Efecto de iones en la Pirazinamidasa recombinante de la cepa H37Rv de Mycobaterium tuberculosis Patricia Ferrer

Efecto de iones en la Pirazinamidasa recombinante de la cepa H37Rv de

Mycobaterium tuberculosis

Patricia Ferrer

H37Rv

Pirazinamida PirazinamidasaModo de acción

Clonación, expresión y purificación

Quelación

Reactivación enzimática con

iones solosReactivación enzimática en

combinación iónica

Parámetros cinéticos

Marco general

¿Qué es la pirazinamida?

nicotinamidapirazinamida≈

Reducción del tratamiento de la TB de 9 a 6 meses

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a8/Nicotinamide_structure.svg

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7c/Pyrazinamide.svg

Marco general

Modo de acción de la Pirazinamida

* No tiene un blanco específico intracelular

*Pseudo-NAD (vía de reciclaje)

*Inhibición/feedback en síntesis de NAD

Disrupción de la fuerza protón motriz y

depleción de energía

Función de transporte de

membrana

Marco general

Pirazinamidasa de Mycobacterium tuberculosis

• Nicotinamidasa

• 37% de identidad de seq con Pzase de Pyrococcus horikoshii 999

• 6 hojas beta

• 4 alfa hélices

• Sitio activo: D8, A134, C138

• Sitio de coordinación: H51, H71, D49

Marco general

Diagrama del sitio activo unido al Zn+2 (en PH999)

Marco general

Mecanismo de hidrólisis de PZA por la PZAsa de Mycobacterium tuberculosis

Hipótesis

La enzima H37Rv de Mycobaterium tuberculosis quelada, podría reactivarse e incluso llegar a aumentar su actividad en presencia del Zn+2 o de algún metal de transición gracias a su unión en el sitio de coordinación.

Objetivos

• Encontrar el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima H37Rv de Mycobaterium tuberculosis quelada.

• Evaluar las consecuencias sobre la actividad enzimática frente a una interacción iónica en una misma reacción

• Determinar los parámetros cinéticos de la enzima H37Rv sin quelar (dejada a temperatura ambiente por 6 horas)

• Comparar los parámetros cinéticos de la enzima H37Rv quelada junto con los iones vs la enzima sin quelar

¿Cuál será el ión capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?

Clonación y expresión

pET28a:: His6-PncA (se adicionan 6 His al extremo COO- de la enzima)

Escherichia coli Novablue cells

BL21(DE3)pLysS cells

expresión

Caldo LB + KanamicinaIPTGCentrifugar

Pellet en binding buffer (buffer fosfato 20mM. 0.5 NaCl, imidazol 20mM)


Purificación de la enzima

Células a -70ºC

Sonicación

Centrifugación

Recuperación del sobrenadante

Obtención del extracto crudo

Cromatografía de afinidad

Fracción soluble

Columna His-Trap

Lavados con buffer 40 mM imidazol

Salida de la Pzasa con buffer 60 mM imidazol

Análisis de fracciones por SDS-PAGE


Purificación de la enzima

SDS-PAGE Gel de las fracciones de la cromatografía

Prueba de Bradford

T10 T11 T12 T13 T14 M T15 T16

Concentración de fracciones

Nuevo SDS-PAGE


Quelación Pzase H37Rv

Control Muestra quelada (qx)

* 50mM Buffer fosfato pH 6.45

* Agua MQ

* 50mM Buffer fosfato pH 6.45

* Agua MQ

* EDTA 80 mM

En incubación por 6 horas

a T amb

Lavar con buffer fosfato pH 6.45 (filtración, Amicon - membrana de ultrafiltración de 10 Kda) x 3 veces

Prueba de Bradford


Prueba de actividad cualitativa (método de Wayne)

Enzima control y quelada (qx)

