平成 23 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究Ⅱ

論文題目

大腸菌の細胞内 pH 及び Na+濃度調節に関与する

遺伝子の機能的スクリーニング法の検討

Functional screening of genes for the regulation of

cellular pH and Na+ concentration in Escherichia coli .

微生物学研究室 6 年

06P089 柳 静香

（指導教員：山口 利男）

要 旨

ほとんどの細胞生物は、極端な外界の変動に関わらず細胞内の環境を一定に保つ機構

を備えていることが知られている。細菌のアルカリ耐性においては cation/H+ antiporterが

重要な役割を果たすことが知られており、現在最も研究が進んでいる大腸菌では Na+/H+

antiporter として nhaA、nhaB 、及び Na+(K+,Ca2+)/H+ antiporterの chaA がアルカリ耐性及び塩耐性に主要な役割を果たすことが明らかとなっている。一方で、nhaA、nhaB、chaAの 3つの cation/H+ antiporterを欠損させた株は、Na+濃度の低い環境であればpH 9.0でも生育が可能であることから、大腸菌のアルカリ耐性には他の遺伝子産物も関与

している可能性が高いと考えられる。

本研究では、大腸菌の単一遺伝子破壊株ライブラリー（Keio colection）を用い、細菌の

アルカリおよび Na+耐性について、これまでの解析法では見出されなかった新規の機構を見

出すことを目的とし、網羅的スクリーニング法の確立を行った。培養時間や培養 pHなどのス

クリーニング条件を模索した結果、まずグリセロールストックから LBKagarに各菌株を移し

て一晩培養した後、96 well プレートに分注した LBK100 pH 7.0を用いて 24時間前培養

し、次に LBK200（pH 7.0および pH 9.0）と LBNa200（pH 7.0および pH 9.0）を用いて

24時間培養して OD660を測定することとした。

スクリーニングの結果、「アルカリ耐性に関与している可能性が高い遺伝子」40種、「アル

カリ条件下での Na+耐性に関与している可能性が高い遺伝子」58種、「Na+耐性に関与す

る可能性の高い遺伝子」4種を検出した。興味深いことにアルカリ耐性に関与していると考え

られる遺伝子の中には、同一の生合成経路に関与すると考えられるものが複数見られ、例

えば芳香族アミノ酸生合成の基質となるコリスミ酸生合成に関与する aro遺伝子、コリスミ酸を原料とするエンテロバクチンの生合成経路に含まれる ent遺伝子などがそれぞれ複数検出された。このことからコリスミ酸、エンテロバクチンの生合成、鉄輸送などがアルカリ耐性に

関与する可能性は極めて高いと考えられる。現段階では全株のスクリーニングが終わった訳

ではないが、興味深いことにH+の取り込みやNa+の排出に関与する遺伝子はほとんど検出

されず、むしろ化合物の代謝に関与する遺伝子、および鉄の輸送に関与する遺伝子が多く

検出されていた。ただし、今回見出された経路がどのような分子機構でアルカリ耐性や Na+

耐性に寄与するのかについては今後のさらなる解析が必要であろう。

キーワード

1．nhaA 2．nhaB 3．chaA 4．アルカリ耐性 5．Na+耐性 6．aro遺伝子 7．ent遺伝子 8．Keio collection 9．大腸菌 10．エンテロバクチン 11．コリスミン酸 12．鞭毛

13．鉄の輸送 14．flg遺伝子 15．flh遺伝子 16．嫌気的培養 17．好気的培養

目 次

1. はじめに ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 1

2. 実験方法 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 2

3. 結果 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 4

4. 考察 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 19

謝 辞 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 22

引用文献 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 23

Table 9. スクリーニングの結果（差が出たもの） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 24

Table10. 各遺伝子の機能（差が出たもの） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 53

1

1. はじめに

ほとんどの細胞生物は、極端な外界の変動に関わらず細胞内の環境を一定に保つ

機構を備えていることが知られている。特に細胞膜は外界との唯一の仕切りとなる

ことから、細胞内への影響を最低限に押さえるための機構を多数有している。これ

までに多くの生物の細胞膜において様々な輸送体が同定されており、また個々の輸

送体の詳細な機能解析の積み重ねにより、細胞が多様な輸送体を駆使していかに細

胞内環境を制御しているかが明らかとなりつつある。

細菌のアルカリ耐性においては、cation/H+ antiporterが重要な役割を果たすこ

とが知られている。cation/H+ antiporterは全ての生物に存在する膜タンパク質で

あり、細胞内外の cationと H+を交換することにより細胞内の pHを一定に保つ役

割を果たしている。大腸菌で最初に発見されたNa+/H+ antiporterである nhaAは、アルカリ条件下において細胞内の Na+と細胞外の H+を交換することにより細胞内

の過度のアルカリ化を防ぐことが知られている（1）。また、nhaAは Na+の排泄を媒介するため、Na+耐性にも重要な役割を果たしている（2）。大腸菌には他の

Na+/H+ antiporterとして nhaB（3）、及び Na+(K+,Ca2+)/H+ antiporterの chaA（4）が存在することが知られており、アルカリ耐性及び塩耐性に主要な役割を果たすこ

とが明らかとなっている。しかしながら、nhaA、nhaB、chaAの 3つの Cation/H+ antiporterを欠損させた株は、Na+濃度の低い環境であれば pH 9.0でも生育が可

能であることから（5）、大腸菌のアルカリ耐性には他の遺伝子産物も関与している

可能性が高いと考えられる。

一方で、大腸菌のトランスクリプトーム解析により、アルカリ条件下において、

電子の輸送と同時に H+を細胞外へ排出する呼吸鎖複合体に関与する遺伝子と、鞭

毛や走化性に関与する遺伝子の発現が抑制されることが見出されており、逆に H+

を取り込んでATPを合成するATP合成酵素の遺伝子については発現が誘導される

ことが明らかとされている（6）。これらの結果は、アルカリ条件下において細胞内

に H+を保持するように遺伝子の発現量が変化することを示している。また海水中

においては、成長の停止と同時に、細胞分裂とヌクレオチド生合成を担う遺伝子は

抑制され、代謝や移動性や走化性を担う遺伝子は誘導されることが見出されている

（7）。このことから移動性や走化性を担う遺伝子が海水中での大腸菌の生存に関与

2

していると考えられる。しかしこれらの解析は、ストレス負荷により転写が活性化

あるいは抑制された遺伝子のみについてのものであり、恒常的に発現している遺伝

子については原理上考慮されておらず、いわゆる「ハウスキーピング遺伝子」がア

ルカリ耐性に重要な役割を担っている可能性を否定できない。

こうした背景から、本研究では、大腸菌の単一遺伝子破壊株ライブラリー（Keio

colection）を用い、細菌のアルカリおよび Na+耐性について、これまでの解析法で

は見出されなかった新規の機構を見出すことを目的とし、網羅的スクリーニング法

の確立を行った。

2. 実験方法

使用した菌株および培養条件

大腸菌の単一遺伝子破壊株ライブラリー（keio collection）は国立遺伝学研究所

より供与を受けた（8）。なお、Keio collectionはカナマイシン耐性遺伝子が各遺伝

子に挿入された変異株コレクションであるため、すべての培地にはカナマイシンを

添加した。寒天平板上で提供された各菌株は 96 well plateに移し、LBK培地 (1%

Bacto tryptone, 0.5% Yeast extract, 86mM KCl) に 15µg/mlのカナマイシンを加

えたもので 37℃一晩静置培養後、終濃度 15%のグリセロールを加えて使用時まで

-80℃で保存した。スクリーニング条件の検討時には、LBK100 培地（1% Bacto

tryptone, 0.5% Yeast extract, 200 mM KCl, 25 mM Bis-tris propanem pH 7.0 あ

るいは 9.0）、LBNa100（LBK100の NaClを KClに置き換えたもの）、LBK200

培地（LBK100の KClを 200mMとしたもの）、LBNa200培地（LBK200の KCl

を 200mM NaClに置き換えたもの）、LBK400培地（LBK100の KClを 400mM

としたもの）、LBNa400培地（LBK400の KClを 400mM NaClに置き換えたも

の）を用いた。寒天平板から 96 well plate、あるいは 96 well plate間での各菌株

の植え替えには微生物用トランスファーセット（アズワン）を用いた。

スクリーニング条件の検討

スクリーニングの前培養として、グリセロールストックから LBKagar（1%

Bacto tryptone, 0.5% Yeast extract, 86mM KCl, 1.2% Agar）上に各菌株を移して

37℃で一晩培養し、これらを 96well plate上に分注した LBK100（pH 7.0）に移

3

したのち 24 時間静置培養した後、培養液の濁度（OD660）を測定した。OD660の

測定には HTS 7000 Plus（Perkin-Elmer）を用いた。次いで、各 wellの前培養液

を LBK100、LBNa100、 LBK200、 LBNa200（pH 7.0あるいは 9.0）を用い、

37℃で 24時間静置培養し、同様に OD660を測定した。

また、スクリーニングの精度を確認するため、keio collectionの plate No.39で

差が出たもの 5つ（ytfG, yjiO, brnQ, holC, nhaA欠損株）と平均的なもの 2つ（yjjI, dcm欠損株）を選択し、それぞれを LBK100 pH 7.0で 37℃で 24時間震盪培養し

て OD660を測定した。次いで、同濃度の菌液を LBNa100（pH 7.0および 9.0）に

移して 37℃で培養し、1 時間ごとに 8 時間後まで OD660を測定した。また同様の

実験を、前培養（LBK100 pH 7.0）を震盪培養で、その後本培養では振盪と静置

培養の両方、あるいは前培養・本培養ともに静置培養でも行った。

アルカリおよび Na+耐性に関与する遺伝子のスクリーニング

LBK200、LBNa200（pH 7.0あるいは 9.0）で培養し測定した OD660の値を比

較してアルカリ及び Na+耐性に関与する遺伝子を検出した。

まず LBK200、LBNa200（pH 7.0あるいは 9.0）の 4種類の培地それぞれで同

時に行った 3 枚の plate を測定して得られた OD660の平均値と標準偏差を各 well

ごとに出し、平均値をその wellの結果の OD660とした。次に 1枚の plate中の 96

個あるwellの結果の平均値を求め、その平均値を 100%とした時にそれぞれのwell

の結果が何%に相当するかを求めた。さらにその値と 100%との差を計算し、差の

平均値を求めて、100%との差が差の平均値以上のものを生育状態に違いがあると

判断した（以下 100%との差が差の平均値以上で OD660が 100%以上のものを+、

100%以下のものを‐、100%との差が差の平均値の 2倍以上で OD660が 100%以上

のものを++、100%以下のものを‐‐と表記する）。

4種類の培地での結果を比較して、LBK及び LBNaの pH 9.0は‐で pH 7.0は

平均的又は+又は++、及び pH 9.0 は‐‐でそれ以外は‐又は平均的又は+又は++

になった well の欠損遺伝子をアルカリ耐性に関与している可能性がある、LBNa

pH 7.0と pH 9.0は‐で LBKは平均的又は+又は++、及び LBNa pH 7.0と pH 9.0

は‐‐でLBKは‐又は平均的又は+又は++になったwellの欠損遺伝子はNa+耐性

に関与している可能性がある、LBNa pH 9.0は‐でそれ以外の培地では平均的又

4

は+又は++、及び LBNa pH 9.0 は‐‐でそれ以外の培地では‐又は平均的又は+

又は++になった wellの欠損遺伝子は pH 9.0において Na+耐性に関与している可

能性があると判断した。

3. 結果

3-1. スクリーニング方法の検討

スクリーニングの精度を上げるためには、何らかの positive controlが必要とな

る。そこで本研究では、既に pHおよび Na+耐性に重要な役割を担うことが明らか

となっている nhaA遺伝子の欠損株を positive controlとして用いることとした。遺伝学研究所から提供を受けた Keio collectionのうち、nhaA欠損株は No. 39のプレートに含まれていたため、このプレートを条件検討に用い、nhaA欠損株のアルカリ条件下での生育の低下が顕著に検出できる様な培養条件を模索した。

3-1-1. 前培養方法の検討 我々の研究室では、Keio collection の全株をグリセロールストックとして保存

しているので、まず初めにグリセロールストックから固形培地（LBKagar）に各

菌株を移して一晩培養した後、固形培地から 96 well プレートに分注した

LBNa100 （pH 7.0および pH 9.0）を用いて 37℃で 20時間培養し、OD660を測

定した。測定の結果、pH 7.0と pH 9.0の間で nhaA破壊株（Table 1、D-10）の生育に差は見られたものの、測定ごとにばらつきが見られた（データ示さず）。菌

