Efecto de la eritropoyetina exógena, sobre el proceso de eritropoyesis en ratas wistar macho

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Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán-C1

Bioquímica de Sistemas

Proyecto

“Efecto de la eritropoyetina exógena, sobre el proceso de eritropoyesis en ratas wistar

macho”

Alumnos: Álvarez Flores Jazmín Chávez Maya Yesenia

Lozano Amado Daniela Ortega Vilchis Cristhian Leonardo Pérez Santiago América Jannine

Asesores:

Q.F.B Azucena Lee Mendoza Q.F.B Gabriela Escalante Reynoso

Grupo: 1552

Cuautitlán Izcalli, 13 de Noviembre de 2008

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Índice

Portada ……………………………………………………………………………………………………………………………………1

Definición del Problema……………………………………………………………………………………………………………3

Justificación de Problema…………………………………………………………………………………………………………3

Marco teórico…………………………………………………………………………………………………………………………..4 Generalidades de Sangre Composición………………………………………………………………………………………………………………..4 Paquete Celular……………………………………………………………………………………………………………6

Plasma………………………………………………………………………………………………………………………….6 Eritrocito Estructura…………………………………………………………………………………………………………………….7 Función-Hemoglobina………………………………………………………………………………………………….8 Metabolismo Funcional……………………………………………………………………………………………….9 Grupo Hemo………………………………………………………………………………………………………………13 Eritropoyesis…………………………………………………………………………………………………………………………..17 Técnicas………………………………………………………………………………………………………………………………….18

Hemoglobina……………………………………………………………………………………………………………..18 Hematocrito……………………………………………………………………………………………………………….18 Fragilidad Osmótica……………………………………………………………………………………………………19 Bilirrubina libre…………………………………………………………………………………………………………..20 Conteo de Reticulocitos……………………………………………………………………………………………..21

Objetivos………………………………………………………………………………………………………………………………..22

Hipótesis…………………………………………………………………………………………………………………………………22

Materiales y Metodología Experimental…………………………………………………………………………………23

Cronograma……………………………………………………………………………………………………………………………26

Resultados………………………………………………………………………………………………………………………………27

Graficas y Análisis de Resultados…………………………………………………………………………………………….28

Grafico de peso………………………………………………………………………………………………………….28 Grafico de conteo de reticulocitos…………………………………………………………………………….28 Grafico de hematocrito………………………………………………………………………………………………29 Grafico de hemoglobina…………………………………………………………………………………………….30 Grafico de bilirrubina directa……………………………………………………………………………………..31 Grafico de bilirrubina total………………………………………………………………………………………..31

Conclusiones…………………………………………………………………………………………………………………………..32

Referencias…………………………………………………………………………………………………………………………….33

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Planteamiento del problema

Conocer los efectos que produce la administración de eritropoyetina recombinante humana (rHu-EPO) en ratas wistar macho, realizando pruebas bioquímicas-hemáticas, que nos permitan cuantificar los parámetros que se relacionan con el proceso de eritropoyesis.

Justificación de Problema Este proyecto, tiene como finalidad, saber qué efectos causa la administración de eritropoyetina recombinante humana (rHu-EPO) en lotes de ratas wistar macho; es importante destacar la importancia que tiene el uso de animales de laboratorio en el desarrollo de la investigación biomédica, en este caso, la rata, la cual es reconocida como un modelo en la investigación, elegida por ciertas cualidades como son: el tamaño pequeño, corto tiempo de reproducción, fácil alimentación y sobre todo, la gran similitud que tiene su metabolismo con el del humano; debido a ello, es posible experimentar metodologías que tendrán, en un futuro, una aplicación directa en el ser humano. La rHu-EPO es una forma de agente hematopoyético biosintético de la Eritropoyetina sérica (hormona endógena glicoproteínica). La deficiencia de Eritropoyetina, acarrea severas enfermedades hematológicas, por lo que se ha tenido que hechar mano de la biotecnología (Tecnología de DNA Recombinante) para la obtención de una hormona virtualmente idéntica, a partir de líneas celulares de ovarios de Hámsters chinos. La rHu-EPO se encuentra disponible como Eritropoyetina alfa (epoetin alfa) y como Eritropoyetina beta (epoetin beta). Posee secuencias y acciones farmacológicas idénticas a las de la hormona endógena, pero difieren en la naturaleza de la composición de los carbohidratos, no obstante, se obtienen efectos similares a los de la hormona endógena. La rHu-EPO estimula la proliferación, maduración y diferenciación de los precursores eritrocíticos en la médula ósea, en forma idéntica a la eritropoyetina endógena humana. La eritropoyetina también libera reticulocitos al torrente sanguíneo, donde madurarán a eritrocitos. La administración intravenosa o subcutánea de rHu-EPO ha demostrado estimular la eritropoyesis en voluntarios sanos, pacientes con insuficiencia renal crónica y pacientes infectados con VIH con niveles de eritropoyetina endógena menores a 500 mU/ml. Por vía intravenosa, las concentraciones pico se logran a los 15 minutos aproximadamente, mientras que por vía subcutánea se obtienen entre 5 y 24 horas, después de la aplicación. Desgraciadamente, la eritropoyetina se reviste de actualidad cada cierto tiempo debido a su uso como sustancia dopante en deportes que requieren alta resistencia, como el ciclismo y el atletismo de fondo, debido a que los músculos requieren oxígeno para realizar cualquier tipo de ejercicio y sus necesidades aumentan paralelamente a la intensidad del esfuerzo realizado. En caso de que no llegue suficiente oxígeno y se siga haciendo deporte, las células musculares obtienen la energía siguiendo una vía metabólica anaerobia de la que resulta la síntesis de ácido láctico. Esta alternativa es responsable de la aparición de la sensación de fatiga muscular y, cuando el ácido láctico cristaliza, de las típicas agujetas que suceden a una actividad deportiva intensa. El mecanismo que buscan los deportistas mediante la administración de EPO es la de aumentar la masa eritrocitaria, aumentando la capacidad de la sangre de transportar oxígeno. De esta

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forma, se aseguran de que llegan mayores cantidades de energía a los músculos y de que la vía anaerobia y, por tanto, la fatiga muscular tarda más en aparecer, con lo que incrementan su capacidad de esfuerzo y su resistencia. Se ha demostrado que el uso de EPO hasta incrementar los niveles de hemoglobina por encima de 13g/dl aumenta considerablemente el riesgo de fallecimiento por enfermedades cardiovasculares. El aumento de la masa eritrocitaria va de la mano con el aumento de la viscosidad sanguínea, lo que dificulta y ralentiza la circulación. Esto favorece la aparición de trombos que pueden embolizar y producir infartos, de especial importancia en corazón y cerebro, o episodios de muerte súbita. Debido a estos pros y contras, resulta de vital importancia el estudio de dicha hormona endógena, y corroborar, por medio de pruebas bioquímicas-hemáticas como son: Medición de Hemoglobina, frotis sanguíneo, Conteo de reticulocitos, Hematocrito, Bilirrubina Libre y Fragilidad Osmótica, la repercusión y efecto que causa en el proceso de eritropoyesis, en el cual se puede ver afectado el metabolismo de los eritrocitos, que se verá reflejado en la maduración y cantidad que se encuentran en el torrente sanguíneo; dicha investigación puede ser extrapolada hacia el metabolismo humano, y tener una aplicación benéfica hacia la mejora de la calidad de vida de la población.

