Efecto de microorganismos rizosféricos en Sorghum vulgare

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA

TESIS COMO REQUISITO

PARA OBTENER EL TÍTULO DE

BIÓLOGO

PRESENTA

MAYRA FERNANDA ROJAS CORREA

DIRECTOR DE TESIS

DRA. MARÍA VALDÉS RAMÍREZ

México, D.F., Octubre 2013

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Efecto de microorganismos rizosféricos en

Sorghum vulgare creciendo en suelo de un jal de

mina de oro y plata, de Mineral del Monte,

Hidalgo.

~ ii ~

Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de

Microbiología Agrícola del Departamento de Microbiología

de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto

Politécnico Nacional, bajo la dirección de la Dra. María

Valdés Ramírez.

~ iii ~

Agradecimientos

A la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas y a los profesores que tuve durante

mi estancia en ella por la formación profesional que me brindaron.

A la Doctora María Valdés Ramírez le agradezco por su apoyo, su paciencia, por

sus valiosas enseñanzas, sus consejos, sus conversaciones, su amistad, por darme

un gran ejemplo, por confiar en mí y por dirigir esta tesis.

A la Doctora Paulina Estrada de los Santos por la donación de dos cepas

bacterianas pertenecientes a la colección del Centro de Ciencias Genómicas,

UNAM, utilizadas en el desarrollo de esta tesis, por sus consejos y su amistad

brindada.

Al Doctor Javier Villegas de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo

y a la empresa Biosustenta por la donación del hongo micorrízico arbuscular

utilizado en el desarrollo de esta tesis.

Al profesor Miguel Gutiérrez de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas por el

asesoramiento en el análisis estadístico de esta tesis, por sus consejos y su

amistad.

A la M. en C. Lilia Rico por su amistad, por sus valiosos consejos para el desarrollo

de esta tesis y por sus valiosas observaciones.

A los sinodales, Biól. María Victoria Hernández Pimentel, Raúl Colmenero Solís y a

la Q. B. P. Nidia Sánchez Sánchez, por sus observaciones y por el tiempo invertido

en la revisión de esta tesis.

A los biólogos Mario Lamadrid y Efrén Hernández por su ayuda en el muestreo de

suelos y por sus consejos.

Al Ingeniero Agrónomo Daniel Velázquez por su ayuda y su apoyo brindado en la

realización de esta tesis y por ser un gran amigo.

~ iv ~

Dedicatoria

A mi madre, mi ejemplo, la mujer que más admiro, le dedico esta tesis con todo mi

corazón, agradeciéndole su paciencia, su comprensión, su apoyo incondicional, sus

palabras de consuelo, por escucharme siempre y por su gran amor. Gracias a ella

llegue hasta aquí y soy lo que soy.

A mi padre, mi ejemplo, mi apoyo, mi héroe, le dedico esta tesis agradeciéndole el

camino que ha recorrido conmigo y con mi madre. Gracias por romper la

contaminación.

A mis hermanas por los valiosos momentos que hemos pasado juntas y por su amor.

A Alejandra por su ligereza en la palabra, por tomarme de la mano en todo momento,

por ser mi aliada y mi mejor amiga, porque en México y en Argentina siempre

estuviste a mi lado apoyándome. A Angélica por sus consejos, por su guía, por su

comprensión y por escucharme siempre. Gracias a las dos por las risas y la felicidad

que me brindan todos los días.

A mi abuelito, que siempre ha creído en mí, que me alienta siempre ha ser una gran

mujer y a estudiar siempre, por su apoyo y su gran amor.

A mi tío Gonzalo que no logró ver culminado este proyecto de mi vida, se la dedico

con todo mi amor y respeto, espero que donde se encuentre sepa que éste también

es su logro, le agradezco su apoyo, su amor, su aliento y su motivación para

dedicarme a la ciencia. Siempre está en mi corazón.

Y muy especialmente a mis amigos por su apoyo, su preocupación, sus consejos,

por sus valiosas distracciones y los bellos momentos que hemos pasado juntos a

Omar, Moisés, Aline, Claudia, Jessica, Berenice, Gilberto y Alejandra.

~ v ~

M u j e r

Mujer, si te han crecido las ideas de ti van a decir cosas muy feas, que no eres buena, que si tal cosa que cuando callas te ves mucho más hermosa. Mujer, espiga abierta entre pañales cadena de eslabones ancestrales ovario fuerte, di lo que vales, la vida empieza donde todos somos iguales. Mañana es tarde, el tiempo apremia. Mujer si te han crecido las ideas de ti van a decir cosas muy feas, cuando no quieran ser incubadoras dirán, no sirven estas mujeres ahora. Mujer, semilla, fruto, flor, camino, pensar es altamente femenino. Hay en tu pecho dos manantiales, fusiles blancos y no anuncios comerciales. Amparo Ochoa

La Tierra fecunda

Diego Rivera

~ vi ~

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….... 2 1.1 MINERÍA……………………………………………………………………………... 2

1.2 INDUSTRIA MINERA EN MÉXICO………………………………………………... 2 1.3 CONTAMINACIÓN PROVOCADA POR LA INDUSTRIA MINERA……………. 5 1.3.1 Procesos de Extracción de Minerales……………………………………………. 5 1.3.1.1 Amalgamación con mercurio…………………………………………………… 6 1.3.1.2 Cianuración………………………………………………………………………. 6 1.3.3 Factores que contribuyen a la contaminación por actividad minera…………. 7 1.3.4 Riesgos a la salud por la actividad minera………………………………………. 9 1.3.5 Impacto de la actividad minera en plantas…………………………………….. 11 1.4 IMPORTANCIA DE LA ESTABILIZACIÓN DE LOS SUELOS…………………..12 1.4.1 Importancia del Suelo……………………………………………………………. 12 1.4.2 Alternativas de estabilización de los suelos…………………………………….12 1.4.3 Biotecnología aplicada en el mejoramiento de suelos…………………………14 1.4.3.1 Revegetación: Una alternativa de Recuperación de Ecosistemas……….. 15

1.5 MICORRIZA…………………………………………………………………………. 17 1.5.1 Hongos Micorrízico Arbusculares……………………………………………..... 18 1.5.2 Establecimiento de la Simbiosis………………………………………………… 18 1.5.3 Tolerancia de la micorriza Arbuscular a metales pesados……………………20 1.5.4 Rhizophagus intraradices………………………………………………………... 21 1.6 BACTERIAS AUXILIARES DE LA MICORRIZA…………………………………. 22 1.6.1 Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida…………………………... 25 2. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………………... 27 3. OBJETIVOS…………………………………………………………………………... 28 3.1 OBJETIVO GENERAL……………………………………………………………... 28 3.2 OBJETIVOS PARTICULARES……………………………………………………. 28 4. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………... 29 4.1 MATERIAL BIOLÓGICO…………………………………………………………… 29 4.2 ÁREA DE ESTUDIO………………………………………………………………... 29 4.3 MUESTREO………………………………………………………………………… 31 4.4 TRABAJO EXPERIMENTAL………………………………………………………. 31

~ vii ~

5. RESULTADOS……………………………………………………………………..... 34 5.1 EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE HMA Y BAM EN EL CRECIMIENTO ÁEREO…………………………………………………………………………………... 35 5.2 PORCENTAJE DE MICORRIZACIÓN…………………………………………… 36 5.3 LONGITUD DE LA PARTE AÉREA………………………………………………. 39 5.4 VOLUMEN RADICAL………………………………………………………………. 41 5.5 BIOMASA DE LA PARTE AÉREA………………………………………………… 42

6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO…………………………………………………………… 43

7. DISCUSIÓN…………………………………………………………………………... 44

8. CONCLUSIÓN………………………………………………………………………...46

9. PROSPECTIVAS DE LA INVESTIGACIÓN……………………………………….. 47

10. LITERATURA CITADA………………………………………………………………49

11. APÉNDICE………………………………………………………………………….. 58

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Pectoral con la representación del dios XippeTótec. Oaxaca. Oro. Cultura

Mixteca…………………………………………………………………………………….. 3

Figura 2. Vista general de tres depósitos de jales del distrito Minero de Pachuca... 7

