Ecologia, Isolamento e Identificação de Bactérias ... · Ecologia, Isolamento e Identificação de Bactérias Diazotróficas259 Funcionalidade versus localização Em questão

Capítulo 10

Ecologia, Isolamento e Identificaçãode Bactérias Diazotróficas

Veronica Massena ReisVera Lúcia Divan Baldani

José Ivo Baldani

Introdução

Os microrganismos que usam nitrogênio na forma de gás comosubstrato para a enzima nitrogenase são conhecidos como fixadores denitrogênio ou diazotróficos. Esses microrganismos pertencem à classedas bactérias e, dentre estas, vários gêneros foram descritos durantemais de 30 anos de pesquisa. A Embrapa Agrobiologia tornou-seconhecida mundialmente pelas pesquisas desenvolvidas com bactériasdiazotróficas associadas a gramíneas, principalmente cereais, comotrigo, arroz, milho, sorgo; gramíneas forrageiras, como capim Braquiária(Brachiaria spp.), capim-elefante (Pennisetum purpureum), e principal-mente pela pesquisa desenvolvida com a cana-de-açúcar (Saccharum spp.)

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liderada pela pesquisadora Johanna Döbereiner. Faz-se necessárioenfatizar que essas bactérias podem colonizar diversas famílias vegetais,e relatos de isolamento desses microrganismos de solo, água e de insetos,embora escassos, também são encontrados na literatura.

Até bem recentemente, a identificação microbiana requeria oisolamento em culturas puras seguidas de uma bateria de testesfisiológicos e bioquímicos. Entretanto, o uso de contagem em placascontendo meios de cultivo não representa o que realmente se visualiza,quando se utilizam amostras de solo ou planta e avalia-se a presençade microrganismos diretamente do microscópio marcados com corantesespecíficos para componentes celulares. Os meios de cultivo, por maisricos que sejam, não são capazes de permitir o crescimento de todos osmicrorganismos presentes numa amostra.

Dois diferentes tipos de células contribuem para este fenômeno:espécies conhecidas, onde as condições aplicadas não permitem o seucrescimento ou estão num estado não cultivável; espécies nãoconhecidas que nunca foram cultivadas por não se conhecer o métodoadequado (AMANN et al., 1996). Embora isso estimule a busca decondições de “culturabilidade” e, conseqüentemente, de novasformulações para acessar essa imensa diversidade natural, o uso demeios de cultivo de células bacterianas é muito antigo.

A busca para acessar essa diversidade foi a responsável pelodesenvolvimento de vários métodos baseados na amplificação deseqüências a partir de amostras do ambiente. Isso revolucionou aestratégia de ação de estudo que antes era baseado apenas emmicrorganismos cultivados em formulações sintéticas. Hoje, sabemosa seqüência de microrganismos que são descritos como espéciesnovas, mas sem que um único indivíduo tenha sido cultivado. Atualmente,a classificação filogenética de microrganismos tem se baseado noconjunto de métodos necessários e tem sido chamada de análise polifá-sica que inclui métodos fenotípicos e genotípicos. Estima-se que 99%de diversidade de microrganismos é desconhecida. Em 2001, com anova validação de espécies e gêneros (a última foi em 1980), 4.518espécies foram divididas em 998 gêneros, perfazendo um número médiode 4,5 espécies para cada gênero (maiores detalhes veja YOUNG,2001).

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Funcionalidade versus localização

Em questão de funcionalidade, vários autores discutem onde essesmicrorganismos poderiam fazer a diferença em termos de contribuiçãopara a nutrição nitrogenada das plantas. Até o final da década de 90,bactérias diazotróficas eram estudadas somente com o enfoque dalocalização radicular e, no caso das associativas, como o próprio nomediz, a superfície ou rizosfera era o alvo principal das análises. Em 1992,a presença desses organismos em amostras de colmos de cana-de-açúcare a contagem desses em números maiores de 10 mil células de tecidocoletado do interior dos colmos de cana-de-açúcar deu início aos estudosonde o ponto-alvo era a localização interna nas plantas avaliadas. Apartir daí foi usado o termo endófito, isto é, bactéria localizada dentrodo tecido vegetal. Esse termo foi baseado em trabalhos de outros gruposque não incluem bactérias diazotróficas. Döbereiner foi a primeira ausar esse termo para o caso desses microrganismos.

