Efecto de los reguladores de crecimiento en la callogénesis de Capsicum annuum L variedad aviculare a partir de embriones cigótigosA.D. Cardenas-Martín, J.C. Correa-Llano & P.M. Osorio-Montalvo

Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Instituto Tecnológico de Mérida, Av. Tecnológico km. 4.5 S/N C.P. 97118, Mérida, Yucatán, México.

Palabras clave: Capsicum annuum L var. aviculare, chile max, callogénesis.

Resumen

Se probaron varios tratamientos con diversas combinaciones de reguladores de crecimiento para inducir la callogénesis en chile max. El explante utilizado en el experimento consistió en semillas cortadas transversalmente de chile max para poner en contacto el embrión cigótico con el medio de cultivo. El medio básico utilizado fue el Murashige & Skoog (1962) adicionado con el 3% de sacarosa. Se evaluó la eficiencia del protocolo de descontaminación, el % de necrosamiento y la eficiencia en la producción de callo. El efecto del 2,4-D en la callogénesis en embriones somáticos cortados de Capsicum annuum L var. aviculare resultó ser más efectivo que el efecto del AIA. El uso de concentraciones bajas de BAP combinado con 2,4-D presentó buenos resultados comparado con el uso de altas concentraciones de BAP. Las peores respuestas se obtuvieron en tratamientos que contenían combinaciones de AIA con BAP tanto en altas como bajas concentraciones.

Abreviaciones: 2,4-D – Acido 2,4 diclorofenoxiacético; AIA – Acido 3 indol-acético; BAP – 6-Bencilaminopurina; MS – Murashige & Skoog (1962).

Introducción

El chile max clasificado como Capsicum annuum L., variedad aviculare (D’Arcy y Eshbaugh), ha sido causa de múltiples controversias entre los taxónomos, quienes han dado a esta variedad distintos nombres, como los enlista Long (1998): minus (Figherhut); baccatum (Terpó); minimun (Heiser y Pickersgill); y variedad glabriusculum (Heiser y Pickersgill). Una situación semejante se presenta en los diversos nombres vulgares o comunes que recibe este pequeño chile en las distintas regiones del país: chile max, chiltepín, chile piquín, chiltepec, chiltepillo, chilpaya,

chile de monte, chile parado, pájaro pequeño, amomo, pico de paloma, pico de pájaro, chile de Chiapas, ululte, totocuitlatl, chile mosquito, tlilchilli, milchili y diente de tlacuache (Long, 1998).

El chile max es un arbusto silvestre perenne, cuyo fruto es una baya redonda u oblonga de 3 a 6 mm de diámetro que crece en posición eréctil. En estado inmaduro el fruto es de color verde oscuro, debido a la alta concentración de clorofila; sin embargo, al madurar se torna de color rojo, causado por una alta cantidad de pigmentos rojos conocidos como licopersinas. Las plantas de chile max alcanzan su madurez reproductiva entre los seis y diez meses de edad. La floración comienza durante los meses de mayo y dura hasta agosto, y la fructificación es de junio a octubre. El color rojo de los frutos atrae a diversas aves, que al comerlos se encargan de dispersar las semillas. El chile max fuera de la Península de Yucatán crece bajo la protección de los árboles en sitios montañosos cercanos a márgenes de arroyos y cañones (Nabhan 1985; Nabhan et al., 1990; Gentry, 1942 ).

Aunque se han llevado a cabo algunos esfuerzos para propagar plantas de chile max, este es el único chile que no ha podido ser domesticado. El chile max requiere de cierto tipo de suelo, humedad y sombra, condiciones que solo se las brinda el medio ambiente natural. Un chile max que se siembra en maceta no tiene la forma, el color, el tamaño ni el sabor de los que se dan en la condiciones silvestres (Bañuelos, 2008).

La planta, además, es difícil de obtener en el campo, debido a que los pobladores de la región se tienen que introducir al monte y recorrer grandes distancias para hallarla. No obstante, la semilla puede germinar en un ambiente natural después de haber sido previamente ingerida por las aves, pasando por su tracto digestivo y defecarlas, contribuyendo de esta manera a su distribución y germinación (Bañuelos et al., 2008; Arcia, 1985). La planta vive en lugares frescos, pues depende de una temperatura entre 15 y 30 °C, luz (fotoperiodo de 14 horas oscuridad y 10 horas luz), humedad relativa entre 75-100% (Villalón et al., 2003), y, sobre todo, que se encuentra distribuida bajo la sombra de árboles y arbustos; infortunadamente se conoce muy poco sobre la germinación de la semilla.

