輔 仁 大 學 生 命 科 學 系輔 仁 大 學 生 命 科 學 系輔 仁 大 學 生 命 科 學 系輔 仁 大 學 生 命 科 學 系

細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗細胞學實驗

請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權請尊重智慧財產權

禁止複製或拷貝禁止複製或拷貝禁止複製或拷貝禁止複製或拷貝

酵素免疫測定法

Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay, ELISA

ELISA

是一種免疫測定法 (Immunoassay, IA)

抗原或抗體的固相

抗原或抗體的酶標記

定性定量分析

抗原抗體的結合實質上只發生在抗原的抗原決定位與抗體的抗原結合位點之間。

由於兩者在化學結構和空間構型上呈互補關係，所以抗原抗體反應具有高度的專一性(specificity)。

抗原抗體反應的這種專一性使免疫測定能在一非常復雜的蛋白質化合物(例如血清)中測定某一特定的物質，而不需先分離待檢物 。

Ag+Ab→→→→Ag·Ab

最適比例

敏感性敏感性敏感性敏感性

化化化化學學學學比色法的敏感度比色法的敏感度比色法的敏感度比色法的敏感度為為為為mg/ml

酶酶酶酶反應測反應測反應測反應測定法的敏感度定法的敏感度定法的敏感度定法的敏感度約為約為約為約為5-10μμμμg/ml

標記標記標記標記的免疫敏感度可提高的免疫敏感度可提高的免疫敏感度可提高的免疫敏感度可提高數數數數千倍千倍千倍千倍，，，，達達達達ng/ml

ELISA

三三三三個個個個必要的必要的必要的必要的試劑試劑試劑試劑：：：：

（（（（1））））固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体，，，，即即即即“免疫吸附免疫吸附免疫吸附免疫吸附劑劑劑劑"（（（（immunosorbent））））

（（（（2））））酶酶酶酶標記標記標記標記的抗原或抗体的抗原或抗体的抗原或抗体的抗原或抗体，，，，稱為稱為稱為稱為“結結結結合物合物合物合物"（（（（conjugate））））；；；；

（（（（3））））酶酶酶酶反反反反應應應應的的的的基質基質基質基質。。。。

indirect ELISA的原理

coating

將抗原或抗體固定的過程稱為coating。

蛋白質與plate是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質

分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的

作用。

Wash

達到分離游離和結合物質的目的

清除殘留在板孔中游離的物質，以及非專一性吸附的干

擾物質

在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術

在在在在ELISA中中中中，，，，常用的稀常用的稀常用的稀常用的稀釋釋釋釋液液液液為為為為含含含含0.05%Tween-20

磷酸磷酸磷酸磷酸鹽緩衝鹽緩衝鹽緩衝鹽緩衝液液液液。。。。

Wash buffer

indirect ELISA的原理

indirect ELISA

• 一抗，認得抗原的抗體

• 二抗，認得一抗的抗體，通常會連接著detection reagent，isotope or enzyme

• Enzyme和substrate作用後會呈色，測其吸光值可回推抗原的量

Blocking是在coating之後用高濃度的無關蛋白質溶

液再coating的過程。以大量不相關的蛋白質填充這些

空隙，因而避免ELISA后的步驟中干擾物質的吸附

常用blocking solution：0.05%-0.5%的BSA; 10%

的小牛血清或1%明膠(gelatin);脫脂奶粉,比較廉價，

可以高濃度使用（5%）

Blocking

indirect ELISA的原理

HRP

Peroxidase

Horse radish peroxidase (HRP) 山葵過氧化酶

Substrate

DH2+ H2O2 D+ 2H2O

DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物。

DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)和ABTS 。

TMB經經經經HRP作用作用作用作用後產後產後產後產物物物物呈藍呈藍呈藍呈藍色色色色(OD370)。。。。TMB性性性性質較穩質較穩質較穩質較穩

定定定定，，，，可配成溶液可配成溶液可配成溶液可配成溶液試劑試劑試劑試劑，，，，只需只需只需只需與與與與H2O2溶液混和即成溶液混和即成溶液混和即成溶液混和即成應應應應用液用液用液用液

。。。。

ABTS雖雖雖雖不如不如不如不如OPD和和和和TMB敏感敏感敏感敏感，，，，但空白值但空白值但空白值但空白值質質質質低低低低，，，，也也也也為為為為一一一一

些些些些試劑試劑試劑試劑盒所盒所盒所盒所採採採採用用用用。。。。

吸光值與抗原量的關係

• 吸光值

�單位時間內enzyme與substrate反應的狀況

�吸光值越高，反應越快。

�反應快，enzyme多

�被留在ELISA plate上的二抗多�抗原多

�單位時間內，抗原量正比於吸光值

indirect ELISA測什麼?

• 定量�已知濃度反推未知濃度

最後反應的產物量的量，與原液中所含物質的量呈正比或反比。

1. Coating 將各種已知及未知濃度之肌動蛋白(抗原)固定於ELISA plate，4℃靜置隔夜。

2. Washing 將抗原溶液吸出，並以PBS-Tween 20沖洗三次，每次清洗時浸置5 分鐘。

3. Add first Ab (rabbit anti-actin Ab) 加入100 µl一抗溶液，置於37℃培養箱作用3小時，

4. Washing 將溶液吸出後再以PBS-Tween 20沖洗，三次。

5. Add secondary Ab (goat anti-rabbit IgG-peroxidase)加入100 µl之二級抗體溶液 ，並於37℃作用1.5小時，

6. Washing 將溶液吸出後再以PBS-Tween 20沖洗，三次。

7. Detection 加入50 µl之基質溶液(substrate)進行呈色反應，在室

溫下避光反應20分鐘。8. 待顏色穩定後以ELISA光度計(ELIDA 5, Physica Co.)，

在波長655 nm下測定吸光值。

加樣品時應將所加物加在LEISA plate的底部，避免

加在孔壁上部，注意不可濺出，不可產生氣泡。

注意事注意事注意事注意事項項項項

標準曲線標準曲線標準曲線標準曲線 y = 0.1469x + 0.7952

R2 = 0.8867

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25 30 35 40

抗原濃度 ng/ul

OD

405

強度

Coating Ag on ELISA plate

X20010050100C

X20010050100B

X20010050100A

654321

三重複

實驗紀錄

4.3

200

2.2

100

3.51.10.50.3吸光值

未知50100 濃度

標準曲線標準曲線標準曲線標準曲線 y = 0.1469x + 0.7952

R2 = 0.8867

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 5 10 15 20 25 30 35 40

抗原濃度 ng/ul

OD

405

強度

結果討論方向

1. 反應是不是work? 是否顯色

2. 標準曲線是不是合理???3. 未知濃度的待測品吸光值是不是落在標準

曲線之內????4. 未知物的濃度多少?????5. 未知物的總量有多少??????6. 有沒有其他不尋常的事件發生???????