Figura 3. Establecimiento de la simbiosis micorrízico arbuscular……………………19

Figura 4. Desarrollo vegetal de Medicago trunculata inoculada con Glomus

intraradices y sin inocular creciendo en suelo contaminado con metales

pesados………………………………………………………………………………….. 21

Figura 5. Vista al microscopio de estructuras fúngicas formadas por el HMA R.

intraradices............................................................................................................. 22

Figura 6. Sitios de acción de las Bacterias Auxiliares de la micorriza…………….. 24

Figura 7. Localización del área de estudio…………………………………………… 29

Figura 8. Vista General de la mina “La Rica”, ubicada en Mineral de Monte,

Hidalgo…………………………………………………………………………………… 30

~ viii ~

Figura 9. Comparación del crecimiento aéreo entre las plantas testigo y los cinco

tratamientos, inoculados con HMA, BAM o ambos inóculos…………………………35

Figura 10. Estructuras fúngicas características de hongos micorrízico arbusculares

observadas en las plantas inoculadas con R. intraradices y las dos BAM. …………37

Figura 11. Arbúsculo observado en raíz de S.vulgare inoculada con R. intraradices

+ P. fluorescens CHAO.………………………………………………………………….38

Figura 12. Estructuras fúngicas características de hongos micorrízico arbusculares

en raíces de S. vulgare, en el tratamiento inoculado con R. intraradices + P.

fluorescens CHAO.………………………………………………………………………38

Figura 13. Plántulas de sorgo donde se observa la longitud de la parte aérea entre

los tres tratamientos inoculados con el HMA R.

intraradices………………………………………………………………………………. 40

Figura 14. Plántulas de sorgo donde se aprecia la diferencia en altura y vigor de las

mismas micorrizadas y creciendo con una de las dos bacterias en estudio. ………40

Figura 15. Volumen radical en plantas inoculadas con el HMA y las BAM……… 41

Figura 16. Efecto de la interacción entre inoculante HMA- BAM, sobre el porcentaje

de micorrización..………………………………………………………........................63

Figura 17. Efecto de la interacción entre inoculante HMA- BAM, sobre la longitud

aérea.…………………………………………………………………………………….. 64

Figura 18. Efecto de la interacción entre inoculante HMA- BAM, sobre el volumen

radical …………………………………………………………………………………….64

Figura 19. Efecto de la interacción entre inoculante HMA- BAM, sobre la biomasa

de la parte aérea………………………………………………………………………... 65

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Tecnologías de tratamiento aplicables en la remediación de sitios

contaminados…………………………………………………………………………….13

Tabla 2. Propiedades químicas del suelo de la Mina La rica……………………….34

Tabla 3. Concentraciones de metales pesados determinados en el suelo de la Mina

La Rica…………………………………………………………………………………… 34

~ ix ~

Tabla 4. Porcentaje de micorrización observado en los tratamientos inoculados con

el HMA R. intraradices y las dos BAM P. fluorescens y P. putida wcs………………36

Tabla 5. Longitud de la parte aérea promedio observado en los tratamientos testigo

e inoculados con el HMA R. intraradices y con las dos BAM P. fluorescens CHAO y

P. putida wcs.......................................................................................................... 39

Tabla 6. Volumen promedio obtenido en los tratamientos testigo e inoculados con el

HMA R. intraradices y con las dos BAM, P. fluorescens CHAO y P. putida wcs….41

Tabla 7. Peso seco promedio obtenido en los tratamientos testigo e inoculados con

el HMA R. intraradices y con las dos BAM, P. fluorescens CHAO y P. putidawcs...42

Tabla 8. Valores de varianza obtenidos en el análisis estadístico para los

parámetros: Porcentaje de micorrización, Longitud de la parte aérea, Volumen

Radical y Biomasa de la parte aérea………………………………………………….. 43

Tabla 9. Resultados de ANOVA, de las determinaciones de longitud aérea,

porcentaje de Micorrización, volumen de la raíz y biomasa…………………………63

Efecto de microorganismos rizosféricos en Sorghum vulgare creciendo en

suelo de un jal de mina de oro y plata, de Mineral del Monte, Hidalgo.

Resumen

Una de las actividades económicas de mayor importancia a nivel mundial es la

minería, siendo uno de los sectores económicos con gran aportación económica en

México beneficiando el desarrollo de nuevas tecnologías a partir de los elementos

extraídos en esta actividad.

Sin embargo, esta industria genera un impacto negativo en los ecosistemas, el

resultado de la actividad minera genera residuos denominados “jales”. Dentro de

estos residuos se producen una gran cantidad de desechos sólidos, líquidos y

gaseosos. Algunos de los elementos liberados producto de la actividad minera, en

concentraciones elevadas suelen ser nocivos para los organismos, tales como el

Cadmio (Cd) y el Mercurio (Hg) los cuales no tienen función biológica y si un alto

nivel de toxicidad.

Una forma de estabilizar las condiciones del suelo e inmovilizar los metales pesados

evitando su lixiviación e incursión a los ciclos biogeoquímicos, es revegetando con

la utilización de microorganismos que viven asociados a las plantas.

El objetivo general de este trabajo fue evaluar el efecto de algunos microorganismos

rizosféricos capaces de aumentar la efectividad de la revegetación realizada por las

plantas en los ecosistemas. Los microorganismos inoculados en las plantas

ensayadas de sorgo (Sorghum vulgare), fueron un hongo micorrízico arbuscular

(Rhizophagus intraradices) e individualmente dos cepas de bacterias conocidas

como auxiliares de la micorriza: Pseudomonas fluorescens CHAO y Pseudomonas

putida wcs.

Los resultados con el hongo Rhizophagus intraradices en inoculación dual con P.

fluorescens CHAO mostraron diferencias estadísticas significativas en términos de

biomasa, longitud y nivel de micorrización en las plantas, lo que condujo a un buen

desarrollo de las mismas bajo las condiciones extremas del suelo de jal.

Efecto de microorganismos rizosféricos en Sorghum vulgare creciendo en suelo de un jal de mina de oro y plata, de Mineral del Monte, Hidalgo.

2

1. INTRODUCCIÓN

1. 1 MINERÍA

La minería es una actividad de gran importancia económica a nivel mundial, ya que

los elementos obtenidos de este proceso benefician el desarrollo de nuevas

tecnologías, debido a que los instrumentos utilizados en la industria y en la vida

diaria están fabricados con metales como hierro, cobre, cadmio, oro, plata y otros

elementos (Volke et al., 2005), es por ello que la minería es la una de las bases del

desarrollo económico y tecnológico del mundo.

Según el Instituto Nacional de Estadística Geografía e Información (INEGI, 2010),

la minería es una actividad económica primaria, debido a que los minerales son

tomados directamente de la naturaleza, acumulados en yacimientos, ya sea al aire

libre o en el subsuelo a diferentes niveles de profundidad. Debido a que son

recursos no renovables, el valor de éstos depende de su disponibilidad.

1.2 INDUSTRIA MINERA EN MÉXICO

En México está actividad se inició desde la época prehispánica, los principales

minerales y piedras preciosas explotados fueron oro, plata, jade, turquesa y

obsidiana. Esta explotación de minerales se inició y persiste en la actualidad, debido

a la privilegiada geología de México (Langenscheidt, 1997), la cual provee al

territorio con la presencia de minerales de gran valor y potencialmente explotables.

Los habitantes del México antiguo supieron aprovechar con eficacia las rocas y

minerales, y gracias a la experiencia acumulada en cientos de años de observación,

desarrollaron procedimientos para su obtención y utilización acordes con el avance

tecnológico y las necesidades de los pueblos prehispánicos.

La actividad minera fue de gran influencia en la evolución cultural, haciendo posibles

creaciones que en la actualidad son objeto de admiración como joyas de oro, plata

y piedras preciosas cuyo fin era esencialmente ritual (Figura 1) y artefactos utilitarios

como coas, hachas, escoplos y otros instrumentos metálicos de cobre, admirables

desde el punto de vista estético y técnico (Zamora, 2003).


3

Figura 1. Pectoral con la representación del dios XippeTótec. Oaxaca. Oro. Cultura

Mixteca. (Tomado de León, 1997).

