
PR+vaniprevir (NS3) MSD社
ブリストル・マイヤーズ社
アッヴィ社
ギリアド・サイエンシズ社2015
2011 PR+telaprevir (NS3) 田辺三菱社
Sofosbuvir Ledipasvir
1. ハーボニー (2015年9月)
NS5B阻害剤 NS5A阻害剤
Ombitasvir
NS5A阻害剤NS3/4A阻害剤
Paritaprevir
+ Ritonavir
2. ヴィキラックス (2015年11月)
C型慢性肝炎に対する新しい経口配合剤
+
+
Development of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C virus infection who achieved sustained virological response following interferon therapy: A large-scale, long-term cohort study (Nagaoki Y, Chayama K et al., J Gastroenterol Hepatol, 2015)
・36(3%) of 1094 patients developed HCC after SVR・The cumurative rates of HCC at 5, 10, and 14 years were 4%, 6% and 12%,
respectively
最近の抗HCV剤は驚異的な治療成績を達成しているが、ウイルス排除後の肝発癌が新たな課題となっている
肝発癌予防に対する新たな戦略:抗腫瘍剤のなかで抗ウイルス活性を有する化合物を探索する
DAAによるHBV再活性化に関する注意勧告
DAA時代のHCV研究の課題
1.SVR後HCC
2.DAA治療におけるHBVの再活性化
肝発癌予防、HBV再活性化予防
HCVとレプリコン
5’UTR 3’UTRCore E1 E2 NS2 NS3 4B NS5A NS5BIRES
構造領域 非構造(NS)領域
HCV ゲノム RNA(9.6kb)
Hepatitis C Virus: HCVフラビウイルス科ヘパシウイルス属
1本鎖、プラス鎖RNA
血液を介した感染
HCV感染者日本:200万人以上世界:2億人以上
5’UTR
ΔC EMCV
IRES3’UTR
NS3 4B NS5A NS5BNeoRHCVレプリコン
(Lohmann et al. Science 1999)
Con-1株遺伝子型1b
細胞
核
5’ 3’
翻訳
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’5’ 3’
5’ 3’5’ 3’5’ 3’
複製
HCVの生活環
粒子形成
放出
RLアッセイシステム
0 1 10 1000
20
40
60
80
100
120
140
HC
V R
NA
(%)
IFN- (IU/mL) 添加24時間後
(LightCycler PCR)
レニラルシフェラーゼ(RL)を発現する全長HCV RNA複製細胞に
薬剤を添加し、24〜72時間後にルシフェラーゼ活性を測定する
0 1 10 100IFN- (IU/mL)添加24時間後
0
20
40
60
80
100
120
ルシフェラーゼ活性を測定よく一致する
全長12 kb RNA
HCVHCV 外来性
RLアッセイシステムRT-PCRによる従来法
5’ 3’C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B
∆C
EMCVIRES
NeoR
NS4AP7
RL
スタチン剤 高脂血症治療剤 臨床試験(全国)フルバスタチン (EC50; 0.9 mM) 治癒率70%?