Por otra parte, Medina (2003) afirma que el chile max es un recurso que actualmente se encuentra bajo fuerte presión antropogénica debido a su extracción, pues al parecer las formas de corte no han sido las más adecuadas. Además, existe presión en cuanto a la eliminación cuando se desmontan grandes extensiones de matorral para dar paso a otras actividades como la agrícola y pecuaria.

En condiciones experimentales, la germinación varía según los diferentes parámetros físico-químicos (temperatura, humedad, luz y fitohormonas). Existe una fitohormona conocida como ácido giberélico (AG) que puede romper la latencia de las semillas y que frecuentemente reemplaza la necesidad de estímulos ambientales, tales como luz y temperatura (Hernández, 2004).

Debido a que existe poca información sobra la germinación del chile max y su posible domesticación, siendo este un recurso alimenticio y económico para los pobladores de la región, es necesario implementar alternativas que garanticen el recurso para las futuras generaciones.

Por tal motivo, en el presente proyecto se pretende valorar si los embriones de las semillas de chile max, de la región Yucateca, tratadas con diversos reguladores de crecimiento vegetal, estimulan la respuesta callogénica del explante, para posteriormente desarrollar un protocolo de organogénesis o embriogénesis somática indirectas para obtener plántulas de acuerdo con las condiciones ambientales de Yucatán.

Materiales y métodos

Recolección del material vegetal

Las semillas de chile max fueron colectadas en el municipio de Mérida, Yuc., ubicado a 40 km de la línea costera del Golfo de México. La población tiena una altitud promedio de 8 metros sobre el nivel del mar. En general, la localidad posee una orografía plana, clasificada como llanura de barrera; sus suelos son generalmente rocosos o cementados. El tipo de suelo en la ciudad es leptosol.

Se colectaron 10 gramos de chile de forma manual, se realizó la selección de frutos que tuvieran un color rojo intenso y tamaño prominente (Figura 1a). Posteriormente se secó a la sombra por un periodo de 2 semanas. Una vez transcurridas las dos semanas del secado, se abrió el fruto y se extrajeron las semillas, seleccionando aquellas que estuvieran en buen estado (color, tamaño y ausencia de necrosis).

Figura 1. a) Frutos frescos de chile max. b) Semillas axénicas. c) Corte de semillas.

Tratamiento de la semilla

La desinfección de las semillas se realizó asépticamente dentro de un gabinete de flujo laminar, con inmersión en etanol al 70% durante 5 minutos, posteriormente se realizó otra inmersión en Hipoclorito de Sodio comercial (Cloralex ®) al 30% por 15 minutos, seguido por varios lavados en agua destilada estéril después de cada inmersión para la eliminación de los residuos de los desinfectantes (Figura 1b).

Inducción de la callogénesis

Para inducir la callogénesis, antes de ser establecidas en frascos gerber, las semillas fueron seccionadas transversalmente para exponer el embrión a los diferentes tratamientos que se probaron (Figura 1c). Todos los tratamientos contenían las sales de Murashige & Skoog (1962) y siempre estuvieron suplementados con el 3% de sacarosa. El medio fue solidificado con 2.2 gr de gelrite y el pH fue ajustado a 5.7 antes de que fuera esterilizado en autoclave (121°C durante 15 min). Los cultivos fueron incubados a 25 ± 2°C bajo condiciones de fotoperiodo (16 h luz). Se evaluó 1 semilla cortada en 2 partes por cada frasco, con 5 repeticiones por tratamiento y fueron evaluados por un periodo de 50 días.

Resultados y discusión

Protocolo de descontaminación

Dado que solo tuvimos 4 frascos contaminados de los 50 donde establecimos las semillas cortadas podemos determinar que tuvimos un 8% de contaminación, lo que nos indica que el empleo de etanol al 70% y cloro al 30% seguido de enjuagues de agua destilada estéril comprueba ser una estrategia muy efectiva empleada en el protocolos de descontaminación como el de Santana-Buzzy (2005).

Respuesta general de los explantes a los tratamientos

Transcurridos 50 días después de su establecimiento in vitro los explantes mostraron la siguiente respuesta: de los 11 tratamientos evaluados en 5 se obtuvo una respuesta callogénica (45.45%), en 3 se presentó fenolización (27.27%), 3 se necrosaron (27.27%) y 2 no presentaron ninguna respuesta (18.18%) como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Efecto de la combinación de reguladores de crecimiento en la callogénesis del chile max.