Kloepper et al. (1997) descrevem que bactérias endofíticas sãoaquelas que podem ser isoladas de tecidos vegetais superficialmentedesinfestados ou extraídas de dentro da planta, e que não causam danosvisíveis ou induzem sintomas na planta. Fica claro, portanto, quebactérias com capacidade para se estabelecer endofiticamente emtecidos vegetais devem ser enquadradas em algumas regras:

• A bactéria deve ser capaz de invadir e proliferar nos tecidosda planta hospedeira, desenvolvendo mecanismos para ultra-passar as barreiras físicas e químicas desenvolvidas pela planta(mecanismos constitutivos e induzíveis), estabelecendo vias deinfeção e colonização, bem como os sítios de estabelecimento.

• A bactéria não deve induzir uma resposta drástica da planta àinfeção (resposta hipersensível), caracterizada pela morterápida e necrose das células ao redor do ponto de infeção,impedindo a colonização dos tecidos.

• A bactéria deve possuir um padrão de colonização modeladopela planta hospedeira, uma vez que a multiplicação massivae/ou hiperativação de genes de virulência pode colapsar os

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tecidos, induzindo sintomas na planta e conseqüentementeestabelecendo uma interação patogênica.

• No caso de interações mais evoluídas, a bactéria deve seguiro ciclo de vida da planta hospedeira, desenvolvendo mecanis-mos para colonizar sementes ou estruturas de propagaçãovegetativa.

Baldani et al. (1997a) propuseram a distinção em endófitofacultativo e obrigatório, diferenciando respectivamente bactériascapazes de sobreviver no solo e estabelecer-se nas raízes, daquelascom baixa capacidade de sobreviver no solo e capazes de colonizarraízes e parte aérea. Para diferenciar os endófitos diazotróficos daquelesmicrorganismos com capacidade de infectar as raízes e que possuem osolo como um hábitat alternativo, Reinhold-Hurek & Hurek (1998)sugeriram o termo “endófito oportunista”.

Estudos envolvendo o processo de infeção e colonização, vias dedispersão sistêmica, bem como os sítios de estabelecimento e atividadedas bactérias diazotróficas endofíticas em gramíneas, são ainda bastanteescassos, principalmente com relação a plantas crescendo em condiçõesde campo. A ferramenta fundamental para responder a questões básicasdo estabelecimento endofítico é a microscopia ótica e eletrônica decaráter descritivo associada a microanálise. Além da microscopia, outrastécnicas, como por exemplo as técnicas imunológicas e genéticas,devem ser usadas para rastrear bactérias, genes, enzimas e/oumetabólitos induzidos pela interação bactéria-planta.

Deixando de lado o caráter endófito de algumas espécies, estecapítulo irá abordar a ecologia, as diferenças morfológicas e as técnicasde isolamento e contagem das bactérias fixadoras de nitrogênioestudadas atualmente pelo grupo da Embrapa Agrobiologia.

Ecologia das bactérias fixadoras de nitrogênioestudadas pelo grupo da Embrapa Agrobiologia

O descobrimento de duas espécies do gênero Azospirillum:A. lipoferum e A. brasilense no final da década de 70 deve-seprincipalmente à introdução do meio de cultivo semi-sólido NFb, sem

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nitrogênio. Mais tarde, outra espécie foi descrita usando esse mesmomeio de cultivo, o Azospirillum amazonense. Entretanto, o seu cresci-mento nesse meio era prejudicado pela melhor adaptabilidade das duasespécies isoladas anteriormente. Sendo assim, uma modificação da fontede carbono de malato para sacarose, aumento da concentração detampão e concomitante redução do pH final foram os fatores seletivosusados para favorecer o isolamento e a contagem dessa espécie, o queresultou no meio semi-sólido LGI. Esse é um exemplo de como a pesquisaevolui para adaptar o conhecimento da fisiologia do microrganismo novoe aplicá-lo em metodologias que permitam a sua detecção de formamais barata, rápida e seletiva. Mas, antes disso, vamos conhecer umpouco da distribuição ecológica de várias espécies de bactériasdiazotróficas.