50 mM Buffer fosfato pH 6.45

Pirazinamida 20 mM

Agua MQ

Incubación por 3 min a 37ºC

Añadir sulfato de amonio ferroso 20%

Inmediatamente añadir 0.1M Buffer glicina pH 3.4

Diferencia en intensidad de color


Reactivación de la Pzasa usando metales

Control Muestra Quelada

Enzima 3uM Enzima 3uM

50mM Buffer fosfato pH6.4 50mM Buffer fosfato pH6.4

Agua MQ Agua MQ

20mM PZA 20mM PZA

---- Con o sin ión (0.1-1.5mM) **

** según el metal



Iones

Fe2(SO4)3.H2O

FeSO4.7H2O

CuCl2.2H2O

Cd(NO3)2.4H2O

MgSO4.7H2O

CoSO4.7H2O

MnSO4.H2O

CaCl2

Zn (NO3) 2 .6H2O

Concentración óptima de cada

metal

Titulación



blanco controlqx sin

iónqx- Cd qx- Ca qx- Co qx- Cu qx-F e+2 qx- Fe+3 qx-Mg qx-Mn qx-Zn

----- x x x x x x x x x x x

X x x x x x x x x x x x

X x x x x x x x x x x x

----- ----- ----- x x x x x x x x x

x x x x x x x x x x x x

Pzasa

Buf.PO4

Agua MQ

ión

Pza





2. Incubar las muestras por 30 minutos a 37ºC

1. Añadir sólo enzima, agua, buffer e ión (según el caso)

3. Añadir la Pza e incubar las muestras por 3 minutos a 37ºC

4. Agregar sulfato de amonio ferroso e inmediatamente buffer glicina pH 3.4





T = 0 T = 1 T = 2 T = 3 T = 4 T = 5 T = 6 T = 7 T = 8 T = 9 T = 10 T = 11

T = 3 T = 4 T = 5 T = 6 T = 7 T = 8 T = 9 T = 10 T = 11 T = 12 T = 13 T = 14

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

Tiempo Pza

Tiempo de

detener la rxn

Tiempo de rxn /tubo



4. Agregar sulfato de amonio ferroso e inmediatamente buffer glicina pH 3.4

5. Centrifugar las muestras por 10 minutos a 13 000 RPM

6. Colocar por duplicado un volumen de cada muestra en un placa (espectrofotómetro a 450nm)

Prueba de actividad cuantitativa (método de Wayne)

7. Realizar prueba de Bradford de cada una de las muestras/rxn



Actividad Pzasa

0.0004

0.0143

0.0032

0.00060.0004

0.0105

0.0004 0.00030.0007

0.0097

0.0041

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0.016

0.018

no qx qx sin ion Ca Cd Co Cu Fe2+ Fe3+ Mg Mn Zn

Ac

tiv

ida

d (

OD

/uM

*min

)

1er experimento2do experimento3er experimentopromedio



% de Recuperación de actividad enzimática

2.40

27.24

137.43

0.08 0.00 -0.28 3.32

92.39

37.17

-10.00

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

100.00

110.00

120.00

130.00

140.00

150.00

Ca Cd Co Cu Fe2+ Fe3+ Mg Mn Zn

%

1er experimento 2do experimento3er experimento promedio

% recuperación = (Act con metal - actividad qx sin ión) / ( actividad de no qx – actividad qx sin ión) x 100



% de Recuperación de actividad enzimática

2.40

27.24

137.43

0.08 0.00 -0.28 3.32

92.39

37.17

-10.00

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

80.00

90.00

100.00

110.00

120.00

130.00

140.00

150.00

Ca Cd Co Cu Fe2+ Fe3+ Mg Mn Zn

%

1er experimento 2do experimento3er experimento promedio

Los metales que reactivan más a la enzima: Co > Mn > Zn > Cd

¿Cuál será el efecto en una interacción iónica?

Reactivación de la Pzasa con 6 combinaciones posibles a partir de 4 iones

blanco control qx sin

iónQx

Cd+MnQx

Co+ZnQx

Co+CdQx

Mn+ZnQx

Mn+Cdqx

Zn+CdQx-Co Qx-Mn Qx-Zn Qx-Cd

Pirazinamidasa

Agua MQ

Pirazinamida

---- ---- ---- [óptima de ión] / 2 **

** [óptima] de ión

Co, Mn, Cd = 1mM

Zn = 1.5 mM

** [ión] en el experimento

Co, Mn, Cd = 0.5mM

Zn = 0.75 mM



Actividad Pzasa

0.0039

0.0050

0.0092

0.0154

0.0011

0.0073

0.0123

0.0004

0.0087

0.0161

0.0099

0.0041

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0.016

0.018

0.020

noqx qx sin ion Co + Cd Co + Mn Co + Zn Mn + Cd Mn + Zn Zn + Cd Co Mn Zn Cd

Act

ivid

ad (

OD

/uM

*min

)

1er experimento2do experimento3er experiementopromedio



Por lo tanto:

• No habría sinergismo en ningún caso

• La interacción produciría en cambio una disminución de la actividad o se manifestaría como si se tratara del ión sólo


De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>>Mn, Zn, Cd ???