OR6アッセイシステムを用いて見出した抗HCV剤候補
生理活性物質オンコスタチンM IL6ファミリー(肝分化誘導、抗腫瘍効果)
5-HETE アラキドン酸代謝産物
医薬品やサプリメント論文発表 本来の薬効や機能 治療剤としての現状
Hepatology (‘06)
テプレノン 抗潰瘍剤 臨床試験(岡山)
ミゾリビン リウマチ治療剤
ビタミンD2 栄養補助剤
Liver Int (‘11)
BBRC (‘05)
AAC (‘07)
国内特許出願
FEBS Lett (‘09)
ハイドロキシウレア 臨床試験(横浜)Arch Virol (‘10)Antiviral Ther (‘10)国内外特許出願
(EC50; 0.7 ng/ml)
(EC50; 5 mg/ml)
(EC50; 60 mM)
(EC50; 100 mM)
(EC50; 4 mM)
(EC50; 2 mM)
慢性骨髄性白血病治療剤
ラロキシフェン (EC50; 1 mM) JGV(‘12) 骨粗鬆症治療剤
N-251 (EC50; 3 mM) PLoS ONE (‘13) 抗マラリア剤 臨床試験予定
HuH-7細胞
・ 肝細胞がん・ 日本人・ 男性・ 57歳・ 岡山大学(1982年)・ IL28B SNP:rs8099917 T/G
(インターフェロン治療抵抗性)・全長HCV RNA複製細胞システム
OR6細胞 (Ikeda et al. BBRC 2005)
Li23細胞
・ 肝細胞がん・ 日本人・ 男性・ 56歳・ 国立がんセンター(1987年)・ IL28B SNP:rs8099917 T/T
(インターフェロン治療感受性)・ 全長HCV RNA複製細胞システム
ORL8細胞 (Kato et al. Virus Res 2009)
2種類の肝細胞株における相違点
HuH-7細胞とLi23細胞は、リバビリンやメトトレキサートなどの抗HCV剤に対して異なる薬剤感受性を示す
年齢
57
56
性別
男
男
細胞株
HuH-7
Li23
人種
肝細胞癌 T/G
T/T
細胞の由来rs8099917
日本人
日本人 肝細胞癌
遺伝子型
1b
1b
臨床
1b
ヘルシーキャリアー
ヘルシーキャリアー
急性肝炎
HCV株
O
1B-4
KAH5
Core a.a.(70/91)
ISDR
R/L
Q/L
Q/L
1
0
0
HCV RNA 複製細胞
HuH-7 Li23
OR6 ORL8
1B-4R 1B-4RL
KAH5R KAH5RL
IL28B SNPrs12979860
C/T
C/C
肝細胞およびウイルス株の背景
IL28B SNPでrs809917がT/TだとIFN感受性rs12979860がC/CだとIFN感受性
ISDRの変異が2個以上だとIFN感受性
Core aa70が野生型(R)だとIFN感受性Core aa91が野性型(L)だとIFN感受性
図3
HuH-7 Li23
OR6 1B-4R KAH5R ORL8 1B-4RL KAH5RL
IFN-α (IU/ml) 0.94 0.58 0.44 0.18 0.24 0.16
IFN-γ (IU/ml) 0.25 1.00 0.44 0.06 0.06 0.05
IFN-λ1 (ng/ml) >40.00 10.00 1.45 0.02 0.08 0.06
OSM (ng/ml) 1.13 2.25 0.80 0.18 0.38 2.00
CsA (μg/ml) 0.37 0.31 0.35 0.19 0.24 0.25
PTV (µM) 0.58 0.86 0.08 0.20 0.080.39
EC50IFN: InterferonOSM: Oncostatin MCsA: Cyclosporine APTV: Pitavastatin
5’ 3’C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B
∆C
EMCVIRES
NeoR
NS4AP7
RL
全長HCV増殖レポーターアッセイ系による薬剤感受性の評価
2種類の肝細胞株を用いたメトトレキサートに対する薬剤感受性の違い
Ueda et al. BBRC 2011
HuH-7細胞とLi23細胞は、メトトレキサートに対して異なる薬剤感受性を示す
0
20
40
60
80
100
120
ORL8
OR6
RLU
(%)
IFN-λ1 (ng/mL)
OR6
ORL8
IFN-λ1 (ng/mL)
0 0.2 2 20
細胞株によるIFN-λ1に対する感受性
RLU
(%)
Cel
l nu
mbe
r (%
)
b-actin
NS5B
Core
OR6 EC50 : >100 mM
100 020406080
100120
50 1002512.5リバビリン (mM)
100502512.50
ORL6とORL8のリバビリンに対する感受性
ORL8は患者血中濃度(10-14mM)で抗HCV活性を示す