Marco Teórico

� Generalidades de Sangre Existen varios conceptos de sangre desde diferentes puntos de vista: � Anatómico: Es un compartimiento cerrado, que se mantiene en movimiento regular y

unidireccional debido al bombeo del corazón. � Fisiológico: Es un líquido cuyas funciones principales son el transporte de elementos a los

diferentes sitios del organismo, la defensa del mismo contra elementos extraños (agresiones físicas, mecánicas o químicas), así como el mantenimiento del equilibrio hidroelectrolítico.

� Histológico: Es un tejido del tipo conjuntivo especializado hematopoyético (variedades

mieloide y linfoide), formado por líquido y tres clases de elementos formes: eritrocitos, leucocitos y plaquetas.

� Bioquímico: Es una suspensión de células en un líquido que contiene iones y elementos

orgánicos indispensables para las actividades metabólicas del organismo. � Físico: Un líquido con células en suspensión, que se mantiene en estado de solución en los

vasos sanguíneos y que al salir de ellos, por ejemplo: a través de una lesión, puede pasar al estado de gel.

Con lo anterior se puede integrar una definición que incluya los aspectos más relevantes: Definición: La sangre es un tejido en circulación dentro de los vasos sanguíneos, cuya

composición es compleja aunque relativamente constante; constituida por una fase líquida

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que se denomina plasma, en donde se encuentran suspendidos los elementos formes

(celulares) y disueltas algunas sustancias orgánicas e inorgánicas.1

Al dejarla en reposo, las células sedimentan y el plasma aparece como un líquido sobrenadante de color amarillo claro (Ilustración 1). La sangre coagulada sufre modificaciones, entre las que destaca la precipitación de fibrina, sustancia que forma la estructura fundamental del coagulo (Ilustración 2).2

Suero y Coagulo

Plasma y Paquete Celular

Ilustración 1

Ilustración 2

La sangre representa aproximadamente el 7% del peso corporal total: así, un individuo de 70 kg tiene aproximadamente 5 litros de sangre. El volumen de sangre por kg de peso de un individuo es de 77 mililitros, de los cuales 43 mililitros corresponde al plasma y 34 mililitros a la masa globular, y aproximadamente 2,900 mililitros de sangre por metro cuadrado de superficie corporal. La densidad de la sangre es en promedio 1,060 y su punto de congelación es alrededor de -0.055OC.3 Entre sus muchas funciones se pueden mencionar las siguientes:

a) Transporte de sustancias nutritivas y oxígeno hacia las células de manera directa o indirecta.

b) Transporte de desechos dióxido de carbono desde las células. c) Distribución de hormonas y otras sustancias reguladoras a las células y tejidos. d) Mantenimiento de la homeostasis por actuar como amortiguador (buffer) y participar

en la coagulación y termorregulación.

1 Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-

Iztacala, México. pp: 295 2 Ross, Michael H., Gordon I. Kaye. (2005). Histología: texto y atlas con biología celular y molecular. 4ª

edición. Medica Panamericana, Buenos Aires. Págs: 216-222 3 Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-

Iztacala, México. pp: 295

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e) Transporte de células y agentes humorales del sistema inmune que protege el organismo de los agentes patógenos, proteínas extrañas y células transformadas (es decir: células del cáncer).4

• Paquete Celular

Las células constituyen algo menos de la mitad del volumen de la sangre; cuando la sedimentación es completa, se observa que estas células forman tres capas. Los glóbulos rojos, eritrocitos, fácilmente reconocibles por su color, son más densos y se acumulan en el fondo del recipiente. Los glóbulos centrifugados constituyen alrededor de 45% del volumen de la muestra de sangre. Encima de ellos puede verse una capa blanca delgada; esta capa corresponde aproximadamente al 1% del volumen de la muestra; esta capa comprende glóbulos blancas (leucocitos: neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos) y plaquetas (trombocitos). Las plaquetas, elementos sanguíneos de menor densidad, forman una capa delgada y nacarada por encima de los glóbulos blancos.5

• Plasma El plasma es el integrante extracelular líquido de la sangre (50% - 60% del volumen de sangre). Está constituido por agua (90%) y moléculas orgánicas e inorgánicas (10%), proteínas, carbohidratos, lípidos, catabolitos, enzimas, coenzimas, vitaminas, hormonas destinadas a diversas partes del cuerpo (Ilustración 3). Es un líquido amarillento, opalescente o turbio y ligeramente alcalino (pH=7.4); su volumen normal, medido don diversas sustancias (colorantes o albúmina radioactiva) corresponde, aproximadamente al 5% del peso corporal, equivalente en un adulto de 70 kg de peso. El plasma sirve para mantener las constantes fisicoquímicas de la sangre (viscosidad, presión osmótica, pH, etc.); se halla en equilibrio dinámico con los líquidos intersticial e intracelular; transporta: anticuerpos sustancias alimenticias y de desecho, múltiples elementos naturales con acciones biológicas particulares (hormonas, vitaminas, anticuerpos, etc.) y medicamentos administrados. Alguna de estas sustancias, permanecen libres en el plasma; otras forman compuestos químicos en especial con proteínas que las fijan en sus moléculas para transportarlas. Estas permanecen constantes en el sistema circulatorio gracias a la función realizada por los vasos linfáticos que las regresan al torrente sanguíneo.6

4 Ross, Michael H., Gordon I. Kaye. (2005). Histología: texto y atlas con biología celular y molecular. 4ª

edición. Medica Panamericana, Buenos Aires. Págs: 216-222 5 Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-

Iztacala, México. pp: 295 6 Ibíd.

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Composición bioquímica del plasma sanguíneo

Ilustración 3

� Eritrocito

• Estructura Los eritrocitos o hematíes son, de entre todos los elementos formes de la sangre, los más abundantes y determinan el color rojo de la misma. Actúan solo dentro del torrente circulatorio, en donde fijan oxígeno a la altura de los pulmones para entregarlo a los tejidos y fijan dióxido de carbono a la altura de los tejidos para llevarlo a los pulmones. El número de eritrocitos en un milímetro cúbico de sangre es de 4.5 a 5 millones, en la mujer adulta y, de 5 a 5.5 millones en el hombre adulto. La vida media o tiempo que duran circulando, desde su producción en la médula ósea, hasta su destrucción por el sistema de fagocitos mononucleares, es de 120 en aproximación. Tienen forma de disco bicóncavo, con diámetro entre 6 y 8 micrómetros (con promedio 7.2), anchura en la periferia: de 2 micrómetros, y en el centro, de 1 micrómetro (Ilustración 4). Esta configuración del eritrocito le provee la mayor cantidad de superficie posible en relación con su volumen, un atributo importante para el intercambio de gases.7 La forma del eritrocito es mantenida por proteínas de la membrana en asociación con el citoesqueleto. El eritrocito no es una estructura rígida, y puede sufrir deformaciones que le permiten pasar a través de capilares con menor diámetro que el. De esta flexibilidad depende su vida media. En ciertas condiciones patológicas, los eritrocitos pierden su forma normal cambiando a semilunar o de hoz, como en la anemia de células falciformes, o esférica, como la esferocitosis hereditaria; y muchas otras formas en diversas condiciones (Ilustración 5).8

7 Ibíd.

8 Ross, Michael H., Gordon I. Kaye. (2005). Histología: texto y atlas con biología celular y molecular. 4ª

edición. Medica Panamericana, Buenos Aires. Págs: 216-222

Forma y Tamaño del eritrocito

Ilustración 4

El volumen de los eritrocitos es, en promedio, de 87 femtolitros (fl); cuando es mayor, se denomina macrocitos, y cuando es menor, microcitos.