Gênero Azospirillum

O gênero Azospirillum inclui atualmente seis espécies descritas,mas apenas 5 são fixadoras de nitrogênio, incluindo a mais nova espéciedescrita, A. doebereinerae, em homenagem a Johanna Döbereiner(ECKERT et al., 2001). As duas espécies primeiramente classificadas nadécada de 70 são as mais estudadas, sendo A. brasilense a que acumulao maior número de publicações durante essas últimas 3 décadas e podeser considerada como um modelo de estudo nessa área de pesquisa.A distribuição ecológica de Azospirillum é extremamente ampla evariada (DÖBEREINER; PEDROSA, 1987). Bactérias desse gênero têmsido encontradas em associação com plantas monocotiledôneas edicotiledôneas, sendo por isso consideradas ubíquas (BASHAN;HOLGUIN, 1997). Entretanto, algumas peculiaridades são observadasna ocorrência das espécies de Azospirillum em associação com plantasda família Gramineae. As espécies A. lipoferum e A. brasilense são asmais freqüentemente encontradas colonizando a maioria das plantasde regiões tropicais e temperadas, chegando a ser isoladas de gramíneascrescidas em locais gelados como o Ártico (NOSKO et al., 1994). A maioriados isolados tem sido obtida de plantas de maior interesse agronômicocomo milho, arroz, sorgo e trigo (BALDANI, 1984; BALDANI et al.,1997a). Essa espécie também foi predominante em raízes e folhas daforrageira Miscanthus sinensis cv. Giganteus, cultivada na Alemanha,

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(KIRCHHOF et al., 1997b) e na seiva de 91 genótipos de milho crescidosno campo (MARRIEL; CARDOSO, 1998). A espécie A. amazonense,inicialmente isolada de gramíneas forrageiras e da palmeira Bactrixgrassipus (MAGALHÃES et al., 1983), apresenta uma distribuição bastanteampla, incluindo cereais como milho, sorgo, arroz (BALDANI, 1984) ecana-de-açúcar (raízes, caules e folhas) que, juntamente com as espéciesA. lipoferum e A. brasilense, são detectadas em altos números, podendochegar até a 107 células por grama de tecido analisado (BALDANI et al.,1986b). Apesar da sua ampla ocorrência, o isolamento da espécieA. amazonense tem se restringido a plantas crescidas em algumasregiões do Brasil, exceto por sua detecção em amostras de plantas decana-de-açúcar cultivadas no Havaí e na Tailândia (DÖBEREINER,1992ab). As demais espécies do gênero possuem distribuição ecológicamuito mais restrita. Recentemente, Reis et al., (2001) apresentaram umestudo da presença de Azospirillum em três genótipos de Brachiariacolhidos de duas localidades do Brasil, Mata Atlântica e Cerrado, everificaram que o maior número de isolados obtidos pertencia à espécieA. amazonense. Vale ressaltar que, das três espécies, essa é a maisadaptada a pH baixo, condição essa predominante em solos tropicais.

Já A. halopraeferens foi isolado somente do rizoplano e raízes dagramínea Kallar grass (Leptochloa fusca L.) crescida em solos salinosno Paquistão, e nenhum estudo posterior detectou a sua presença(REINHOLD et al., 1987). Da mesma forma, A. irakense só foi encontradoem amostras do solo da rizosfera e de raízes de plantas de arrozcultivadas no Iraque (KHAMMAS et al., 1989). A mais nova espécie deAzospirillum, denominada A. largimobile, tem sua ocorrência restritaàs águas de um lago na Austrália (DEKHIL et al., 1997) e não está descritacomo fixadora de nitrogênio. Muito pouco se conhece sobre a ecologiada nova espécie A. doebereinerae em virtude de sua recente descrição(ECKERT et al., 2001).

Gênero Herbaspirillum

O gênero Herbaspirillum é representado por cinco espécies, sendotrês descritas no Brasil: H. seropedicae isolado de gramíneas pelo grupoda Embrapa Agrobiologia e descrito em 1986 (BALDANI et al., 1986a),

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H. rubrisubalbicans foi proposto em 1996 utilizando isolados depositadosem coleção de culturas (GILLIS et al., 1995), e o mais novo destes, oH. frisinguense, que engloba isolados de gramíneas plantadas no Brasil(Pennisetum purpureum) e na Alemanha (Miscanthus spp. e Spartinaspp.) (KIRCHHOF et al., 2001). Existe um último grupo chamado grupo 3,que não representa uma espécie e é constituído de isolados não fixadorese por isso não será incluído nesta revisão (GILLIS et al., 1995).