株の移植には微生物用トランスファーセット（注：96well プレートのピッチに併

せて 96本のピンが並んでいるプラスチック器具）を用い、96種の菌株を一度に液

体培地にそれぞれ植菌しているが、この際にトランスファーセットのピンがコロニ

ーのどの部分と接触するかにより植え継がれる菌体量がばらつくことがこの原因

であると考えられた。そこで、固形培地でなく液体培地（LBK 培地）で一晩前培

養を行ったところ、固形培地での前培養よりも測定ごとのばらつきを押さえられる

ことが示された（データ示さず）。

5

Table 1. LBNa100 pH7.0と pH9.0の比較 ＃39 各 wellの菌株で欠損している遺伝子名

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A yjfP ytfM yjgI yjhX yjiR ytjB phr holE polA hsdM hofC betT

B ulaR ytfN yjgD yjhR yjiS yjjK dinI ruvA mrr hofB codB

C yjfY ytfP yjgR yjiC yjiX yjjY mfd ruvC dinF aroP cynX

D yjfZ yzfA yjhF yjiG yjjG yjtD umuC nudB uvrA holD yadG tauB

E ytfE ytfQ yjhG yjjU sbcC recT dcm mutL nhaA fhuC tauC

F ytfG yjgA yjhI yjjW priC ydaV sbmC priB yaaU fhuD araJ

G ytfJ pyrL yjhP yjiN yjjI recR tus alkA holC kefC fhuB brnQ

H ytfL yjgH yjhQ yjiO yjjJ seqA topB alkB hsdS setA metN mdlA

＊ 黄色の wellは遺伝学研究所より該当遺伝子名提示が無かった株を示す。

LBNa100 pH7.0 平均値 1.0306

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A 1.0947 1.1096 1.1421 1.1697 1.0244 1.0359 1.0741 0.827 1.0249 1.0583 0.8667 1.059

B 1.1615 1.0515 1.0452 1.1128 0.9722 0.9844 1.0101 1.0522 0.0681 1.1243 1.2139 1.1695

C 1.03 1.147 1.1066 0.9822 0.9837 0.9617 0.9106 0.9668 1.0305 0.0439 1.0767 1.0852

D 1.1375 1.1749 1.004 0.994 1.1483 1.0566 1.003 1.0376 1.0938 1.0369 1.1336 1.1412

E 1.1134 1.1263 1.0806 1.0364 1.1255 0.9985 1.0055 1.0226 1.0481 0.9674 1.1324 1.0017

F 1.1627 1.1197 0.9953 1.0151 0.9961 0.9731 0.9811 1.0268 1.0487 1.1433 1.0993 1.1975

G 0.082 1.2233 1.0623 1.2378 1.1901 1.1527 1.1845 1.1049 0.6186 1.1713 1.1244 1.1451

H 0.1317 1.2231 1.1567 1.1409 1.0722 1.0258 1.048 1.1158 1.1492 1.1716 1.0875 1.1634

LBNa100 pH9.0 平均値 0.5657

A 0.6716 0.7878 0.6438 0.7821 0.6401 0.6118 0.6558 0.5728 0.6101 0.6402 0.6752 0.6881

B 0.7979 0.7429 0.5762 0.6792 0.4522 0.2463 0.5603 0.4573 0.0685 0.581 0.7416 0.7969

C 0.8152 0.6762 0.5058 0.5013 0.445 0.4697 0.4836 0.4582 0.5019 0.0456 0.5344 0.7053

D 0.7124 0.739 0.4341 0.4595 0.5787 0.4936 0.4693 0.4961 0.5574 0.5267 0.5301 0.8357

E 0.7626 0.5564 0.5028 0.566 0.5804 0.4924 0.5655 0.5478 0.4864 0.3745 0.5484 0.6716

F 0.7521 0.5778 0.4173 0.4549 0.4669 0.455 0.3993 0.5034 0.6216 0.5408 0.5252 0.7964

G 0.0847 0.7754 0.5727 0.6451 0.6663 0.6007 0.6207 0.5427 0.3944 0.5979 0.5424 0.7045

H 0.1363 0.7876 0.5961 0.6018 0.5865 0.4743 0.5808 0.513 0.549 0.5871 0.5595 0.7635

3-1-2. 測定機器による誤差の検討

また、プレートリーダーの測定ごとの誤差を検証するために、No.39 を 96 well

plate に分注した LBK100 pH 7.0 2枚で培養し、それぞれのプレートについて測

定を 2 回ずつ行ったところ、1 枚目の 1 回目と 2 回目の差は平均約 0.02、最大約

0.07で、2枚目の 1回目と 2回目の差は平均 0.0039、最大約 0.014程度であった。

これらの値は、OD660の測定値の平均（1.1~1.2 前後）と比べて顕著に小さいこと

から（Table 2）、プレートリーダー自体に起因する誤差は無視して良いと考え、

OD660の測定は 1回のみ行うこととした。

6

Table 2. 測定機械による誤差の検証 #39 LBK100 pH7.0

1 枚目 1 回目 平均値 1.219

1.1883 1.1933 1.2219 1.2557 1.1377 1.1879 1.206 1.0623 1.0873 1.1906 1.2333 1.1589

1.2225 1.1772 1.1559 1.2184 1.1358 1.1234 1.173 1.2106 1.1985 1.2062 1.3264 1.418

1.1988 1.248 1.2705 1.2144 1.2177 1.2275 1.2646 1.2691 1.1748 1.329 1.2754 1.334

1.2683 1.2225 1.1595 1.1454 1.2555 1.2653 1.1874 1.1718 1.2162 1.203 1.3116 1.4171

1.2776 1.2733 1.288 1.2505 1.3056 1.2657 1.2568 1.2336 1.2305 1.2049 1.3541 1.1683

1.2309 1.2088 1.0787 1.1031 1.1408 1.1714 1.1599 1.1284 1.192 1.2174 1.1493 1.4048

1.1846 1.2409 1.2632 1.2801 1.2952 1.302 1.2453 1.2848 0.6785 1.3164 1.2764 1.3679

1.3659 1.2555 1.2185 1.1851 1.1502 1.03 1.1491 1.1423 1.2097 1.2174 1.1304 1.3994

1 枚目 2 回目 平均値 1.2108

1.1863 1.2 1.2203 1.2576 1.149 1.1746 1.1984 1.0649 1.1013 1.1964 1.2302 1.1537

1.192 1.1595 1.1297 1.2047 1.1024 1.0944 1.1398 1.1692 1.1764 1.1822 1.2658 1.3469

1.1576 1.2154 1.215 1.1751 1.1864 1.1716 1.2459 1.2694 1.1591 1.3433 1.2841 1.3062

1.2262 1.2295 1.1538 1.1398 1.2694 1.2792 1.1945 1.1776 1.2247 1.2173 1.3196 1.3998

1.2242 1.2413 1.2168 1.2079 1.2747 1.1969 1.257 1.1892 1.2083 1.1748 1.3513 1.1477

1.2023 1.2258 1.0904 1.1116 1.1399 1.1811 1.1707 1.1302 1.1869 1.2226 1.1505 1.4356

1.223 1.2697 1.2597 1.291 1.2909 1.2756 1.2537 1.2782 0.6693 1.327 1.2629 1.3573

1.3712 1.2928 1.2587 1.2279 1.1841 1.0557 1.1686 1.1622 1.2172 1.2171 1.1339 1.3917

1 枚目 2 回の差 平均値 0.0201

0.002 -0.007 0.0016 -0.002 -0.011 0.0133 0.0076 -0.003 -0.014 -0.006 0.0031 0.0052

0.0305 0.0177 0.0262 0.0137 0.0334 0.029 0.0332 0.0414 0.0221 0.024 0.0606 0.0711

0.0412 0.0326 0.0555 0.0393 0.0313 0.0559 0.0187 -3E-04 0.0157 -0.014 -0.009 0.0278

0.0421 -0.007 0.0057 0.0056 -0.014 -0.014 -0.007 -0.006 -0.008 -0.014 -0.008 0.0173

0.0534 0.032 0.0712 0.0426 0.0309 0.0688 -2E-04 0.0444 0.0222 0.0301 0.0028 0.0206

0.0286 -0.017 -0.012 -0.008 0.0009 -0.01 -0.011 -0.002 0.0051 -0.005 -0.001 -0.031

-0.038 -0.029 0.0035 -0.011 0.0043 0.0264 -0.008 0.0066 0.0092 -0.011 0.0135 0.0106

-0.005 -0.037 -0.04 -0.043 -0.034 -0.026 -0.02 -0.02 -0.008 0.0003 -0.003 0.0077

2 枚目 1 回目 平均値 1.1435

1.2413 1.1508 1.0721 1.2476 1.1253 1.0648 1.1721 1.0537 0.9917 1.0212 1.1269 1.1308

1.3072 1.0829 1.1078 1.1868 1.1045 1.0275 1.1137 1.1592 1.1107 1.1802 1.1789 1.1277

1.0941 1.1215 1.1177 1.1038 1.1292 1.1499 1.0555 1.0682 1.0656 1.1525 1.07 1.1416

1.179 1.1564 1.0997 1.0524 1.2961 1.235 1.1507 1.0956 1.1286 1.108 1.1821 1.263

1.2271 1.1721 1.1354 1.1023 1.27 1.1873 1.3436 1.1023 1.1231 1.1049 1.1635 1.0955

1.1364 1.0922 1.101 1.0548 1.0942 1.2838 1.0493 1.0516 1.1493 1.1572 1.0226 1.2419

1.1359 1.2039 1.142 1.2441 1.2874 1.1584 1.2711 1.1603 1.0932 1.1685 1.0734 1.193

1.353 1.2172 1.143 1.1296 1.0282 1.0274 1.051 1.1054 1.1788 1.2062 1.1695 1.2688

2 枚目 2 回目 平均値 1.1436

1.2459 1.1542 1.0784 1.2496 1.1291 1.0644 1.179 1.0538 0.9914 1.0222 1.1255 1.1442

1.3095 1.086 1.1103 1.1845 1.1015 1.0317 1.1126 1.1577 1.1139 1.1858 1.1743 1.1309

1.1044 1.122 1.1202 1.1079 1.1362 1.1546 1.06 1.0718 1.0661 1.1533 1.0712 1.1401

1.1746 1.1582 1.1024 1.0553 1.2924 1.2427 1.1567 1.0979 1.1297 1.1079 1.181 1.2582

1.2194 1.1728 1.1429 1.1132 1.2734 1.194 1.352 1.1037 1.1228 1.105 1.1579 1.0926

1.1362 1.0949 1.1043 1.0598 1.0961 1.2859 1.0484 1.051 1.1494 1.1564 1.02 1.2349

1.1358 1.2008 1.1385 1.2437 1.2854 1.1553 1.263 1.155 1.084 1.1608 1.0686 1.1936

1.3531 1.2108 1.1369 1.1312 1.0293 1.0131 1.0486 1.0929 1.1716 1.1929 1.1565 1.2726

2 枚目 2 回の差 平均値 0.0039

-0.005 -0.003 -0.006 -0.002 -0.004 0.0004 -0.007 -1E-04 0.0003 -1E-03 0.0014 -0.013

-0.002 -0.003 -0.003 0.0023 0.003 -0.004 0.0011 0.0015 -0.003 -0.006 0.0046 -0.003

-0.01 -5E-04 -0.003 -0.004 -0.007 -0.005 -0.004 -0.004 -5E-04 -8E-04 -0.001 0.0015

0.0044 -0.002 -0.003 -0.003 0.0037 -0.008 -0.006 -0.002 -0.001 1E-04 0.0011 0.0048

0.0077 -7E-04 -0.008 -0.011 -0.003 -0.007 -0.008 -0.001 0.0003 -1E-04 0.0056 0.0029

0.0002 -0.003 -0.003 -0.005 -0.002 -0.002 0.0009 0.0006 -1E-04 0.0008 0.0026 0.007

1E-04 0.0031 0.0035 0.0004 0.002 0.0031 0.0081 0.0053 0.0092 0.0077 0.0048 -6E-04

-1E-04 0.0064 0.0061 -0.002 -0.001 0.0143 0.0024 0.0125 0.0072 0.0133 0.013 -0.004

7

3-1-3. 培養時間の検討

次に、中性条件とアルカリ条件の差をより大きく検出できるような条件の模索を

目的として、培養時間の検討を試みた。培養時間の延長により、OD660の最大値が

大きくなれば、それだけ差の検出が容易となる可能性が高い。そこで、LBK100 pH

7.0での培養を、30時間および 50時間に延長して OD660を測定する実験を 2枚ず

つ行った（Table 3）。その結果、24 時間以上に培養時間を延長しても nhaA 破壊株の中性条件とアルカリ条件での生育の差にあまり差異は見られなかった。また一