• Función-Hemoglobina (Metahemoglobina) La hemoglobina (Hb), el principal componente de los glóbulos rojos sanguíneos, es una proteína conjugada que sirve como vehículo para el transporte de oxigeno (Ocarbono (CO2). Cuando está completamente saturada, cada gramo de hemoglobina contiene 1.34ml de oxigeno. La masa de los glóbulos rojos de un adulto contiene aproximadamente 600g de hemoglobina, capaz de transportar 800ml de oxigeno. Una molécula de hemoglobina consta en dos pares de cadenas polipeptídicas (Globina) y cuatro grupos hemo, conteniendo cada uno un átomo ferroso (Ilustración 6), cada grupo hemo se localiza de forma precisa en un hueco o pliegue de cada una de las cadenas polipeptídicas. Localizada cerca de la superficie de la molécula, el hemo se combina reversiblemente con una molécula de oxde carbono.

Forma y Tamaño del eritrocito Eritrocitos anormales

Ilustración 4 Ilustración 5

El volumen de los eritrocitos es, en promedio, de 87 femtolitros (fl); cuando es mayor, se denomina macrocitos, y cuando es menor, microcitos.

Hemoglobina (Metahemoglobina)

principal componente de los glóbulos rojos sanguíneos, es una proteína conjugada que sirve como vehículo para el transporte de oxigeno (O

). Cuando está completamente saturada, cada gramo de hemoglobina contiene o. La masa de los glóbulos rojos de un adulto contiene aproximadamente

600g de hemoglobina, capaz de transportar 800ml de oxigeno. Una molécula de hemoglobina consta en dos pares de cadenas polipeptídicas (Globina) y cuatro grupos hemo, conteniendo

no un átomo ferroso (Ilustración 6), cada grupo hemo se localiza de forma precisa en un hueco o pliegue de cada una de las cadenas polipeptídicas. Localizada cerca de la superficie de la molécula, el hemo se combina reversiblemente con una molécula de ox

Grupo Hemo

Ilustración 6

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os anormales

Ilustración 5

El volumen de los eritrocitos es, en promedio, de 87 femtolitros (fl); cuando es mayor, se

principal componente de los glóbulos rojos sanguíneos, es una proteína conjugada que sirve como vehículo para el transporte de oxigeno (O2), y dióxido de

). Cuando está completamente saturada, cada gramo de hemoglobina contiene o. La masa de los glóbulos rojos de un adulto contiene aproximadamente

600g de hemoglobina, capaz de transportar 800ml de oxigeno. Una molécula de hemoglobina consta en dos pares de cadenas polipeptídicas (Globina) y cuatro grupos hemo, conteniendo

no un átomo ferroso (Ilustración 6), cada grupo hemo se localiza de forma precisa en un hueco o pliegue de cada una de las cadenas polipeptídicas. Localizada cerca de la superficie de la molécula, el hemo se combina reversiblemente con una molécula de oxigeno o dióxido

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La hemoglobina de una persona adulta normal, es la hemoglobina A, posee 2 cadenas alfa con 141 aminoácidos y dos cadenas beta con 146 aminoácidos, se le denomina alfa2-beta2. La función principal de la hemoglobina es transportar oxigeno desde los pulmones, donde la tensión de oxigeno es elevada, a los tejidos, donde es baja (Ilustración 7). A una tensión de oxigeno de 100mm de Hg. En los capilares pulmonares del 95% -98% de la hemoglobina esta combinada con el oxigeno. En los tejidos, donde la tensión de oxigeno puede ser tan baja como 20mm de Hg., el oxigeno se disocia fácilmente de la hemoglobina; en este caso menos de una 30% del oxigeno podría permanecer combinado con la hemoglobina.

Hemoglobina

Ilustración 7

La hemoglobina reducida es hemoglobina con hierro no unido al oxigeno. Cuando cada grupo hemo está asociado a una hemoglobina con hierro no unido al oxigeno, la hemoglobina se conoce como oxihemoglobina (HbO2). Tanto en la Hb como en el HbO2, el hierro permanece en estado ferroso. Cuándo el hierro se oxida al estado ferrico, se forma metahemoglobina y la molécula pierde su capacidad para transportar oxigeno o dioxido de carbono.9

• Metabolismo Funcional, Rutas Metabólicas.10

El metabolismo de los eritrocitos es limitado, debido a la ausencia de núcleo, mitocondria y otros organelos subcelulares. Aunque la unión, transporte y liberación de oxigeno y dióxido de carbono es un proceso pasivo que no requiere energía, existe una variedad de procesos metabólicos dependientes de energía que son esenciales para la viabilidad de la célula. Las vías metabólicas más importantes para el eritrocito maduro necesitan glucosa como sustrato (Ilustración 8). Estas vías se refieren a:

� Vía Emboden – Meyerhof mejor conocida como "glucólisis" � Ciclo de la Hexosa – Monofosfato � Vía de la Hemoglobina Reductasa � Ciclo de Rapoport – Luebering

9 Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-

Iztacala, México. pp: 295 10 Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán Libros,

Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.

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Metabolismo energético del eritrocito

Ilustración 8

Las principales vías están enmarcadas, los substratos y productos de cada vía están fuera del marco. Hb, hemoglobina; MHb, metamoglobina; NAD, NADH, nicotinamida adenina dinucleotidasa; ADP, adenosina difosfatasa; ATP, adenosina trifosfato; NADP, NADPH, nicotinamida adenina dinucleotidasa fosfato; G-6-P, glucosa-6-fosfato; F-6-P, fructosa-6-fosfato; Ga-3-P, gliceraldehido-3-fosfato; 2,3 DPG, 2,3-difosfoglicerato.

Estas vías contribuyen con energía al mantener:

� El potasio intracelular alto, el sodio intracelular bajo y un calcio intracelular muy bajo (bomba de cationes)

� Hemoglobina en forma reducida � Elevados niveles de glutation reducido � Integridad y deformabilidad de la membrana

Vía Emboden–Meyerhof o glucólisis Proporciona ATP para la regulación de la concentración intracelular de cationes (Na, K, Ca, Mg) a través de bombas de cationes. El eritrocito obtiene energía en forma de ATP del desdoblamiento de la glucosa por esta vía. Aproximadamente 90 a 95% del consumo celular de oxigeno utiliza esta vía. Los eritrocitos normales no tienen depósitos de glucógeno. Dependen por completo de la glucosa ambiental para la glucólisis. La glucosa penetra a la célula mediante difusión facilitada, un proceso que no consume energía. Es metabolizada a lactato, donde produce una ganancia neta de dos moles de ATP por un mol de glucosa.

Ciclo de la Hexosa Monofosfato Proporciona Nicotinamida-Adenina Dinucleotido fosfato y glutation para reducir oxidantes celulares. Aproximadamente 5% de la glucosa celular ingresa a la vía oxidativa Hexosa Monofosfato, un sistema auxiliar para producir sustancias reductoras. Esta vía produce así mismo, glutation. El glutation reducido protege a la célula contra cualquier lesión oxidante permanente. Los oxidantes dentro de la célula oxidan los grupos sulfhídrico (SH) de la hemoglobina, a menos que los oxidantes sean reducidos por el glutation reducido.

Ilustracion 8 y 9. Explican losenzimáticos que actúan sobre los metabolitos intermedios. Las vías enzsobre la derecha son las que procesan estos metabolitos sin formación del radical hidroxilo altamente reac-tivo. Este potente radical puede formarse por las reacciones que se ven a la izquierda si las concentraciones de peroxido y supero

Vía de la Hemoglobina Reductasa Protege a la hemoglobina de la oxidación vía la de una vía alterna a la vía Emboden estado reducido Fe++. La hemoglobina con el hierro en estado ferrico, Femetahemoglobina. Esta forma de hemoglobina no logra combinarse con el oxigeno. La metahemoglobina reductasa en unión con el NADH producido por la vía Emboden protege al hierro hem de la oxidación. Sin este sistema, el 2todos los días, al cabo del tiempo se eleva a 20 a 40% limitando gravemente la capacidad de

Ilustración 9

Ilustración 10

Explican los pasos en la reducción univalente del oxigeno y vías enzimáticos que actúan sobre los metabolitos intermedios. Las vías enzimáticas mostradas sobre la derecha son las que procesan estos metabolitos sin formación del radical hidroxilo

tivo. Este potente radical puede formarse por las reacciones que se ven a la izquierda si las concentraciones de peroxido y superoxido son suficientes.

Vía de la Hemoglobina Reductasa

Protege a la hemoglobina de la oxidación vía la NADH y metahemoglobina reductasa. Se trata de una vía alterna a la vía Emboden – Meyerhof, esencial para mantener al hierro hem en el

. La hemoglobina con el hierro en estado ferrico, Fe+++, es conocida como . Esta forma de hemoglobina no logra combinarse con el oxigeno. La

metahemoglobina reductasa en unión con el NADH producido por la vía Emboden l hierro hem de la oxidación. Sin este sistema, el 2 % de la metahemoglobina formada

todos los días, al cabo del tiempo se eleva a 20 a 40% limitando gravemente la capacidad de

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pasos en la reducción univalente del oxigeno y vías imáticas mostradas

sobre la derecha son las que procesan estos metabolitos sin formación del radical hidroxilo tivo. Este potente radical puede formarse por las reacciones que se ven a la

y metahemoglobina reductasa. Se trata Meyerhof, esencial para mantener al hierro hem en el

, es conocida como . Esta forma de hemoglobina no logra combinarse con el oxigeno. La

metahemoglobina reductasa en unión con el NADH producido por la vía Emboden – Meyerhof % de la metahemoglobina formada

todos los días, al cabo del tiempo se eleva a 20 a 40% limitando gravemente la capacidad de

transportadora de oxigeno en la sangre. Medicamentos oxidantes pueden interferimetahemoglobina reductasa y producir valores aun más elevados de metahemoglobina. Esto provoca cianosis.

Ciclo de Rapoport – Luebering 2,3 – difosfoglicerato (DPG) el cual facilita la liberación de oxigeno a los tejidos. Este ciclo es parte de la vía Emboden –fosfoglicerato y ATP. El DPG esta presente en el eritrocito en una concentración de un mol BPG/mol de hemoglobina y se une con fuerza a la desoxihemoglobina, manteniendo a la hemoglobina en estado desoxigenado facilitándose la liberación de oxigeno. El incremento en la concentración de difosfoglicerato facilita la liberación de oxigeno a los tejidos mediante la disminución en la afinidad de la hemoglobina para el oxigeno. De esta mancuenta con un mecanismo interno para la regulación del aporte de oxigeno a los tejidos.

transportadora de oxigeno en la sangre. Medicamentos oxidantes pueden interferimetahemoglobina reductasa y producir valores aun más elevados de metahemoglobina. Esto

Luebering

difosfoglicerato (DPG) el cual facilita la liberación de oxigeno a los tejidos. Este ciclo es – Meyerhof y tiene por finalidad evitar la formación de 3

fosfoglicerato y ATP. El DPG esta presente en el eritrocito en una concentración de un mol BPG/mol de hemoglobina y se une con fuerza a la desoxihemoglobina, manteniendo a la

obina en estado desoxigenado facilitándose la liberación de oxigeno. El incremento en la concentración de difosfoglicerato facilita la liberación de oxigeno a los tejidos mediante la disminución en la afinidad de la hemoglobina para el oxigeno. De esta mancuenta con un mecanismo interno para la regulación del aporte de oxigeno a los tejidos.

Metabolismo del eritrocito

Ilustración 11

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transportadora de oxigeno en la sangre. Medicamentos oxidantes pueden interferir con la metahemoglobina reductasa y producir valores aun más elevados de metahemoglobina. Esto

difosfoglicerato (DPG) el cual facilita la liberación de oxigeno a los tejidos. Este ciclo es Meyerhof y tiene por finalidad evitar la formación de 3 –

fosfoglicerato y ATP. El DPG esta presente en el eritrocito en una concentración de un mol BPG/mol de hemoglobina y se une con fuerza a la desoxihemoglobina, manteniendo a la

obina en estado desoxigenado facilitándose la liberación de oxigeno. El incremento en la concentración de difosfoglicerato facilita la liberación de oxigeno a los tejidos mediante la disminución en la afinidad de la hemoglobina para el oxigeno. De esta manera el eritrocito cuenta con un mecanismo interno para la regulación del aporte de oxigeno a los tejidos.