21
42
66
kDa
ORL8 EC50 : 8.7 mM
リバビリン (mM)100502512.50
020406080
100120140
50 1002512.5
1
10
100
1000
RLU
(%)
OR6
(-) 0.1 1 10IFN-λ1 (ng/mL)
(-) 0.1 1 10IFN-λ1 (ng/mL)
0.1
1
10
100
1000
RLU
(%)
ORL8
RBV (-)RBV 12.5µMRBV 25µMRBV 50µM
OR6およびORL8細胞におけるIFN-λ1とRBV併用効果
genotype
2a
clinical condition
Fulminant hepatitis
HCVstrain
JFH−1
HCV permissive cells
HuH-7 Li23
RSc D7
HuH-7およびLi23細胞由来のJFH-1 感受性細胞株
5’ 3’C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B
∆C
EMCVIRES
NS4AP7
RL
HCV JFH-1株は現在感染性HCV粒子産生が可能な唯一のHCV株
細胞株
HuH-7 Li23
HCV株 Sub full Sub full
O sO OR6 ND ORL8
1B-4 s1B-4R 1B-4R ND 1B-4RL
KAH5RsKAH5R KAH5R ND KAH5RL
JFH1 RSc D7
NS3 NS4B NS5A NS5B 3’
NS4A
5’
∆C
EMCVIRES
NeoRRL
5’ 3’C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B
∆C
EMCVIRES
NeoR
NS4AP7
RL
HCV培養細胞系
細胞 薬剤
0h-24h
解析
72h
0
20
40
60
80
100
120
(-) 0.08 0.16 0.31 0.63 1.25 2.5 5 10
Rela
tive
RL A
ctiv
ity (%
)
Guanfacine-HCl (µM)
EC50: 0.768 µM
0
20
40
60
80
100
120
(-) 0.240.490.981.953.917.8115.631.362.5 125 250
Cell
Viav
ility
(%)
Guanfacine-HCl (µM)
CC50: 128 µM
Core
β-actin
21 kDa
42 kDa
(-) 0.63 1.25 5 102.5
Guanfacine-HCl (µM)
Li23細胞でGuanfacine・HClは抗HCV活性を示す
020406080
100120140
(-) 0.08 0.16 0.31 0.63 1.25 2.5 5
Rela
tive
RL A
ctiv
ity (%
)
Guanfacine-HCl (µM)
HCV JFH-1株においてもGuanfacine・HClは抗HCV活性を示す
EC50: 1.23 µM
0
50
100
150
200
(-) 0.98 1.95 3.91 7.81 15.6 31.3 62.5 125 250
Cell
Viav
ility
(%)
Guanfacine-HCl (µM)
CC50: 139µM
細胞 薬剤
0h-24h
解析
72h
HuH-7系細胞ではGuanfacine・HClは抗HCV活性を示さない
0
20
40
60
80
100
120
(-) 0.16 0.31 0.63 1.25 2.5 5 10
Rela
tive
RL A
ctiv
ity (%
)
Guanfacine-HCl (µM)
OR6
0
20
40
60
80
100
120
(-) 0.08 0.16 0.31 0.63 1.25 2.5 5
Rela
tive
RL A
ctiv
ity (%
)
Guanfacine-HCl (µM)
RSc JRN/35B
細胞 薬剤
0h-24h
解析
72h
・降圧剤 (α2アドレナリン受容体作動薬)アドレナリン受容体のうち、α2受容体のみが、抑制性のGタンパク(Gi)共役型であり、セカンドメッセンジャーのcAMPを減少させる。2005年効果がないため販売中止となった。製造:日本チバガイギー、発売:ノバルティス、販売:持田製薬
・cAMPを抑制して作業記憶を改善。2013年より小児のADHDに対して治験開始。塩野義/Shire(アイルランド)が日本で申請準備中(2015年8月)
Guanfacine (エスタリック)
お問い合わせ先
国立大学法人鹿児島大学
産学官連携推進センター知的財産部門
〒890-0065 鹿児島市郡元1-21-40
TEL:099-285-3878
FAX:099-285-3886
E-Mail:[email protected]