O Herbaspirillum seropedicae tem sido isolado da maioria dasgramíneas examinadas, tais como milho, sorgo, arroz, forrageiras e cana-de-açúcar, cultivadas no Brasil. Mais recentemente, a mesma espéciefoi isolada de raízes, caules e folhas de cana-de-açúcar cultivada naAustrália (BODDEY et al., 1998). Os estudos têm demonstrado que oH. seropedicae apresenta uma baixa sobrevivência quando inoculadono solo natural ou esterilizado e monitorado por meio de contagem emmeio JNFb semi-sólido (OLIVARES et al., 1996). Os autores, entretanto,conseguiram reisolar a bactéria do solo quando sementes de sorgoesterilizadas (livres de bactérias) foram germinadas neste solo, e apopulação de bactérias diazotróficas presentes nas plântulas foi avaliadaem meio semi-sólido JNFb, sugerindo que a bactéria pode estar emestágio viável, mas não culturável no solo. Essa pode ser uma das razõesde a mesma ter sido inicialmente isolada de solo de rizosfera de milho,sorgo e arroz (BALDANI et al., 1986a) e mais recentemente de diversasgramíneas cultivadas em solo contaminado com metais pesados, masnão em solo desnudo (LANGE et al., 1998).

A outra espécie do gênero Herbaspirillum, H. rubrisubalbicans,tem sido encontrada associada a plantas de cana-de-açúcar e de raízesda erva daninha Digitaria insularis, crescida no interior da plantaçãode cana-de-açúcar (OLIVARES et al., 1996). Por ser uma bactéria causadorada doença estria-mosqueada na variedade de cana-de-açúcar B-4362,hoje erradicada dos canaviais brasileiros, sua detecção tem sido bastanterestrita.

Já H. frisinguense foi descrito recentemente utilizando amostrasde tecido de raízes e colmos de diversos genótipos de capim-elefante(Pennisetum purpureum Schum.) em um experimento conduzido naEmbrapa Agrobiologia e em amostras de duas gramíneas Miscathus eSpartina plantadas na Estação Experimental do GSF, centro de pesquisa

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voltado para a saúde e desenvolvimento agrícola localizado na cidadede Friesing, Alemanha.

Gênero Gluconacetobacter

As espécies de bactéria pertencentes à família Acetobacteriaceaesão caracterizadas fenotipicamente pela habilidade de crescer empH baixo e oxidar etanol a ácido acético (DE LEY, 1992, SWINGS,1992). Historicamente, era dividida em dois gêneros: Gluconobactere Acetobacter. Nos últimos anos, várias modificações ocorreram e aúltima atualização da classificação filogenética dessa família permitiua divisão entre quatro gêneros: Acetobacter, Gluconobacter, Gluco-nacetobacter e Acidomonas baseado na análise parcial da seqüênciade pares de base da subunidade 16 S do RNA ribossomal (YAMADAet al., 1997). A partir dessa reorganização, a espécie Acetobacterdiazotrophicus foi transferida para o novo gênero Gluconacetobacter(YAMADA et al., 1998).

Gluconacetobacter diazotrophicus foi isolada inicialmente decana-de-açúcar (CAVALCANTE; DÖBEREINER, 1988) e posteriormenteencontrada associada a batata-doce (PAULA et al., 1993), Pennisetumpurpureum (Reis et al., 1994), café (JIMENÉZ-SALGADO et al., 1997),abacaxi (TAPIA-HERNÁNDEZ et al., 2000), insetos como cochonilhas,que habitam a bainha foliar da cana-de-açúcar (FRANKE et al., 1999),e o cereal Eleusine coracana, plantado na Índia (LOGANATHAN et al.,1999). Ao longo desses anos a sua presença tem sido observada emraízes, caules e folhas de plantas de cana-de-açúcar cultivadas no Brasil,assim como de plantas cultivadas na Argentina, Uruguai, México, Cuba,Estados Unidos e Austrália (BALDANI et al., 1997a, LI; MACRAE, 1992).Foi também isolada do fluido do apoplasto de cana-de-açúcar cultivadano Canadá (DONG et al., 1994). Entretanto, nas amostras de café, outrasbactérias de crescimento semelhante a G. diazotrophicus foram isoladase dois novos grupos foram identificados e classificados como novasespécies de Gluconacetobacter fixadoras de nitrogênio: G. johannae eG. azotocaptans (FUENTES-RAMIREZ et al., 2001), perfazendo um totalde três espécies diazotróficas descritas nessa família.

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Por ser uma bactéria que possui uma sobrevivência muito baixano solo (BALDANI et al., 1997a), é bem provável que a via principal detransmissão seja o tolete de cana-de-açúcar, muito embora o palhiçoda própria cultura não deve ser descartado como uma fonte alternativade inóculo quando incorporado ao solo (BALDANI et al., 1998).Um argumento a favor dessa possibilidade é a detecção recente pormeio da técnica de imunocaptura, mas não da contagem do númeromais provável do G. diazotrophicus em plantas adultas (oriundas demicropropagação), cultivadas no campo (REIS JÚNIOR, 1998).

Outras possibilidades seriam por meio de esporos de fungosmicorrízicos arbusculares presentes no solo, já que a bactéria foidetectada colonizando os mesmos, principalmente em experimentosde inoculação em vasos (PAULA et al., 1993) ou pela contaminaçãoocorrida no momento da sucção da seiva do floema por cochonilhasque vivem dentro da bainha foliar das plantas de cana-de-açúcar e quepossuem essa bactéria dentro da linfa (ASHBOLT; INKERMAN, 1990).Caballero-Mellado & Martinez-Romero (1994) levantaram a hipótesede que esse inseto é o responsável pela dispersão dessa espécie a curtadistância e que o tolete transporta a bactéria para as regiões onde acana-de-açúcar foi importada.

Gênero Burkholderia

Por sua vez, o gênero Burkholderia tem sido isolado de diversasplantas, como por exemplo, arroz, mandioca, batata doce e cana-de-açúcar (OLIVEIRA, 1992; BALOTA, 1994; BALDANI, 1996b). A mesmaainda não foi encontrada em associação com outros cereais e suapresença em outras gramíneas forrageiras ainda não foi explorada.Os resultados obtidos até o momento apontam o arroz como uma dasplantas que apresenta elevada ocorrência deste gênero (CAMPOS et al.,1998). Uma análise recente dos isolados obtidos de cana-de-açúcarmostrou a existência de um novo gênero de Burkholderia colonizandoessa planta, denominada B. tropica (REIS et al., 2004). Isolados comcaracterísticas semelhantes a essa espécie foram obtidos de plantasmicropropagadas de cana-de-açúcar cultivadas em solo oriundo de

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canavial (ARCANJO et al., 2000) e de plantas de cana-de-açúcar adultascultivadas na Austrália (BODDEY et al., 1998).

Características morfológicas das espécies

Azospirillum spp.

O gênero Azospirillum foi definido por Tarrand et al. (1978) ehoje compreende seis espécies, A. brasilense e A. lipoferum(TARRAND et al., 1978), A. amazonense (MAGALHÃES et al., 1983),A. halopraeferens (REINHOLD et al., 1987), A. irakense (KHAMMASet al., 1989) e A. largimobile (DEKHIL et al., 1997), caracterizadascom base na análise fenotípica e genotípica (homologia DNA:DNA eseqüência da rRNA 16S). O seqüenciamento da rRNA 16S mostrou aformação de dois subgrupos distintos: o primeiro subgrupo é formadopelas espécies A. lipoferum, A. brasilense, A. halopraeferens eA. largimobile, e as duas primeiras espécies apresentam um alto graude similaridade genética; o outro subgrupo é formado pelas espéciesA. amazonense e A. irakense. Entretanto, por não apresentaremcaracterísticas genéticas divergentes que justifiquem a criação de novogênero, os mesmos continuam a fazer parte do gênero Azospirillum(DEKHIL et al., 1997). Algumas características fisiológicas possibilitamdistinguir as espécies de Azospirillum e têm sido usadas como basepara os estudos de isolamento e pré-identificação nos laboratórios.Tanto a espécie A. lipoferum como A. brasilense utilizam malato comofonte de carbono, mas somente a primeira consegue utilizar glicose,necessita de biotina como fator de crescimento e forma célulaspleomórficas em meio alcalino (BALDANI et al., 1997a). As duasespécies também têm a habilidade para produzir fito-hormônios comoAIA. Os genes para a biossíntese desse fito-hormônio foram encontradostambém em A. amazonense, mas não em A. irakense e A. halopraeferens(VANDE BROEK; VANDERLEYDEN, 1995). A habilidade para utilizarsacarose é a principal característica de A. amazonense e A. irakense,embora somente a primeira espécie seja capaz de crescer em pH

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mais ácido, e, para as demais espécies do gênero, o pH ótimo decrescimento está próximo da neutralidade. A. halopraeferens eA. largimobile utilizam o malato como principal fonte de carbono, porémmanitol também é usado. A temperatura ótima para crescimento estáentre 32oC e 37oC, entretanto, A. halopraeferens tem um crescimentoótimo a 41oC e possui tolerância a condições salinas. Já A. largimobileapresenta uma temperatura ótima de crescimento ao redor de 28oC.Uma característica interessante da espécie A. irakense é a capacidadede hidrolisar pectina e também de tolerar altas concentrações de sais(KHAMMAS et al., 1989) como já observado para o A. halopraeferens(REINHOLD et al., 1987). O seqüenciamento da rRNA 16S e 23Spermitiu o desenvolvimento de sondas para a identificação de estirpesda maioria das espécies de Azospirillum através da hibridização como DNAr (KIRCHHOF et al., 1997a), com exceção da espécieA. largimobile, descrita muito recentemente.

Herbaspirillum spp.

No caso das espécies do gênero Herbaspirillum, existemdificuldades para distinguir as duas espécies já conhecidas. Alémdisso, o isolamento do Herbaspirillum é dificultado, uma vez quepode ser confundido com Azospirillum, principalmente aquelasbactérias capazes de tolerar o pH inicial mais ácido do meio JNFb.Desse modo, a formação de película no meio JNFb, per si, não indicaa presença de bactérias das espécies de Herbaspirillum. A separaçãodas duas espécies só é possível após a purificação das colônias emmeio JNFb contendo três vezes a concentração de azul de bromotimol(as colônias ficam azuladas) e crescimento em meio com meso-eritritol e N-acetilglucosamina. O H. seropedicae usa a N-acetilglu-cosamina, mas não a primeira fonte de carbono, enquanto o opostoocorre com estirpes da espécie H. rubrisubalbicans. O uso de sondasespecíficas desenvolvidas para diferenciar as espécies (BALDANIet al., 1996a) podem ser usadas para confirmar a que espéciespertencem os isolados.

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Gluconacetobacter spp.

No caso do Gluconacetobacter diazotrophicus, o meio de cultivoLGIP permite o crescimento, quase que exclusivo, da bactéria-alvo,tendo em vista a alta concentração de açúcar cristal (10% - 100 g L-1) edo baixo valor do pH do meio (5,5 a 5,7). No meio LGIP sólido, ascolônias são alaranjadas, porém a formação de colônias cor chocolateem meio batata-P é uma característica que as distingue facilmente dequalquer outra bactéria diazotrófica endofítica caracterizada até omomento. Embora cresça e metabolize a sacarose, essa bactéria nãousa diretamente esse açúcar como fonte de carbono, já que nenhumsistema de transporte de sacarose foi detectado em G. diazotrophicus(MARTINEZ–DRETZ, 1995). A autora demonstrou a necessidade de umaenzima extracelular com atividade sacarolítica para que a mesma sejametabolizada. Um aspecto interessante dessa bactéria refere-se à suacapacidade de crescer e fixar nitrogênio em presença de nitrato e serparcialmente inibida por amônia (STEPHAN et al., 1991), principalmentena presença de altas concentrações de sacarose (REIS & DOBEREINER,1998).

Burkholderia spp.

Este gênero inclui mais de 30 espécies descritas. Dentre as espéciesfixadoras de nitrogênio desse grupo, muito pouco se sabe, pois a maioriados laboratórios que a estudam não está relacionada com atividadesagrícolas. Sabe-se que B. vietnamiensis e um isolado de B. kururiensis,o KP 23, são capazes de reduzir nitrogênio a amônio (ESTRADA DELOS-SANTOS et al., 2001; BALANDREAU et al., 2001). Isso não implicaque essa habilidade esteja presente em outras espécies, faltando apenastestá-las, e que mesmo algumas estirpes o façam.

