初代培養神経細胞を用いた麻酔薬による神経毒性並びに 保護作用の分子生物学的研究

（麻酔科神経分子生物学研究グループ） 大阪大学大学院医学系研究科 生体統御医学講座 麻酔・集中治療医学教室

澁田 達史 １． これまでの研究

1994 年より麻酔分野における一酸化窒素の研究を開始しました。主に、循環、疼痛の 2分野を中心に研究を行い、Circulation などに論文を発表しました。1996 年より大阪大学第二生理学教室、福田教授（当時）、小阪淳講師（当時：現在国際医療福祉大学基礎医学センター教授）と共に初代培養神経細胞を用いた実験を開始し、1997 年より麻酔集中治療医学講座で細胞培養室を立ち上げました。現在に至るまで、井上隆弥先生、清水智明先生、Varathan Sriranganathan 先生、森田知孝先生とともにチオペンタールナトリウム、ケタミンをはじめとする静脈麻酔薬や、一酸化窒素（NO）合成阻害薬、フリーラジカルスカベンジャー（FRS）等の薬物ならびに低温療法の脳保護作用についてラット初代培養脳神経細胞を用いて研究を行ってきました。また、麻酔薬による若年者への神経学的な悪影響を解明するため、幼若神経細胞に対する麻酔薬の神経毒性に関して従来の形態学的研究に加え、カルシウムイメージング法により、幼若期に麻酔薬に曝露された神経細胞がグルタミン酸やNMDAに対しどのような反応を見せるのかについて研究を行っています。 これは妊娠 17日目のラット初代培養神経細胞の培養初期に麻酔薬（ケタミン、チオペンタール）を 72時間暴露し、2週間後にグルタミン酸に対してどのような反応を示すかカルシウムイメージング法で見たものです。低濃度ケタミンやチオペンタール群では、グルタミン酸を付加するとカルシウム濃度がいったん上昇した後に速やかに低下するのに対し、高濃度のケタミンを曝露していた群では細胞内カルシウム濃度が低下する時間が遅延します。幼若期にある種の麻酔薬を付加すると影響が遷延する可能性を示唆する所見です。(Neurosci Res 2015 98:9-16, Shibuta et al)

２． 主な英文原著業績 • Intracerebroventricular administration of a nitric oxide-releasing compound, NOC-18, produces thermal hyperalgesia in rats. Satoshi Shibuta, Takashi Mashimo, Akitoshi Ohara, Ping Zhang and Ikuto Yoshiya Neuroscience Letters 187: 103-106, 1995

• A new nitric oxide donor, NOC-18, exhibits a nociceptive effect in the rat formalin model. Satoshi Shibuta, Takashi Mashimo, Ping Zhang, Akitoshi Ohara and Ikuto Yoshiya Journal of the Neurological Sciences 141: 1-5 1996

• Cardiovascular Effects of an Ultra-Short-Acting Nitric Oxide-Releasing Compound, Zwitterionic Diamine/NO Adduct, in dogs. Ping Zhang, Akitoshi Ohara, Takashi Mashimo, Jianhuna Sun, Satoshi Shibuta, Koji Takada, Hiroaki Kosaka, Masaru Terada and Ikuto Yoshiya Circulation 94: 2235-2240 1996

• A comparative study of the antinociceptive action of xenon and nitrous oxide in rats. Akitoshi Ohara, Takashi Mashimo, Ping Zhang, Yoshimi Inagaki, Satoshi Shibuta and Ikuto Yoshiya Anesth Analg 85: 931-936 1997

• Intrathecal administration of a new nitric oxide donor, NOC-18, produces acute thermal hyperalgesia in the rat. Takaya Inoue, Takashi Mashimo, Satoshi Shibuta and Ikuto Yoshiya. Journal of the Neurological Sciences 153: 1-7 1997

• Nitric oxide-induced cytotoxicity attenuation by thiopentone sodium but not pentobarbitone sodium in primary brain cultures. Satoshi Shibuta, Jun Kosaka, Takashi Mashimo, Yutaka Fukuda and Ikuto Yoshiya. British Journal of Pharmacology 124: 804-810 1998

• Rapid development of nitric oxide-induced hyperalgesia depends on an alternate to the cGMP-mediated pathway in he rat neuropathic pain model. Takaya Inoue, Takashi Mashimo, Masahiko Shibata, Satoshi Shibuta and Ikuto Yoshiya. Brain Research 792: 263-270 1998