部 30時間後の OD660の方がむしろ低くなる wellがあり、50時間後においてはそ

の傾向がより顕著となった。これらの結果は、培養時間の延長により複数の well

において溶菌が起きている可能性を示唆しており、従って 24時間以上の培養は効

果的ではないと考えられた。以上から、培養時間は 24時間が適当であると判断し

た。 Table 3. 培養時間の検討 #39

1 枚目

24 時間 平均値 1.1926

1.227 1.2385 1.1878 1.2666 1.0938 1.1019 1.248 1.0112 1.0886 1.157 1.1277 1.0819

1.3302 1.1983 1.1571 1.2516 1.0994 1.0914 1.1219 1.1545 1.1774 1.1917 1.2443 1.2287

1.2066 1.1806 1.1796 1.1109 1.1116 1.1066 1.1975 1.2406 1.1176 1.203 1.1398 1.1323

1.2342 1.2005 1.1153 1.1294 1.3487 1.2266 1.1706 1.1529 1.2152 1.1497 1.2767 1.3127

1.2655 1.2177 1.1895 1.2049 1.2425 1.1706 1.2416 1.1686 1.2707 1.1642 1.3084 1.1754

1.2708 1.197 1.0924 1.0907 1.1397 1.1402 1.1721 1.1777 1.2243 1.2016 1.187 1.3537

1.2232 1.2595 1.2007 1.2884 1.2852 1.2185 1.2389 1.2141 0.5579 1.2753 1.2121 1.3231

1.5037 1.3175 1.2234 1.2137 1.1459 1.1014 1.1459 1.1481 1.1807 1.2452 1.1777 1.3874

30 時間 平均値 1.219

1.1883 1.1933 1.2219 1.2557 1.1377 1.1879 1.206 1.0623 1.0873 1.1906 1.2333 1.1589

1.2225 1.1772 1.1559 1.2184 1.1358 1.1234 1.173 1.2106 1.1985 1.2062 1.3264 1.418

1.1988 1.248 1.2705 1.2144 1.2177 1.2275 1.2646 1.2691 1.1748 1.329 1.2754 1.334

1.2683 1.2225 1.1595 1.1454 1.2555 1.2653 1.1874 1.1718 1.2162 1.203 1.3116 1.4171

1.2776 1.2733 1.288 1.2505 1.3056 1.2657 1.2568 1.2336 1.2305 1.2049 1.3541 1.1683

1.2309 1.2088 1.0787 1.1031 1.1408 1.1714 1.1599 1.1284 1.192 1.2174 1.1493 1.4048

1.1846 1.2409 1.2632 1.2801 1.2952 1.302 1.2453 1.2848 0.6785 1.3164 1.2764 1.3679

1.3659 1.2555 1.2185 1.1851 1.1502 1.03 1.1491 1.1423 1.2097 1.2174 1.1304 1.3994

50 時間 平均値 1.0942

1.2812 1.1657 1.2176 1.1911 1.1642 1.2511 1.2931 1.1013 1.1522 1.1459 1.1792 1.1774

1.2321 1.1177 1.0459 1.103 1.0383 0.9975 1.0056 1.0205 1.0811 1.1052 1.0939 1.1303

1.1451 1.0889 1.0508 0.9969 0.997 0.9997 1.0862 0.999 1.0023 1.0714 1.0429 1.1062

1.1948 1.071 1.0038 0.9836 1.1268 1.068 1.0205 1.0047 1.0468 1.0724 1.0965 1.1421

1.1701 1.1181 1.0265 1.0244 1.0892 1.0151 1.0784 0.9997 1.0287 0.9899 1.0716 1.2083

1.2113 1.0972 0.9694 0.9834 1.011 1.0183 1.1073 1.0121 1.084 1.0465 1.0273 1.1987

1.0745 1.1317 1.0748 1.1267 1.1357 1.0812 1.1032 1.113 0.6255 1.1002 1.0717 1.2141

1.2487 1.2003 1.148 1.1631 1.1251 1.0468 1.1165 1.1134 1.1231 1.1376 1.1422 1.3267

8

2 枚目

24 時間 平均値 1.2469

1.1975 1.2146 1.1468 1.2523 1.1381 1.0827 1.2668 1.1519 1.1104 1.0939 1.1777 1.1345

1.4156 1.2062 1.231 1.3163 1.1907 1.0961 1.187 1.2491 1.1994 1.2971 1.3399 1.1998

1.232 1.2596 1.2362 1.2061 1.217 1.2347 1.1638 1.215 1.2119 1.2527 1.1588 1.1827

1.2523 1.2219 1.2202 1.2064 1.352 1.3463 1.2708 1.311 1.2777 1.2521 1.2814 1.3289

1.2734 1.3014 1.301 1.2498 1.4471 1.2781 1.6633 1.2583 1.2777 1.2782 1.2942 1.1788

1.2095 1.2356 1.166 1.2084 1.2555 1.4254 1.0933 1.2366 1.3312 1.2782 1.1571 1.3419

1.1927 1.3108 1.2551 1.3448 1.3536 1.2863 1.3394 1.2541 1.1983 1.2301 1.1638 1.3056

1.4262 1.3343 1.2339 1.2465 1.168 1.1181 1.1414 1.193 1.2272 1.2794 1.2569 1.3162

30 時間 平均値 1.1435

1.2413 1.1508 1.0721 1.2476 1.1253 1.0648 1.1721 1.0537 0.9917 1.0212 1.1269 1.1308

1.3072 1.0829 1.1078 1.1868 1.1045 1.0275 1.1137 1.1592 1.1107 1.1802 1.1789 1.1277

1.0941 1.1215 1.1177 1.1038 1.1292 1.1499 1.0555 1.0682 1.0656 1.1525 1.07 1.1416

1.179 1.1564 1.0997 1.0524 1.2961 1.235 1.1507 1.0956 1.1286 1.108 1.1821 1.263

1.2271 1.1721 1.1354 1.1023 1.27 1.1873 1.3436 1.1023 1.1231 1.1049 1.1635 1.0955

1.1364 1.0922 1.101 1.0548 1.0942 1.2838 1.0493 1.0516 1.1493 1.1572 1.0226 1.2419

1.1359 1.2039 1.142 1.2441 1.2874 1.1584 1.2711 1.1603 1.0932 1.1685 1.0734 1.193

1.353 1.2172 1.143 1.1296 1.0282 1.0274 1.051 1.1054 1.1788 1.2062 1.1695 1.2688

50 時間 平均値 1.1295

1.2185 1.1953 0.9756 1.0901 0.9631 0.9719 1.2068 1.1188 0.9325 0.9353 1.1914 1.0239

1.2354 1.1477 1.1198 1.1344 1.132 1.0949 1.1185 1.1262 1.0822 1.1299 1.143 1.1018

1.1531 1.1702 1.1752 1.1026 1.0827 1.1024 1.1035 1.0652 1.0552 1.1239 1.0868 1.1112

1.183 1.1685 1.1191 1.0892 1.2058 1.1739 1.0818 1.0723 1.0798 1.1226 1.1236 1.1962

1.1936 1.1345 1.1018 1.0742 1.1395 1.08 1.2172 1.055 1.0741 1.0864 1.1839 1.1179

1.188 1.147 1.0713 1.0428 1.0405 1.16 1.039 1.0048 1.122 1.1453 1.1034 1.2491

1.0918 1.1992 1.1526 1.2049 1.209 1.1275 1.1749 1.1494 1.1055 1.1578 1.1394 1.2209

1.2226 1.2296 1.1678 1.1935 1.1378 1.147 1.1937 1.214 1.1801 1.1971 1.2514 1.2569

3-1-4. アルカリ条件における培地 pHについての検討

次いで、アルカリ条件の培地の pHを 9.5および 10.0に上昇させ、nhaA破壊株と他の株との差が検出しやすくなるかについて検討した。その結果、pH 9.5 では

nhaA欠損株と他の株との違いは顕著となった様に見受けられたものの、全体的に測定値が低くなったため、誤差との判別がつきにくくなる傾向見られた。また、pH

10.0 では 96 個の well 殆どが生育せず、この条件はスクリーニングには向かない

と考えられた。以上より、アルカリ条件の培地は pH 9.0とするのが妥当であると

考えられた（Table 4）。

9

Table 4. アルカリ条件の決定 #39

LBNa100 pH9.5

1 枚目 平均値 0.3248

0.6053 0.3136 0.2992 0.4805 0.3073 0.4059 0.3536 0.3471 0.3006 0.5605 0.601 0.4154

0.4185 0.366 0.3255 0.3685 0.3291 0.2529 0.2416 0.2178 0.0476 0.3158 0.3358 0.45

0.342 0.262 0.267 0.2828 0.2954 0.3079 0.2575 0.3104 0.3007 0.0428 0.2952 0.6013

0.2763 0.258 0.2829 0.2881 0.2971 0.2933 0.268 0.346 0.3079 0.2836 0.266 0.6158

0.273 0.2532 0.3624 0.2953 0.2753 0.4021 0.306 0.3044 0.2947 0.1838 0.272 0.4372

0.3656 0.2831 0.2157 0.2465 0.2826 0.2772 0.3196 0.3667 0.2946 0.2454 0.2892 0.4225

0.2761 0.3508 0.3503 0.309 0.3105 0.2877 0.2774 0.2932 0.2392 0.268 0.3183 0.5706

0.3617 0.3215 0.3265 0.3265 0.2933 0.2398 0.298 0.3437 0.3214 0.3451 0.4001 0.4765

2 枚目 平均値 0.2952

0.6841 0.341 0.3302 0.4055 0.3185 0.4505 0.3674 0.3348 0.2862 0.3526 0.4445 0.4934

0.5231 0.2652 0.288 0.3738 0.2695 0.2273 0.226 0.2195 0.0444 0.275 0.2521 0.4332

0.4331 0.2416 0.2252 0.2438 0.2632 0.2781 0.2306 0.2147 0.2646 0.0409 0.2375 0.4129

0.3645 0.2464 0.2687 0.2663 0.2244 0.2436 0.2709 0.2568 0.2604 0.2241 0.2343 0.3087

0.2864 0.226 0.2627 0.2556 0.2599 0.3625 0.2476 0.2851 0.2692 0.1855 0.2777 0.3708

0.2924 0.2533 0.207 0.2341 0.2701 0.2523 0.2687 0.2487 0.2967 0.2321 0.2522 0.3702

0.3131 0.3197 0.2857 0.2627 0.2645 0.2662 0.2537 0.2577 0.2069 0.2401 0.261 0.3833

0.4541 0.3795 0.3669 0.3568 0.3125 0.275 0.2856 0.3129 0.292 0.3445 0.3135 0.3997

3 枚目 平均値 0.2979

0.4762 0.3156 0.3656 0.328 0.3162 0.3699 0.411 0.3656 0.3104 0.4423 0.4845 0.4744

0.4536 0.364 0.3125 0.3304 0.2969 0.2817 0.2608 0.238 0.0524 0.2964 0.29 0.3535

0.3958 0.2498 0.2319 0.2882 0.2874 0.2856 0.2784 0.2194 0.273 0.0402 0.2806 0.3911

0.3402 0.2668 0.2866 0.2931 0.24 0.2742 0.2809 0.2767 0.3116 0.2422 0.2577 0.3175

0.3127 0.2415 0.267 0.2836 0.2949 0.2863 0.3113 0.2875 0.2484 0.1722 0.2511 0.3871

0.3868 0.2903 0.2246 0.2471 0.3019 0.2624 0.2824 0.2931 0.3264 0.2414 0.281 0.3381

0.0434 0.3469 0.2725 0.2657 0.3251 0.2673 0.2572 0.2857 0.2162 0.2487 0.269 0.4484

0.0813 0.336 0.3471 0.3368 0.3294 0.2724 0.3521 0.2984 0.2978 0.3159 0.3579 0.4112

4 枚目 平均値 0.2979

0.3926 0.3064 0.335 0.397 0.3236 0.3155 0.3735 0.3258 0.2879 0.3334 0.3392 0.3662