Tratamiento (T) RespuestaT0: MS Control NecrosadoT1: MS + 2,4-D (4.52 µM) Callo semicompacto de 7 mm T2: MS + 2,4-D (4.52 µM) + BAP (13.32 µM) Callo friable de 5 mm T3: MS + 2,4-D (4.52 µM) + BAP (26.64 µM) Necrosado de 3 mm T4: MS + 2,4-D (9.05 µM) + BAP (13.32 µM) Callo friable de 4 mmT5: MS + AIA (11.42 µM) Necrosado de 2.5 mmT6: MS + AIA (11.42 µM) + BAP (13.32 µM) Necrosado T7: MS + AIA (11.42 µM) + BAP (26.64 µM) Sin respuesta T8: MS + AIA (22.83 µM) + BAP (13.32 µM) Sin respuesta T9: MS + BAP (13.32 µM) Callo compacto de 4 mmT10: MS + BAP (26.64 µM) Callo compacto de 3 mm

Respuesta no favorable

Los tratamientos T7 (MS + 11.42 µM AIA + 26.64 µM BAP) y T8 (MS + 22.83 µM AIA + BAP 13.32 µM) no tuvieron respuesta alguna y el explante se conservó igual después de 50 días de cultivo (Figura 2a).

En T0 (MS Control) y T6 (MS + 11.42 µM AIA + 13.32 µM BAP) los explantes se necrosaron completamente (Figura 2b) y no crecieron en absoluto a comparación de T3 (MS + 4.52 µM 2,4-D + 26.64 µM BAP) y T5 (MS + 11.42 µM AIA) que al principio si crecieron algunos milímetros pero finalmente terminaron necrosándose (Figura 2c).

Figura 2. a) Explantes sin respuesta. b) Explantes necrosados. c) Explantes necrosados que tuvieron un leve crecimiento.

Respuesta favorable

Entre los tratamientos que generaron callo friable estuvieron T2 (MS + 4.52 µM 2,4-D + 13.32 µM BAP) y T4 (MS + 9.05 µM 2,4-D + 13.32 µM BAP), los cuales tuvieron una apariencia blancuzca-cristalina y se pudieron observar que estaban formados por pequeños agregados celulares. El callo en T2 (Figura 3b) tuvo un crecimiento de 5mm y en T4 4mm de diámetro (Figura 3c).

Los tratamientos que generaron callo compacto fueron T9 (MS + 13.32 µM BAP) y T10 (MS + 26.64 µM BAP), tuvieron una coloración amarillenta-marrón y no se distinguían los agregados celulares como en T2 y T4. Los callos en T9 (Figura 3d) y T6 (Figura 3e) tuvieron un crecimiento de 4mm y 3mm respectivamente.

En el caso de T1 (MS + 4.52 µM 2,4-D) se presento un crecimiento desproporcionado comparado con los demás tratamientos (Figura 3a) pues el callo alcanzó un tamaño de 7mm de diámetro y tuvo características en apariencia tanto de callo friable como de callo compacto, entonces podemos decir que en T1 proliferó callo de tipo semicompacto.

Figura 3. (a) T1: MS + 2,4-D (4.52 µM). (b) T2: MS + 2,4-D (4.52 µM) + BAP (13.32 µM). (c) T4: T4: MS + 2,4-D (9.05 µM) + BAP (13.32 µM). (d) T9: MS + BAP (13.32 µM). (e) T10: MS + BAP (26.64 µM).

Analizando los 3 tipos de respuesta callogénica que tuvieron estos 5 tratamientos entre los 11 que se probaron, podemos decir que 18.18% presentó callo friable, 18.18% callo compacto y 9.9% callo semicompacto. De estos 5 tratamientos determinamos que sin lugar a dudas el mejor

tratamiento fue T1 por el grado de crecimiento que tuvieron los callos y por tener ambas características de callo (compacto y semicompacto).

Con este experimento podemos sacar las siguientes conclusiones:

El efecto del 2,4-D en la callogénesis en embriones somáticos cortados de Capsicum annuum L var. aviculare es más efectivo que el AIA, ya que el mejor tratamiento únicamente contuvo 4.52 µM de 2,4-D.

El uso de concentraciones bajas de BAP combinado con 2,4-D presentaron buenos resultados comparado con el uso de altas concentraciones de BAP.

Las peores respuestas se obtuvieron en tratamientos que contenían combinaciones de AIA con BAP tanto en altas como bajas concentraciones.

Bibliografía

Arcia, G. D. 1985. Evaluación financiera y económica de un sistema agroforestal en el Estado de Quintana Roo. Tesis de M. C., Programa Forestal, Colegio de Postgraduados, Chapingo, México, p. 168.

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Villalón, H., T. Medina, J. M., Soto, L. A., Rodríguez, O., Pozo, M., Ramírez, F., Garza, R., López, A., R. López, L. y M. Lara.2003. Efecto de diferentes intensidades de luz en la producción de chile piquín (Capsicum annuum L. var aviculare). Revista Ciencia Universidad Autónoma de Nuevo León (enprensa).