Na Embrapa Agrobiologia, as duas espécies de bactérias perten-centes ao gênero Burkholderia, B. brasilensis e B. tropica têm comomeio semi-seletivo o JMV semi-sólido, que usa manitol como fonte decarbono e pH ao redor de 5,0. Esse meio, acrescido de 100 mg L-1 de

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extrato de levedura, tem permitido o isolamento dessa bactéria,principalmente B. brasilensis. As células são encapsuladas e podemapresentar de 1 a 4 flagelos polares. As colônias em meio JMV são depequenas a médias, úmidas, esbranquiçadas, com o centro amarelado.Na presença de extrato de levedura (20 a 100 mg L-1) ocorre um aumentoda atividade da nitrogenase e favorecimento da divisão celular. Ambassão capazes de crescer em meio contendo 50 g L-1 de açúcar cristal,mas somente B. tropica tolera 100 g L-1 desse açúcar, usando a formu-lação do meio LGI-P.

O que se precisa para formular um meio decultivo semi-seletivo para bactérias diazotróficas

Meios de cultivo variam em grau de seletividade, isto é, utilizam-se de substâncias ou condições que separam parte da população nativade um certo hábitat pela capacidade de adaptação. No caso debactérias diazotróficas, o primeiro filtro seletivo é a supressão de formasde nitrogênio inorgânio. A partir daí, podemos ter outras variações,como de pH, osmolaridade, adição de fungistáticos, etc., semprevisando ao crescimento da bactéria-alvo a partir de amostras de plantase solo.

Além de água, a formulação de um meio de cultivo para bactériasdiazotróficas requer: uma ou mais fontes de carbono, um tampão(geralmente o fosfato), sais que complementam as necessidades celularesde crescimento tanto para macronutrientes como fósforo (P), potássio(K), cálcio (Ca), magnésio (Mg), enxofre (S) etc., como paramicroelementos como ferro (Fe), boro (B), zinco (Zn), sódio (Na) etc., e,no caso de bactérias diazotróficas, o molibdênio é incluído, já que écomponente estrutural da nitrogenase, enzima responsável pela reduçãodo N gasoso. Além desses elementos, também pode-se fazer uso deindicadores de viragem de pH, como o azul de bromotimol, vitaminas emistura de compostos orgânicos, como o extrato de levedura, extratosde planta, caldo de cana-de-açúcar, entre outros. O equilíbrio químicodessas soluções deve ser mantido de forma a favorecer a célula aassimilar tais componentes, isto é, alta osmolaridade ou condições

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extremas de cultivo (como mudança de pH, uso de fungistáticos eantibióticos, entre outros) devem ser testadas para não restringir amultiplicação. Soluções com grandes quantidades de açúcar aumentama osmolaridade da solução, mas podem ser úteis no caso de se procurarmicrorganismos de hábitats específicos e mesmo extratos de plantas,como uso do caldo de cana-de-açúcar (LGI-P) ou partes destas, como ouso de batata inglesa cozida (meio batata) podem inserir compostosricos em diversas substâncias orgânicas comparáveis ao extrato delevedura e alguns fatores de crescimento não especificados.

Os meios de cultivo são conhecidos pelas siglas e alguns delessão conhecidos universalmente em virtude de sua abrangência, comoo caso do NB - caldo nutritivo (NB = Nutriente Broth), meio LB (LuriaBertani) etc., e podem ser vendidos por diversos laboratórios.

A consistência do meio de cultivo é obtida por meio da adição deagentes solidificantes como o agar-agar, que nada mais é que umagelatina. Meios sólidos, usados em placas de vidro chamadas Petri,servem para visualização de colônias e, na forma semigelificada ousemi-sólida, a concentração é reduzida em torno de dez vezes a dausada nos meios sólidos. Vale ressaltar esse ponto, pois o meio semi-sólido sem adição de nitrogênio é o pré-requisito básico que faz adiferença na formulação dos meios de cultivo. Esses meios permitemque a bactéria inoculada comece a se multiplicar numa condição ótimade oxigênio dissolvido na solução, que é baixa (no fundo do tubo épróxima a zero e vai aumentando conforme a distância da superfície),permitindo a divisão celular dos microrganismos aeróbios, mas não inibea síntese ou manutenção da atividade da nitrogenase existente, que sóé funcional em anaerobiose (sem oxigênio).

Essa modificação do meio sólido para semi-sólido permitiu umavanço no isolamento desses microrganismos a partir da década de70 e até hoje as diversas formulações descritas são usadas para isolarbactérias conhecidas e novas espécies, permitindo que a pesquisa dafixação biológica de nitrogênio seja desenvolvida em diversosinstitutos de pesquisa no mundo e facilitando a troca de informaçõesentre estas.

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