0.3554 0.3048 0.2793 0.2511 0.2875 0.2597 0.2843 0.2444 0.0537 0.3223 0.287 0.3056

0.2938 0.3055 0.2695 0.2923 0.2871 0.2942 0.3001 0.2513 0.278 0.0415 0.2842 0.3172

0.2964 0.2607 0.2841 0.2953 0.2445 0.3269 0.2955 0.3108 0.3306 0.2493 0.2759 0.3018

0.2892 0.2876 0.307 0.2963 0.3104 0.3204 0.3132 0.3041 0.2876 0.1952 0.2816 0.3616

0.3799 0.2945 0.2419 0.2595 0.2902 0.2759 0.3363 0.3374 0.2695 0.2434 0.2839 0.3595

0.0458 0.3017 0.3286 0.2944 0.3281 0.2807 0.3118 0.3111 0.2361 0.274 0.354 0.4284

0.0915 0.3669 0.3283 0.3515 0.3677 0.2841 0.3138 0.3149 0.329 0.3679 0.3716 0.4721

4 枚の平均値 平均値 0.3039

0.5396 0.3192 0.3325 0.4028 0.3164 0.3855 0.3764 0.3433 0.2963 0.4222 0.4673 0.4374

0.4377 0.325 0.3013 0.331 0.2958 0.2554 0.2532 0.2299 0.0495 0.3024 0.2912 0.3856

0.3662 0.2647 0.2484 0.2768 0.2833 0.2915 0.2667 0.249 0.2791 0.0414 0.2744 0.4306

0.3194 0.258 0.2806 0.2857 0.2515 0.2845 0.2788 0.2976 0.3026 0.2498 0.2585 0.386

0.2903 0.2521 0.2998 0.2827 0.2851 0.3428 0.2945 0.2953 0.275 0.1842 0.2706 0.3892

0.3562 0.2803 0.2223 0.2468 0.2862 0.267 0.3018 0.3115 0.2968 0.2406 0.2766 0.3726

0.1696 0.3298 0.3093 0.283 0.3071 0.2755 0.275 0.2869 0.2246 0.2577 0.3006 0.4577

0.2472 0.351 0.3422 0.3429 0.3257 0.2678 0.3124 0.3175 0.3101 0.3434 0.3608 0.4399

10

LBNa100 pH10.0

1 枚目 平均値 0.0518

0.0415 0.0416 0.0426 0.0417 0.0417 0.0418 0.0477 0.0455 0.0421 0.0448 0.0444 0.0441

0.0426 0.0416 0.0427 0.0427 0.0426 0.0428 0.046 0.0496 0.0531 0.0554 0.0521 0.0417

0.0402 0.0442 0.0401 0.0419 0.0486 0.0406 0.0412 0.0411 0.0429 0.0419 0.0417 0.0425

0.0392 0.0397 0.0403 0.041 0.0419 0.0414 0.0409 0.0411 0.0413 0.041 0.0412 0.0414

0.0421 0.0528 0.0462 0.044 0.0796 0.0414 0.0613 0.0477 0.0421 0.0606 0.0486 0.0417

0.0414 0.0403 0.0399 0.0411 0.0458 0.0407 0.0415 0.0409 0.0409 0.0405 0.0416 0.0408

0.0647 0.0809 0.0749 0.0693 0.1517 0.0961 0.1289 0.146 0.0685 0.1191 0.1573 0.0401

0.0901 0.0465 0.0512 0.0427 0.0514 0.0466 0.0456 0.0476 0.0494 0.0435 0.0497 0.0411

2 枚目 平均値 0.0458

0.0417 0.0414 0.0405 0.0414 0.043 0.0411 0.0453 0.0501 0.0441 0.0455 0.043 0.046

0.0428 0.0415 0.0593 0.0498 0.0409 0.0405 0.0437 0.0471 0.0762 0.062 0.0583 0.0439

0.0401 0.0422 0.0411 0.0403 0.044 0.04 0.0408 0.0431 0.043 0.0403 0.0428 0.0422

0.0394 0.0408 0.0394 0.0402 0.0444 0.0404 0.0413 0.0457 0.0416 0.0424 0.0435 0.0427

0.0396 0.0428 0.0547 0.044 0.0523 0.0421 0.0419 0.0445 0.0813 0.0424 0.0455 0.0421

0.0398 0.04 0.0392 0.0399 0.0395 0.0398 0.0394 0.0425 0.0417 0.0434 0.0412 0.0421

0.0395 0.0535 0.0634 0.0497 0.0587 0.0753 0.0563 0.1145 0.0392 0.0428 0.0694 0.0397

0.0458 0.0411 0.0412 0.0421 0.0409 0.0406 0.0422 0.0415 0.0418 0.0411 0.0423 0.0414

3 枚目 平均値 0.049

0.0417 0.0432 0.0412 0.0417 0.0408 0.0416 0.0456 0.0428 0.0403 0.0423 0.0438 0.0434

0.0407 0.0494 0.0479 0.044 0.044 0.0417 0.041 0.0431 0.0402 0.0445 0.0428 0.0432

0.0402 0.0406 0.0396 0.0404 0.0417 0.0404 0.0711 0.0456 0.0414 0.0414 0.0496 0.0421

0.04 0.0405 0.0411 0.0434 0.0416 0.041 0.041 0.0414 0.0414 0.0414 0.0412 0.0408

0.0398 0.0627 0.0566 0.0426 0.0413 0.0512 0.0418 0.0478 0.0397 0.0443 0.0505 0.0427

0.0406 0.0415 0.0389 0.0399 0.0409 0.0403 0.0402 0.041 0.0403 0.0418 0.0433 0.042

0.0627 0.1328 0.1344 0.1845 0.0508 0.0594 0.0509 0.0534 0.0472 0.0718 0.1154 0.0402

0.0954 0.0608 0.0434 0.0434 0.0432 0.0442 0.0416 0.0411 0.0439 0.0441 0.0502 0.0411

4 枚目 平均値 0.0497

0.0422 0.0424 0.0418 0.0432 0.0418 0.042 0.0492 0.0429 0.0418 0.0483 0.0429 0.0442

0.0396 0.0407 0.0422 0.0406 0.0402 0.0421 0.0429 0.0523 0.0454 0.0578 0.0536 0.0426

0.0393 0.0395 0.0387 0.0436 0.0425 0.0412 0.0399 0.0412 0.0449 0.0427 0.0418 0.0421

0.0376 0.039 0.0404 0.0399 0.0394 0.0418 0.0397 0.0413 0.0418 0.0414 0.0425 0.041

0.0379 0.0628 0.0529 0.0484 0.045 0.0604 0.0428 0.0657 0.0426 0.0471 0.0436 0.0433

0.0395 0.0405 0.038 0.0399 0.0393 0.0417 0.0405 0.0403 0.0427 0.0431 0.0427 0.0416

0.0463 0.1185 0.2144 0.0667 0.0652 0.0809 0.0682 0.144 0.0695 0.0762 0.0592 0.0409

0.0744 0.06 0.045 0.0435 0.0459 0.0484 0.0439 0.0507 0.0506 0.0429 0.0425 0.0442

4 枚の平均値 平均値 0.0491

0.0418 0.0422 0.0415 0.042 0.0418 0.0416 0.047 0.0453 0.0421 0.0452 0.0435 0.0444

0.0414 0.0433 0.048 0.0443 0.0419 0.0418 0.0434 0.048 0.0537 0.0549 0.0517 0.0429

0.04 0.0416 0.0399 0.0416 0.0442 0.0406 0.0483 0.0428 0.0431 0.0416 0.044 0.0422

0.0391 0.04 0.0403 0.0411 0.0418 0.0412 0.0407 0.0424 0.0415 0.0416 0.0421 0.0415

0.0399 0.0553 0.0526 0.0448 0.0546 0.0488 0.047 0.0514 0.0514 0.0486 0.0471 0.0425

0.0403 0.0406 0.039 0.0402 0.0414 0.0406 0.0404 0.0412 0.0414 0.0422 0.0422 0.0416

0.0533 0.0964 0.1218 0.0926 0.0816 0.0779 0.0761 0.1145 0.0561 0.0775 0.1003 0.0402

0.0764 0.0521 0.0452 0.0429 0.0454 0.045 0.0433 0.0452 0.0464 0.0429 0.0462 0.042

11

3-1-5. 解析方法の検討

スクリーニングを進めるにあたって、ある株について LBNa100 pH 7.0 と pH

9.0で OD660に差が出た場合、それが pHの違いに起因するのか、あるいは Na+の

毒性に起因するのか区別する必要があると考えた。そこで、LBNa100 pH 7.0及び

pH 9.0で培養すると同時に、Na+を K+と置き換えた LBK100 pH 7.0及び pH 9.0

でも培養することにした。さらに再現性を確認するため、同じ条件の培地で 96 well

plateを 3枚ずつ培養し、3枚の平均値を求めることとした。また同じ条件の培地

で培養した 3枚のばらつきを考慮するため、96個の wellそれぞれにおいて 3回の

実験結果の標準偏差と標準偏差の平均値を求め、標準偏差が平均値以下になった

well の実験結果をばらつきが少なく信頼できるものと考えることにした。これら

の計算は 1枚の plateごとに行った。

次に、スクリーニング結果の判定法について検討した。本研究の様な大規模スクリーニ

ングの場合、サンプル数が大きくなることから、その結果判定には定量的かつ簡便な手

法が望ましいと考えられる。そこで本研究では、同一条件の培地で培養した 3セットの実

験結果の平均値を算出し、さらにその平均値の平均値を算出し、この値を 100%とした場

合のそれぞれの株での測定値が何%に相当するかを計算し、次いで各株と平均値との

差（%）をそれぞれ求めた。さらに、各株で得られた平均値との差（%）の平均を求め、差

の平均値以上の差が検出された株について生育状態に違いがあると判断することとした。

差の程度の判定は、平均値との差（%）の絶対値が差の平均値以上で、プレート全体の

平均よりも良好な生育が見られた株を+、生育が顕著に低下したものを‐、また、平均値

との差（%）の絶対値が差の平均の 2倍以上で生育がプレート全体の平均より良好であっ

たものを++、生育が顕著に低下していたものを‐‐と判定することとした。例として No.39

plate LBNa100 pH 9.0の計算結果を下に記した（Table 5）。

Table 5. No.39 plate LBNa100 pH9.0計算結果

3 枚の平均値 平均値 （100%） 0.5501

0.7913 0.5692 0.56 0.6649 0.6181 0.6287 0.6098 0.4251 0.5273 0.6662 0.4278 0.7322

0.8249 0.6318 0.6562 0.4426 0.5269 0.4586 0.4585 0.3826 0.0497 0.5542 0.5478 0.554

0.8712 0.5784 0.4336 0.6807 0.4969 0.5118 0.6626 0.5474 0.4999 0.0402 0.5781 0.5666

0.5691 0.4708 0.5319 0.5096 0.4822 0.4301 0.4938 0.517 0.8249 0.5527 0.4304 0.5458

0.5574 0.5858 0.6774 0.5439 0.4699 0.5015 0.4454 0.4818 0.6888 0.4033 0.4847 0.6205

0.7526 0.6242 0.3992 0.446 0.4941 0.4957 0.5054 0.5739 0.6342 0.4785 0.7324 0.667

0.5119 0.6558 0.5089 0.4878 0.5154 0.489 0.4515 0.588 0.2772 0.4491 0.4331 0.7385

0.5937 0.5456 0.6939 0.7802 0.7604 0.4494 0.5515 0.4814 0.6098 0.5529 0.6317 0.657

12

標準偏差 平均値 0.0678

0.128 0.1421 0.0693 0.0666 0.3419 0.1507 0.0645 0.0443 0.0393 0.1084 0.0568 0.0205

0.1163 0.1043 0.0883 0.0763 0.018 0.0437 0.0519 0.0417 0.005 0.022 0.147 0.1245

0.0389 0.0543 0.031 0.1013 0.0186 0.0182 0.1094 0.204 0.0332 0.001 0.0772 0.0618

0.1358 0.0338 0.0133 0.0079 0.0628 0.0588 0.0408 0.0728 0.0372 0.0379 0.0136 0.1103

0.177 0.1209 0.063 0.0641 0.0165 0.0412 0.0191 0.0202 0.057 0.0329 0.0276 0.0768

0.0611 0.1021 0.0189 0.0291 0.027 0.0135 0.0966 0.0495 0.0046 0.1249 0.1109 0.1178

