10
Ectodomain shedding of VEGF183, a novel isoform of vascular endothelial growth factor, promotes its mitogenic activity in vitro Liu Jingjing, Bhooma Srinivasan & Rouel S. Roque Department of Pathology and Anatomy and the North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center, Fort Worth, Texas, USA Received 1 September 2000; accepted in revised form 6 April 2001 Key words: endothelial cells, heparin, mitogen activated protein kinases, mitogenic activity, plasmin, vascular endothelial growth factor, vascular permeability Abstract We have previously reported the discovery of VEGF183, a novel isoform of vascular endothelial growth factor (VEGF), whose nucleotide sequence revealed an 18-bp deletion in the exon 6A-encoded region of VEGF. The following study was done to characterize VEGF183 and to determine its biological activity in vitro and in vivo. Recombinant human VEGF183 was expressed in Escherichia coli (rhVEGF183) or in human 293 embryonic kidney cells (293-VEGF183) and tested for stimulation of permeability of dermal vessels in normal rats as well as for mitogenic activity and phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPK) in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). While small amounts of VEGF183 were secreted into the conditioned media (CM) of 293 cells expressing VEGF183 (293-VEGF183 cells), most of the VEGF183 remained cell surface-bound and could be released into the CM following treatment with plasmin or heparin. CM from 293-VEGF183 cells treated with heparin or plasmin induced about a twofold increase in cell numbers and stimulated MAPK phosphorylation in HUVECs as compared with CM from untreated 293-VEGF183 cells or from heparin- or plasmin-treated 293 cells containing the vector alone. Intradermal injections of rhVEGF183 promoted increased permeability of dermal vessels to Evan's blue dye. Our study shows that VEGF183 is predominantly a cell-anchored protein that promotes increased vascular permeability in vivo but requires extracellular cleavage or release by heparin or plasmin to promote its mitogenic activity in vitro. Abbreviations: CM ± conditioned media; 4-CN ± 4-chloro-1-naphthol; HUVECs ± human umbilical vein endo- thelial cells; MAPK ± mitogen activated protein kinase; PBS ± phosphate-buered saline; 293-pCR3.1 cells ± 293 cells containing vector alone; rhVEGF ± recombinant human VEGF expressed in E. coli; rPrG-agarose ± recom- binant Protein G-agarose; RT±PCR ± reverse transcription±polymerase chain reaction; SDS±PAGE ± sodium dodecyl sulfate±polyacrylamide gel electrophoresis; streptavidin±HRP ± streptavidin±horseradish peroxidase; VEGF ± vascular endothelial growth factor; 293-VEGF cells ± 293 cells expressing human VEGF Introduction Numerous growth factors and cytokines are synthesized and released onto the cell surface where they may remain inactive or perform biological functions via juxtacrine mechanisms. Membrane-anchored molecules may also undergo proteolytic cleavage by `secretases' in a process called ectodomain shedding, resulting in their release and in the appearance of a biological response [1, 2]. Members of the A Disintegrin and Metallopro- teinases family such as SUP-17 in Caenorhabditis elegans [3] and kuzbanian in Drosophila promote cleavage of the extracellular domain of transmembrane receptors LIN- 12/Notch [4]. In mammals, tumor necrosis factor-a converting enzyme promotes ectodomain shedding of several molecules including tumor necrosis factor-a (TNF-a), transforming growth factor-a, L -selectin ad- hesion molecule, and TNF-a receptor [1]. Reports of increased mitogenic activity following cleavage and release of VEGF189, a cell-bound isoform of vascular endothelial growth factor (VEGF), by urokinase [5] and plasmin [6] extend the role of ectodomain shedding to the activation of VEGF. VEGF is a family of homodimeric proteins that are highly angiogenic in vivo [7±12], stimulate the prolifer- Correspondence to: Rouel S. Roque, Department of Pathology and Anatomy, University of North Texas Health Science Center, 3500 Camp Bowie Blvd. ME2-202, Fort Worth, TX 76107-2699, USA. Tel: +1-817-735-5055; Fax: +1-817-735-2610; E-mail: [email protected]. edu Angiogenesis 4: 103±112, 2001. 103 Ó 2001 Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands.

Ectodomain shedding of VEGF183, a novel isoform of vascular endothelial growth factor, promotes its mitogenic activity in vitro

Embed Size (px)

Citation preview

��������� ����� �� �������� � ���� ������ �� ������� ���������� ����� ������� ������� �� ���� ��� �������� �� �����

��� ��������� ��� ������ � � � ����� �� ��������������� ���� �� ��� ������ ��� ��� ���� ����� ��� �������� ���������� ���������� ���� �������� �� ������ !������ "�� #���� ������ � �

�������� � ��������� ���� ������� �� ������� !��� " #���� ����

$�� %���& �������� � ������ �� ���� ������� ���� ��� ������� $�� ���� ��������� ������%� �� ����� � ���� ��������� � ���&� ! ����� � ���� � ����� �����%

�������

'� �� ���������% �������� �� ��������% �! ()*+�,-� ����� ���!��� �! � ���� � �������� � ���&� ! ����.()*+/� &��� ���������� �������� ���� ��� � �,0�� �������� �� �� �1�� "#0������� ������ �! ()*+� 2�!����&��� ����% & � ���� �� � � �����3� ()*+�,- �� �� ��������� ��� �������� � ������% �� ���� �� �� ������������ �� �� � ()*+�,- & � �1������� �� ����������� � � .�()*+�,-/ �� �� �� � �4- ����%���� $����%����� .�4-0()*+�,-/ �� ������ !�� ������ ���� �! ����� �����% �! ���� � ������� �� ���� � � �� � &��� � !����������� ������% �� ������%� ���� �! �������0 ���� ��� ������� $�� ��� .5#67/ �� �������� �� � ������� ����� �������� � ����� .89():�/� '��� �� �� ������ �! ()*+�,- &��� �������� ���� �� ����������� ���� .:5/�! �4- ����� �1�������� ()*+�,- .�4-0()*+�,- �����/� ���� �! �� ()*+�,- ��� ���� ���� ���! ��0����� ������� �� ���� ��� ���� �� :5 !����&��� ��� ����� &�� �� ���� �� �� ���� :5 !��� �4-0()*+�,- ����� ��� ���&�� �� ��� �� �� ���� ������� ���� �&�!��� ����� �� �� ���� ������� �� ������ ��� 5#67 ������%� ������ 89():� � ���� ��� &�� :5 !��� ����� ��� �4-0()*+�,- ����� �� !��� �� ���0 �� �� ����0��� ��� �4- ��������� ����� �� ������ ����� ;��� ���� � ���������� �! �()*+�,- �������� ����� ��� ����� �����% �! ���� �������� �� )� �<� ���� �%�� =�� ����% ��&� � � ()*+�,- �� �������� ���% ����0 ������ ������� � � ������������� ��� � ���� � ����� �����% �� ��� ��� �������� �1�� ������ � ��� � �� �� ���� �� �% �� ��� �� �� ���� ��������� ��� ��������� ������% �� �����

�''���������& :5 > ����������� ���� ?0:@ > ?0�����0�0� ���� 89():� > �� � ������� � ���� ����0���� � ����� 5#67 > ������� ���� ��� ������� $�� �� 6� > ���� ��0��A���� � ���� �4-0�:�-�� ����� > �4-����� ���� ����� ������ ���� �()*+ > �������� �� �� � ()*+ �1������� �� �( � � �6�*0 � ���� > �����0��� �� 6������ *0 � ���� �2>6:� > ������� �� ����������>���%��� �� � �� �� ����� �B�>6#*) > �����������%� ���! ��>���% ��%� ���� ��� �������������� ������ �����>8�6 > ������ �����>����� ��� ����1�� �� ()*+ > � ���� � �������� � ���&� ! ���� �4-0()*+ ����� > �4- ����� �1�������� �� � ()*+

����������

@������� ���&� ! ����� �� �%��$���� �� �%�����3�� �� ���� ��� ���� �� ���� ���! �� &��� ��% � %��� �� �� ����� �� ���!��� �������� � !�������� �����1� ����� ��� ������ 5���� ��0 ������ ���������� % ��� ������� �������%��� ��� � �� �% C������ ���< �� ������� � ���� ������� �� �������� ��������� �� �������� �� �� �� �� ��� � ��� �! �������� � ��������

D�� �E� 5������ �! �� # B���������� �� 5�� ������0���� ��� ! ���% ��� � �960�F �� !������'����� � �����D-E �� $�3� �� � �� ������ � ������� ��� � �� �! ���1�� ������ � ��� �� �! �� ������� �� ��������� �;@0��G@��� D?E� ;� � �� ��� ����� �������� ! ����0����������� ��3%�� �������� ������� �� ������� �!����� � ��������� ��������� ����� �������� ! ����0�.2@+0�/� �� ��!������ ���&� ! ����0�� �0�������� �0����� ��������� �� 2@+0� �������� D�E� ������� �!����� ��� ��������� ������% !����&��� ��� � �� ������ �� �! ()*+�,4� ����0����� ���!��� �! � ���� ��������� � ���&� ! ���� .()*+/� �% ���$�� �� DHE ���� ���� D"E �1���� �� ���� �! ������� �� ������� ���� ���� ���� �! ()*+�

()*+ �� ! ���% �! ���������� �������� � � �����% ��������� �� ��� DF>��E� ������ �� �� �����!��0

!����������� �I ����� �� ������ B�� ������ �! 6 �����% ��

#� ���%� 9��������% �! @��� 2�1 � 8� �� ������� :������ -H��

: �� �&�� ���� 5)�0���� +��� '���� 2J F"��F0�"44� 9�#� 2��I

K�0,�F0F-H0H�HH + 1I K�0,�F0F-H0�"�� )0� ��I ������L�������

���

����������� I ��->���� ����� ��-� ���� $ �%�� �������� ��' ������( ������� �� ��� ������ ����(

���� �! �������� � ����� �� ������� DF� ,� ��E� ������� �� �� ����� �����% �! ����� ������� D��� ��� �-E�5������ �! ��� ! ���% > ()*+���� ()*+�?H�()*+�"H� ()*+�,-� ()*+�,4� �� ()*+��" >������ !��� ����� ���� �������� �! ������ ���� ���� �� D�?>�FE� '��� �� �1��� �! �� ()*+ ���� ���1������� �� ()*+��"� �� ���� ���!���� �� � � �0����3�� �% � ��� � �� �������� ��������� �! �1�� "� 2����1�� " �� ���������% ������� �� ()*+��� ��()*+�"H� &��� ���% � �� �! �� .�1�� "/ �� ������� ()*+�?H �� ()*+�,4� 5�������� �1�� F �� ���������� �� �� �&� �� ����� ���!����� ()*+��� ��()*+�?H� 2� �������� �� ������ �! �1��� " �� F ���� � ����� ���!���� �! ()*+ � % ���������� �� �������� � � ���������� �� ���������� �! � � ���!�������� ��% �� ���� ������ ��� �� ������� �� M�$���D�?E� ���� � �� ��������� D�?E� �� ��� ������� D�H� �"E����&� ! ���� ����� ������ D�,E� ��������� ������% D�4E �� �������� ������� D��� ��E� 5�������� �� ���% � �������!� �� �� �1�� "0���� ����� � ���1%������ � ��� ���! ()*+�?H �� ()*+�,4 �� ���� ��������� ���� ��� ���� M���% �� ���� ���! ��0������� ����� �� ���1�� ������ � � ������ D�"� ��E�

'� �� �������% ���������� ����� � ��� ���!��� �!()*+� ()*+�,- D�FE� &��� ���������� ������������ ��� � �,0�� �������� �� �� �1�� "0������� ��������� ��� ������ ���% ������ � �! �� �1�� F0��������������� �� ()*+�,4� 2� �������� �� �� �1�� "#0������� ��� ��� � � ����������� �� �� �� M���% ���1�� ������ � � ���10 �� ���� ���! ��0������� ����� �!()*+�,4 �� �� �������� �� �� �� ���$�� �� ��� � ������ �� ()*+ DHE� ����� ������ �� � � ���������� ������ ��()*+�,-� 8�&����� ����� �� �������� �� ()*+�,-.�1�� "#�/ �� ���� ��� .�, ��/� �� �� �� ��� ��� ��������� � � ()*+�,- &���� ��� �1���� � � ���������� �� �� ���� ����� � �� ()*+�,4� 2��� �� !����&���������� &��� ���� �� � � �����3� ()*+�,-� �� �����0���� &���� ()*+�,- �� �������� ���&� ! ���� ��$�()*+��� �� ()*+�"H� �� ��� ��� ���� ����� ��$�()*+�,4� � &��� � �� ��������� ��� �������� � ������%�� ���� �� �� ����

�!��������� ���������

)������ �

6� ����� �� ���� ������� ���� � �� ���&� ������0������ &��� ��� ���� !��� ���� :���� � :�� .��������� 5�������/� #�� ����������� ��3%��� �� �� �����!�� ������� �� ����������0���%��� �� � �� �� �����.�206:�/ �1���� �� 2 � �� �� ������% .:������� ��� ������ ;���� 6 �� #���� : ��!���� / �� �� ��B@# ���%��� �� .��� � ����� � ���� � : ��!���� / &������� ��� !��� 6����� .5 ������ '��������/� +��������� �� ������� �1��������� �:�-��09�� ������� 2G#������� $��� �� =�� ��� 2=6��+� ��������� �����&��� ��� ���� !��� ;��������� .� � B����� : ��!���� /��)2��� ������ �� ���.B)-/��%�� ���������

.���/ ����� &��� !��� ��� � ����� ����!��� ���� ��*�������� .*?�,/ &��� ���� ��� !��� ��!� 2������0����� ;��� .*� �� ;�� ��� @�& N��$/ &��� �������%��0B0���� � ����%� ������ .;62*/� ��! ������� ���� ����� !�� ���� �%��� &��� !��� ���� � +�� �������� � �%���� 2F ������ �� ������� ��� B@# ���������� $��& � ���� ��� !��� #���� � .#�������� 8������;�������/� �� 2� �� -H�0� ��� & � !��� ;:@ .;������: ��!���� /� +�� ����������� � �������� �������� ��������� * � ���� .�6�*0 � ����/ & � ���� ��� !�����!� 2���������� �������� � ���0�������0� !������� ����� �������� � ���0�����5#67 .�0)�$/� � ���� ���%���� � ���0()*+� �� � ������ �% ���������� �� ���� '������ �������� �� ����� ������0��� ����$��� ��������� �� ������� �� ����� !��� � �� :��3 ����������%� ;�� .� �� :��3� : ��!���� /�7 ���������� � �$���� ������ �����0����� ��� ����1�0� �� .������ �����08�6/ �� ?0�����0�0� ���� .?0:@/ &��� ���� ��� !��� ;=0�#B .8�������� : ��0!���� /� #������% ��������� �������� & � ��� ���� !���:8)5;:=@ .2������ � : ��!���� / �� :# 6������#�� % �� ���� $�� & � !��� 6;)�:) .���$!����;�������/�

!� �� ����

8�� � ������� � ���� �������� � ����� .89():�/ ���� � ����%���� $����% .�4-/ ����� &��� ��� ���� !���#����� � 2%�� :������ :���������� ���$������ 5 �%0� ��� #�� �������� &��� � ��� ���� �� ���&� ������.B�������<� ����O�� ) ���� ������ &�� � �5 �0���� ����� ��� �����G�� ����������� ��� ��G�� �������0�%���� �H �5 8���� ��!!��� �� ��P !�� � �����������/ � -F �: ����� �����O�� �������� �! 4HP ��� HP :=��

����' ������� ���' � ����� ��� �� ����

�2>6:� & � ���!����� �� �� � ����� �@# ���������� D�FE ����� �� ������ � ������ H�::#:2:02#*#::::**2:***::2::*###:0-� �� ����&����� � ������ H�0******#2:::*###::0:2*#***#**0-�� �������� �� ����!% �� !��� ��0������ �! �� � ()*+� '�� � ��; ���� ��� �%������� �� �� H�0�������� �! ()*+ ������ ���% ��&�0���� � �! ��� ���� � ��������� *���; ����������� ����& � ���������� �� �� ��&����� � ������ !�� ����������()*+ ���!���� ���� �� �)2��� ������ !�� ������������ � �1�������� �� � ��� �������� #����O� ���� & � ��������� �� B@# ���%��� �� !�� �, �%���� !����&�� �%��+ B@# ���%��� �� �� �� O� � �&� �%���� �� ����� ��-�0# ���� ��� ���� ��� !�� 2# �������� 6:� ������������ ����� !��� �� �������� �! ()*+ ���!���� &������ ��� ���� �:� -��09�� ������ ����� �� 2# �������$�� �� �� ��!����� ���� 2=6��+� ������ 6� ��������� ����� ()*+�"H� ()*+�,-� �� ()*+�,4 &����������� ����� ������� %�����3 ���� �� -�60� �������������������� ������ H�0*#*#*#2*#*:22::20:#*0-�� H�0:*###*:*:##*###2:::*0-�� �� H�0

��? ,( -���.��� �� � (

::#:#***#:***#222:0-� �������� �� �������3� �� ���!���� �! ()*+� �� �1�� "#0������� �������� ��()*+�,- �� ()*+�,4� �� ()*+�,- ���� D�FE������������%� 6� ����� &��� ���� ��� �� ��������� ����������� �� ������� ��� B@# ���%��� ��� 2� ��������� ��� ���� ������ �4- ����� &��� �� ��!����� &�� ����!��0� ���� �� H �� �� ���� B@# ���� ����� �� �()*+�"H� ()*+�,-� ()*+�,4� �� �� �:� -�� ������ ����� �� �������� &�� "�� ��G�� *?�, !�� � &��$���� ��� �������� �! �4- ����� �1�������� ()*+ .�4-0()*+�����/ �� �� ������ ���� .�4-0�:�-�� �����/ &��� � ��0� ���� �� ���&� ���� ������������ &�� -�� ��G��*?�,� �� � �� ��� ����% F>�� � %�� �4-0()*+ �����&��� � � �����3�� !�� ()*+ �1�������� ����� ����0���������� ���� �� '������ �������� �����3��� � ���� ���0()*+ ;�* � �I��� ���������

����'����� ��������� �� )� ���� ��� ������ �� ����

6� ����� ���� ����� �� ����� !�� ()*+ ���!���� &����������� &�� ��; �� *����� ��� ��� ���� �� �)2��� ������ �� �� ��!����� ���� ��� ����� �������� ��������� �����O� ������ ����� &��� �%��� �� ���� !��'������ �������� �� !�� ���� ���� �! ��������� ������ ��������� ��!������ �� ���� � �������� D�4E� ���Q%� �����&��� ���&� �� =B"�� �! ��">���� ������� &�� � �5;62* !�� �>- � ��� ������!���� � H�� � � !�� �H ��� � ���� ������ ����� 6������ &��� &����� �� �%��� ����A�� ���� ����� �� �5 2���08:�� �8 ,�-� �� �5)B2#� �� �H ��G�� �%��3%�� � -F �: !�� -� ��� &����� ���� � ��������� :��� �%� ��� &��� ����� ��� !����� ���� �������� �! ��H ��G�� B@#�� ; !�� -� ���� ���� ���� ����� �F* ������ H� �� ������!���� ��"���� � � !�� �� ���� 2� �������� �� �������� &������������ �� ��������� ������� !����&��� ������!�� ���� ���&� �% ������ �����%� ���! ��0���% ��%� ���� ����������������� .�B�06#*)/� 2� ������� &��� ������ -��� & � ��A�� ���� ����� H� �5 2���08:�� �8 ,���� �5 )B2#� �� ��HP 2�����0J0��� !����&�� �% ? 5��� �� & � ��A��� ��������3 ���� & � ��������� �%����� ���� �� ������� �� �H �5 B22 �� & � ��A�� !��? � ? �: �� � $��� !����&�� �% ������!�� �����)1�� ��� &��� ��� �� �%3�� !�� �? � ���� �� �52���08:�� �8 ,��� ?� �5 @ :� � ? �: �� ������ ��� �� ���& ��!������� '������ �������� & � ���!����� ����!����� �������� ����� ���0()*+ ;�* � �I����

)���' �� �'� ���

�4-0()*+ ����� ����� ��� �� ��������� �� �%�����0��O����� ������ &��� � ����� &�� �� �� 2� ��-H�0� ��� .��FH :�G����/� :5 & � ��������� �� ���0����� ��� ���� ����� ������!�� � O����� .:��������0���������� ���� +����� 8������� 2�1 �/� ��� ��������� ����� ()*+ �� ����� &��� ���&� �� � =B"��

�! ���>��-� �������� �� �� ��!����� �� ��������� ���%�����0��O����� ������ !�� -� ���� 2F �@# ���%���0 �� & � ������� &�� � �5 ;62* �� �� �������� �!��� ��G�� ��! ������ !�� � � -F �:� 6� ����0�������

�������� �� ��� ����� &��� ��� � ����� &�� �� �:�2� �� -H�0� ��� !�� � �� ��������� ������ &������� ��� � ����������

�����������������

:������� ��� :5 !��� �4-0()*+ ����� &��� ����� ���&�� �� �� �! � ���� ���0()*+ ;�* �� �� �5 ���������� �� �� �H� �5 ������ �������� �8 F��� �? �: !�� � � !����&�� �% �6�*0 � ���� !�� � �;�����������10�6�*0 � ���� & � ��� �����������% ������!�� ���� � ������ � � !�� �� �� 2� ������ & �& ��� -� �� ���� ��0��A���� � ���� .6�/� �8 F�?���1�� &�� � ���� ��A��� ������ !�� H ���� �� �� ����� ��P �B�06#*) �����

#������ ' �����

:���� &��� & ��� �� 6�� �8 F�-� �� �%��� �� ����O���;6# ��A�� .6�� �P @������ 60?�� ���HP ���������1%��� ��� �H� �5 ������ �������� � �5 ��%����0�� �������� ����� ���� � �5 ���%����%����!��%�Q������� � ��G�� ��������� �� � �5 ������ ����0� � � ��/� :��� �%� ��� &��� ������!���� � �"���� � �!�� �H ��� � ? �: �� ������� �������� ����� &����� ����� �� ������ � ��� ����� �� :# 6������ #�� %�� ����� � ����� &��� ��� � ��� �� ��P �B�06#*)���� ����� �������� �� ���0�������� ����������� 6��0����� !��� ���� ���� ���� &��� �� ��!����� ���� 6(B+����� ��� !�� - � ��� �� -� �# � ? �:� ����$��&�� HP ������ ����� ������ �� 6�� �� ����� ����������� &�� ���� �% ��������� !����&�� �% ����0��� �� ������ �% ���������� ;������� ����� � ���&��� ���� ��3�� ����� ?0:@ �� ������� !�� ��������0������� �� �������

������� � � ����� ���������

�4-0()*+ ����� &��� ����� ��� �� 2� �� -H�0� ��� ����� ��� &�� H� ��G�� �� ��� �� ��� � ���� �����G���� ���� !�� �>�? � :5 & � ���������� �������� ������0!���� �� ���� !�� ���� �����!�� ���� �� %� ��5#67 ������%� ����� �� ��� �� �B�06#*) ���������� ����� � ����� �� �1����� �� J0� % O��� -H�0� ����� �()*+ �������� !��� �( � � &��� ��� ��� ���&�� ��� � ���� �����G�� �� ���� !�� �>�? �� ���� � ����� 6� ���� & � ����� ��3�� �% ����� H ��G�� �������� �� �� :5 �� �()*+ ����� �� ������� ��89():��

�� ������� ������

89():� �� ��� � ������ ����� ��� 2�H Q �$ &������&� �� �����0!��� ������ !�� �? ��� ����� ���&�� �()*+ !��� �( � � �� &�� :5 !��� �4-0()*+����� �� �� �������� �! ��P ����� !�� ? � %�� :���� &�����%�����3�� �� ������� ����� ��%� � ���� ��

/�0"123 ��H

����%�������� #�� �1��������� &��� ���� �� ������� ��� � �� �� ���� ������ �� ������ � � �%��� &��� ���� ������0�����

)��$ ������� ���� �����

89():� ���&� �� �����0!��� ������ �� 2�H Q �$� !���? &��� ����� ��� &�� :5 !��� �� ����0��� ��� �4-0()*+�,- ����� �� �4-0�:�-�� ����� !�� �� ���� :����&��� & ��� �� ��� ���� 6� �� �� �%��� �� ����O���;6# ��A�� &����� ������ ���1%��� ��� �� ���0������ !�� '������ �������� ����� ���0�����5#67 ������% � �I���� ��������� � ���� �� ���� & � �����0����� �% ��������� &�� ���0�������0� ;�* � �I������������ )1��������� &��� ���� ���� ������

/���� �� ������'� ��� �����

2� �A���� �! ()*+�,- �� � ���� � ����� �����% & ������� ����� ����O� ���� �! �� 5���� �� % D�?E����Q%� ��� � �! O�� �H�0� � �� � �� &��� �������3��&�� ������ ������ ���� �� ��� �������� ���� � ��� ��%&�� � �� ��HP )� �� ���� �%� !����&�� �% ���� ���� ����������� ���� �� � �$ &�� 6� �� ��!������()*+�,- !��� �( � �( 2� ��� �� &��� � ���O��� �� �$�� Q �� ���� ����� �� ���������� ����� &��� � ���6���� �����% & � �������� ��� �% �� !��� ���� �!����� ����� ��� �� �� �� $ �� �! �����0����� �%� ��� ��������� ������

"����

/�0"123 ��������� '� 453 �� � �� ��� � �� 6'���

2� ����� �� � � �����3� ()*+�,- �� ��������� ����������� � ������%� �� ��� ()*+ ���� ����� &��� ��� �0����� �% �� ��!������ �� � ����%���� $����% .�4-/����� &�� �� ����� ���� ����� ()*+�"H� ()*+�,-�

�� ()*+�,4 .�4-0()*+ �����/� -H�0� ����� ()*+�������� �� �� :5 �! �4-0()*+ ����� &��� ������0�������� ��� ����� ���0()*+ ;�* �� � �%3�� �%�B�06#*)� &��� ���� �%� ��� &��� ������ �% '�������������� !�� ()*+ .+����� �/� #� ������� � ��.�?" $B / & � �������� �� :5 !��� �4-0()*+�"H����� ��� ��� !��� �4-0()*+�,4 ����� ��� �4-0�:�-�������� # � �� �! ������ ��������% ��� ������ ��3�.�"? $B / � � ()*+�"H & � �������������� ���!��� :5 �! �4-0()*+�,- ������ '������ ����� �! �����%� ��� ��&�� ()*+0�������� � ��� �� �4-0()*+�,- �� �4-0()*+�,4 ����� ��� ��� �� �4-0()*+�"H ����4-0�:�-�� ������ 2� ()*+0�� ����� � ��� �� ��'������ ����� ���� ��� �� ����� � ���� ��� � ��&� $�� -H�0� ����� � �� �������������� ��� !��� :5�! �4-0()*+�,- ������ 2��� O������ ��������� � �&��� �� �� ������ �! ()*+�,- &��� �������� ���� ��:5� ()*+�,- ��� ���� �����% ����0������

�������6�� ���� /�0"123 ������ ��� ����������������

�� ��% �� ��!����� �4-0()*+ ���� ����� &��� � ����� &��2� �� -H�0� ��� �� ����� ��� &�� �� ���� :5 & ��������� ���� ���� !�� �������������� ���� ����� � �0��� ���0()*+ ;�*� �� ��� �� �B�06#*) ����.+����� �#/� 8�� ��� �������� �� ���� �� �! �"? $B ()*+�,- � �� !��� �4-0()*+�,- �����&��� ()*+�"H & � ���� ��� !��� �4-0()*+�"H ��������� �� ������� �� �� �������� �� ������ �! �� ���.� � ��� ��&�/� ;������������� ���� �! ()*+ !����� ���0��� ��� �4-0�:�-�� ����� ��� ��� ������ �� �%� �� �� �B�06#*) ����� 89():� &��� ��� ����� ����� :5 !��� � ����� �� ���0��� ��� �4-0()*+ ��������� .+����� �/� 2� ������ �! ����� �1����� �� :5!��� ����� ��� �4-0()*+�,- ����� & � ����� � �� � ��� :5 !��� �� ���0��� ��� �� ����� ��� �4-0�:�-�������� :5 !��� �� ���0��� ��� �4-0()*+�,- ������������ ����� �&�0!��� ����� �� �� �� ������ �!

"����� 1� 5 �� �� � �1�������� �! ()*+�,-� �� ��� �4- ���� ����� ���� ����� ()*+�"H .(�"H/� ()*+�,- .(�,-/� ()*+�,4 .(�,4/� �� ��

������ ���� .�:�-��/ &��� ��� ����� ��% � ����� &�� 2� �� -H�0� ��� .��FH :�G����/ � ��������� ����� �)1�������� � 6�����������:���������� ���� &��� �������� ��� ���� �� ���� !�� �������������� ���� ����� ���0()*+ ;�* �� �6�*0 � ����� :��� �%� ��� &���

!� ����� ��� �� ��P �B�06#*) ���� .�� ��G� ��/ ����� ���0�������� ���������� �� �� ��!����� ���� 6(B+ ����� ���� 5���� ��� &���

��������� !�� '������ �������� ����� � ���� ���0()*+ ;�*� ������%� ��� �� � ���0� ���� ;�*� �� ������ �����08�6� �� ����� & � ���� ��3��

����� ?0:@� 7 ���������� � �$��� &��� ���� �� ����� �� ��3�� �! ()*+ ��������� ()*+0� ��� &��� � �$�� &�� ���&��

��" ,( -���.��� �� � (

89():�� ����� � �� :5 !��� �� ���0��� ��� ������� ��� �4-0()*+�"H ������ 2� ����� ��� ������ �!����� ���&� �� :5 !��� ����� ��� �4-0�:�-�� .�?����������/ � ���� ��� &�� � � � �� ���� .������� �����/� � �� ��������� �� �� �A���� �! ����� �� �������!�� ���� �� %��

� �����6�� ����� /�0"123 ������� ������� ���� )��$

�4-0()*+ ���� ����� &��� � ����� &�� 2� �� -H�0� ��������� ��� &�� �� ����� �� ()*+ & � ���������0����� ��� !��� � � :5 ����� � ���� ���0()*+ ;�*.+����� -#/� 6� ���� ��� ����� �������� �� ���� �� �!����� �0��3�� !� ������ ��" $B !��� �4-0()*+�"H0��4-0()*+�,-0� �� �4-0()*+�,4 ������ 2��� !� �0����� &��� ��� �� ���� � � �� ����� ��� ()*+�"H

� �� �������� �� �� :5 �! ����� ��� �4-0()*+�"H������ 2� ��������� �� ������% �! �� �� ����0���� ���()*+� 89():� &��� ����� ��� &�� :5 !��� �� �0���0��� ��� �4-0()*+ ����� �� ������ !�� ������%� 0���� �! �������0 ���� ��� ������� $�� �� .5#67/ .+�����-/� 2� :5 !��� �� ����0��� ��� �4-0()*+�,-����� .(�,-0��/ �� !��� ����� ��� �4-0()*+�"H �����.(�"H/ ������ ��� ��� �������� ������%� ���� �! ?� �� ?? $B � ��� �� 89():�� � ���� ��� &�� :5!��� �� ����0��� ��� �4-0�:�-�� ����� .�:�-��0��/ ��!��� ����� ��� �4-0()*+�,- ����� .(�,-/� 2������ & ����� �� ��������� ������� �� ����� 2� �������� �! &� $�����05#67 � ��� �� 89():� ��� ��� &�� :5!��� �� ����0��� ��� �4-0�:�-�� ����� �� !��� ��0��� ��� �4-0()*+�,- ����� � % �� ��� �� ���������������5#67 �� 89():�� �A���� �! �����0�������

"����� 4� ���� �� �! ����0����� ()*+�,- �% �� ���� .#/ �4- �����

�1�������� ()*+�,- .(�,-/� �� ������ ���� .�:�-��/ &��� ����� ���

�� ��������� �� �%�����0��O����� ������� ��� � ����� &�� �� ��

2� �� -H�0� ��� � ��������� ����� C)1�������� � 6���������<� 2&�

������ �����%0���� ����� ���� ����� -H�0� ����� ()*+�,-� �� ��

������ ���� .�:�-��/ &��� ����� ��� �� H� ��G�� �� ��� !�� " � ���

����������� ���� .:5/ &��� ���������� �������� ��� ����� ��

�������������� ��� &�� � ���� ���0()*+ ;�*� ;����� ������1��

&��� ��� � ��� �� �B�06#*) ���� ����� ���0�������� �����������

����� ����� � ����� �� �1����� �� J0� % O��� ()*+�,- ���� ��� �%

�� ��� & � � �$�� &�� � ���&� ./ :5 !��� �� ���0��� ��� ��

����� ��� �4- ����� �1�������� ()*+�"H .(�"H/� ()*+�,- .(�,-/� ��

������ ���� .�:�-��/ &��� ���� �� 89():� �� ������� �� Q �$� ��

�� �������� �! ��P ����� !�� ? � %�� :���� &��� ��� ��%�����3�� ��

������� ����� ����%�������� )1��������� &��� ���� � �� �� ����

����� �� � � &��� � �%3�� ����� �0�����

"����� 3� 5#670������%� ���� �% �� ����0��� ��� ()*+�,- ��

�������� � ������ .#/ �4- ����� �1�������� ()*+�"H .(�"H/� ()*+�,-

.(�,-/� ()*+�,4 .(�,4/� �� ������ ���� .�:�-��/ &��� ��� ����0

� ��% � ����� &�� �� �� 2� �� -H�0� ��� .��FH :�G����/ � ���������

����� C)1�������� � 6���������<� :��� &��� & ��� &�� �����0!���

������ �� ����� ��� &�� ��� � ���� �����G�� �� ���� !�� � �

!����&�� �% ����� ��3 ���� &�� ��������� :5 &��� ���������� ���0

����� ��� ����� �� �������������� ��� &�� ���0()*+ ;�*� ;�0

���� ������1�� &��� ��� � ��� �� ��P �B�06#*) ���� �� �1�����

�� O��� ./ :5 !��� �� ����0��� ��� .��/ �� ����� ��� �4- �����

�1�������� ()*+�"H� ()*+�,-� �� �:�-�� &��� ���� �� ���&�0

������� 89():� !�� �� ���� �� ��� �� ���� & ��� &�� 6�� ��

�%��� �� �;6# ��A�� ���� ����� ����� �� �� ���� � �� ����������

:��� �%� ��� &��� !� ����� ��� �� �B�06#*) ����� �������� �����0

������ �� ��!����� ���� 6(B+ ����� ���� �� ��������� !�� ����0

���������� ����� ���������������� �� ���0�����5#67 �

�I���� ��������� 5���� ��� &��� �������� �� �������� &�� ���0

������� � ;�* � �IH�� �������� �� ��������� � ���� �� �����

/�0"123 ��F

! ����� ��� ����� �� �� ������ !��� & ���� �� ��� ��� ���� �������� �������� �% �4- ������

"� 6 ����� ����'����� ����� /�0"123 ����������� )� ���� ��� �� ����'�� �������� �������� �� �����

2� ��� ���� &���� �� � �$ �! ��������� ������% �!:5 !��� �4-0()*+�,- ����� �� ��� �� �����% ��������� 5#67 ������%� ����� ���� � � �! ���0����� &��� ��� �� �� ������ ������ �! ���&� ! �������� ��� ���� �� ������� �� �� ()*+�,-<� �������� �$ �! �������� � ������% ������ ��� ��� �% ��3%��� ������ ��� �% �� ���� �� � ()*+�,- & � ������������� �� �)2��� ������ !�� �1�������� �� �( � � .��������/ .+����� ?/� ����� � �%� ��� �1�������� �������0� �� �� � ()*+�,4 .�()*+�,4/� ()*+�,-.�()*+�,-/� ()*+�"H .�()*+�"H/ �������� ���� ����% ������ .� ��� �>?� �����������%/� �� ��������������� ���� ��� !��� �� �%� ��� .� ��� H>F/ &������ � ��� �� ��P �B�06#*) ���� ����� ������������������ �� �� ���� &�� :��� ���� ����� �� ���� !��������� ��!������ �� ���� �� '������ ��������� '����������� �! ������� ()*+�,4� ()*+�,-� �� ()*+�"H�������� .� ��� ,>��� �����������%/ �� �! ��!����� ��������.� ��� ��>�-� �����������%/ ����� ���0()*+ ;�* ����O���� �������% �! �� ()*+ ��������� ����� � �%� ������� ����� �� ����% �� ���� ��� ��� �������� �� �%� ��� ������� � �� .� �� ?/ � �� �� ()*+0�1�������������� 2� ()*+ �������� ������% �! �� ��!������������� .� ��� ��>�-/ �������� ��� �� � � �����% �!�� �������� �� ()*+ �������� �� ������3� �� �����&�� �� ��� � !�� �A������ ��������0������� �� ������0�� � ������% D�-E�

2� ���� �� �� ������% �! �� !���0����� ()*+�,-&�� ���� ()*+ ��������� 89():� &��� ��� ��� !��? � %� &�� ��!����� �()*+�"H� �()*+�,-� ���()*+�,4 ��������� �()*+�"H ������� ��0!���

����� �� �� �� ������ �! 89():� � ���� ��� &������� ��� ��� &�� �()*+�,- �� �()*+�,4 .+��0��� H/� 2� � �$ �! ��������� ������% �� ���� �! �� !���0����� �()*+�,- !��� �( � � � � ����� ��� O����������� :5 !��� �4-0()*+�,- ������ ���������� � �()*+�,- � % ������� ����0�� ��� ���� � ���������� ���1���� ��������� ������% �� �����

� ����� � ������ /�0"123 ����� ���� ��� �� ����6��� ��/�!�

������� ��&��� ��������� �! ��������� ������% �!()*+�,4 !����&��� ��� � �� &�� �� ���� D"E ��� ���� %������3� � � �� ���� ��� � �� �! ()*+�,- � % ��� ������� ��� ������%� 2� �� ���� ��� � �� ���� ��()*+ � ���� � ���� �� #�����>#� ��� D�4E &�� �� ��� ������� �� ()*+�,-� -H�0� ����� ()*+ ��������!��� ��� ����� &��� ����� ��� &�� ��� � ���� �����G���� ���� !�� � � ����� ��3�� &�� H ��G�� ���������!� ����� ��� �� ��P �B�06#*) ����� �� �������� �% ���� ����� �%� *�� �������������� ��&�� � �� ���&� � ��� !� ������ !�� � � ������� .+����� H#/� &���� � ���� !� ����� .���� ��%� �� ()*+ @0��������/���� ���� � ��" $B �� �� ���� ������� �� �� ������!� ����� . ���&� �/ � �� �%� !����� 2� ����� � ��3���! �� � ���� � ��� . ���&/ �� ���� ���� �������% &������ �! �� �������� �� ����0��� ��� ()*+ @0�����0��� ."/ ������� � � �� ���� � � ��� �� ���� �! ��� ��� ���!���� �! ()*+� ��������� ()*+�,-� 2������� !� ������ &��� �������� �% �� ����0��� ���-H�0� ����� �( � � �������� .+����� H#/ ��� ��� �%�� ����0��� ��� �4-0()*+ �������� .+����� -#/� 2��& � ���� ��% ��� ����� �� �� ���� M���% �! ��()*+ :0�������� .������ !� �����/ �� �� ���� ���! ��0������� ����� �� � �� �� � �4- ����� �� �� ��� �! ()*+ ������% &�� ��� ��� �������3� �������� �� ��()*+ :0���������

"����� 7( �������� �� �1�������� �! ()*+�,- �� �( � �( �206:� & � ���!����� �� �� � ����� �@# �� ����!% �� !��� �������� �! �� �

()*+ �� 6:� �������� &��� ������ ���� �� �:�-�� ������ � ��������� �� C)1�������� � 6���������<� 6� ����� ���� ����� ()*+�"H�

()*+�,- �� ()*+�,4 &��� �������� &�� ��; �� *����� ��� ��� ���� �� �)2 ��� ������� �� �� ��!����� ���� ��� ��������� ������

����� � �%� ��� �1�������� �� ��A����� ()*+ �������� .� ��� �>-/ �� �� ����% ������ .� �� ?/� �� ��������� ������ ���� ��� !��� ��� .� ��� H>

F/ &��� ��� � ��� �� ��P �B�06#*) ���� ����� �������� ���������� �� �� ���� &�� :��� ���� ����� ;�������� ������ &��� ���� !�� �������

��!������ �� ����� '������ ����� &��� ���!����� �� ��!����� �������� ��� �� ��P �B�06#*) ���� ����� �������� .� ��� ,>��/ �� ���0��������

���������� .� ��� ��>�-/ ����� � ���� ���0()*+ ;�* �� ?0:@� ()*+�,4 .� ��� �� H� ,� ��/ ()*+�,- .� ��� �� "� 4� ��/ ()*+�"H .� ��� -�

F� ��� �-/ ����% ������ .� �� ?/�

��, ,( -���.��� �� � (

2� ��������� ������% �! �� �� ����0��� ����()*+ �������� & � ��� �� %�� �� 89():���()*+�,- �� �()*+�,4 ��� ��� �% �� ���� ��0����� ����� �&�0!��� ����� �� �� �� ������ �!89():� � ���� ��� &�� ����� ��� �()*+�,- ���()*+�,4 .+����� H/� 2� ��������� ������% �! ���� ����0��� ��� �()*+�,- �� �()*+�,4 �����0���� � � �! �()*+�"H &�� ����� %�� �����O� ��.� � �����/ ������% �� �� �������� �� ������ �!�� ���� ��� ������

/�0"123 ������� ��������� ����� �� ������'� ��� �� ����

2� ��������� �� �������� � ������% �! ()*+�,- �� ����O�� ���� � � �� &��� �������� ���� ���� ��% &�� ��A��.6�/ �� �()*+�,- !��� �( � � �� �������� !���� $ �� �! )� �� ���� �%� .+����� "/ �� �$�� Q ���#����� ����� �������� ����� &��� �������� � ����������� ����� &�� 6�� �� �� ������ &��� �����������%��� �� ���� � ���� ��� &�� ���� �������� &��

�()*+�,- .(�,-/ �� �� O�� ��� ��� 5�������� ���� ������ �! �� ����� ����� �� �� ()*+�,-0������������� &��� ���������� �� &�� �� ������ �!�()*+�,- �������� ��������� ��� � � � ���� ������ ������� � �$���� .(�,-� ������ ����/ &����������� � ����� &��� ���� ������� & � �������� ����� ��� &�� �� �� ���� ����� .(�,-� ����� ����/&�� �������� ������ ������� ������� 2��� O������������� � � �� !���0����� ()*+�,- � % �1��������� �����% ������% �� ��� ���� �� �� ������ �!��3%� ��� ��� � �� �� �� ��� ���� ���

#�����

()*+ �� �%������0��� ���������� ������� &�� ��1$��&� ������� � ������� �� �� �� ��������� !��� ����� ���� �������� �! ������ ���� > ()*+����()*+�?H� ()*+�"H� ()*+�,-� ()*+�,4� ��()*+��" > &��� � � ������� ���� ��� ���� �?H��"H� �,-� �,4� �� ��" ���� ����� �����������% D�?>�FE�;� ���� ������� �������� ���� ()*+��� �� ()*+�"H ��� � �� �� ���� ���� �� � ���� ��� &��()*+�,- �� ()*+�,4 D�H� �FE� ()*+�?H � ����������O�� ���% �� ���� �� ����� ���� ����� D�"E� &���()*+��" ��@# � ���� ��&� ���% �� �� � !�� ������ �B@# ���� �% D�?E�

()*+ �� ���� ��% �1������� �� � ����� ������� ��0������� �� � ��� �� ��� ������ $����%� ������� �� ����� �� ��� �� �� ����� �� ������ %��1� �� ������ D4���� �F� �?>�"E� '��� ����%��� ()*+ �1�������� ������� 0������� ����� D�FE� &� ���������� ����� ������� �������� �! �� � ()*+ &��� ���������� �������� & ����� ����� &�� ()*+�,-� 2� ���������� �������� �!()*+�,- ���� ��� � �,0�� �������� �� �1�� "#� �����0�������� �� �� ��1 ���� ���� .2%�>�%�>���>2��>���>( �/ ��� ��� ������ ���% ������ � �! �� �1�� F0������� �������� !���� �� ()*+�,4� 5��� �������%���� ������� ��&�� � � ()*+�,- �� ��� �������� & � ��� �1������� �� ���� � �� �� � ������� !��� � �������� ����� ���� �� ��� D�FE� 2� �A���� �! %��1� &��� ��� ������ �� �� �1�������� �! ()*+�,- ������� � ��� � ����� �� ���� D�FE �� ��&�� � � %��1������������ �������� ����� ��� ()*+�,- �1��������

"����� 8( ( ���� � ����� �����% ������� �% ()*+�,- �� ���� #��� ��

&��� �������3�� �� �������� ���� � ��� ��% &�� � �� ��HP )� ��

���� �%�� #!��� -� ��� ������ ���� ����� ��� �� �������� ������

���� ���� � ���������� �! H �� �� �� �()*+�,- !��� �( � � .(�,-/

�� 6� ���� ���� �� � �$� #!��� ����� -� ���� � � ��� � & �

�������� &�� �������� �! ������ ���� �� �$�� Q �� ���� ����� ��

��������� ����� &��� � ��� �� ����� ����� &��� ������ ����

6���� �����% & � �������� ��� �% �� $ �� �! �����0����� ���� �%�

� �� ��������� ����� ��������� �� �� ����� � �$����

"����� 9( 6� ���� ��� � �� �! ()*+�,-� .#/ �������� �� �� �

()*+�"H .(�"H/� ()*+�,- .(�,-/� �� ()*+�,4 .(�,4/ �1�������

�� ��� ����� &��� ���&� �� ��������� �� �%�����0��O����� ������

�� � ����� &�� �� �� 2� �� -H�0� ��� .��FH :�G����/ !����&���

��������� &�� � �5 ;62* �� �� �������� �! ��� ��G�� ��! �������-H�0� ����� ()*+ �������� &��� ���� ���� ��!����� �� ����� ��

����� ��� &�� ��� � ���� �����G�� �� ���� !�� � � ��� � ��� ��

��P �B�06#*) ����� �� �1����� �� O��� 6� ����0��� ��� -H�0

� ����� ()*+ !� ������ &��� � �$�� &�� ���& �� ���&� �� ./

()*+ ��������� �� �� �������� �� ������ �! �� ����� &��� ����� ���

&�� �������� �� ���� �� 89():� �� �� �������� �! ��P ����� ��

������� �� Q �$� !�� ? � %�� :���� &��� ��� ��%�����3�� �� �������

����� ����%�������� )1��������� &��� ���� � �� �� ���� �����

�� � � &��� � �%3�� ����� �0�����

/�0"123 ��4

����� � �� � � �������� !�� ���� ���!���� �! ()*+ D�"��,E� ;� ��� ����%� &� !����� � � �����3�� ()*+�,- �� ���������� ��� �������� � ������% �% �1���������� � ()*+�,- �� �( � � .�()*+�,-/ �� �� �� �����%���� $����% �4- ����� .�4-0()*+�,-/�

=�� ����% ��&�� � � ()*+�,- & � �������� ���% ����0 ������ ������� � � & � �������� � ��& ������ ���� ������ ��� ��� ��� �1���� ��������� ������% ���������� � ����� ������ ���� ��� �% �� ��� �� ��� ��� �%�� ����� #����� ��� � �$ �! ������% ���� �� ��� ���� �� �� ������ �! ()*+�,- ���� ��� ���� �� :5 �!�� ()*+�,-0�� ��!����� �4- ������ �� ����� � � �$ �! ������% �! ��!����� �()*+�,- �������� !��� �( � ���������� � � �� !���0����� ()*+�,- � �$�� ����0����� ������%� 2� ��������� �! �������� � ������% �!()*+�,- �% �� ����0��� � �� & � ����O�� �� ����1�������� �%������ #���� ���� �! ()*+�,- �% �� ����0��� � �� � � ����� �������� ������� ��&��� ����� ��0 ������ ���&� ! ����� � % ������� �������%������ � �� �1�� ������ ��% �% C������ ���< .�� �������� ���� ������� �� �������/ �� �A��� ���� ���� �� ��������� �� ���� ���� �������� � ������% D�� �� �4E�5�� ���������� ��� �� �!��� ��������� �&����� ��������� ���� ��� � ���$�� �� �� �� ����� � % �������������� �! ���� �� ���&� ! ������ +�� �1 ����� � ���1��� ���������� ��0- .5560-/ � � ��� �� �� ���0����0��� ������� � ���&� ! ����0��$� ���&� ! ���� .80)*+/ �� �� ��1� ����� �� ������ �� ������� ������� �� �� �� ��!��� 80)*+ !��� ��1� ����� �� � � ����� ���&� ! ���� D�4E� 8�� ���%�� ���&� ! ����G�� ���� ! ���� �� �������� � � �� ����� ���������� ���!����&��� ���$�� �� ��� � ��� �� �� ��!����� ���� �������� ��% ����� ���&� ! ���� D-�E� ����� ��%�()*+�,4 �1����� ��������� ������% !����&��� ���� ���% ���$�� �� !��� ���� ���! ��0������� ����� DHE� =��O����� �! ������ ���� �! ��������� ������% �! ������0�� � ����� �% ()*+�,- �� ���� ���!���� �! ()*+!����&��� �� ���� ��� � �� !����� ��� ���� �� ���� �!������� �� ������� �� ���� �������� � ��������� ��� � ()*+0���� ��� ������������

;� ��� ����%� &� ��&�� � � �� �� ������ �!()*+�,- &��� �������� �% ()*+�,-0�� ��!����� �4-����� ���� �� :5� ��� �� �� D-�E �������� ! � �����O� �� ����� �! ()*+�,- �� �� :5 �! ()*+�,-0�� ��0!����� :=� ������ 2� �� ���� ���� ���% ���&��� ����O������ �� ���� ������ ��� ��� �� ��������� �� ����A������ �� ���� ����� �� �1�������� �%����� ���� �� ���&� �������� 6������� �% ������� �� ��� � ��� ���%����� �� � � &� � � ����� �� �����O� ���% �� �������! ()*+�,- ���� ��� �� �� :5 �! �4- ����� &�� &� ����������� �� ������� � �1�������� �%������ '������ �� ������ �� �����O� �� ������ �! ()*+�,- �� ��� ��% �������� �% ()*+�,- �1�������� ������ �������% ��� ��% ��&�� � � ������% ���� ������ �!()*+�,- &��� ���� ��� ���� �� ������ � ���� ���&�� ()*+�,4� 2��� ����� ���������� &��� C������ 0���< � � ��� �! ���� ���� ()*+ �� �� ����� �� ������()*+�,- � % ����� � ������ �� !������� �� �� ������ �! ������� ()*+�,4�

'��� ����� ��� �()*+�,- !��� �( � � ��� ��������� �� �� �����!�� ���� �! �������� �������� � �������� �������� ����� ��� ����� �����% �! ����� ������� ������ � � ��� 6������� �% ������� �� ��� � ��� ���% �����& � � :5 !��� �4- ����� �1�������� �������� �� ������� �0()*+�,- �������� ������� �������� � �0��� � ����� �����%� ����� � O������ �! ����� �����%0�� ����� ������% �% ()*+�,4 �� ���� ���������%�������� D�?E� ����� ��� ()*+�,- �� ()*+�,4����� % ����� �����%0�� ����� ������% ��� ��� ����0����� ������%� ������ ���� ��� �% �� ��� �� ��� ��� �%��3%���� �� ����� ��� ��� ������ �! ()*+�,- ������ ��� ���� �� ������ � ���� ��� &�� ()*+�,4�()*+�,- � % �� % ������ ���� �� ���� �� ����������� � �����3�� �% ����� ��� � ���� � ����� �����% &��0��� � ���� � �����!�� ����� ��� � � � �������� ��� �$������ �� ����� ������� �% D-�� --E �� �� �������� ��� �! �� �%� D-?E�

=�� ����%� ��&��� �� !���0����� �()*+�,- ������� �1���� ��������� ������% �� ���� ������ ��� ��� �%�� ���� �� ���� ��� �% �� ���� � � ����� ��������������� �! � �$ �! ��������� ������% �! ����0�����()*+� ��� � ()*+�,4 DHE� 2�� �� �� ����� �� ���� ��������� ������% �! �1�� ������ � � ���10�����()*+�,4 D��E �� �� ��� ��������� ������% �� ��� &�������1������� �� ������� ������� D-HE �� �� ����� �����D-"E� ;� ����� �� ������ ��� � � ()*+�,- �� ()*+�,4���� ����� ���!��� ���� � � �� �������� ��% �����&��� ����� �� �� ���� ���! �� �� ������� �� ���1�� ������ � � ���1� :���0����� �� � ���10�����()*+�,- �� ()*+�,4 ����� ����!���� !���������� ��% ��� ��1� ����� ��� ����� �� ������ �� �������!�� ���� �! �� ���� �������� 2� �����1�������� �!()*+�,4 �� ������ �� ��������������� ���� ���0����� �����!�� ���� �! �� ��� � � ���� ���� &�� ����������������� �! �� ����� � ���� ������� D-"E ����������&�� ��� %�������� #������� � ������� �� ��& ���������� �� ��������� �� ��1� ����� ������% �! ����0����� �� � ���10����� ()*+�,- �� ��0������� �%�0�����

=�� ����% ��&��� �� ���� �� �! ()*+�,- �%�� ��� � � ����� �������� ������� �! �� ���� �� �!��� ����� ()*+ !��� ���� ���! ��0 �� � ���10������������ DH� "� ��E� ;� ������� �� �� ���� �! ������� ��������� �% �������%���� �� ����� ������ �! ()*+!��� ���� ���! ��0 �� � ���10������� ����� �% �� ��� ���� � � ���! �� � % ���������� �� �� ����� ���� �! ���������� � ������% �! ()*+� ()*+ ��������� ������ ��%()*+�,4� ��� � �� �� �� M���% !�� �� ���0 ���� � � ���! ��0���� ����� ��������%� �� �� �� �1�� 0������ � � ���1 DH� ��E �� �� ���� ���! ��� DH� "� �HE�#����� ����� �� �� D-FE �������� � �� ����� � �!�� ���0���� ����� ��������� "�>F� $B ����0���! �� ��0������� ��������0������� �������� .:��06/ ���� ���� �� M���% ������� �! ()*+ �� ���� ���! ���� ����� ���� ���� ������� �� ��� �� �� � � ���! ��������� �� ���� �� �! ()*+ !��� ���� ���! ��0������������ D"� -FE� '��� ��� O����� � � ���% ���� ���� ���������� �� �� M���% �! ()*+ �� �� ��� �������

��� ,( -���.��� �� � (

������ ��� ����� ������ �� � � �� ��� �������� �%�� ���0���� ����� ������ ��� � � �� ������ � % ���0���� �� ���� �� �� �������� � ������% �! ()*+� ��� � ����� ��� � ���� � ����� �����%�

:�� ��%� ������� � ������� �� ������ �� !������������� �� �� � � ���������� �� !�������� �!()*+�,-� ������ ��% �� ���� ����� &�� ()*+�,4�#� �� ������� ����� ()*+�,- �� ()*+�,4 ��� � ��� �� ����� � � � ���������� &�� ���% ���� �,0����A������ ���&��� �� �&� ���!����� 8�&����� ����� ��,0�� ��A������ �� �� ������� � !���� �! �� �� M���% ����� ���&� ! ���� �������� ��$# � ������&� �� ����� �� ��$# �1��������� &����% �� �,0���������� �� �� �1�� ������ � ��� �� ������� ��� �1����0���� �� !������� �� ���0������ � ������� D-,E� 6�� ���()*+�,- �� ()*+�,4� �� � ��� ���� ���! ��0 ���1�� ������ � � ���10����� ���!���� �! ()*+� � % �� ����� � ��A������� �� �1�������� � ������ �� ��A��0��� ������� ����� � ����� ����������� 5�������� ������� �1�� "0 �� �1�� F0������� ��������� �� ��� ���1%������ � ������ �! ()*+ �� ���� ������ ����� ��� !�������� D�?>��E� &� ��� %������3� � � �� �,��0�������� �� �� �1�� "#0������� �������� ��()*+�,- ����� ������ �� � � ���������� �� �������� � ��������� ������ �� ()*+�,-� 2��� � � ���������� � %������ !��� ���!��� ���� � �A��� ��� �� �� ���������! �� �1�� "#0������� ��� �� �� �� �A���� �!�������%��� ��� � �� �� ������ ��� �������� � ������%� +���1 ����� �� �������� �! �1�� "#0������� �������� ��()*+�,4 � ���� ��������� �� ������ ���!��� 0���� � � ��� �� ��� ������� � ���������� �1������ ��� ���� ��Q����� ��� �� ������� �� ��� �������� �� ����� ���&� ��������� ������% D�"E� #����� �� ������������ �� �1�� "#� �� ()*+�,- ��� �� �� ������ ������������ ������%� ��� �A���� �� ��������0������� ��� ���� �� ��� ������� #� �� �� �A���� �! ���$�� �� ��()*+�,-� ������� � ������� �� ��� ������ �� �����0���� &���� �� ������ �! �1�� "#�� �� � ���� �����$�� �� ��� � �� ���� DHE� &���� ������� ��� � �� �!()*+�,- �% ���$�� ��� 2� ���� �! ���� C������ ���< ���� ��������� �! ��������� ������% �! ()*+�,- ������ ��� �� �� �������� ����

��$����� ����

2�� &��$ & � ��������� �% �� ��0��0 �� !��� ��#����� � 8� �� #����� ���� @ ���� � #M�� �� ��!��� @ ���� � )%� ;�������� *� �� )N��F""� '� � �$B� � &����� = $!��� !�� �� ������ � ��� �� ������ � ���� �! O����� �� B�� 5�� �� 6 %�� �� )�=�� !�� ������ � �� ���� �! �� � ���������

"�������

�� 6����� ��� �� �$ ��� ����% 6 �� �� #� ������� � ���� !��

������� �� ������� �� � �� �� � ������������ ������� �44,

�,�I ��,�>?�

�� 8����� @5� 7 �� � )8� 2����� #�� 5���� �� ������� �����0

� ���� ����� � �44F -��I �"H>F4�

-� '�� :� 5��3����� 55� *����& �� ;� �960�F� !������'�����

� ����� #B#5 ������� ��� ��� �� ������ � 7�3� �� �� �� ���

���� �� ���0��G@��� ���� ������ B���������� �44F ��?I ?FH4>

"F�

?� 6 � B� ����� *5� 7�3� �� � �������� �������%��� ���������� �!

���� �� ���� ��� � ��� � ��������� ������ ������ � ��

������� �� ������������� :��� �44F 4�I �F�>,��

H� 6����� �� 5��� +� ��� ������ � �� �� )1�� ������ � ��� � �� �! ��

� ���� � �������� � ���&� ! ���� �,40 ���� ��� !��� �%

���$�� �� �� �������� !�� ��� ��������� �A���� � ��� :�� �44F

�F�I �--4�>"�

"� 8���$ 7#� ����� B'� ��&� �� #5 �� �� B� � ����� ���� �!

� ���� � �������� � ���&� ! ���� ��� � �� �����% �% ������� ��

�������%��� ��� ������ � ��� :�� �44� �"FI �"�-�>F�

F� :������% B� 8������ � B� @����� � �� �� 2���� � ���� �

����� �����% ! ���� ������ ��� �������� � ���� ���&� �� ����0

�������� � :��� ;����� �4,4 ,?I �?F�>,�

,� ����� B� : �� ��� *� 7� �� ' �� �� ( ���� � �������� �

���&� ! ���� �� �������� ��������� �������� ������� �4,4 �?"I

�-�">4�

4� 6����� )#� #���% ��� +���% )B �� �� ( ���� � �������� � ���&�

! ����G� ���� � ����� �����% ! ���� �1�������� �� ����� �����

�! ����� � ���� ���� ��3 ����� 6��� @ �� #� � ��� 9�# �44H 4�I

4�H>4�

��� =3 $� 8� 8 % �� 8� (������ �# �� �� ;��� ����� � ���� ����

���� �� �! ()*+ � ���� ����� � ���� ���� ��3 ���� �� � ����� ��

��� $��&� �! �� ����� ����� � � ����� �� � ����� �� ���� ����

)1� )%� ��� �44F "?I H�H>�F�

��� 6� �� 7� ����� *� '��� 8� ��� � '� ( ���� � �������� � ���&�

! ���� �� ������� � ����� ����������� ! ���� �� �� � ����� �

�� ���( @ ���� �44� -H4I ,?H>,�

��� :������% B2� ( ���� � ����� �����% ! ����I # ������ ����� ��� �!

����� ������ !�������� � :��� ����� �44� ?FI ��4>�-�

�-� ������ B�� * ��� ��� B��� $ #5 �� �� 2���� ����� �������

� ���� � ����� �����% ! ���� � � �������� ������ ���� �! ������

Q���� ������� �4,- ��4I 4,->H�

�?� 8���$ 7#� +��� � @� '���� � �� �� 2� � ���� � �������� �

���&� ! ���� ! ���%I ;�����O� ���� �! !���� ������� � �������

�� � � �����3 ���� �! ����� ���� �������� �! �@#� 5�� )���

�44� HI �,�">�?�

�H� +��� � @� 8���$ 7#� � $�� � � �� �� 2� � ���� � ������0

�� � ���&� ! ���� ! ���% �! ���%��������� � :��� ����� �44� ?FI

���>,�

�"� 6����� $ R� :��� 2� ��� � � �� �� ()*+ �?H� ��������

� ���� � �������� � ���&� ! ���� ���!��� � � ����� �� �1�� ���0

��� � � ���1� � ��� :�� �44F �F�I F�H�>,�

�F� �������� �� J�� N� #� �& � @� ����� ��� 8�� � 5�S ���� �����

�1����� ()*+�,-� ����� ������� � �� �� �! � ���� � �������� �

���&� ! ����� ;����� =�� ���� (�� ��� �444 ?�I FH�>4�

�,� ���� +� =���� @� *���3�� 6) �� �� :��� ���� �� �! ��� �����

O����� �� ���&� ! ���� �% �1�� "0������� �������� �! � ���� �

�������� � ���&� ! ����� � ��� :�� �44F �F�I �?��->4�

�4� 7�%� #� ���� � �2� @��%�� 8( �� �� 2� � ���1%0������ �

��� �� .���>�"H/ �! � ���� � �������� � ���&� ! ���� �� ������ �

!�� ��� ��������� ������%� � ��� :�� �44" �F�I FF,,>4H�

��� ��$�� �� +����� 8� @��!��� *� 7� ������ 5� : � �����3 ���� �!

����� � ���� � �������� � ���&� ! ���� .()*+/ ��������� ��

����� ����� � � ���� ()*+�"H �� ��� �1��F0������� ��� ���

� ��� :�� �44" �F�I HF"�>F�

��� ��$�� �� 2 $ ��� �� 5� � 8T �� �� @���������0� �� �1�������

�% �������� � �� ����� ����� � � ���!���0�����O� �������� !��

� ���� � �������� � ���&� ! ����� :��� �44, 4�I F-H>?H�

��� 6 �$ �)� 7����� *0#� +��� � @� 2� � ���� � �������� � ���&�

! ���� .()*+/ ���!����I B�A������ � ���������� ���� �� ������0

���� � �1�� ������ � � ���1 �� ��� ������% �! �1�� ������ � � ���10

����� ()*+� 5�� ��� :��� �44- ?I �-�F>�"�

�-� 6������ #�*� ������ @8� � � #���� 5: �� �� :�� ����

������3 ���� �! � ���� � ����� �����% ! ����G� ���� � �������� �

/�0"123 ���

���&� ! ���� �� ������� � !�� ��� �������� � ������%� � ��� :��

�44? �"4I -�,F4>,H�

�?� ����� �� ;��� #� #��� 2 �� �� B���������� �! ����� � � ���� ���� ��

���� ��� �% %��1� 0������� � ���� � �������� � ���&� ! ����

.()*+/ �1�������� �% �������� � � @������� �44H �HI ?F-,>

?F�

�H� ��� B2� *����� #� 5����� �' �� �� :������ �� ��@#

�1�������� �! � ���� � �������� � ���&� ! ���� �� �������

����� � �! � � � ! ������ ���� ;����� =�� ���� (�� ��� �44"

-FI �--?>?��

�"� 5�����$� #� ��� 2� � ���� �� : �� �� 8%��1�� ������ ���� �!

� ���� � �������� � ���&� ! ���� �1�������� �� ���� �� �� ���(

� � ;����� �44? F�I -F?>4�

�F� �������� �� ������ � � � � � J �� �� ( ���� � �������� � ���&�

! ���� �� ����� ��� !����&��� ����� �% ��������� �� �� ��� � ���

5�� :��� ����� ���� ��?I �->-��

�,� #����� �6� @������ �5� 7�%� # �� �� 8%��1�� ����� ���� �!

� ���� � �������� � ���&� ! ���� �� ����� � ������ #�� =�� �0

��� �44H ��-I �H-,>??�

�4� ��3�$� 5� � � *� 5���� 5# �� �� 5 ���1 5�� ���������� ��0-

���� ��� ����� �� ���0������� )*+0��$� ���&� ! ���� �% ��� �0

�� � �����O� ��1� ����� �� ����� � ��� :�� �44F �F�I

-�F-�>F�

-�� @ ����� �� 2 � ����� �� (��� ) �� �� )1�� ������ � �������%���

��� � �� �% ���$�� �� �� �������� !�� ���� ���� �! �� ���%��

���&� ! ����G�� ���� ! ����� )5= � �44� ��I ?,�H>--�

-�� ��� �� �� �� #� 6�� B� ;�����O� ���� �� � � �����3 ���� �! ��&

�������� � �� �� �! � ���� � �������� � ���&� ! ����I ()*+�,-�

����� ���%� #�� �44, �??-I ?��>"�

-�� #����� ��� :�A� � �B� ������� 5: �� �� : ���� �% �����0

�����% �� ����� Q�& �� �$���� � ������ �! � ������ &�� �� �����

�������� �� ������� ����� ������ @ )��� � 5�� �4F� �,"I ?H?>"��

--� :�� 0( 3 �*� *� % ��� R����� �: �� �� : � �����3 ���� �! ��

� ��% �� ��� �! �� ����� ������� �% �% �������� Q������������%�

B� ����� �4,H -?I H?>4�

-?� �������� �� �=� � � 8������� ('5� ���� �! � ���� �

����� �����% ! ����G� ���� � �������� � ���&� ! ���� �� �%�

���� ��� � � =�� ���� �44F ,�I H��>���

-H� 2 $���� �� 2������ N� :��M� � 2 �� �� *��� �� ��!�� �!

� $�� B@# �������� !�� ���� ���!���� �! � ���� � �������� �

���&� ! ���� ������ ��� ���� ��� � ����������� �� ���( � � ;�����

�44" FHI ?,F>H���

-"� *�������� �� 5 �� � ��� 8��$�% � �� �� ;��!���� �! � ���� �

�������� � ���&� ! ���� �� �� ������� �� ! ���� �� ������� ��

�1� �� ����� � ���� ����� 5�� :��� ��� ���� ��I F�,�>4��

-F� ����� :� 7�� 50B� :�����% B2 �� �� ;�����O� ����� ����O0

� ����� �� � � �����3 ���� �! ����0���! �� ��������� ��������0

������� �������� !��� �� � �708�� ����� �� ������ �����

�� �� ����� ���� � ��� :�� �44H �F�I �,�F>�"�

-,� �$�� 6#� �����08���� :� *���� )5 �� �� 2�����0�����O�

����� ���� �������� ����� ��� �&� ���!���� �! �� ��$# ���������

� ��� :�� �44- �",I �H�H�>F�

��� ,( -���.��� �� � (