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• Hemolisis: Trastornos metabólicos.11 La actividad enzimatica deficiente en el eritrocitos provoca anomalías que conduce a su destrucción prematura y anemia hemolítica estos trastornos normalmente son hereditarios. Sin embargo, la interferencia con el metabolismo de los eritrocitos o el ambiente oxidativa puede provocar a veces una hemólisis en individuos con eritrocitos son normales. El eritrocito maduro carece de mitocondrias y por lo tanto, carece de los mecanismos de fosforilizacion oxidativa y de actividad del ciclo de Krebs. La producción de energía es principalmente glucolitica, y el 90% de esta se obtiene a través de la vía de Embdem –Meyerhof, y la glucosa se convierte en acido láctico con producción de 2 mol de ATP. El ATP es necesario en las reacciones celulares que requieren energía: para el transporte activo de cationes a través de la membrana y para preservar el mantenimiento de la deformabilidad de la membrana y para preservar la forma bicóncava de la célula. La glucosa recogida por los eritrocitos e independiente de la insulina. Aproximadamente el 90% de la glucosa se consume en la vía glucolitica mientras que el 10% se utiliza en la vía de pentosas (derivación de monofosfato de hexosa MHP). Una fase de la vía glucolitica genera NADH, que tiene un papel importante en la protección de la hemoglobina frente al estrés oxidativa. La mayoría de la hemoglobina (metahemoglobina) producida en la célula normal (aproximadamente el 3% del total del día) se reduce por la reductasa Met Hb unida a NAD. La derivación del MHP genera NADPH en las primeras fases, mediante las enzimas G5PD y 6-fosfogluconato. La producción de NADH esta unida a la reducción del glutation y a través de este mecanismo, a la preservación de la oxidación enzimatica vitales y de hemoglobina. El GSH reduce pequeñas cantidades de hemoglobina oxidada. La actividad de la derivación del MHP aumenta cuando las células se exponen a un fármaco oxidante, probablemente como consecuencia de la producción elevada de NADP. Si una enzima en esta vía carece de actividad, no se produce GSH y la hemoglobina se oxidara por el ambiente oxidativa. La oxidación en los eritrocitos se media por derivados del oxigeno altamente energéticos denominados colectivamente activado. Las cadenas de globina se desnaturalizan y precipitan como corpúsculos de Heinz, que se adhieren a la membrana, induciendo rigidez y una tendencia a la lisis. Las deficiencias enzimáticas moderadas en esta vía pueden no asociarse con anemia en condiciones normales; sin embargo, un episodio hemolítico agudo se produce si las células se exponen a un ambiente oxidante (fármacos, infecciones).

� Grupo Hemo: Síntesis y Degradación.12 La síntesis y final de la síntesis de protoporfirina, así como la incorporación del hierro a esta para formar el heme, tiene lugar dentro de las mitocondrias (Ilustración 12). En cambio los pasos intermediarios de la síntesis de protoporfirina ocurren fuera de estas, en la porción soluble del citoplasma. Las mitocondrias rodean el núcleo del precursor eritroide. En ciertos trastornos en los que hay un fallo de la incorporación del hierro al heme, se acumula dicho hierro en el interior de las mitocondrias. La mayoría de las mitocondrias son expulsadas de la célula junto con núcleo, y pocas que permanecen se pierden al cabo de un día o dos después de que hematíe penetra en la circulación. Así pues, el hematíe maduro, al carecer de RNA y de mitocondrias, no pueden sintetizar ni las cadenas de globina ni la porción heme de la hemoglobina. Las reacciones enzimáticas que producen a la formación del heme pueden resumirse de la siguiente manera.

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Ibíd. 12 Daryl. K. Granner. Mayes. A. Peter. Murray Robert K. Robwell Victor W. (2001) Bioquímica de Harper.

15ª edición. Manual Moderno, México. Págs. 413-4123.

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El succinil –CoA, formadao en las mitocondrias durante el ciclo de Krebs, se combina con glicina para formar acido δ-aminolevulinico (δ- ALA). La enzima que cataliza esta reacción, (δ- ALA)- sintetasa, limita la tasa de síntesis del heme. El fosfato de piroxinal es necesario como coenzima para esta reacción.

1) Dos moléculas de (δ- ALA) se combina para formar un compuesto pirrólico, el porfobilinogeno.

2) Cuatro moléculas de porbilinogeno se une entre sí para constituir una anillo tetrapirrolico, compuesto denominado uroporfirinogeno.

3) Sucesivas descarboxilaciones de las cadenas laterales del uroporfinogeno conduce a la formación primero, de un compuesto llamado coproporfirinogeno y, luego protoporfirina la enzima que cataliza esta ultima reaccion es una enzima mitocondrial.

4) Un atomo de hierro ferroso se añade a la protorfirina para formar heme. Esta reaccion se cataliza por la enzima ferroquelatasa (heme-sintetasa).

Síntesis del Grupo Hemo

Ilustración 12

15

La destrucción de la hemoglobina en que la destruyen, los cuales se reutilizan, y el hierro del heme ingresa a la reserva del hierro también para su reutilización. También se degrada la porción de porfirina libre de hierro del heme, sobre todo en las células reticuloendoteliales hepáticas, esplenicas y de la medula ósea.Al parecer el catabolismo del heme proviente de la totalidad de las hemoproteinas se lleva acabo enfraccion microsomal de las células mediante un comportamiento sistema edenominado hem oxigenasa. Cuando el hem de las hemoproteínas llEga al sistema de la heme oxigenasa, por lo general el hierro y constituye la hemina. La hemina se reduce a heme con el NADPH y, con ayuda de mas NADPH, se añade oxigeno al puente α- metenilo entre los pirroles I y II de la porfirina. El ion ferroso se oxida de nuevo a la variante ferrica. Con la adición subsecuente de oxigeno, se libera el ion férrico, se produce monóxido de carbono y de la escisión del anillo tetrapirrolico resde biliverdina IX- α. En las aves y los anfibios se excreta la biliverdina IXenzima soluble denominada biliverdina reductasa reduce el puente metenilo entre los pirroles III y IV a un grupo metileno para producir bilirrubina IXque un gramo de hemoglobina produce 35mg de bilirrubina es de alrededor de 250ª 350mg, provenientes principalmente de la hemoglobina, pero también de la eritropoyesis ineficaz de varias hemoproteínas adicionales como el citocromo

Degradación del grupo hemo y formación de pigmentos biliares

La destrucción de la hemoglobina en el cuerpo, la globina se degrada hasta los aminoácidos que la destruyen, los cuales se reutilizan, y el hierro del heme ingresa a la reserva del hierro también para su reutilización. También se degrada la porción de porfirina libre de hierro del

e todo en las células reticuloendoteliales hepáticas, esplenicas y de la medula ósea.Al parecer el catabolismo del heme proviente de la totalidad de las hemoproteinas se lleva acabo enfraccion microsomal de las células mediante un comportamiento sistema edenominado hem oxigenasa. Cuando el hem de las hemoproteínas llEga al sistema de la heme oxigenasa, por lo general el hierro y constituye la hemina.

La hemina se reduce a heme con el NADPH y, con ayuda de mas NADPH, se añade oxigeno al metenilo entre los pirroles I y II de la porfirina. El ion ferroso se oxida de nuevo a la

variante ferrica. Con la adición subsecuente de oxigeno, se libera el ion férrico, se produce monóxido de carbono y de la escisión del anillo tetrapirrolico resulta una cantidad aquimolar

En las aves y los anfibios se excreta la biliverdina IX- α de color verde; en los mamenzima soluble denominada biliverdina reductasa reduce el puente metenilo entre los pirroles

rupo metileno para producir bilirrubina IX-a, aun pigmento amarillo. Se estima que un gramo de hemoglobina produce 35mg de bilirrubina es de alrededor de 250ª 350mg, provenientes principalmente de la hemoglobina, pero también de la eritropoyesis ineficaz de varias hemoproteínas adicionales como el citocromo.