• The influence of the timing of administration of thiopentone sodium on nitric oxide-mediated neurotoxicity in vitro. Satoshi Shibuta, Jun Kosaka, Takaya Inoue, Tomoaki Shimizu, Katsuji Tomi and Takashi Mashimo. Journal of the Neurological Sciences 174: 9-15. 2000

• The effects of propofol on NMDA- or nitric oxide-mediated neurotoxicity in vitro. Shibuta S, Sriranganathan V, Inoue T, Shimizu T, Tomi K, Mashimo T. Neuroreport 12(2):295-8. 2001

• Neuroprotective effect of hypothermia at defined intraischemic time courses in cortical cultures. Varathan S, Shibuta S, Shimizu T, Mashimo T. J Neurosci Res. 65(6):583-90. 2001

• Hypothermia and thiopentone sodium: individual and combined neuroprotective effects on cortical cultures exposed to prolonged hypoxic episodes. Varathan S, Shibuta S, Shimizu T, Varathan V, Mashimo T. J Neurosci Res. 68(3):352-62. 2002

• Effects of deep hypothermia on nitric oxide-induced cytotoxicity in primary cultures of cortical neurons. Varathan S, Shibuta S, Varathan V, Takemura M, Yonehara N, Mashimo T. J Neurosci Res. 72(5):613-21. 2003

• The neuroprotective effect of ONO-1714 on NMDA-mediated cytotoxicity in vitro. Shibuta S, Varathan S, Mashimo T. J Neurol Sci. 215(1-2):31-6. 2003

• Ketamine and thiopental sodium: individual and combined neuroprotective effects on cortical cultures exposed to NMDA or nitric oxide. Shibuta S, Varathan S, Mashimo T. British Journal of Anaesthesia 97 (4): 517‒24. 2006

• Small temperature variations alter edaravone-induced neuroprotection of cortical cultures exposed to prolonged hypoxic episodes. S. Shibuta, S. Varathan, T. Kamibayashi, and T. Mashimo. Br. J. Anaesth. 104: 52-58. 2010

• The influence of initial target effect-site concentrations of propofol on the similarity of effect-sites concentrations at loss and return of consciousness in elderly female patients with the Diprifusor system. Shibuta S, Kanemura S, Uchida O, Mashimo T. J Anaesthesiol Clin Pharmacol. Apr;28(2):194-9. 2012

• Only extra-high dose of Ketamine affects L-glutamate-induced Ca2+ elevation and neurotoxicity. S. Shibuta, T. Morita, J. Kosaka, T. Kamibayashi, and Y. Fujino. Neurosci Res Sep;98:9-16. 2015

３． 最近の海外学会発表 • Prolonged exposure to ketamine but not thiopental sodium might potentiate glutamate-induced neurotoxicity in rat primary cultured cortical neurons. Satoshi Shibuta, Tomotaka Morita, Takahiko Kamibayashi, Yuji Fujino. Society for Neuroscience Abstracts Presentation Number: 800.02/U8. 2014. (Washington DC, USA)

• Neurons protected by thiopental sodium did not show L-glutamate-induced hypersensitivity in vitro. Tomotaka Morita, Satoshi Shibuta, Jun Kosaka, Yuji Fujino. Euroanaesthesia Accepted Abstract Number: 6AP1-5. 2015. (Berlin, Germany)

• The response of cortical cultured neurons to neurotransmitters after hypoxic insults in vitro. Tomotaka Morita, Satoshi Shibuta, Yuji Fujino, Jun Kosaka. Society for Neuroscience Abstracts Presentation Number: 2444. 2015. (Chicago, USA)

澁田 達史（SfN 2014） 森田 知孝（ESA 2015）

４． 学位取得者 張 平（北京大学卒̶大阪大学） 澁田 達史（大阪大学現職） 井上 隆弥（大阪大学̶開業） Varathan Sriranganathan (Royal Preston Hospital, Lancashire, UK) 森田 知孝（大阪大学）

昨今の麻酔科医不足の中、臨床に携わりながら研究を行うことは甚だ困難が予想されますが、培養実験に関しては時間の自由度が高いため、実験計画を十分に練ることにより、参入のハードルが低くすることができると思います。一人でも多くの麻酔科医が培養神経細胞を使った実験を開始する一助になればわれわれにとってこの上ない喜びです。神経細胞の初代培養では、最初は個々の点に過ぎないものが、突起を伸ばしネットワークを張り巡らせていきます。カルシウムイメージングを行うとネットワーク上を光が駆け抜ける様は実に美しい風景です。皆様にも是非この美を楽しんで頂きたいと思っています。

Varathan Sriranganathan（2014 年大相撲春場所）