ENZYME - The Enzyme Data Bank


De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd???


De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd ???


De los 4 metales que dan lugar a una mayor reactivación enzimática: Co+2 >>> Mn, Zn, Cd ???


Habrá alguna relación entre la homeostasis iónica y el parasitismo intracelular?

X+2 = Fe+2, Cu+2, Mn+2, Zn+2

Nramp2 homólogo de rata

Simporter potones/cationes divalentes de amplia

especificidad

Fe+2 >> Zn+2, Mn+2, Cu+2, Co+2, Ni+2, Cd+2, Pb+2

¿Cuáles serán los parámetros cinéticos de la H37Rv?

Cinética enzimática

Kcat = nº de recambio


Cinética enzimática


Cinética enzimática de la H37Rv control

0 0.05 0.10 0.15 0.25 0.50 1 2 5 10 15 20

Pirazinamidasa

Buffer fosfato pH 6,4

Agua MQ

[Pza] mM

Incubación por 2 min a 37ºC

Intervalo de adición de la droga 1 min

Tiempo de reacción con la droga 1 minuto a 37ºC



Velocidad vs [sustrato]

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500

[sustrato uM]

Vel

oci

dad

(u

mo

l/min

)

Velocidad vs [sustrato]

-0.020

0.000

0.020

0.040

0.060

0.080

0.100

0.120

0.140

0.160

0.180

0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500

[sustrato uM]

Vel

oci

dad

(um

ol/m

in)

1er experimento

2do experimento



1er experimento

Lineweaver-Burke y = 0.8186x + 5.8342R2 = 0.9985

0.000

20.000

40.000

60.000

80.000

100.000

120.000

140.000

160.000

180.000

-2.000 48.000 98.000 148.000 198.000 248.000

1/PZA (1/umol)

1/V

elo

cid

ad (

min

/um

ol)



2do experimento

Lineweaver-Burke y = 1.2098x + 6.1112

R2 = 0.9935

0.000

10.000

20.000

30.000

40.000

50.000

60.000

70.000

80.000

90.000

100.000

-2.000 48.000 98.000

1/PZA (1/umol)

1/V

elo

cid

ad (

min

/um

ol)

Marco general

Acción de la pirazinamidasa

Metabolismo de NAD

NAD -glycohydrolase

Nicotinamide-nucleotide adenylyltransferase NAD(+) synthase

Nicotinamidase

phosphorilase

Marco general

Método de Wayne

Sulfato de amonio ferroso

Buffer glicina pH 3.4


¿Cuál será el íon capaz de reactivar más fuertemente a la enzima?


Titulación: ej del Fe+2, del Mn+2 y del Zn+2

Titulación Fe+2

0.000

0.002

0.004

0.006

0.008

0.010

0.012

0.014

0.016

noquelada

qxsinion 0.01 0.05 0.1 0.25 0.5 0.75 1

Act

ivid

ad (O

D/u

M*m

in)

1er experimento

2do experimento




Titulación Manganeso

0.0000.0020.0040.0060.0080.0100.0120.0140.0160.0180.020

no qx qx sinion

0.01 0.05 0.1 0.25 0.5 0.75 1 1.5 2

Act

ivid

ad (

OD

/uM

*min

)

1er experimento

2do experimento

Titulación Zinc

0.000

0.005

0.010

0.015

0.020

0.025

0.030

no qx qx sinion

0.01 0.05 0.1 1 1.5 2

Act

ivid

ad (O

D/u

M*m

in)

1er experimento

2do experimento






Iones [final en la rxn] mM

Fe2(SO4)3.H2O 0.1

FeSO4.7H2O 0.1

CuCl2.2H2O 0.1

Cd(NO3)2.4H2O 1

MgSO4.7H2O 1

CoSO4.7H2O 1

MnSO4.H2O 1

CaCl2 1

Zn (NO3) 2 .6H2O 1.5

% rec = d / x 100



Actividad

Enz qx + iones

No qx

Qx sin ión

Ión1 Ión2 Ión3

d

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