Ilustración 13

16

el cuerpo, la globina se degrada hasta los aminoácidos que la destruyen, los cuales se reutilizan, y el hierro del heme ingresa a la reserva del hierro también para su reutilización. También se degrada la porción de porfirina libre de hierro del

e todo en las células reticuloendoteliales hepáticas, esplenicas y de la medula ósea. Al parecer el catabolismo del heme proviente de la totalidad de las hemoproteinas se lleva acabo enfraccion microsomal de las células mediante un comportamiento sistema enzimatico denominado hem oxigenasa. Cuando el hem de las hemoproteínas llEga al sistema de la heme

La hemina se reduce a heme con el NADPH y, con ayuda de mas NADPH, se añade oxigeno al metenilo entre los pirroles I y II de la porfirina. El ion ferroso se oxida de nuevo a la

variante ferrica. Con la adición subsecuente de oxigeno, se libera el ion férrico, se produce ulta una cantidad aquimolar

α de color verde; en los mamíferos una enzima soluble denominada biliverdina reductasa reduce el puente metenilo entre los pirroles

a, aun pigmento amarillo. Se estima que un gramo de hemoglobina produce 35mg de bilirrubina es de alrededor de 250ª 350mg, provenientes principalmente de la hemoglobina, pero también de la eritropoyesis ineficaz y


17

� Eritropoyesis.13

• Desarrollo normal del eritrocito. Los eritrocitos se derivan de las células madre comprometidas denominadas hemocitoblasto. La eritropoyetina, una hormona de crecimiento producida en los tejidos renales, estimula a la eritropoyesis, es decir, la formación de eritrocitos y es responsable de mantener una masa eritrocitaria en un estado constante.

• Funciones de la eritropoyetina: - Estimula proliferación y maduración del rubriblasto - Reduce tránsito de células no proliferativas en médula - Induce liberación de reticulocitos a circulación

• Aumento de eritropoyetina - Anemia por hemorragia y hemólisis - Anemias ferroprivas - Proceso de desarrollo. Las etapas de desarrollo morfológico de la célula eritroide incluyen (en orden de madurez creciente) (Ilustración 14).

• Proeritroblasto

• Eritroblasto basófilo

• Eritroblasto policromatófilo

• Eritroblasto ortocromático

• Reticulocito

• Hematíe, finalmente, cuando ya carece de núcleo y mitocondrias.

Serie Eritrocitica

Ilustración 14

A medida que la célula madura, la producción de hemoglobina aumenta cambiando el color del citoplasma en muestras de sangre teñidas con la tinción de Wright, de azul oscuro a gris rojo y rosáceo. El núcleo paulatinamente se vuelve picnótico y es expulsado fuera de la célula en la etapa ortocromática.

13

Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohemático. UNAM-FES-Iztacala, México. pp: 295

18

Los eritrocitos de los mamíferos no poseen núcleo cuando llegan a la madurez, es decir que pierden su núcleo celular y por lo tanto su ADN (los anfibios y aves tienen eritrocitos con núcleo). Los eritrocitos también pierden su mitocondria y utilizan la glucosa para producir energía mediante el proceso de glucólisis seguido por la fermentación láctica. Los eritrocitos son producidos continuamente en la médula ósea de los huesos largos. (En el embrión, el hígado es el principal productor de glóbulos rojos.) El bazo actúa como reservorio de eritrocitos, pero su función es algo limitada en los humanos. Sin embargo, en otros mamíferos como los perros y los caballos, el bazo libera grandes cantidades de glóbulos rojos en momentos de estrés. Algunos atletas han tratado de explotar esta función del bazo tratando de liberar sus reservas de eritrocitos mediante fármacos, pero esta práctica pone en riesgo al sistema cardiovascular dado que éste no está preparado para soportar sangre cuya viscosidad sea superior a la normal.

� Técnicas

• Determinación de hemoglobina.14 El método de la cianometahemoglobina (hemiglobincianuro, HiCN) tiene la ventaja de la conveniencia y una solución estándar estable fácilmente disponible. Fundamento: La sangre se diluye en una solución de ferrocianuro potasico y cianuro potásico (Reactivo de Drabkin). El ferrocianuro potásico oxida la hemoglobina a hemoglobina (Hi, metahemoglobina) y el cianuro potásico convierte iones cianuro a la forma HiCN, que tiene una absorción máxima amplia a una longitud de onda de 540nm. La capacidad de absorción de la solución se mide en un espectrofotómetro a 540nm y se compara con una estándar de HiCN. Interpretación: La disminución de la hemoglobina indica anemia, que puede deberse a deficiencia en las sustancias que intervienen en su formación, alteraciones en los organos que la sintetizan y disminución en la producción o destrucción excesiva de los eritrocitos. Valor de Referencia en ratas: hemoglobina: 14.8%15

• Hematocrito (volumen del paquete hemático)16 El hematocrito venoso mide el tanto por ciento del volumen total de una muestra de sangre venosa ocupado por los hematíes o, dicho de otro modo, es la relación entre volumen de eritrocitos y el de sangre total. Se expresa como porcentaje o como fracción decimal. Fundamento: El hematocrito se determina por centrifugación de una muestra de sangre anticoagulada bajo condiciones normalizadas. El anticoagulante puede ser heparina seca, EDTA u oxalato ajustado. El resultado se calcula de la siguiente fórmula:

14 Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán Libros,

Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.

15 Delgado Buenrostro, Norma Laura, María Esther Revuelta Miranda. (1993). Guía práctica para el

manejo de animales de laboratorio. 1ª edición. UNAM-FES-Cuautitlán, México. Págs: 80-83 16

Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán Libros, Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.

19

Valores de referencia en ratas: Hto: 46%17 Interpretación: Al mismo tiempo que se determina el hematocrito se debe examinar el plasma para poner en evidencia la ictericia (color amarillo) o hemólisis (color rojo). También se debe observar el espesor de la capa cremosa. Hematocrito aumentado: El hematocrito está aumentado en la hemoconcentración, tal como se observa en casos de shock asociado con operaciones, traumas, quemaduras y en policitemia. Hematocrito disminuido: el hematocrito esta disminuido en condiciones asociadas con sobrecarga de líquidos, por ejemplo, descompensación cardiaca, embarazo, y excesiva administración de fluidos. En la fase de convalecencia después de la pérdida de sangre el volumen sanguíneo se restablece por un incremento del volumen del plasma, por lo que el hematocrito puede disminuir en la fase inicial de la terapia con transfusión.

Hematocrito

Ilustración 15

• Fragilidad Osmótica Eritrocitaria.18

Fundamento: La fragilidad osmótica eritrocitaria (FOE) es una técnica realizada para el estudio de las membranopatías eritrocitarias. La membrana eritrocitaria es semipermeable, es decir, permite el libre paso de agua a su través, restringiendo el paso de ciertos solutos iónicos como el cloruro, sodio y potasio. Por ello, si el eritrocito se incuba en un medio hipertónico, el eritrocito pierde agua y se deshidrata. Por el contrario, si el eritrocito se incuba en un medio hipotónico, entra agua y el eritrocito se hidrata. Si la hipotonía del medio supera cierto límite, se altera la membrana del eritrocito produciéndose una salida masiva de la hemoglobina hacia

17 Delgado Buenrostro, Norma Laura, María Esther Revuelta Miranda. (1993). Guía práctica para el

manejo de animales de laboratorio. 1ª edición. UNAM-FES-Cuautitlán, México. Págs: 80-83 18 www.alojamientos.us.es/hematologia/practicas_2007-08.pdf, 08 de Septiembre de 2008

20

el medio, dando lugar a la hemólisis. La intensidad de la hemólisis es directamente proporcional al grado de hipotonía del medio (esto es, a mayor hipotonía mayor hemólisis). Llamamos FOE a la medida realizada para determinar la capacidad de una población de eritrocitos para resistir el efecto hipotónico del medio, y se expresa como aquella concentración de NaCl (en g/L) necesaria para producir el 50% de hemólisis (H50). Para cada eritrocito, la FOE depende de la relación que existe entre su superficie (S) y su volumen (V). Debido a su forma bicóncava, los eritrocitos pueden aceptar, sin producir hemólisis, una entrada de agua capaz de aumentar su volumen hasta un 70%. Una vez rebasado este límite, sobreviene la hemólisis. Cuando existe un defecto en la forma del eritrocito que disminuye la relación S/V, como ocurre en la esferocitosis hereditaria, este límite disminuye, y la hemólisis comienza en presencia de soluciones menos hipotónicas, aumentando la FOE (o lo que es lo mismo, aumenta el valor de H50). Interpretación: La esferocitosis hereditaria es un trastorno relativamente común que se caracteriza por glóbulos rojos sanguíneos intrínsicamente defectuosos, debido a su forma esférica. Estos glóbulos presentan un aumento en la fragilidad osmótica: son más frágiles que lo normales las personas que sufren de talasemia, algunos glóbulos rojos son más frágiles que lo normal, pero una porción mayor de los mismos es menos frágil que lo normal.

• Bilirrubina.19

Fundamento:

�� λ � 530 ��

��

Valores de referencia en ratas: Bilirrubina total: 0.15-0.35mg/dl20

Interpretación:

Bilirrubina indirecta

Bilirrubina no conjugada o libre, es decir, aquella que se produce en la sangre a partir de la degradación de los eritrocitos, siendo transportada hacia el hígado por la albumina. Allí este complejo se disocia y la bilirrubina, sola, penetra en la célula hepática donde se conjuga con el acido glucuronico por acción de la UDP glucuronil transferasa. El poder identificar cual de las bilirrubinas esta elevada (directa o indirecta) nos permite definir si el problema esta antes, en o después del hígado. La bilirrubina indirecta se ve aumentada cuando existe daño hepatocelular, obstrucción del árbol biliar intrahepático y extrahepático, enfermedad hemolítica, ictericia neonatal fisiológica, enfermedad de Gilbert, intolerancia a la fructosa, etc. Bilirrubina directa

Bilirrubina conjugada, es decir, aquella que, después de separarse de la albumina, penetra en la célula hepática donde se conjuga con el acido glucuronico por acción de la UDP glucuronil transferasa. La bilirrubina directa se ve aumentada en obstrucciones biliares o colestasis (por

19

Henry John Bernard. (2007) El laboratorio en el diagnostico clínico. 20ª edicion. Marbán Libros, Madrid. Págs. 479-480 y 572-573. 20 Delgado Buenrostro, Norma Laura, María Esther Revuelta Miranda. (1993). Guía práctica para el

manejo de animales de laboratorio. 1ª edición. UNAM-FES-Cuautitlán, México. Págs: 80-83

21

un cálculo o piedra de la vesícula), en tumores hepáticos o de cabeza de páncreas, en estrechamientos de los conductos biliares, en colestasis inducidas por medicamentos, en los síndromes de Dubin-Johnson y de Rotor, en hepatitis y cirrosis, etc. Bilirrubina total

Compuesto pigmentado, producido por degradación de los grupos hemo de la hemoglobina en las células de la medula ósea, del bazo y del hígado. Es un producto de desecho. Su determinación es útil para el diagnostico y evolución de la ictericia, en la anemia y en la obstrucción biliar. Viéndose aumentada esta cifra en enfermedades hepáticas, en neoplasias de páncreas, en anemias hemolíticas, en obstrucciones biliares, en la enfermedad de Gilbert, en la malaria, etc. La acumulación de bilirrubina en la sangre de los recién nacidos puede provocar graves daños cerebrales. Por el contrario, la bilirrubina disminuye en anemias ferropenias y en anemias aplasicas.

• Conteo de reticulocitos. 21 Fundamento: Los reticulocitos son eritrocitos inmaduros que contienen restos de rRNA. Cuando son sometidos a colorantes llamados supravitales, como el azul de cresilo brillante, este precipita sobre los restos de rRNA permitiendo observarlo en forma de “cuenta de rosario”, que los eritrocitos maduros no contienen. Interpretación: El valor de referencia es de 5-20 reticulocitos/1.000 eritrocitos o 0.5-2.0%. Cuando se presenta la destrucción acelerada de eritrocitos (anemia hemolítica, sangrado excesivo, hemorragias), el número de eritrocitos aumenta. Una cantidad elevada de reticulocitos, indica una gran actividad eritropoyetica de medula ósea; una cantidad disminuida indica lo contrario; así, la cantidad de reticulocitos presentes en una muestra de sangre permite conocer la actividad eritropoyetica de la medula ósea.

21 Bauer, John D. (1986). Análisis Clínicos: Métodos e Interpretación. Editorial Reverte, España. Págs:

204-205, 589-594

22

Objetivos General

Administrar eritropoyetina a un lote de ratas wistar machos para estudiar los efectos sobre la eritropoyesis mediante la valoración de diferentes parámetros hemáticos.

Objetivos Particulares

Administrar por vía subcutánea eritropoyetina en una dosis 0.5mL por cada 250g de

peso en las ratas para evaluar una posible alteración.

Cuantificar parámetros bioquímicos (bilirrubina) físicos (peso) y hematológicos

(fragilidad, hematocrito y hemoglobina) para observar si existen variaciones debidas al

tratamiento.

Hipótesis Al administrar eritropoyetina (0.5ml/250g) a ratas wistar macho se estimulará la eritropoyesis alterando los valores de las pruebas hematológicas, físicas y bioquímicas.

23

Materiales y Metodología Experimental

Materiales

Biológico Químico Instrumental

40 Ratas wistar macho Reactivo de Drabkin Espectrofotómetro

2 ml de Sangre con EDTA EDTA 5% Centrifuga clínica

1.5 ml de sangre NaCl 0.9% Microcentrifuga

Bioyetin®

Kit para determinación colorimétrica de bilirrubina D y T en suero de WIENER

LAB®

Bortex

Metanol Microscopio óptico

Azul de metileno Balanza de dos platos

Giemsa Balanza granataria con

canasta

Éter Agujas 25 x 16

Acido pícrico Jeringas 1 y 3 ml

Aceite de inversión Vasos pp 100 y 250 ml

Campana

Tubos de ensaye

Tubos para centrifuga

gradilla

Pipetas graduadas 0.1, 1,

2, 5 y 10 ml

Pipeta sahli

portaobjetos

Pipeta pasteur

Propipeta

Tubos Capilares

Cuba metálica

Baño Maria

24

Metodología experimental

Marcar, pesar y distribuir

por medio de una curva

japonesa

20 ratas wistar

macho control Alimentadas con

20g de croquetas

SPORTSMAN`S

CHOICE® por día y

agua

20 ratas wistar

macho tratadas

Administradas vía

subcutánea con

eritropoyetina

(0.5mLX250g) dos

veces por semana

(lunes y jueves)

durante 31 días de

inducción

Se pesaron antes de

cada punción

Lote de 40 ratas

wistar macho

25

Se puncionaron vía intracardiaca una vez por

semana (obteniéndose 3.5ml de sangre

aprox.)