Uno de los factores que influyó en la conquista del continente americano fue el

hallazgo de metales y piedras preciosas, ya que desde el primer viaje realizado al

continente americano, los conquistadores hallaron oro en forma de pepitas en los

ríos y de esta forma se incentivó el interés para continuar la búsqueda, poblando

así el territorio americano. Los conquistadores consideraron a México, Perú, Bolivia

y Colombia la tierra de El Dorado, donde aseguraban se encontraban manantiales

inagotables de oro y plata (León, 1997).

En el Diccionario Universal de Historia y Geografía publicado en México en 1853, al

hablar de la conquista de Querétaro en 1531, argumenta que se encontraron minas

que manifestaban no haber sido elaboradas con barras, cuñas ni picos, sino a fuerza

de fuego y no de pólvora, como prueba de la actividad minera prehispánica, aunado

a ello los picos de cobre de los chinantecas con los cuales Hernán Cortés derrotó a

Pánfilo de Narváez, es prueba concluyente de las habilidades de los indígenas en

la metalurgia (García, 1895).


4

Los documentos que relatan la historia de la conquista no mencionan como era la

extracción de los minerales y metales preciosos, lo que se sabe es que la

purificación del mineral de interés se daba por un simple lavado y se separaba por

diferencia de densidades, incluso se creía que recurrían a la calcinación, hechos

que Hernán Cortés describía en cartas (Ramírez, 1884).

Desde la conquista del territorio mexicano, la minería se convirtió en una actividad

primordial para el desarrollo económico de la colonia y posteriormente del país,

siendo la época colonial cuando se desarrolló con mayor intensidad. Gracias a la

minería se fundaron la mayoría de las ciudades coloniales y se construyeron vías

de comunicación. Durante la Independencia la industria minera sufrió un declive, y

se reactivó posteriormente con inversión extranjera; en el Porfiriato hubo un re auge

de la minería en el país, satisfaciendo nuevos mercados se construyeron grandes

plantas metalúrgicas (Gutiérrez y Moreno, 1995).

Los primeros trabajos subterráneos fueron realizados en Taxco, Pachuca,

Guanajuato y la Sierra Gorda de Querétaro. Actualmente la producción minera se

concentra en trece entidades: Chihuahua, Jalisco, Michoacán, Zacatecas, Durango,

Sonora, Coahuila, Guanajuato, San Luis Potosí, Hidalgo, Sinaloa, Colima y

Guerrero (Gómez et al., 2010).

Según la Secretaría de Economía (SE, 2012) durante el 2011 los principales

estados productores del sector minero, fueron Sonora (23%), Zacatecas (23%),

Chihuahua (14%), Coahuila (11%), San Luis Potosí (6%) y Durango (6%).

Producto de esta actividad, México se ubica en el primer lugar en producción de

plata, el noveno en oro y el onceavo en cobre a nivel mundial, produciendo en 2011,

16,761 md al año, representando el 2% del PIB. Debido a que la minería es el primer

eslabón de la cadena productiva de muchas industrias; actualmente la tendencia a

nivel mundial es utilizar minerales para la creación de nuevas tecnologías,

generando en México un total de 309,725 empleos directos (SE, 2012), lo que refleja

la importancia de mantener este sector activo y redituable.


5

En la actualidad, la industria minera se ha visto afectada por los bajos precios

internacionales de los metales, no obstante continúa siendo una actividad

económica relevante, ya que fomenta el desarrollo de muchas regiones del país,

como única actividad económica (Gutiérrez y Moreno, 1995).

1.3 CONTAMINACIÓN PROVOCADA POR LA INDUSTRIA MINERA

1.3.1 Procesos de Extracción de Minerales

A lo largo del desarrollo del sector minero, los procesos de recuperación de metales

se han ido perfeccionando, intentando reducir el impacto al medio ambiente y

aprovechando en mayor proporción los minerales obtenidos en los procesos de

extracción.

Los minerales extraídos se concentran utilizando métodos físicos y posteriormente

se separa la fracción económicamente redituable por gravimetría (Hernández et al.,

2009).

De acuerdo con Volke et al (2005), los procesos para recuperar metales se dividen

en pirometalurgia e hidrometalurgia. La pirometalurgia es un proceso en seco

basado en el uso de calor, el cual incluye métodos como calcinación, tostación,

fusión, volatilización, electrólisis ígnea y metalotermia; mientras que la

hidrometalurgia consiste en un proceso húmedo que abarca métodos como son

lixiviación, purificación y flotación. El método de flotación es una de las técnicas más

antiguas para la recuperación de metales y es utilizado para concentrar los

minerales, eliminando materiales sin valor.

Los materiales que no logran ser totalmente recuperados, se separan en forma de

lodos, que contienen altas concentraciones de elementos potencialmente tóxicos,

estos lodos son finalmente dispuestos en tinas, a las cuales se denominan presas

de jales (Hernández et al., 2009).


6

1.3.1.1 Amalgamación con mercurio

Uno de los métodos de recuperación de oro y plata más conocidos es la

amalgamación con mercurio, en este proceso se añade mercurio al mineral durante

la trituración, molienda y lavado, este método se basa en la adhesión del mercurio

al oro, formando una amalgama que facilita la separación de la roca, arena u otro

material. La amalgama se calienta para recuperar el oro a cielo abierto. En el caso

de no utilizar una retorta (destilador), los vapores del mercurio son liberados a la

atmósfera, produciendo aproximadamente emisiones de 300 toneladas métricas

anuales en todo el mundo según el Programa de las Naciones Unidas para el Medio

Ambiente (PNUMA, 2008).

La amalgamación por mercurio generalmente produce altas concentraciones de

contaminante en el ambiente debido a que no en todos los casos se combina el oro

para producir la amalgama y puede haber desperdicios de hasta un 90% del

mercurio empleado para la recuperación. Aunque este mercurio se puede reutilizar,

grandes concentraciones quedan dispersas en el ambiente provocando altos

niveles de mercurio en suelos, sedimentos y cuerpos de agua, dañando flora y fauna

(PNUMA, 2008).

1.3.1.2 Cianuración

Otro método empleado para la recuperación de minerales es la cianuración, este

proceso consta del uso del ion CN- y del oxígeno que se encuentra en el aire como

agente oxidante. El oro y la plata se disuelven en una solución de cianuro de sodio

o de potasio, el oxígeno en la solución de cianuro favorece la formación de cianuro

de oro y sodio o potasio según sea el caso, una vez formada la solución se separa

de los demás minerales, finalmente la recuperación del oro se lleva a cabo con

carbón activado (Salinas et al., 2004).


7

1.3.3 Factores que contribuyen a la contaminación por actividad minera

Aunque la industria minera ha sido de gran utilidad para el hombre, ésta genera un

alto impacto en los ecosistemas, el material subterráneo puede generar volúmenes

de residuos hasta ocho veces superiores al original (Volke et al., 2005). Mondragón

(2008) explica que el resultado de la actividad minera genera residuos denominados

“jales”, los cuales incluyen los materiales producto de la excavación para encontrar

las vetas y los sobrantes de la separación del mineral (Figura 2). Dentro de estos

residuos se genera una gran cantidad de desechos sólidos, líquidos y gaseosos, en

forma de gases, humos, partículas y aguas residuales (Gutiérrez y Moreno, 1995).

Figura 2. Vista general de tres depósitos de jales del distrito Minero de Pachuca. A-B.

Centro de Extensión Universitaria de la Universidad Autónoma de Hidalgo, donde se

aprecian sitios habilitados para practicar deportes, así como algunos Cupressus spp.

Introducidos. C. Campo de Golf, con manchones de herbáceas. D. Mina de Acosta (Juárez

et al. 2011).

La excavación de minas, la remoción de minerales y el proceso de extracción y

purificación provoca que haya incursión de metales pesados a los ecosistemas. Los

metales pesados se definen como elementos metálicos cuya densidad es superior


8

a 5 g/cm3. En términos ecológicos de definen como todos aquellos elementos

metálicos, que aparecen comúnmente asociados a problemas de contaminación.

Algunos de ellos en bajas concentraciones son esenciales para algunos organismos

como Fe, Mn, Zn, B, V, entre otros y en concentraciones elevadas suelen ser

nocivos para los mismos. Otros elementos sin función biológica en los organismos

son dañinos a cualquier concentración como son el Cd, Hg y Pb (Adriano, 2001),

estos elementos que suelen ser dañinos también son llamados elementos

potencialmente tóxicos (EPT). González (2008) define a los elementos

potencialmente tóxicos como elementos esenciales y no esenciales que pueden

generar síntomas de toxicidad e inhibición del crecimiento en las plantas. Los EPT

afectan el número, diversidad y actividad de los organismos del suelo inhibiendo la

descomposición de materia orgánica, alterando así la estructura del suelo, es decir

sus propiedades fisicoquímicas.

Los metales pesados suelen incorporarse al ecosistema por deposición atmosférica

afectando la calidad y el equilibrio del suelo; éstos provienen de cenizas y escorias

de procesos de combustión fósil o derivados del petróleo, por actividad agrícola que

incluye la adición de fertilizantes y pesticidas, y de residuos industriales, urbanos y

mineros (Ortiz et al., 2007).

En el caso de la actividad minera, la incursión de metales pesados provoca un

desequilibrio en el contenido de nutrientes fundamentales, influyen en una ruptura

de los ciclos biogeoquímicos, provoca baja capacidad de intercambio iónico e influye

en la disminución de la capacidad de retención de agua (Puga et al., 2006).

Ramos y Siebe (2006) describen los procesos geoquímicos desarrollados en

depósitos de jales que influyen en los niveles de pH y a su vez en la movilización de

los EPT, como son la oxidación de sulfuros que generan acidez, neutralización de

acidez por carbonatos y otras fases que cuando se intemperizan generan

alcalinidad, la precipitación de fases minerales secundarias como óxidos,

oxihidróxidos, sulfatos e hidroxisulfatos y la adsorción en superficies de óxidos y

oxihidróxidos. De acuerdo a estas reacciones químicas llevadas a cabo en los

suelos, las propiedades de éstos son alteradas modificando su pH, y así enfrentan


9

transformaciones de tipo químico, físico y biológico, afectando la biota en el

ecosistema.

1.3.4 Riesgos a la salud por la actividad minera

La actividad minera es también relevante en cuanto a la toxicología, ya que los

daños al ecosistema también tienen repercusión en la salud humana.

Derivados de los procesos de extracción antes descritos, elementos como el

mercurio, plomo, arsénico, cadmio y cianuros entre otros, han sido reportados como

tóxicos y dañinos para la salud humana.

El mercurio (Hg) que se desecha a los cuerpos de agua, por acción de los

microorganismos se transforma en un compuesto altamente tóxico llamado

metilmercurio el cual es fácilmente absorbido a través de la piel, vía respiratoria y

vía gastrointestinal, atacando al sistema nervioso central y periférico. La

Organización Mundial de la Salud (OMS, 2007), reporta que la inhalación de vapor

de mercurio puede ser perjudicial para los sistemas nervioso, digestivo e inmune,

dañando riñones y pulmones, provocando incluso la muerte.

Los síntomas por intoxicación por mercurio incluyen temblores, insomnio, pérdida

de memoria, efectos neuromusculares, dolores de cabeza y disfunción cognitiva y

motora.

Eleizer (2004) reporta que se ha demostrado que países como Canadá, Estados

Unidos de Norteamérica, China, Filipinas, Siberia y parte del continente africano y

de América del Sur son ejemplos de sitios contaminados con mercurio por obtención

de oro en la actividad minera.

Franco et al. (2010) señalan que el Arsénico (As) es considerado como uno de los

contaminantes más importantes del agua potable en el mundo, ya que provoca

cáncer en la piel, pulmones, vejiga y el riñón.

Se ha reportado que en Zimapán, Hidalgo se encontró un alto contenido de arsénico

desde 2550 mg/kg hasta 21400 mg/kg en jales de ese sitio, que es considerado

tóxico no por su concentración sino por las condiciones del suelo en cuanto a pH,

favoreciendo su disponibilidad en los ecosistemas (Méndez y Armienta, 2003).


10

La exposición al Plomo (Pb) puede causar daños en cerebro, hígado y riñón, el

cadmio (Cd) puede causar insuficiencia renal, hepática, y alteraciones al sistema

inmune (Franco et al., 2010).

En cuanto a los cianuros, cuando tienen un par de electrones libres pueden sustituir

ligantes esenciales de una biomolécula, volviéndose altamente tóxicos, como es el

caso de la hemoglobina, en la cual el cianuro forma hexacianoferratos con el hierro,

afectando de esta forma el transporte de oxígeno en el cuerpo (Gutiérrez y Moreno,

1995).

Carrillo y González (2006) argumentan que dado la inconsistencia de la

normatividad de desechos mineros en México, las empresas mineras depositan los

residuos generados de esta actividad en zonas o terrenos parcialmente aislados a

cielo abierto, evitando la generación de costos por tratamiento de descontaminación

y reducción de toxicidad, y estos desechos dañan flora y fauna incluyendo a las

personas que viven cerca de estos sitios; debido al viento y la erosión están

expuestos a elementos potencialmente tóxicos.

Desde que comenzó la explotación minera en México, no ha habido una

reglamentación o normatividad adecuada tanto para el proceso de extracción como

para la disposición de los residuos, no fue sino hasta el 2003 que se decretó la

NOM-141-SEMARNAT-2003 la cual establece el procedimiento para caracterizar

los jales, así como las especificaciones y criterios para la caracterización y

preparación del sitio, proyecto, construcción, operación y post-operación de presas

de jales. Por tanto las actividades mineras anteriores a esta reglamentación no

tuvieron una normatividad como tal, aunque si hay normatividad para manejo de

residuos peligrosos desde 1993, pero no en específico para los residuos de la

minería. Así, debido a una larga jornada de explotación minera a través de la historia

sin normatividad, la disposición de elementos potencialmente tóxicos provenientes

de esta actividad no han sido regulados ni tomados con la importancia pertinente,

en cuanto a la estabilización de los ecosistemas, disminuyendo un impacto en los

ecosistemas perturbados.


11

1.3.5 Impacto de la actividad minera en plantas Las plantas al encontrarse bajo estrés desarrollan mecanismos de protección para

subsistir en el ambiente, la respuesta de las plantas se da por medio de una cascada

de reacciones iniciada con la percepción de estrés, seguida de señalizaciones, un

transductor, reguladores de transcripción, activación de genes, y finalmente la

respuesta al estrés abiótico se refleja en un conjunto de cambios que pueden ser

morfológicos, bioquímicos y fisiológicos (Rivera, 2003).

Las plantas han tenido que evolucionar generando respuestas a estrés abiótico, en

el caso de la tolerancia a metales pesados, la fisiología vegetal ha desarrollado

mecanismos que mantienen las concentraciones de iones metálicos esenciales,

reduciendo al mínimo la exposición a metales pesados no esenciales, dado que la

primera respuesta en señal de defensa de planta en un estado de estrés es la

prevención o reducción de absorción restringida en las células de la raíz, inhibiendo

el transporte a larga distancia y disminuyendo la nutrición mineral.

Dentro de los mecanismos desarrollados por las plantas para su supervivencia hay

mecanismos que minimizan el daño causado por metales pesados evitando la

inclusión de estos a través de la homeostasis en general, ya que la fisiología

generalmente favorece un equilibrio de solutos dentro y fuera de la membrana por

lo tanto a determinadas concentraciones de ciertos metales su incursión dentro de

la célula es limitada, hay mecanismos que son específicos para ciertos metales

implicando una exclusión de ese elemento o favoreciendo un secuestro intracelular.

Siendo o no específica la respuesta, se desarrollan estrategias de almacenamiento

y desintoxicación como son la quelación y la formación de vacuolas, posteriormente

se activa un mecanismo de defensa ante estrés oxidativo y se sintetizan proteínas,

hormonas o especies reactivas al oxigeno (Manara, 2012).

Algunas moléculas sintetizadas por las plantas bajo estrés por metales pesados,

son las metalotioneínas, fitoquelatinas, proteínas de choque térmico y el tripéptido

glutatión que juega un papel central en la protección de las plantas a estrés

ambiental (Rivera, 2003).


12

1.4 IMPORTANCIA DE LA ESTABILIZACIÓN DE LOS SUELOS

1.4.1 Importancia del Suelo

El suelo junto con el aire, el agua, y la luz solar constituye el fundamento de la vida

en los ecosistemas, ya que alberga una gran diversidad de organismos y

microorganismos. A su vez constituyen un reactor natural de gran importancia, ya

que es un elemento filtrante, amortiguador y transformador, en el cual se llevan a

cabo una serie de reacciones bioquímicas vitales para los organismos y los

ecosistemas, como son los ciclos biogeoquímicos. También desempeña funciones

como reservorio de nutrientes, reserva genética y fuente de materiales no

renovables. La estabilidad y las condiciones de la solución del suelo influyen en la

disponibilidad y movilidad de los nutrientes (Volke et al., 2005).

Aunque las condiciones del suelo deben de permanecer óptimas para los

organismos, las actividades antropogénicas han afectado en gran medida la calidad

del suelo. En este aspecto la actividad minera a lo largo de su explotación ha

generado gran cantidad de elementos potencialmente tóxicos. Las características

del suelo a su vez están involucradas en aumentar o reducir la toxicidad de metales

en el suelo, Puga et al. (2006) exponen que la distribución y disponibilidad de los

metales pesados en los perfiles del suelo, está influenciada por propiedades

intrínsecas del metal y características del suelo.

Los métodos de recuperación de minerales alteran las condiciones del ambiente no

solo de la litosfera, sino también de la atmósfera y de la hidrosfera, provocando

incursión a los ecosistemas de elementos tóxicos.

1.4.2 Alternativas de estabilización de los suelos

El tema de recuperación de aéreas perturbadas ha captado gran interés a nivel

global, convirtiéndose ya en un instrumento de nuevas políticas públicas en el área

ambiental, y todas las políticas implementadas se caracterizan por tener un objetivo

en común que es corregir el impacto ambiental generado por actividades

antropogénicas. Por lo tanto, la búsqueda de alternativas que descontaminen o


13

estabilicen los ecosistemas han tenido gran auge en la actualidad y una de esas

alternativas es la Biotecnología.

Para descontaminar y estabilizar suelos es necesario hacer una evaluación del

grado de perturbación del ecosistema y una vez evaluado, se decide el proceso

mediante el cual se descontaminarán los suelos (Cruz, 2008). Según la Agencia de

Protección al Ambiente de los Estados Unidos (EPA, 2004) existen tratamientos

químicos, físicos, biológicos y térmicos mediante los cuales se logra el propósito de

disminuir la toxicidad de metales pesados (Tabla 1).

Tabla 1. Tecnologías de tratamiento aplicables en la remediación de sitios contaminados. (EPA,

2004).

Tipo de

Tratamiento

Suelo

Aguas profundas

Químico

Oxidación /Reducción;

agente patentado base

fosfato, químico reductor.

Barrera reactiva permeable

Oxidación/Reducción con diversos

materiales como: ditionito de sodio,

Fe2+ + piedra caliza + KMnO4

H2O2. FeSO4 + HCl, NaOH +HCl

Precipitación de minerales

Físico

Inundación

Lavado de suelos

Separación electrocinética

Solidificación/ estabilización

Inundación

Separación electrocinética

Separación física

Biológico

Biorremediación

Fitorremediación

Biorremediación

Fitorremediación

Térmico

Incineración

Vitrificación


14

1.4.3 Biotecnología implicada en el mejoramiento de suelos

La Biotecnología se define como la aplicación tecnológica de organismos vivos para

la modificación de productos o de procesos para usos específicos (Madigan et al.,

2009).

La Biotecnología del suelo es un área de gran interés dentro de las Ciencia del

suelo, ya que los microorganismos que se han empleado han mostrado gran

potencial mejorando los procesos, como es el caso de la contaminación de suelos

en el cual se ha procurado aplicar técnicas que mejoren los ecosistemas e

inmovilicen o degraden metales pesados, metaloides u otros contaminantes. El uso

de microorganismos para recuperar los suelos ha tenido gran relevancia ya que los

métodos biológicos no generan contaminantes como los métodos de

descontaminación físicos y químicos en los cuales la aplicación de técnicas genera

otros contaminantes. Aunado a ello otra de las ventajas del uso de microorganismos

para establecer los ecosistemas es el bajo costo (González, 2005).

Por lo tanto la Biorrecuperación de ecosistemas es un proceso viable y efectivo de

la Biotecnología, Bandyopadhyay y colaboradores (1994) definen a la

biorrecuperación como una alternativa biológica que usa microorganismos vivos o

sus metabolitos para acumular, transformar o degradar contaminantes.

La explotación de los beneficios obtenidos por los microorganismos para

inmovolizar, quelar y reducir las concentraciones de sustancias tóxicas de los

ecosistemas, es un campo ya explorado en el que se han utilizado microorganismos

para el tratamiento de aguas residuales, hidrocarburos, y plaguicidas pero en el

aspecto de contaminación de suelos por metales pesados es reciente el interés que

se ha enfocado para buscar alternativas biotecnológicas que puedan estabilizar los

suelos y mejorar la calidad de los ecosistemas.

Debido a que de forma natural los microorganismos del suelo juegan un papel muy

importante en el mantenimiento del equilibrio en el suelo y en el beneficio que

ofrecen a las plantas, se han aislado microorganismos de suelos contaminados con

metales pesados.


15

En la revisión realizada por González (2005), se reportan bacterias aisladas de sitios

contaminados como son: Burkholderia pickettii, B. solanacearum y Ralstonia

eutropha; bacterias aisladas de suelos contaminados con metales pesados como

Burkholderia, Hafnia, Pseudomonas, Acinetobacter, Comamonas y Agrobacterium;

y bacterias Gram positivas como Arthorobacter ramousus y A. aurescens, lo cual

aporta elementos para investigar cuál es su función, su impacto o aporte a estos

ecosistemas.

En una investigación realizada por Sizova y colaboradores (2001), se concluyó que

el uso de especies de Pseudomonas incrementó la supervivencia de sorgo en un

suelo contaminado con arsenito; las bacterias utlizadas en esta investigación fueron

P. fluorecens 38a, P. putida 53a y P. aureofaciens BS1393, que también son

bacterias promotoras del crecimiento vegetal (González, 2005).

1.4.3.1 Revegetación: Una alternativa de Recuperación de Ecosistemas

Dalmasso (2010) define a la restauración ecológica como el conjunto de acciones

que se llevan a cabo para recuperar la cobertura vegetal de un área degradada, y

por ende una mejora del sistema natural.

Los ecólogos han mostrado gran interés por la restauración ecológica considerando

que existe la probabilidad de autoregeneración de los ecosistemas a través de

procesos sucesionales (Muñoz et al., 2006). Dentro de los proyectos de

rehabilitación de áreas degradas por la actividad minera, la revegetación es de

primordial importancia.

El objetivo principal de la revegetación inducida es restituir la estructura y cobertura

vegetal.

Posterior a la contaminación de un ecosistema después de cierto periodo, la

repoblación por especies pioneras se da de forma natural, estas especies

desarrollan mecanismos de tolerancia a elementos tóxicos y esta cobertura vegetal

beneficia a los ecosistemas disminuyendo la energía del impacto de lluvia, además

de inmovilizar estos elementos (Ramos y Siebe, 2006).


16

Una de las ventajas que una revegetación inducida ofrece es la posibilidad de

mejorar el rendimiento de los ecosistemas, ya que además de utilizar plantas

tolerantes a concentraciones elevadas de metales pesados como son las plantas

metalófitas, se puede incrementar la eficiencia del proceso de estabilización del

suelo, inoculando con microorganismos que presenten potencial para inmovilizar y

tolerar elementos tóxicos, acelerando el proceso de restauración.

En un estudio de revegetación en suelos contaminados por actividad minera Muñoz

et al. (2006), proponen especies de las familias Poacea, Leguminosae y Asteraceae

para el establecimiento de herbáceas como cobertura vegetal en minas de

explotación geológica a cielo abierto.

La selección de especies para iniciar la revegetación es crucial ya que los criterios

en los que se base estarán influyendo directamente en la rehabilitación del

ecosistema, por lo tanto algunos de los puntos a considerar es el clima, ya que las

plantas seleccionadas deben de tener gran capacidad de adaptación a las

condiciones climáticas de la zona a revegetar, de igual importancia el tipo de

vegetación nativa es muy importante ya que las plantas elegidas deben de ser

compatibles con la flora de la zona (Muñoz et al., 2006), es por ello que las poáceas

son una opción tangible para comenzar un programa de revegetación, ya que gran

parte de las especies de la familia Poaceae poseen las características de las plantas

que se pueden seleccionar para revegetar ya mencionadas,

En un estudio realizado por Hernández y colaboradores (2009) se hizo una

determinación taxonómica de un jal de Pachuca, Hidalgo, en el cual se determinaron

25 especies vegetales pertenecientes a siete familias, siendo las más

representativas la familia Asteraceae con nueve especies y la familia Poaceae con

siete especies.

Dentro de la familia Poaceae, la cual según Muñoz et al, (2006) es una opción

factible para revegetar, se encuentra la especie Sorghum vulgare que es un planta

de gran importancia económica en México, siendo uno de los principales cultivos.

Según el Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera (SIAP, 2012) la mayor

de parte del sorgo en grano se utiliza en la preparación de alimentos balanceados

para animales y también se utiliza para alimentos para el ser humano como harinas


17

de sorgo. En la industria extractiva se emplea principalmente para obtención de

almidón y glucosa, además de la obtención de alcohol, acetona y butanol.

El sorgo tiene gran adaptación en zonas áridas o semiáridas con calor, es capaz de

soportar sequía durante períodos largos y reanudar su crecimiento con las lluvias,

germina en temperaturas de 12 a 13º C y se desarrolla bien en suelos alcalinos

(SIAP, 2012).

Ahora bien, puesto que la mayoría de las plantas se encuentran en la naturaleza

asociadas a diferentes microorganismos, la revegetación tendrá más éxito si éstas

se inoculan con los microorganismos adecuados.

1.5 MICORRIZA

El término micorriza fue acuñado por primera vez por el botánico alemán Albert

Bernard Frank en 1885. La palabra micorriza proviene de los vocablos griegos

mykos que significa hongo y del latín rhiza que significa raíz, es decir “hongo- raíz”,

por lo tanto la micorriza se define como la asociación simbiótica que se presenta

entre aproximadamente el 95% de las plantas terrestres y grupos de hongos

especializados del suelo (Rivera, 2003). En esta asociación el hongo le proporciona

a la planta nutrientes como fósforo, nitrógeno, azufre y agua a través del micelio

externo provenientes de la rizósfera, mientras el hongo es beneficiado mediante

fotosintatos (carbón orgánico) provenientes del proceso de la fotosíntesis de la

planta (Zarate, 2011), proporcionándole esta simbiosis a la planta, mayor área de

absorción que incrementa el desarrollo de biomasa, debido a una mayor captación

de nutrientes y un sistema eficiente de aprovechamiento de los mismos.

Brundett (2002) reconoce siete tipos de micorriza, varios de ellos muy similares

entre sí, los dos tipos principales de micorriza son la micorriza arbuscular de amplia

distribución y la más común y la ectomicorriza que se presenta en determinadas

familias de gimnospermas, dicotiledóneas y en un género de monocotiledóneas ,

otros tipos de micorriza mencionados limitadas a especificas familias de plantas son

ericoide, ericales, orquidiode, monotropoide y arbutoide.


18

1.5.1 Hongos Micorrízico Arbusculares

La simbiosis micorrízico arbuscular tiene evidencia fósil desde hace más de 460

millones de años, esta evidencia sugiere que estos hongos están involucrados en

la colonización de las plantas al ambiente terrestre, ya que hay evidencias fósiles

de Hongos Micorrízico Arbusculares (HMA) en raíces de las plantas terrestres más

antiguas de 400 millones de años. Al menos 80% de las especies de plantas

angiospermas son capaces de formar simbiosis micorrízico arbuscular (Harrison

2005; Rivera 2003; Vierheilig et al., 2008).

1.5.2 Establecimiento de la Simbiosis

Los HMA son biótrofos obligados, y se benefician de la planta no solo con la

obtención de carbono orgánico, también pueden completar su ciclo de vida con esta

simbiosis (Harrison, 2005), a su vez la planta no solo se beneficia a partir de la

nutrición mineral sino que el HMA también le confiere una mayor tolerancia a estrés

hídrico y salino, y protección contra hongos patógenos (Vierheilig et al 2008).

Harrison (2005) reconoce cuatro etapas principales del ciclo de vida de las especies

del género Glomus basado en observaciones morfológicas obtenidas a partir de

cultivos monoaxénicos: comienza con la germinación de la espora, un estado pre-

simbiótico, interacción con el huésped y finaliza con el establecimiento de la

simbiosis.

El desarrollo del hongo comienza cuando la hifa forma propágulos (esporas o

micelio). En cuanto al estado presimbiótico comprende el desarrollo del hongo en

ausencia del hospedero es decir la extensión del micelio se mantiene durante un

período de tiempo de una a dos semanas, aunque el crecimiento se detiene en

ausencia de señales moleculares secretadas por la planta hospedera como son las

estringolactonas (lactonas sesquiterpénicas), fitohormonas que promueven la

ramificación de las hifas, estas fitohormonas se encuentran en bajas

concentraciones normalmente en las plantas pero cuando éstas están receptivas a

formar la micorriza y tienen bajos niveles de Fósforo comienzan a sintetizarlas en


19

mayor proporción (Akiyama y Hayashi, 2006). Una vez percibidas las

estringolactonas por el hongo, este produce los factores myc activando la expresión

de genes ENDO 1, que le permite a la planta localizar las células en las cuales las

hifas del hongo hacen contacto (Ramírez y Rodríguez, 2010). El micelio se sigue

extendiendo hasta ponerse en contacto con las raíces de la planta hospedera

iniciando la formación de una estructura llamada apresorio (Rivera, 2003), esta

estructura penetra la célula hasta llegar a las células corticales donde se producen

señales específicas para la formación de arbúsculos, estructuras en las cuales se

lleva a cabo el intercambio de nutrientes entre la planta y el hongo (Ramírez y

Rodríguez, 2010) (Figura 3). Los arbúsculos permanecen aislados del citoplasma

de la célula vegetal mediante una extensión de la membrana plasmática, a la cual

se le llama membrana peri-arbuscular (Gianinazzi et al., 1996; Harrison, 2005) que

funciona como interface simbiótica para el intercambio de nutrientes (Rivera, 2003).

Figura 3. Establecimiento de la simbiosis micorrízico arbuscular. (1) Intercambio de señales

entre el hongo y la planta. (2) Hongo micorrízico arbuscular desarrollando el apresorio en

la superficie de la epidermis de las raíces. (3) Incursión del hongo inter e intracelularmente

en las células de las raíces. (4) Formación de arbúsculos en las células corticales. (5)

Finalmente, el hospedero controla la colonización espacial en las raíces (Delaux et al.,

2013).


20

1.5.3 Tolerancia de la micorriza arbuscular a metales pesados

Son de gran conocimiento los beneficios que ofrecen los HMA a las plantas en

estado de estrés, ya sea estrés salino, estrés hídrico y también en casos de

perturbación del ecosistema del suelo, dándole un mayor enfoque en este trabajo

a la perturbación provocada por la presencia de metales pesados en el suelo.

Aunque no todos los HMA se pueden desarrollar en presencia de metales pesados

ya que estos pueden presentar diferentes grados de tolerancia a estos metales, hay

registros de diferentes géneros de HMA aislados de ecosistemas contaminados con

metales pesados por lo tanto es evidencia de que poseen cierta tolerancia a estos

contaminantes (Rivera, 2003).

Se han descrito algunas estrategias propuestas mediante las cuales los HMA

presentan tolerancia a la toxicidad provocada por metales pesados.

Una de las hipótesis es que los HMA son capaces de sintetizar ácidos orgánicos

que actúan precipitando metales pesados disminuyendo así su efecto tóxico tanto

para la planta como para el hongo (Schützendübel y Polle, 2002). La absorción de

metales pesados por las hifas, es otro mecanismo propuesto ya que la quitina tiene

afinidad a los metales pesados y estos pueden ser absorbidos e inmovilizados en

las paredes o pueden secuestrar estos metales pesados en su citoplasma debido

a moléculas quelantes producidas por los mismos o secretadas por otros

microorganismos y los HMA secuestran estas moléculas favoreciendo la quelación.

Las moléculas quelantes son siderófos, metalotioneínas y fitoquelatinas (Atimanav

y Alok, 2004). Las metalotioneínas y las fitoquelatinas son proteínas ricas en

cisteína con gran afinidad a los metales pesados dado por sus grupos tiol.

Se ha demostrado que el HMA Glomus intraradices Sy167 bajo estrés provocado

por metales pesados expresa genes que codifican para proteínas implicadas en la

tolerancia a metales pesados, incluyendo la metalotioneína (Hildebrandt et al.,

2007).

Una de las moléculas más importantes involucradas en la inmovilización de metales

pesados es la glomalina, que es una glicoproteína producida por las hifas de los

HMA y se ha propuesto su importante rol en el potencial secuestro de elementos

tóxicos, reduciendo su biodisponibilidad (González et al., 2004)


21

Por lo tanto la acción de los HMA en la captación, inmovilización y estabilización de

los metales pesados mejora el desarrollo vegetal en presencia de estos

contaminantes, ya que disminuye la toxicidad de estos elementos y las plantas

tienen un mejor desarrollo que en ausencia de HMA (Figura 4).

Figura 4. Desarrollo vegetal de Medicago trunculata inoculada con Glomus intraradices y sin

inocular creciendo en suelo contaminado con metales pesados. (Hildebrandt et al., 2007)

1.5.4 Rhizophagus intraradices

El hongo micorrízico arbuscular Rhizophagus intraradices Schenck & Smith (2010),

antes conocido como Glomus intraradices Schenck & Smith (1982) pertenece al

phylum Glomeromycota, a la familia Glomeraceae (MycoBank, 2013),

caracterizados por una distribución cosmopolita y por la formación de esporas de

gran tamaño (1-5 mm). Como muchos otros hongos micorrízico arbusculares una

vez establecidas las respuestas moleculares entre el hongo y la planta, estos

desarrollan estructuras fúngicas características de la simbiosis como son

arbúsculos, esporas intraradicales, vesículas y esporas. Como anteriormente se

mencionó los arbúsculos tienen una función de intercambio de nutrientes, las

vesículas son de paredes delgadas y contienen lípidos, las vesículas de la familia

Glomaceae son generalmente de ovoides a elipsoides (INVAM, 2013), las hifas que

se encuentran dentro de los tejidos de la raíz son diferentes en cuanto a morfología


22

y función, ya que las hifas internas tienen funciones de absorción y transporte

mientras que las hifas externas tienen función infectiva (Figura 5.).

Figura 5. Vista al microscopio de estructuras fúngicas formadas por el HMA R. intraradices como

son (A Y C) arbúsculos y (B) vesículas o esporas dentro de raíces teñidas con azul tripán

(International Culture Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi INVAM)

http://invam.caf.wvu.edu/)

1.6 BACTERIAS AUXILIARES DE LA MICORRIZA

Se denomina rizósfera al conjunto de microorganismos, componentes del suelo y la

raíz de la planta interactuando formando un microcosmos (Alves et al., 2010).

Por lo tanto, el estudio de las interacciones dadas en la rizósfera es indispensable

para conocer los efectos de unos organismos sobre otros y determinar los posibles

efectos benéficos o perjudiciales, siendo el objetivo principal la implementación del

mejor sistema rizosférico para obtener buen rendimiento y funcionamiento de este

microecosistema.

Anteriormente se mencionó la definición de micorriza, su importancia y su efecto en

las plantas, debido a que los hongos micorrízicos arbusculares son de gran

importancia en los ecosistemas cualquier tipo de efecto que los microorganismos

del suelo puedan ejercer sobre ellos es relevante, en este caso se enfoca el efecto

de las bacterias en los HMA.


23

Los hongos se encuentran en constante interacción con una amplia gama de

bacterias, dentro estas bacterias se encuentran las Rizobacterias Promotoras del

Crecimiento Vegetal (PGPR), Bacterias Auxiliares de la Micorriza (MHB), y

Bacterias perjudiciales (Miransari, 2011).

El término Mycorrhiza Helper Bacteria, fue utilizado por primera vez por Garbaye en

1994, haciendo alusión a las bacterias con un efecto benéfico sobre la micorriza,

basados en los primeros experimentos realizados por Bowen y Tbeodorou en 1979

en los cuales se demostró en condiciones in vitro el efecto que algunas rizobacterias

ejercían sobre el crecimiento del hongo ectomicrorrízico Rhizopogon luteolus en

plántulas de Pinus radiata, y el efecto negativo o positivo dependió del tipo de la

bacteria aislada. Abriendo así el camino para investigar el efecto de diversas

rizobacterias en el desarrollo de la micorriza (Garbaye, 1994).

Los hongos micorrízico arbusculares y las bacterias del suelo pueden interactuar

sinérgicamente para estimular el crecimiento de las plantas a través de una serie de

mecanismos que incluyen la mejora en la adquisición de nutrientes y la inhibición

de patógenos fúngicos de las plantas (Artursson et al., 2006).

Dado que las evidencias científicas aportan fundamentos que prueban que los

hongos micorrízico arbusculares son beneficiados por las Bacterias Auxiliares de la

Micorriza, hay hipótesis que aseguran que las BAM también reciben beneficios de

los HMA, incrementando la población de estas bacterias en la micorrizosfera; como

es el caso de estudios realizados en condiciones de invernadero con la cepa de

Pseudomonas fluorescens BBc6R8, evaluando su supervivencia en presencia y

ausencia del hongo ectomicorrìzico Laccaria bicolor S238N en raíces del abeto

Douglas, demostrando gran aumento en la presencia de P. fluorescens BBc6R8 en

raíces micorrizadas con L. bicolor S238N (Frey et al., 1997).

Los efectos propuestos por Frey et al. (2007) de las Bacterias Auxiliares de la

Micorriza son: (1) Las BAM contribuyen a la movilización de minerales y materia

orgánica del suelo. (2) Aumentan la receptividad de la raíz para el establecimiento

de la simbiosis. (3) Interactúan con la planta y con el hongo promoviendo un


24

reconocimiento para establecer la simbiosis. (4) Promueven la germinación de los

propágulos fúngicos, la supervivencia y crecimiento del micelio.

Además de los mecanismos ya mencionados que promueven el desarrollo del

hongo, también es importante mencionar que la bacteria actúa contra patógenos,

por medio de la producción de antibióticos, disminuyendo la competitividad y

aumentando la efectividad del hongo; y mejora la nutrición ya que también

promueve el desarrollo del micelio por medio de la producción de factores del

crecimiento, aunque las BAM no solo benefician al hongo ya que pueden producir

también factores del crecimiento que beneficien el incremento de la ramificación de

las raíces aumentando la superficie de absorción y a su vez la biomasa (Figura 6).

Figura 6. Sitios de acción de las Bacterias Auxiliares de la micorriza (Tarkka y Frey, 2008).

El hongo y las raíces actúan en la simbiosis seleccionando las poblaciones

bacterianas en la rizósfera y el suelo, determinando la receptividad del hongo.

Se ha propuesto que la trehalosa juega un papel importante en la selección de las

bacterias que colonizan la micorrizosfera. En la asociación micorrízico arbuscular,

el hongo fija carbohidratos que frecuentemente transforma a trehalosa, que es un

disacárido propuesto como una reserva de carbono. Se ha demostrado que

Pseudomonas monteilli con el hongo ectomicorrízico Pisolithus albus, cultivado en

placa con trehalosa aumenta significativamente el crecimiento fúngico, mientras que


25

no se observó el mismo efecto cuando se cultivó con otros siete compuestos

orgánicos. Por lo tanto hay una hipótesis que propone que ciertos metabolitos, como

la trehalosa, secretada por células fúngicas, pueden facilitar la colonización de las

hifas y la formación de biofilms producidos por las BAM sobre las hifas, aunque aún

no se sabe con exactitud si los biofilms juegan algún papel en los efectos ejercidos

por las BAM sobre los HMA (Frey et al., 2007).

1.6.1 Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida

El género Pseudomonas se encuentra clasificado dentro del dominio Bacteria,

phyllum Proteobacteria, clase Gammaproteobacteria, orden Pseudomonales y

familia Pseudomonaceae (Brenner et al., 2005).

Las Pseudomonas fluorescens son bacilos rectos, Gram negativos, poseen flagelos

polares y son organismos aerobios. Las condiciones óptimas para su crecimiento

son pH neutro y temperatura dentro de un rango de 25 a 30º C (Palleroni, 2005).

Pseudomonas putida son bacterias Gram negativas, con flagelos polares y

anaerobias estrictas (Babu et al., 2013).

Ambas bacterias son Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (PGPR´s)

caracterizadas por su capacidad de colonización agresiva en la raíz, su

supervivencia en la rizósfera y la capacidad de promover el desarrollo vegetal ya

sea por mecanismos directos (producción de metabolitos que afectan directamente

a la planta) o indirectos (producción de metabolitos que afectan factores rizosféricos

que producen un mejora en el crecimiento de la planta).

Aunado a su capacidad de PGPR`s ambas han sido reportadas como Bacterias

auxiliares de la micorriza.

En un trabajo realizado por Fester et al., (1999) la BAM Pseudomonas fluorescens

beneficia al HMA Glomus intraradices, en presencia de Triticum aestivum,

incrementando la colonización micorrízica en las raíces.


26

En un trabajo realizado por Villegas y Fortin (2002), se demostró que la bacteria

Pseudomonas putida con el hongo micorrízico arbuscular G. intraradices, aumenta

la solubilización de fosfato en el suelo beneficiando así la disponibilidad de fosfato

y aumentando la captación del mismo por el micelio y posteriormente transportado

a las raíces de la planta.


27

2. JUSTIFICACIÓN

La contaminación generada por la industria minera provoca perturbaciones en los

ecosistemas, por medio de los productos del proceso de extracción y purificación

de los metales de interés que quedan en los suelos, en los cuerpos de agua y

dispersos en el aire.

En los últimos años el interés por restaurar y mantener los ecosistemas ha inducido

a la comunidad científica a buscar alternativas para lograr rehabilitar los

ecosistemas afectados, es de este modo como la Biotecnología incursiona con el

uso de organismos vivos en la estabilización, en este caso de los suelos

contaminados por la actividad minera. Una forma de estabilizar las condiciones del

suelo e inmovilizar los metales pesados evitando su lixiviación e incursión a los

ciclos biogeoquímicos alterando a su vez los mismos, es utilizando microorganismos

que viven asociados a las plantas.


28

3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

El objetivo general de este trabajo es evaluar el efecto de algunos microorganismos

rizosféricos capaces de aumentar la efectividad de la revegetación por las plantas.

Los microorganismos a inocular en las plantas son un hongo micorrízico arbuscular

y dos cepas bacterianas auxiliares del hongo, en Sorghum vulgare, ofreciendo una

alternativa biotecnológica para revegetar y estabilizar los ecosistemas alterados por

la actividad minera.

3.2 OBJETIVOS PARTICULARES

1. Evaluar el crecimiento de la gramínea inoculada con Rhizophagus intraradices.

2. Evaluar el crecimiento de la gramínea inoculada con Pseudomonas fluorescens

CHAO

3. Evaluar el crecimiento de la gramínea inoculada con Pseudomonas putida wcs

4. Evaluar el crecimiento de la gramínea en inoculación dual con Rhizophagus

intraradices + Pseudomonas fluorescens CHAO

5. Evaluar el crecimiento de la gramínea inoculada con Rhizophagus intraradices

+ Pseudomonas putida wcs


29

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1 MATERIAL BIOLÓGICO

Cepa de Pseudomonas fluorescens CHAO y cepa de Pseudomonas putida

wcs.

Hongo micorrízico arbuscular Rhizophagus intraradices.

Semillas de Sorghum vulgare.

4.2 ÁREA DE ESTUDIO

El área de estudio se encuentra en el Municipio de Mineral del Monte en el estado

de Hidalgo, ubicado a 12km de Pachuca de Soto, localizada en las coordenadas

20° 08.295´ latitud Norte y 98° 40.866´ Longitud Oeste, a una altitud de 2670

m.s.n.m. (Figura 7).

Figura 7. Localización del área de estudio.


30

La temperatura media anual es de 12°C, la mínima media anual es de 7.1°C y la

máxima es 18.2° C, con precipitación media anual de 583.1 mm según la Estación

Climatológica 00013115, localizada en Mineral del Monte, Hidalgo.

La mina San José “La Rica”, se encuentra ubicada dentro del distrito minero

Pachuca-Real del Monte el cual, según la Carta Geológico- Minera del Servicio

Geológico Mexicano (SGM, 2007) éste distrito minero ha producido el 6% de la plata

mundial y el 16% de la producción nacional desde 1492 hasta finales del siglo XX

(Figura 8). Ésta mina se ha dedicado a la explotación de metales como Au, Ag, Zn

y Cu, desde mediados del siglo XVIII y desde hace 10 años dejó de extraer metales,

aunque debido a los métodos de extracción de Au y Ag por amalgamación de Hg y

cianuración, los residuos generados por la explotación se encuentran aún en el

ecosistema en forma de jales mineros, ya que no se puede obtener una

recuperación del 100% en el proceso de extracción (Volke, et al. 2005).

Figura 8. Vista General de la mina “La Rica”, ubicada en Mineral de Monte,

Hidalgo.


31

El estado de Hidalgo es conocido a lo largo de la historia como un sitio minero, parte

de su paisaje está representado por presas de jales. Juárez et al. (2011) mencionan

que se estima que en el distrito minero de Real del Monte y Pachuca existen por lo

menos cien mil toneladas de desechos acumulados como consecuencia de la

extracción de oro y plata. En un trabajo realizado por Castañeda (2002) se

analizaron lixiviados de jales de Pachuca y se presentaron niveles de cadmio

tóxicos.

4.3 MUESTREO

Se tomaron cuatro submuestras del suelo de jal, las zonas de muestreo fueron

equidistantes entre sí, tomadas de 0- 40 cm de profundidad, cada muestra obtenida

contenía el mismo volumen, posteriormente las muestras se homogenizaron en una

muestra compuesta, según la NOM-021-SEMARNAT-2000. El material se dejó

secar al aire por 4 días y se tamizó en tamices de malla de 0.5 mm.

4.4 TRABAJO EXPERIMENTAL

De la muestra homogenizada se determinaron parámetros químicos como

conductividad, capacidad de campo, materia orgánica, capacidad de intercambio

iónico y también se realizó un análisis de las concentraciones de metales pesados

en la muestra de suelo de jal. El análisis se llevó a cabo a través del procedimiento

de digestión húmeda EPA5030; para fósforo total por incineración y cuantificación

por colorimetría, en el Laboratorio de Química, Centro de Edafología del Colegio de

Posgraduados. Con las dos cepas, P. putida wcs y P. fluorescens CHAO, se

realizaron resiembras en agar nutritivo, incubadas a 28 °C durante 48 horas,

posteriormente se cultivaron en caldo nutritivo durante 48 horas con agitación

constante. Del caldo, se realizaron diluciones de hasta 10-8, de estas diluciones de

realizaron aislamientos por la técnica de dispersión en superficie (espatulado),

incubándose a 28 °C durante 48 horas, transcurrido el tiempo de incubación se

realizó una cuenta del número total de bacterias, y se calculó el número de Unidades

Formadoras de Colonias/mL.


32

Las semillas de S. vulgare se desinfectaron lavando tres veces con agua estéril y

Tween 20, posteriormente se colocaron en HgCl 1:1000 durante cinco minutos.

Finalmente se enjuagaron con agua estéril tres veces. Se germinaron en papel

estéril humedecido dentro de bolsas de plástico selladas y se incubaron a 28 °C

durante 48 horas. Dada la extrema concentración de metales pesados en el suelo

del jal, éste se diluyó con arena estéril. Las semillas germinadas se colocaron en

macetas con 400 gr de una mezcla 3:1 suelo estéril- suelo de jal de mina.

Se diseñaron 6 tratamientos con tres repeticiones cada uno; de los seis

tratamientos, tres fueron inoculados con el hongo micorrízico arbuscular R.

intraradices con 200 esporas por maceta y los tratamientos que fueron inoculados

con bacterias la concentración de bacterias por planta fue de 1x106.

Los tratamientos fueron de la siguiente manera:

1. Testigo

2. Rhizophagus intraradices

3. