Prof. Dr. Júlio César Borges

Eduardo Nazaré

Felipe Gonçalves

Renato Capelo

Introdução

Método de Sanger

Pirosequenciamento

Ion Torrent

Aplicações

Desde a descoberta da dupla fita de DNA surgiram diversas ciências, entre elas a genética e a biologia molecular.

Os estudos surgiram com o objetivo de conhecer o funcionamento de uma célula ou organismo, além de conhecer possíveis doenças e tentar encontrar a cura.

Para que isso fosse possível foram descobertos várias técnicas, entre elas o sequenciamento do genético, afim de descobrir a sequência das bases nitrogenadas do DNA.

O primeiro método de sequenciamento de DNA surgiu em meados dos anos 70 e ficou conhecido como método químico ou Maxam – Gilbert, método no qual foi amplamente aplicável na época.

Alguns anos depois, em 1977, Frederick Sanger propõe um método diferente e mais eficiente chamado de método enzimático ou de Sanger. Esse método logo se tornou altamente replicável e é utilizado até os dias de hoje.

Frederick Sanger nasceu em 1918 e faleceu em 2013 aos 95 anos em Cambridge, onde era pesquisador no laboratório de biologia molecular da Universidade de Cambridge.

Ganhador de 2 prêmios Nobel.

1977: Sanger desenvolve seu método de sequenciamento de DNA.

A partir daí sequencias com até 96% de similaridade puderam ser diferenciadas.

O DNA é formado por duas fitas antiparalelas de nucleotídeos complementares formando uma dupla hélice.

Sanger descobriu que se conseguisse interromper a replicação de um mesmo DNA em pontos diferentes ele poderia juntar essas fitas menores e formar a sequência completa do DNA.

O método consiste em adicionar didesoxiribonucleotídeos (ddNTP’s), que são nucleotídeos modificados que não possuem o grupo OH livre no carbono 3’ da pentose.

Existem quatro tipos de ddNTP’s, um para cada base nitrogenada (A,T,G,C).

Quando os ddNTP’s tentam se ligar com a fita de DNA, com a ausência do OH, o próximo nucleotídeo não têm onde se ligar e a replicação para.

Assim é possível obter fitas do mesmo DNA com número de resíduos diferentes.

A reação é realizada em 4 tubos de ensaio.

Cada tudo contêm:

DNA;

DNA polimerase;

Primer;

Nucleotídeos;

E um tipo de ddNTP diferente.

Após isso ocorre a replicação em todos os tubos.

Dentro de cada tubo a replicação acontece e termina em lugares diferentes.

No final do processo temos fragmentos da fita de DNA de diferentes tamanhos.

O conteúdo desses tubos é aplicado em gel de poliacrilamida e separado por tamanho (eletroforese).

Os fragmentos menores ficaram mais em baixo e os maiores mais em cima.

Para obter a sequência do DNA, a leitura é feita de baixo para cima, resultando em fragmentos que se sobrepõem, e formam a fita completa de DNA.

Proposto por Mostafa Ronaghi (1996);

Instituto Real Tecnológico da Suécia;

Pesquisador na Universidade de Stanford;

Vice-presidente da Illumina Company;

Primeira alternativa ao método de Sanger para sequenciamento do DNA.

Detecção através da Luz;

Liberação de Pirofosfato na adição de um nucleotídeo;

Ação de 4 diferentes enzimas:

DNA polimerase;

ATP sulfurilase;

Luciferase;

Apirase;

Substratos utilizados:

Adenosina 5’ fosfossulfato (APS);

Luciferina;

Resultados obtidos rapidamente.

Passo 1

Extração do DNA.

Passo 2

Adição do Desoxirribonucleotídeo Trifosfato (dNTP);

DNA polimerase catalisa a incorporação do dNTP na fita;

Complementar à fita molde;

Liberação de pirofosfato (PPi);

Quantidade equivalente à de nucleotídeos incorporados.

Passo 3

ATP sulfurilase converte PPi para ATP;

Presença de adenosina 5’fosfossulfato (APS);

Conversão de luciferina em oxiluciferina (pela luciferase);

Luz visível;

Proporcional à quantidade de ATP;

Detcção é feita por um chip ;

Gera um pico na saída de dados do software;

Cada pico (sinal de luz) é proporcional ao número de nucleotídeos.

Passo 4

Apirase degrada nucleotídeos não incorporados e ATP;

Após degradar, mais nucleotídeos são adicionados.

Passo 5

Adição de dNTP é realizada sequencialmente;

Cadeia complementar de DNA é construída;

Sequência nucleotídica é determinada a partir dos picos.

• Identificação de bactérias;

• Tipagem fúngica e viral;

• Detectar mutações;

• Análises de metilação do DNA;

• Sequências múltiplas;

• Verificações de clones;

• Sequenciamento do genoma humano.

Vantagens:

Processo automatizado

Tempo de análise curta;

Resposta instantânea do sequenciamento;

Alto rendimento;

Preparo rápido da amostra;

Desvantagens:

Custo elevado;

Grande conhecimento de bioinformática;

Taxa de erro considerada alta (0,0098)

Sequenciamento de DNA da nova

geração;

Pesquisadores de Connecticut, USA;

Pretendem democratizar o

sequenciamento

Desejam chegar em US$ 1000;

Necessidade de remoção do sinalisador

Parecido com o pirosequenciamento;

Utiliza microchip para deterctar a incorporação do dNTP;

Chip mede a diferença de pH;

Evolução acompanha informática;

DNA é fragmentado;

Adição de marcadores;

Cada fragmento liga-se a um “bead”;

“Beads” são posicionados em poços;

Ocorre replicação do fragmento;

Cobre o “bead”;

Poços individuais;

Banho de dNTP;

Caso dNTP ligue-se, libera H+;

Variação do pH detectada pelo chip;

Análises rápidas ~2h; Elevada sensibilidade;

Ideal para DNA pequeno a médio; Baixo custo;

Localiza prontamente sítios específicos no DNA;

Altamente recomendado para avaliação de fragmentos específicos;

Biologia molecular Sequenciamento é utilizado no estudo de

genes e quais proteínas codificam;

Assim, o que levam trocas nos genes?

Biologia evolutiva O sequenciamento do DNA é útil para

entender como diferentes organismos estão relacionados;

Medicina Pacientes podem saber se apresentam

doenças genéticas;

Ciência forense Identificação;

Teste de paternidade;

Obrigado.