2ml de sangre completa ( 0.1ml

de EDTA por cada mililitro de

sangre)

1.5 ml de sangre

Incubar

Frotis sanguíneo (1 gota)

Conteo de retículocitos (1-2

gotas)

Hematocrito (3/4 partes del

capilar)

Fragilidad osmótica (1ml)

Hemoglobina (0.02ml)

Centrifugar

Suero (0.6ml)

bilirrubina

26

Cronograma

Fecha Días de

Inducción Días de trabajo

Actividades realizadas

SEPTIEMBRE

22 0 Lunes Marcado, distribución y administración de EPO

23 1

24 2

25 3 Jueves a)Realización de pruebas a ratas de lote control

b)Administración de EPO a ratas tratadas

26 4

27 5

28 6

29 7 Lunes Realización de pruebas a ratas tratadas y

administración de EPO

30 8

OCTUBRE

1 9



3 11

4 12

5 13



7 15

8 16



10 18

11 19

12 20



14 22

15 23

16 24 Jueves a)Administración de EPO a ratas tratadas

b)Registro de resultados en tablas

17 25

18 26

19 27

20 28 Lunes Realización de pruebas a ratas tratadas

21 29

22 30


b)Eutanasia

27

28

Gráficos y Análisis de Resultados

Como podemos observar la tendencia del lote de eritropoyetina es a subir, esto debido a que las ratas proporcionadas eran jóvenes y se encontraban en desarrollo, además que consumieron un alimento altamente proteico

29

En esta prueba no se realizo una buena apreciación de los reticulocitos debido a que pudieron existir precipitados de colorante por una mala tinción, por ende, lo observado se confundía con reticulocitos, además que los frotis estaban gruesos ocasionando resultados pocos confiables. Como se aprecia en la grafica el cambio no fue significativo, por lo que esta se vuelve una prueba subjetiva la cual no nos demuestra si existe o no efecto de la EPO exógena en el proceso de eritropoyesis.

Tabla de resultados de frotis sanguíneo

Días de inducción Lote Control Lote Eritropoyetina

0 - - - - 3 N - - 7 - - N

10 N - - 14 - - N 17 N - - 21 - - N 24 - - - - 28 N COLORACIÓN 31 N - -

Como nos indica la tabla no hubo cambios observables significativos, esto indica que no existió un cambio en el tamaño y forma de los eritrocitos al administrar EPO en ratas wistar macho.

30

Como se puede observar en la grafica, la tendencia del lote con EPO aumento con respecto al lote control, debido a que la administración de la hormona aumentó la producción de eritrocitos, ya que ésta actúo de forma adecuada en el proceso de eritropoyesis, estimulando la maduración y diferenciación de las células precursoras del eritrocito.

El gráfico de hemoglobina muestra una incongruencia en los resultados ya que los valores suben y bajan, por lo tanto es difícil determinar una tendencia que indique un cambio, esto debido a errores experimentales como un mal manejo de muestra, provocando hemólisis y un mal tiempo de lectura, ya que la lectura debió realizarse a los 5 minutos exactos de agregar la muestra al reactivo de Drabkin, si no ocurre esto, como fue en este caso se obtienen lecturas incorrectas y poco confiables.

31

La gráfica de bilirrubina nos muestra que los valores obtenidos del lote de EPO estuvieron dentro del rango control a excepción de un punto, el cual se atribuye a errores experimentales como el tiempo de lectura, la calibración del equipo y a la poca cantidad de muestra (suero) que se obtenía; además que la medida de la muestra en su mayoría no se realizo con la pipeta adecuada sino con pipeta graduada, la cual tiene un margen de error que alteró los resultados, además que la muestra estaba hemolizada.

32

En la gráfica correspondiente a esta prueba se observa una disminución gradual de la bilirrubina total; teóricamente esta debe presentar un comportamiento similar al de la directa pero experimentalmente no fue así; esto se debió a que la bilirrubina es fotosensible por lo que al realizar la lectura, el compuesto que iba a dar la propiedad ya no tenía la misma composición.

La gráfica obtenida para esta prueba indica que no hubo cambios en la estructura de la membrana del eritrocito, ya que esta se encarga de evaluar la resistencia que tiene la membrana cuando es sometida a diferentes concentraciones de NaCl, la cual indica el porcentaje de hemolisis de los hematíes, por esta razón se dice que la administración de eritropoyetina no afecta la membrana del eritrocito.

Conclusiones

Se logró realizar las pruebas bioquímico-hemáticas a ratas wistar macho tratadas con eritropoyetina; no se consiguió ver un cambio significativo en los resultados debido a la mala manipulación de las técnicas y a la regularidad de la dosificación de EPO la cual no fue significativa, por lo tanto que a una dosis continua de la EPO muy probablemente se hubiesen provocado alteraciones esperadas, como un aumento en el hematocrito, hemoglobina y reticulocitos.

33

Referencias: Ilustraciones:

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Libros, Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.

9.- Ibíd.

10.- Ibíd.

11.- Ibíd.

12.- http://personal.us.es/caossorio/temas/tema_11b.pdf, 07 de Septiembre de 2008.

13.- http://personal.us.es/caossorio/temas/tema_11b.pdf, 07 de Septiembre de 2008.

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15.- http://www.pezcyclingnews.com/?pg=fullstory&id=4746; 06 de Septiembre de 2008.

Bibliografía:

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2. Daryl. K. Granner. Mayes. A. Peter. Murray Robert K. Robwell Victor W. (2001)

Bioquímica de Harper. 15ª edición. Manual Moderno, México. Págs. 413-4123.

3. Delgado Buenrostro, Norma Laura, María Esther Revuelta Miranda. (1993). Guía práctica para el manejo de animales de laboratorio. 1ª edición. UNAM-FES-Cuautitlán, México. Págs: 80-83

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Marbán Libros, Madrid. Págs. 479-480 y 572-573.

5. Novales, Castro Xavier de J., José D. Amato Martínez. (2003) Sistema Linfohematico. UNAM-FES-Iztacala, México. pp: 295

6. Rapaport. I. Samuel. (2002) Introducción a la Hematología. 2ª edición. Masson

Doyma, México. Págs: 7-9.

7. Ross, Michael H., Gordon I. Kaye. (2005). Histología: texto y atlas con biología celular y molecular. 4ª edición. Medica Panamericana, Buenos Aires. Págs: 216-222

Documents

Efecto de la eritropoyetina exógena, sobre el proceso de eritropoyesis en ratas wistar macho