0.0321 0.0669 0.0931 0.0299 0.1027 0.0511 0.0229 0.1733 0.0424 0.0123 0.0209 0.0922

0.0938 0.0309 0.1017 0.0181 0.1405 0.0327 0.0609 0.0706 0.0554 0.0586 0.0577 0.1298

平均値（0.5501）を 100 とした時（％）

143.85 103.47 101.8 120.87 112.35 114.28 110.84 77.274 95.852 121.1 77.759 133.09

149.95 114.85 119.29 80.45 95.774 83.358 83.346 69.555 9.0405 100.74 99.585 100.71

158.36 105.14 78.814 123.73 90.326 93.041 120.44 99.512 90.878 7.3075 105.09 103

103.46 85.582 96.689 92.629 87.654 78.183 89.769 93.98 149.94 100.47 78.244 99.215

101.33 106.49 123.14 98.864 85.424 91.162 80.959 87.581 125.22 73.306 88.115 112.79

136.81 113.47 72.572 81.074 89.811 90.102 91.865 104.33 115.29 86.988 133.14 121.24

93.053 119.21 92.508 88.672 93.683 88.89 82.067 106.89 50.383 81.631 78.723 134.24

107.92 99.173 126.14 141.82 138.22 81.692 100.25 87.509 110.84 100.5 114.83 119.44

平均値 17.299

平均値(100%)との差 平均値の 2倍 34.599

43.848 3.4689 1.7965 20.865 12.352 14.279 10.843 -22.73 -4.148 21.102 -22.24 33.093

49.95 14.854 19.29 -19.55 -4.226 -16.64 -16.65 -30.45 -90.96 0.7422 -0.415 0.7119

58.36 5.1352 -21.19 23.731 -9.674 -6.959 20.441 -0.488 -9.122 -92.69 5.0867 3.0023

3.4568 -14.42 -3.311 -7.371 -12.35 -21.82 -10.23 -6.02 49.944 0.4695 -21.76 -0.785

1.33 6.4864 23.144 -1.136 -14.58 -8.838 -19.04 -12.42 25.216 -26.69 -11.89 12.788

36.813 13.473 -27.43 -18.93 -10.19 -9.898 -8.135 4.3293 15.291 -13.01 33.141 21.241

-6.947 19.211 -7.492 -11.33 -6.317 -11.11 -17.93 6.8924 -49.62 -18.37 -21.28 34.238

7.9164 -0.827 26.143 41.818 38.219 -18.31 0.2514 -12.49 10.843 0.4998 14.83 19.435

3-1-6. スクリーニング感度の検討

次に nhaAよりも pH維持およびNa+排出における寄与の程度が低いと考えられている nhaBと chaAについて、上述のスクリーニング方法で検出できるのかを検証することで、比較的 pHおよび Na+濃度制御への寄与の低い遺伝子であっても検

出可能となる様な条件を模索した。nhaBおよび chaAの破壊株が含まれる No.55 plateを使用し、上述で用いた LBK100 pH 7.0及び pH 9.0と LBNa100 pH 7.0

及び pH 9.0 の他に、アルカリカチオンの負荷を高めた LBK200、LBK400、

LBNa200、LBNa400の pH 9.0で培養した結果、上述で用いた条件（LBNa100）

13

では nhaB と chaA 破壊株を positive clone として検出できなかった。一方、LBNa200 では chaA 破壊株は検出でき、nhaB 破壊株は検出できなかった。LBNa400では全体的に値が小さくなりすぎて有意な差が得られなかった。これら

の結果は、400mM の NaClの負荷ではストレスが掛かりすぎるが、200mMであ

れば、pHおよび Na+耐性に異常のない株の生育には大きな影響が見られず、一方

で異常のある株については検出可能であることを示すと考えられる。そこで、少な

くとも chaA破壊株を positive cloneとして検出可能であった LBNa200を用いてスクリーニングを行うこととした（Table 6）。

以上、3-1-6 までの条件検討を元に、本研究で用いるスクリーニング方法を Fig.1

の様に確定した。

Table 6. NhaBと ChaAの検証 #55 NhaB ChaA

LBNa100 pH9.0

OD660 平均値 （100%） 0.5346

0.6491 0.5481 0.4677 0.4291 0.5328 0.5837 0.5188 0.5288 0.4346 0.4895 0.5241 0.7179

0.6151 0.5977 0.4998 0.4876 0.4979 0.355 0.6122 0.4959 0.597 0.508 0.6004 0.4226

0.628 0.4535 0.4796 0.593 0.6339 0.486 0.5995 0.5427 0.6431 0.4697 0.4305 0.5434

0.5035 0.4913 0.5152 0.608 0.5529 0.5979 0.4139 0.4623 0.53 0.4539 0.4978 0.5392

0.5569 0.5035 0.4553 0.4923 0.608 0.5005 0.5851 0.566 0.5063 0.5043 0.3593 0.5411

0.5945 0.5222 0.5759 0.421 0.6263 0.6207 0.5615 0.4465 0.5209 0.6097 0.4492 0.4523

0.458 0.5371 0.532 0.5702 0.6167 0.5833 0.6108 0.5485 0.5637 0.5374 0.5805 0.5322

0.559 0.599 0.5471 0.4856 0.6268 0.5398 0.5087 0.5095 0.5092 0.6679 0.6018 0.5341

平均値 10.182

平均値(100%)との差 平均値の 2倍 20.364

21.419 2.5266 -12.51 -19.73 -0.342 9.1796 -2.96 -1.077 -18.7 -8.429 -1.969 34.295

15.066 11.798 -6.515 -8.79 -6.87 -33.59 14.511 -7.238 11.674 -4.968 12.304 -20.94

17.466 -15.18 -10.29 11.01 18.57 -9.083 12.135 1.5102 20.297 -12.14 -19.47 1.6537

-5.81 -8.105 -3.621 13.79 3.4307 11.848 -22.57 -13.53 -0.859 -15.09 -6.876 0.8555

4.1727 -5.81 -14.83 -7.917 13.738 -6.384 9.4477 5.8749 -5.286 -5.66 -32.8 1.2234

11.206 -2.318 7.7268 -21.24 17.148 16.101 5.0332 -16.48 -2.568 14.043 -15.98 -15.4

-14.33 0.4627 -0.485 6.6606 15.353 9.111 14.255 2.6014 5.4509 0.5313 8.5873 -0.441

4.5593 12.042 2.3333 -9.165 17.242 0.974 -4.837 -4.7 -4.75 24.942 12.572 -0.092

LBNa200 pH9.0

OD660 平均値 （100%） 0.4496

0.5812 0.5138 0.4228 0.3838 0.445 0.534 0.403 0.4974 0.3812 0.4139 0.4603 0.5105

0.5212 0.5554 0.4597 0.4393 0.3146 0.284 0.4833 0.3999 0.4849 0.418 0.437 0.362

0.4573 0.3632 0.4365 0.459 0.5854 0.3208 0.5053 0.5331 0.3813 0.3674 0.3072 0.4734

0.4791 0.3567 0.3532 0.336 0.3625 0.4993 0.3415 0.4241 0.488 0.2968 0.3361 0.5434

0.492 0.4226 0.3389 0.4547 0.409 0.4141 0.3873 0.4293 0.3922 0.4615 0.2567 0.5084

0.5257 0.4314 0.4553 0.338 0.4229 0.5112 0.449 0.3081 0.4492 0.4267 0.3498 0.4592

0.4068 0.4741 0.584 0.4991 0.6083 0.5375 0.6237 0.5989 0.5273 0.4747 0.5416 0.5267

0.4882 0.5522 0.4711 0.4486 0.507 0.4766 0.5046 0.4939 0.4838 0.4719 0.5096 0.5447

14

平均値 14.193

平均値(100%)との差 平均値の 2倍 28.387

29.272 14.281 -5.96 -14.63 -1.022 18.774 -10.36 10.633 -15.21 -7.939 2.3813 13.547

15.927 23.534 2.2478 -2.29 -30.03 -36.83 7.497 -11.05 7.8529 -7.027 -2.801 -19.48

1.714 -19.22 -2.912 2.048 30.206 -28.65 12.39 18.574 -15.19 -18.28 -31.67 5.295

6.5628 -20.66 -21.44 -25.2 -19.37 11.056 -24.04 -5.67 8.5424 -33.98 -25.24 20.865

9.4321 -6.004 -24.62 1.1357 -9.029 -7.895 -13.86 -4.514 -12.77 2.6482 -42.9 13.08

16.928 -4.047 1.2691 -24.82 -5.937 13.703 -0.132 -31.47 -0.088 -5.092 -22.2 2.1366

-9.518 5.4507 29.895 11.011 35.3 19.552 38.725 33.209 17.284 5.5841 20.464 17.15

8.5869 22.822 4.7834 -0.221 12.768 6.0068 12.235 9.8547 7.6082 4.9614 13.347 21.154

LBNa400 pH9.0

OD660 平均値 （100%） 0.2764

0.364 0.3419 0.3199 0.32 0.3511 0.3658 0.3516 0.3232 0.3348 0.346 0.322 0.3613

0.3731 0.3942 0.2166 0.1893 0.1946 0.2568 0.2226 0.2187 0.2534 0.2346 0.2388 0.2925

0.3506 0.2243 0.2206 0.285 0.2689 0.2553 0.2449 0.2414 0.246 0.219 0.2305 0.2972

0.316 0.2352 0.2245 0.337 0.2172 0.277 0.2316 0.2311 0.2631 0.2577 0.1923 0.3271

0.3097 0.2365 0.2422 0.2266 0.2548 0.1998 0.2081 0.2415 0.2398 0.2182 0.2458 0.3242

0.2809 0.2008 0.2287 0.264 0.1854 0.5249 0.21 0.1793 0.2205 0.198 0.1885 0.3468

0.3452 0.267 0.2866 0.2584 0.2579 0.2504 0.3412 0.3643 0.2629 0.2379 0.3233 0.3155

0.4074 0.2939 0.2821 0.2289 0.3267 0.289 0.298 0.2957 0.3281 0.2615 0.3108 0.3479

平均値 18.145

平均値(100%)との差 平均値の 2倍 36.291

31.687 23.691 15.732 15.768 27.02 32.338 27.201 16.926 21.123 25.175 16.492 30.71

34.979 42.612 -21.64 -31.52 -29.6 -7.096 -19.47 -20.88 -8.326 -15.13 -13.61 5.8195

26.839 -18.85 -20.19 3.215 -2.718 -7.639 -11.4 -12.67 -11 -20.77 -16.61 7.5199

14.321 -14.91 -18.78 21.74 -21.42 0.212 -16.21 -16.39 -4.817 -6.77 -30.43 18.337

12.042 -14.44 -12.38 -18.02 -7.819 -27.72 -24.71 -12.63 -13.25 -21.06 -11.08 17.288

1.6229 -27.36 -17.26 -4.491 -32.93 89.896 -24.03 -35.13 -20.23 -28.37 -31.81 25.464

24.885 -3.406 3.6851 -6.517 -6.698 -9.411 23.438 31.795 -4.889 -13.93 16.962 14.14

47.388 6.326 2.0571 -17.19 18.192 4.5533 7.8093 6.9772 18.699 -5.396 12.44 25.862

Fig.1 スクリーニング方法

15

3-2. pHおよび Na+耐性に関与する遺伝子の予備的スクリーニング 上述の条件を用い、Keio collectionの一部である No.1～11, 39～55の奇数番号の

plate（15枚）（注： Keio Collection のうち、遺伝学研究所より提供されているのは奇数

番号のプレートのみであった）について、上記で策定した方法に従ってスクリーニングを

行った。その結果、四つの条件、すなわち LBK200 （pH 7.0あるいは 9.0）、LBNa200

（pH 7.0あるいは 9.0）のいずれかにおいて、他の株よりと比較して異常な生育を示した

株が半分以上（869株）検出された。このうち、アルカリ条件下（LBNa200 pH9.0）で生

育の低下したものが 181株存在し、これらから他の全ての条件でも同様に生育が低下し

ていた株を除外したものを「アルカリ耐性あるいは Na+に関与する遺伝子の破壊株」の候

補とした。これらをそれぞれの培地での生育パターンを指標に分類し、LBK200および

LBNa200 いずれにおいても pH 9.0で生育が低下した株で破壊されている遺伝子（40

種）を「アルカリ耐性に関与している可能性が高い遺伝子」、LBNa200 pH 9.0でのみ生

育が低下した株で破壊されている遺伝子（58種）を「アルカリ条件下での Na+耐性に関

与している可能性が高い遺伝子」、pHに関係なく LBNa200で生育が低下した株で破

壊されている遺伝子（4種）を「Na+耐性に関与する可能性の高い遺伝子」と判定した

（Table 9. 後に添付）。それらの遺伝子をDAVID functional annotationで解析した結

果をTable 7に記した。なお各遺伝子の機能についてはTable10に記した（後に添付）。

解析の結果、興味深いことに、H+や Na+の輸送に関与する遺伝子は殆ど検出されなか

った一方で、物質の代謝に関与する遺伝子が数多く見出された。また、アルカリ耐性に

関与していると考えられる遺伝子の中に、同一の生合成経路に関与すると考えられるも

のが複数見られ、例えば芳香族アミノ酸生合成の基質となるコリスミ酸生合成に関与する

aro遺伝子が 5種（aroA, aroB, aroC, aroD, aroE）、コリスミ酸を原料とするエンテロバクチン（注：鉄の取り込みに関与する化合物）の生合成経路に含まれる ent遺伝子が 3種（entB, entE, entF）などが検出された。なお chaA遺伝子については、上述の培養条件検討の段階では検出可能と判断されたが、スクリーニングにおいては、測定ごとのばらつ

きが大きかったため、最終的な候補からは除外した。

16

Table 7. DAVID functional annotationの結果 【アミノ酸代謝・合成】 【炭化水素生合成】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

putA zntA pheA aceF rihA

aroA metC gmd cpsB fcl

aroB cbl cpsG rffH

aroC argR nanA ugd

aroD gpt rffA gmd

aroE gltF aroE sdaB

asnA glvG rfaP

【エネルギー産生】 【ビタミン・補酵素の合成・代謝】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

menC zntA yeaX entE rpe

aceF hyfR menC frdB

aceE napF entF ggt

menE aceF gmd

cydB aceE glvG

arcB menE

frdB entB

hypF

【カルボン酸、アミノ酸、アミンへの結合】 【多価金属イオン輸送】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

entF relA entE zntA uidB

aceF entF

arcB fepB

entB

【細胞膜・細胞壁】 【ヌクレオチドへの結合】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

pal ybhL yecS entE sapD ycjV

glpG sapD mglA entF zntA hyfR

cydB zntA ddpD menE relA

arcB sapB ruvA yjjK

ppiD mdtG phoH mglA

entE gpt arcB ddpD

ygdL gltF aroE dbpA

hflC ccmF asnA ugd

uidB cpsB rfaP

rfaP dgoK

yjfZ

【イオンへの結合】 【ストレス応答】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

entE zntA frdB yebG argR

entF rffH ruvA sbcD

menC napF umuD

fepB yeaX dinI

cpsG sdaB phoH

hypF ptr

entB pepQ

aceE

cydB

17

【ヌクレオチド代謝】 【タンパク分解】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

entF relA hflC ptr

gpt umuD pepQ

ydgD

glpG

【二次代謝】 【ビタミン・補酵素】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

rpe entF metC fcl

gmd aceF ugd

glvG aroE gmd

entB kbl

rffA gadA

【糖代謝】 【ヌクレオチド生合成】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

aceF rpe zntA gmd

aceE gmd gpt

nanA sdaB glvG

fruR

【鉄結合】 【転写】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

entE yeaX arcB hyfR

entF frdB umuD uidR

cydB napF putA cbl

fepB sdaB yjhI arcA

entB ruvA rssB

argR

gltF

phoP

nanR

【タンパク質輸送】 【トランスポーター】

アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性 アルカリ耐性 Na 耐性 pH9 で Na 耐性

sapD ddpD chbB ycjV

sapB mglA

一方で、アルカリ及び Na+耐性には直接関係しないと思われるが、興味深いグル

ープとして、pH 7では生育が悪く pH 9では生育が良くなったもの（pH 7は‐/

‐‐で pH 9は平均的/+/++）として検出された 49個の中に、鞭毛に関与する遺伝

子が多数（flgB, flgE, flgG, flgJ, flgK, flgI, fliF, fliG, flhA）含まれていた（Table 8）。

18

Table 8. pH 7では生育が悪く pH 9では生育が良くなったもの

pH7 で育ちが悪く pH9 で育ちが良くなったもの differences (-, --, +, ++)

plate-well No. ORF No. gene name K pH7 K pH9 Na pH7 Na pH9

5-F-5 JW0710 gltA - -

7-H-10 JW0429 lon - -

9-A-10 JW2270 yfbP - -

9-B-11 JW2355 yfdO -- -

9-E-2 JW2507 pepB -- --

9-E-9 JW2250 yfbH -- --

9-F-7 JW4352 radA - --

9-G-4 JW3930 argC - -

9-H-7 JW2152 yeiN - -

11-A-5 JW2702 ygbA - -

11-A-11 JW1835 yebE -- --

11-B-1 JW2446 ypfE - -

11-C-12 JW1913 yedD -- -

11-D-7 JW1631 ydhA - -

11-D-9 JW1766 yeaC -- -

11-F-2 JW2600 yfjG - --

11-G-9 JW1785 yoaG -- --

39-B-5 JW4304 yjiS - -

39-C-4 JW4288 yjiC - -

39-C-5 JW4316 yjiX - -

39-C-6 JW4365 yjjY - -

39-D-3 JW4258 yjhF - -

39-D-4 JW4292 yjiG - -

39-F-5 JW4342 yjjW - -

39-F-9 JW4159 priB - -

41-C-6 JW1394 paaX - -

41-F-8 JW2337 sixA - -

43-B-12 JW1063 flgE -- -

43-D-12 JW1065 flgG -- --

43-E-8 JW3820 fre - - +

43-E-12 JW1067 flgI -- --

43-F-12 JW1068 flgJ -- --

43-G-11 JW1060 flgB -- --

43-G-12 JW1069 flgK - + -

45-A-3 JW1923 fliG - -

45-B-8 JW4279 fimC - -

45-H-1 JW1868 flhA - - +

45-H-2 JW1922 fliF - -

49-D-4 JW0031 carB - -

49-E-7 JW1049 pyrC - -

49-F-2 JW1263 yciK - -

51-E-9 JW3052 fadH - -

51-H-2 JW1723 chbF - --

53-A-7 JW4204 pyrB - --

53-C-2 JW1273 pyrF -- --

53-H-4 JW2541 purL - -

55-F-1 JW0795 glnP - - +

55-F-11 JW3729 rbsC -- + -

55-G-8 JW1847 znuC -- - +

19

4. 考察

本研究では、大腸菌のアルカリ耐性機構の解明に向けた基盤の形成を目的として、

網羅的遺伝子破壊株ライブラリー（Keio collection）を用い、培養時間、培地 pH、

添加するカチオン濃度、解析手法など一連の検討により、スクリーニング手法の確

立を行った。確立したスクリーニング手法により試験的に行った 1400株余のスク

リーニングの結果、101種のアルカリ耐性および Na+耐性に何らかの形で寄与する

可能性が高い遺伝子を見出すことが出来た。さらに、各条件における生育パターン

を詳細に解析することで、これらの遺伝子を 3つのグループに分類できることを見

出した。

一つ目のグループは、破壊株の生育が LBK200 と LBNa200 のいずれにおいて

も pH 9.0で低下したグループであり、これらの遺伝子は、培地中に含まれるカチ

オンの種を問わず、アルカリ耐性において重要な役割を担っている可能性が高いと

考えられる。このグループでは、芳香族アミノ酸生合成、糖生合成、エネルギー産

生、および鉄の輸送に関与する遺伝子が多く見受けられた。現段階では詳細な機構

は不明だが、いずれもアルカリ耐性との関連は報告されていない。特筆すべきは同

一の生合成経路に含まれる aro遺伝子、および ent遺伝子が複数見られた点であろう。先述した様に、aro遺伝子群は芳香族アミノ酸や鉄輸送に関わるエンテロバクチンの生合成に用いられるコリスミ酸の合成経路を構成する遺伝子群であり、この

グループに 5種（aroA, aroB, aroC, aroD, aroE）見出されているが、他のグループでは検出されておらず、これらの結果は、詳細な機構は全く不明ではあるがこれ

らの遺伝子、ひいてはコリスミ酸自体、あるいはその代謝物がアルカリ耐性に関与

する可能性は極めて高いことを示している。さらに、コリスミ酸を出発原料とする

エンテロバクチンの生合成経路の３つの遺伝子も同じグループに属することは、エ

ンテロバクチンの生合成、さらには鉄輸送がアルカリ耐性において重要な役割を持

つ事を強く示唆していると考えられるため、極めて興味深い。加えて、こうした一

つの生合成経路に関与する遺伝子が複数検出できた点は、本スクリーニングがアル

カリ耐性のスクリーニング手法として妥当であることを示す一つの証拠であると

考えている。

二つ目のグループは、pH 9.0の LBNa200でのみ生育が低下したグループであ

20

り、これらは同じ pH 9.0の LBK200では生育が低下しなかったこと、また pH 7.0

の LBNa200でも生育が低下しなかったことから、アルカリ条件、および Na+の存

在それぞれが生育低下の原因ではなく、それらの複合したストレスが原因となった

と考えられる。このグループに属する遺伝子には、アミノ酸や糖の合成に関与する

ものが多く含まれており、Na+の排出に直接関与する様なものは現段階では検出さ

れていない。アルカリ条件下での Na+の排出には nhaA遺伝子産物が主要な役割を果たすことが知られているが、それ以外の遺伝子産物の関与は知られていないこと

から、これらの遺伝子産物の詳細な機能解析を進めれば、細菌の Na+耐性において

新規の機構を見出すことが出来る可能性が高いと考えられる。

三つ目のグループは、NaClを含む培地（LBNa200）においていずれの pH（7.0

あるいは 9.0）でも生育が低下したグループである。このグループに属する遺伝子

の破壊株は、同濃度の KCl を含む培地では生育に異常が認められなかったことか

ら、これらの遺伝子は pHに関係なく Na+濃度の細胞内恒常性維持に関与する可能

性が高いと考えられる。このグループには 4つの遺伝子（zntA、metC、ybhL、sapD）

が見出されているが、いずれも Na+の輸送、あるいは細胞内 Na+濃度の恒常性の維

持に関与するとの報告は無いことから、上記同様、これらの遺伝子産物がどのよう

に細胞内 Na+濃度の維持に関与するのかの詳細な機構については今後の検討が必

要となるだろう。

本スクリーニングの結果をMaurerらによるトランスクリプトーム解析（6）の

結果と比較すると、本スクリーニングによりアルカリ耐性に関与すると考えられた

遺伝子と、トランスクリプトーム解析においてアルカリ条件下での誘導が確認され

た遺伝子は、興味深いことに一部を除いてほとんど一致しなかった。また、トラン

スクリプトーム解析においてアルカリ条件下で発現が誘導されたと報告されてい

る遺伝子の中に、本スクリーニングではアルカリ条件よりもむしろ中性条件での生

育に重要な役割を果たすと考えられると判定されたものが複数存在した。こうした

不一致の原因は現段階では不明ではあるが、一つの要因として、Maurerらの実験

は好気的培養（震盪培養）した大腸菌を用いた実験であったことが挙げられる。本

研究では嫌気的条件下（静置培養）でスクリーニングを行っており、こうした培養

条件の違いが両者間の違いの原因である可能性は高いと考えられる。また、使用し

た pH が、本研究では 9.0、Maurer らの解析では 8.7 であった点も差異が見られ

21

た理由として考えられる。さらに別の要因として、本スクリーニングで見出された

遺伝子が、発現誘導を伴わない「ハウスキーピング」遺伝子としてアルカリ耐性に

関与する可能性も否定できないと考えられる。そうした中でも両者間で一致した遺

伝子（cydB、dinI、asnA）は見られたことから、これらに関しては、嫌気的・好気的条件を問わずアルカリ条件下で発現が誘導されることでアルカリ耐性に関与

すると考えられる。

また、アルカリ耐性とは直接の関与は無いものの、スクリーニングの結果、アル

カリ条件での生育に異常は無いものの、中性条件下での生育が低下するグループが

存在することが明らかとなった。これらのグループの中では、興味深いことに鞭毛

の形成に関与する一連の遺伝子群（flgB, flgE, flgG, flgJ, flgK, flgI, fliF, fliG, flhA）が検出されていた。興味深いことに、flhA を除くこれらの遺伝子は、アルカリ条件下で発現が抑制されることが先のマイクロアレイ解析において報告されている

（6）。本研究で得られた知見は、これを補完するものであり、鞭毛の形成がアルカ

リ条件での生育にはむしろ負の影響を及ぼすことを示すと同時に、本研究で確立し

たスクリーニング法が、アルカリ条件下での生育に関与する遺伝子の機能的スクリ

ーニング法として妥当であることを示唆すると考えている。

現段階では全て株のスクリーニングが終わった訳ではないが、興味深いことに

H+の取り込みや Na+の排出に関与する遺伝子はほとんど検出されず、むしろ化合

物の代謝に関与する遺伝子、および鉄の輸送に関与する遺伝子が多く検出されてい

た。こうした結果は、大腸菌のアルカリ耐性や Na+耐性には、それぞれのイオンの

直接的な輸送よりも、むしろなんらかの間接的な経路が重要な役割を果たす可能性

を示唆するものであると考えている。加えて、これまで細菌のアルカリ耐性はカチ

オン輸送体が主要な役割を果たすと考えられて来たが、遺伝子破壊株を用いた本研

究により、新規の経路が関与するという具体的な証拠を提示できたのではないかと

考えている。ただし、今回見出された経路がどのような分子機構でアルカリ耐性に

寄与するのかについては今後のさらなる解析が必要であろう。

22

謝 辞

Keio collectionの利用はナショナルバイオリソースプロジェクト(NBRP)大腸菌

事業（NIG）のご協力によりご提供頂きました。同事業に深い感謝の意を表させて

頂きます。

本研究の実施および本論文の作成において、ご助言とご指導を頂きました微生物

学研究室 山口利男 助教に心から感謝いたします。

本論文の作成において、ご助言とご指導を頂きました 薬品製造学研究室 朝田

真一 助教に心から感謝いたします。

23

引 用 文 献

１． Padan, E., The enlightening encounter between structure and function in

the NhaA Na+-H+antiporter. Trends. Biochem. Sci., 33, 435-443 (2008). ２． Karpel, R., Olami, Y., Taglicht, D., Schuldiner, S. and Padan E., Sequencing

of the gene ant which affects the Na+/H+ antiporter activity in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 263, 10408-10414 (1988).

３． Pinner, E., Pandan, E., Schuldiner, S., Cloning sequenching, and expression

of the nhaB gene, encoding a Na+/H+ antiporter in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 267, 11064-11068 (1992).

４． Ivey, D. M., Guffanty, A. A., Zemsky, Z., Pinner, E., karpel, R., Pandan, E.,

Schuldiner, S. and Krulwich, T. A., Cloning and Characterization of a

putative Ca+/H+ antiporter gene from Escherichia coli upon functional complementation of Na+/H+ antiporter-deficient strains by the

overexpressed gene. J. Biol. Chem., 268, 11296-11303 (1993). ５． Yamaguchi, T., Tsutsumi, F., Putnoky, P., Fukuhara, M. and Nakamura, T.,

pH-dependent regulation of the multi-subunit cation/proton antiporter

Phal system from sinorhizobium meliloti. Microbiol. 155, 2750-2756 ６． Maurer, L. M., Yohannes, E., Bondurant, S. S., Radmacher, M., and

Slonczewski, J. L., pH reguraters genes for flagellar motility, catabolism,

and oxidative stress in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol.,187, 304-319 (2005)

７． Rosen, Y., Larossa, R. A., Templeton, L. J., Smulski, D. R., and Belkin, S.,

Gene expression analysis of the response by Escherichia coki to seawater. Antonie Van Leeuwenhoek, 81, 15-25 (2002).

８． Baba T., Ara T., Hasegawa M., Takai Y., Okumura Y., Baba M., Kirill A.D.,

Tomita M., Barry L.W., Mori H., Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008 (2006)

24

Table 9. スクリーニングの結果（差が出たもの）

plate- ORF No. LBK200 pH7 LBK200 pH9 LBNa200 pH7 LBNa200 pH9

well No. gene name OD660 stdev OD660 stdev OD660 stdev OD660 stdev

#1 平均 1.066193 0.06369 0.607407 0.047995 1.004099 0.049425 0.524028 0.033935

1-A-1 JW1950 1.142833 0.096722 0.722767 0.018715 1.119067 0.074752 0.618167 0.005979

判定 hchA + +

1-A-2 JW3701 1.190833 0.025926 0.671167 0.026759 1.129167 0.030196 0.550833 0.012478

bglG +

1-A-3 JW3905 1.150433 0.033713 0.689133 0.0535 1.064833 0.050748 0.5742 0.018537

cytR +

1-A-5 JW0430 1.2678 0.098892 0.504167 0.044463 1.086267 0.049915 0.481167 0.01344

hupB + -

1-A-7 JW0662 1.028367 0.134659 0.5396 0.053391 0.772567 0.019868 0.505733 0.027136

nagC -

1-A-8 JW3877 1.2083 0.060809 0.6552 0.037116 1.0696 0.066931 0.5903 0.064485

rhaR + +

1-A-9 JW1316 1.211767 0.134322 0.6944 0.022937 1.146 0.017412 0.543767 0.024399

tyrR + + +

1-A-10 JW5917 0.865967 0.18255 0.463767 0.006361 0.6375 0.074844 0.422833 0.048796

rcsC - - -- -

1-A-11 JW0111 1.037733 0.09577 0.360267 0.03819 1.020567 0.045262 0.313267 0.019156

aceF -- --

1-A-12 JW0711 0.549333 0.059195 0.473233 0.01455 0.5094 0.040619 0.459067 0.010896

sdhC -- - -- -

1-B-7 JW3195 1.0782 0.006929 0.619633 0.033653 1.064 0.01253 0.432767 0.005103

nanR -

1-B-9 JW1610 1.355 0.078525 0.551267 0.063916 1.265467 0.107251 0.429 0.026789

uidR ++ ++ -

1-B-12 JW0712 1.038133 0.119134 0.6347 0.076814 0.982733 0.048558 0.580567 0.007308

sdhD +

1-C-1 JW2201 1.2143 0.03105 0.541833 0.02127 0.987667 0.053983 0.500367 0.068019

ada +

1-C-2 JW4094 1.081233 0.019693 0.6692 0.049197 1.133333 0.066945 0.5476 0.016178

cadC +

1-C-3 JW2361 1.175967 0.093041 0.636333 0.048001 1.143133 0.014897 0.520367 0.043163

dsdC +

1-C-5 JW4221 1.076733 0.054483 0.7057 0.016646 1.1017 0.030442 0.599467 0.03718

idnR + +

1-C-6 JW4079 1.239167 0.06191 0.621667 0.09002 1.265333 0.057101 0.5332 0.036334

melR + ++

1-C-7 JW0019 1.060567 0.029721 0.693533 0.014002 1.0391 0.024077 0.578067 0.081877

nhaR +

25

1-C-8 JW4024 1.113033 0.055268 0.634367 0.052502 1.1236 0.033951 0.618867 0.016822

soxR +

1-C-10 JW0078 1.166633 0.033564 0.600867 0.020702 0.945933 0.039094 0.425533 0.02862

fruR -

1-C-12 JW0713 0.528067 0.061636 0.4379 0.052358 0.532567 0.078137 0.4471 0.006751

sdhA -- -- -- -

1-D-1 JW4077 1.1525 0.021501 0.651 0.260761 0.873667 0.013267 0.549833 0.041752

adiY -

1-D-2 JW1966 1.161933 0.009386 0.626067 0.021258 1.154367 0.096326 0.467367 0.03381

cbl + -

1-D-3 JW3046 1.0275 0.034522 0.682933 0.016903 1.039967 0.055816 0.567567 0.016802

ebgR +

1-D-4 JW2138 1.026233 0.072963 0.522833 0.015491 0.993667 0.03346 0.496267 0.051288

galS -

1-D-5 JW3746 1.2302 0.066056 0.771033 0.089757 1.193733 0.024398 0.632833 0.044863

ilvY + ++ + +

1-D-6 JW3909 1.202333 0.095767 0.599933 0.037005 1.1435 0.071373 0.504 0.032476

metJ + +

1-D-10 JW1702 0.5809 0.031386 0.4417 0.033944 0.590667 0.025526 0.373533 0.014251

ihfA -- -- -- --

1-D-12 JW0714 0.5063 0.040982 0.485167 0.02434 0.550267 0.066742 0.427433 0.017782

sdhB -- - -- -

1-E-1 JW0553 1.474867 0.136842 0.5645 0.110276 1.4317 0.148857 0.641633 0.12126

appY ++ ++ ++

1-E-5 JW0075 1.1399 0.061502 0.736933 0.029041 1.1008 0.026226 0.574867 0.031363

leuO +

1-E-8 JW2644 1.134967 0.121714 0.669667 0.027293 1.0383 0.042913 0.6253 0.022791

stpA +

1-E-9 JW3254 1.075067 0.049881 0.701733 0.008328 1.061367 0.019142 0.5674 0.001735

zntR +

1-E-10 JW3732 1.0343 0.055543 0.6874 0.015398 1.030833 0.02394 0.583967 0.030373

rbsR + +

1-E-11 JW0420 1.079233 0.08618 0.520133 0.079893 1.026167 0.136235 0.503733 0.065154

cyoC -

1-E-12 JW0715 0.587367 0.062629 0.4673 0.098612 0.635733 0.088413 0.376767 0.042484

sucA -- - -- --

1-F-1 JW3206 1.0977 0.022663 0.548067 0.027415 0.974167 0.023601 0.439133 0.036813

argR -

1-F-3 JW0555 1.1243 0.039961 0.703233 0.032486 1.0507 0.016462 0.5967 0.011453

envY + +

1-F-4 JW0895 0.599633 0.042987 0.4645 0.017843 0.565 0.022063 0.441833 0.046743

ihfB -- - -- -

1-F-5 JW0872 1.1222 0.036637 0.777033 0.016275 1.088433 0.031787 0.645167 0.005315

lrp ++ ++

1-F-7 JW4063 1.061533 0.064081 0.688933 0.027227 1.013867 0.066185 0.5654 0.01495

phnF +

1-F-8 JW3089 1.261 0.153772 0.655933 0.146463 1.222267 0.114949 0.5709 0.024782

tdcA + +

1-F-10 JW1901 1.0948 0.075057 0.533333 0.055003 1.0853 0.118953 0.5674 0.005575

sdiA -

1-F-12 JW0716 0.539767 0.006972 0.531767 0.070803 0.497033 0.018343 0.467767 0.161957

sucB -- - -- -

1-G-1 JW3721 1.218167 0.098762 0.498867 0.0237 0.9518 0.026705 0.6319 0.188935

asnC + - +

1-G-5 JW2807 1.1585 0.046446 0.8016 0.063267 1.125867 0.011773 0.644267 0.027375

lysR ++ ++

1-G-6 JW1967 1.1312 0.034304 0.821 0.02975 1.104833 0.024349 0.559933 0.008399

nac ++

1-G-8 JW4200 0.999633 0.10407 0.655133 0.040535 0.977167 0.046758 0.630767 0.043811

treR +

1-G-10 JW2676 1.046433 0.030436 0.704833 0.020018 1.0105 0.026636 0.544033 0.009626

srlR +

26

1-G-11 JW0422 1.091433 0.078967 0.6691 0.043743 0.993033 0.087085 0.6374 0.034746

cyoA ++

1-G-12 JW0717 0.729767 0.023928 0.386 0.054225 0.623533 0.02259 0.423867 0.036462

sucC -- -- -- -

1-H-1 JW0305 1.342033 0.109379 0.6862 0.052966 1.191267 0.038087 0.551533 0.011398

betI ++ + +

1-H-2 JW5894 1.404267 0.085143 0.771267 0.068753 1.372167 0.047839 0.648133 0.062817

cynR ++ ++ ++ ++

1-H-4 JW3964 1.261433 0.038011 0.708267 0.053345 1.1435 0.033074 0.612167 0.191168

hupA + + + +

1-H-12 JW0739 1.1712 0.120742 0.653833 0.078744 0.897667 0.122626 0.604333 0.02217

galM - +

#3 平均 1.07964 0.069268 0.643528 0.067535 1.031539 0.05287 0.532991 0.06404

3-A-1 JW0807 1.075767 0.040808 0.7781 0.041076 1.080967 0.025901 0.645967 0.020596

ybiW + +

3-A-2 JW1228 0.9245 0.060691 0.590933 0.040275 0.935633 0.045412 0.5393 0.045996

adhE -

3-A-4 JW2273 0.788533 0.043483 0.411533 0.035983 0.659767 0.017351 0.426833 0.113816

nuoL -- - -- -

3-A-5 JW5875 0.6995 0.04972 0.495833 0.024175 0.578767 0.006503 0.4339 0.119497

nuoB -- - -- -

3-A-6 JW3205 0.766667 0.085795 0.493867 0.106398 0.6366 0.04145 0.446333 0.081991

mdh -- - -- -

3-A-7 JW3923 1.1301 0.015324 0.806033 0.037108 1.169467 0.018928 0.776867 0.219134

pflD + ++

3-A-11 JW1872 1.198333 0.004524 0.752133 0.040455 1.194 0.018613 0.5495 0.051478

cheB +

3-B-4 JW2274 0.771633 0.089856 0.440067 0.024019 0.612167 0.033011 0.352933 0.032451

nuoK -- - -- --

3-B-5 JW2283 0.7465 0.133067 0.4653 0.050959 0.5782 0.058493 0.371333 0.080506

nuoA -- - -- -

3-B-6 JW3343 1.165233 0.026162 0.878867 0.172488 1.197233 0.029877 0.643333 0.103641

yhfW ++ + +

3-B-10 JW1116 1.156667 0.030543 0.5445 0.050119 1.158467 0.031281 0.433633 0.004087

phoP -

3-C-3 JW1841 1.112667 0.061159 0.5077 0.034832 0.964867 0.044106 0.454567 0.068128

zwf -

3-C-4 JW2275 0.6906 0.07775 0.378333 0.032642 0.612167 0.027511 0.387633 0.063516

nuoJ -- -- -- -

3-C-5 JW2385 1.268433 0.041539 0.6264 0.031833 1.080433 0.04055 0.448767 0.029354

glk +

3-C-6 JW3349 0.978967 0.065903 0.4687 0.038818 0.8648 0.130312 0.2793 0.209475

rpe - - --

3-C-8 JW4114 1.091167 0.074213 0.609367 0.047808 1.008533 0.092009 0.441833 0.038496

frdB -

3-C-9 JW0612 1.257467 0.063357 0.701933 0.081791 1.178533 0.055519 0.5657 0.020878

citB +

3-D-1 JW0886 1.288667 0.104547 0.7596 0.045422 1.236633 0.071337 0.658533 0.224071

pflB + + +

3-D-2 JW5906 1.3295 0.083032 0.983767 0.255045 1.267833 0.116429 0.6931 0.09496

gapC + ++ + +

3-D-3 JW1843 1.1413 0.09132 0.7885 0.01778 1.136233 0.043483 0.6042 0.031369

pykA +

3-D-4 JW2276 0.6426 0.052322 0.4097 0.02925 0.550033 0.036745 0.367367 0.015864

nuoI -- - -- -

3-D-6 JW3366 0.929433 0.072461 0.651767 0.012139 0.892267 0.010871 0.491967 0.040311

pck -

3-D-7 JW3974 1.3374 0.088422 0.724633 0.266144 1.1806 0.054204 0.495733 0.043463

aceB +

3-D-11 JW1951 1.1 0.033329 0.8808 0.077631 1.103 0.017014 0.6937 0.042154

yedV ++ +

3-D-12 JW2367 1.216367 0.009609 0.772333 0.028513 1.207367 0.022459 0.574367 0.074285

+ +

27

3-E-4 JW2277 0.778567 0.034448 0.4031 0.044859 0.640433 0.089891 0.349367 0.040797

nuoH -- -- -- --

3-E-5 JW2448 1.262867 0.071162 0.730167 0.180924 1.2237 0.065068 0.6702 0.177231

talA + + +

3-E-6 JW3587 1.143433 0.039757 0.924433 0.261354 1.054033 0.046434 0.504033 0.015972

gpmI ++

3-E-7 JW3975 1.179833 0.158759 0.7625 0.183105 1.087733 0.054661 0.5576 0.070697

aceA +

3-E-9 JW0683 1.414133 0.128389 0.729967 0.372595 1.245033 0.111215 0.5265 0.147042

kdpD ++ +

3-E-10 JW1223 0.9545 0.142715 0.484767 0.044738 1.125 0.047266 0.3628 0.05134

rssB - - --

3-E-12 JW2453 0.974767 0.033117 0.503133 0.01195 0.990767 0.054432 0.456267 0.034078

narQ -

3-F-1 JW0960 1.313433 0.140116 0.700067 0.119148 1.291933 0.214218 0.550833 0.07171

appC + +

3-F-2 JW1603 1.3111 0.072016 0.9175 0.101019 1.168067 0.080899 0.5931 0.088235

fumC + ++

3-F-3 JW2198 1.2252 0.089425 0.852833 0.099435 1.184833 0.051648 0.638067 0.068533

mqo + + + +

3-F-4 JW2278 0.700767 0.055561 0.433 0.007062 0.639433 0.08098 0.3963 0.021849

nuoG -- - -- -

3-F-5 JW2449 1.3263 0.009321 0.7494 0.170464 1.2256 0.069023 0.5609 0.068262

tktB + +

3-F-11 JW2063 1.237767 0.055002 0.854067 0.176489 1.2221 0.02936 0.5859 0.064217

baeS + + +

3-G-1 JW0961 1.281033 0.128864 0.468133 0.01972 1.0899 0.123912 0.454233 0.060818

appB + -

3-G-3 JW2271 0.808 0.061412 0.4477 0.01905 0.753167 0.072113 0.427767 0.029517

nuoN - - - -

3-G-4 JW2279 0.775533 0.079891 0.380067 0.02045 0.783933 0.134764 0.4218 0.049261

nuoF -- -- - -

3-G-5 JW0563 1.014967 0.11957 0.6801 0.04418 1.002633 0.029196 0.640767 0.043236

cusB +

3-G-7 JW4051 1.201667 0.05321 0.710433 0.045947 1.1606 0.096756 0.650567 0.045877

rpiB +

3-G-8 JW0389 1.092667 0.070073 0.5619 0.124809 1.1327 0.086003 0.657267 0.126366

phoB +

3-G-11 JW2181 1.2353 0.085424 0.8285 0.156611 1.194433 0.040173 0.6959 0.14904

narP + + + +

3-H-1 JW1122 1.069333 0.084749 0.561233 0.082141 0.878667 0.056357 0.535333 0.042084

icd -

3-H-3 JW2272 0.754833 0.039761 0.438233 0.030428 0.675833 0.032061 0.442167 0.02562

nuoM -- - -- -

3-H-4 JW2280 0.711667 0.130108 0.501233 0.062676 0.7105 0.070936 0.434967 0.089314

nuoE -- - -- -

3-H-5 JW2943 1.253667 0.067196 0.843867 0.022689 1.221267 0.101392 0.6484 0.050673

glcB + + + +

3-H-6 JW3918 1.262 0.095384 0.767133 0.026088 1.2671 0.154913 0.693967 0.085287

fsaB + + + +

3-H-7 JW4083 1.206 0.090599 0.778133 0.021313 1.167233 0.124025 0.670367 0.10665

fumB + +

3-H-10 JW1871 1.277467 0.238879 0.8101 0.147294 1.176167 0.034133 0.510033 0.05888

cheY + +

3-H-11 JW2205 1.220433 0.061387 0.6622 0.042324 1.222367 0.055199 0.726767 0.188604

rcsB + ++

#5 平均 1.107003 0.081826 0.625926 0.042501 1.096531 0.077517 0.53251 0.042816

5-A-1 JW2757 0.9814 0.077736 0.718533 0.021274 0.997633 0.042448 0.5894 0.038497

barA -

5-A-2 JW3644 1.237033 0.099949 0.789767 0.05903 1.449367 0.118131 0.662033 0.079876

uhpA + + ++ +

28

5-A-4 JW1186 1.260833 0.110146 0.715567 0.034577 1.314367 0.156649 0.610933 0.090516

treA + +

5-A-5 JW0855 1.303267 0.177716 0.7198 0.042389 1.378167 0.154532 0.546567 0.073759

poxB + ++

5-A-7 JW0401 1.151967 0.076522 0.753133 0.033803 1.456 0.05685 0.6964 0.04583

tsx + ++ ++

5-A-8 JW3043 1.290267 0.158957 0.7743 0.029782 1.377567 0.195328 0.6249 0.072421

aer + + ++ +

5-A-9 JW0100 1.067367 0.103919 0.767267 0.0217 1.048433 0.160054 0.649333 0.070862

coaE + +

5-B-1 JW2993 1.165567 0.024795 0.7278 0.028666 1.197867 1.084044 0.655 0.089582

qseB + +

5-B-4 JW2034 1.111533 0.123071 0.502467 0.017159 1.160767 0.132171 0.449133 0.014708

cpsB - -

5-B-6 JW2334 1.2979 0.11379 0.597567 0.070797 1.168267 0.056905 0.497333 0.047101

yfcT +

5-B-9 JW0243 0.9744 0.066486 0.545433 0.045584 0.9471 0.027916 0.423267 0.014005

ykfA - - -

5-B-10 JW3367 1.285167 0.084769 0.6648 0.036497 1.144667 0.012915 0.486867 0.030172

envZ +

5-B-11 JW2497 0.9993 0.058597 0.5085 0.035422 0.827633 0.010226 0.405067 0.008919

yfgM - - -

5-C-1 JW2994 1.139667 0.068849 0.4859 0.021047 1.1068 0.0398 0.5509 0.040179

qseC -

5-C-3 JW4086 1.134333 0.075608 0.680667 0.041389 1.240433 0.096983 0.5816 0.032174

dcuS +

5-C-5 JW2121 1.338433 0.127582 0.703233 0.107074 1.368567 0.127776 0.5663 0.062344

dld + +

5-C-7 JW2044 1.274933 0.181906 0.6588 0.02996 1.276867 0.046259 0.554933 0.030097

wcaA + +

5-D-2 JW3882 0.544633 0.136057 0.3493 0.048978 0.427233 0.076915 0.361333 0.027951

cpxA -- -- -- --

5-D-5 JW3580 1.218633 0.098115 0.6419 0.071442 1.2628 0.102656 0.557467 0.032842

lldD +

5-D-8 JW0945 0.907567 0.046483 0.585633 0.017867 0.9804 0.167869 0.508067 0.024681

helD -

5-E-1 JW5536 1.192533 0.059012 0.377833 0.018519 1.1979 0.108383 0.351467 0.013866

arcB -- --

5-E-2 JW3883 1.0188 0.030424 0.411933 0.065882 0.906667 0.113357 0.4024 0.028531

cpxR -- - -

5-E-5 JW0675 1.104267 0.02603 0.728633 0.034699 1.0545 0.043172 0.6088 0.050029

pgm - +

5-E-9 JW0318 1.083033 0.047602 0.6848 0.011396 1.091033 0.018461 0.640833 0.019203

yahL +

5-E-10 JW2293 1.1566 0.076002 0.755 0.021826 1.204933 0.04646 1.204933 0.04646

ackA +

5-E-12 JW2633 1.167533 0.019606 0.687667 0.006536 1.3095 0.143813 0.601567 0.055005

yqaD +

5-F-2 JW3967 1.263967 0.053405 0.7369 0.04545 1.178133 0.015553 0.663133 0.017672

zraS + + +

5-F-3 JW4364 1.084367 0.070052 0.4468 0.05765 1.067667 0.082888 0.315233 0.015153

arcA - --

5-F-4 JW1644 0.286767 0.073001 0.2928 0.023522 0.2908 0.04993 0.234667 0.028665

rnt -- -- -- --

5-F-5 JW0710 0.9169 0.056006 0.654367 0.04236 0.8511 0.10055 0.503633 0.019052

gltA - -

5-F-7 JW3285 1.2463 0.115878 0.651167 0.065768 1.29 0.143218 0.5321 0.026861

gspA + +

5-F-9 JW0110 1.025233 0.076836 0.341833 0.07896 1.069767 0.025766 0.265367 0.06479

aceE -- --

5-G-1 JW3624 1.208533 0.120694 0.7647 0.01816 1.075967 0.026564 0.639033 0.037512

rpoZ + +

29

5-G-2 JW3968 1.249067 0.068572 0.708967 0.030962 1.246033 0.074346 0.543567 0.043316

zraR + +

5-G-3 JW3021 1.2443 0.103145 0.747433 0.042094 1.206833 0.053321 0.5728 0.033975

glgS + +

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renD + + +

5-H-9 JW4191 0.544533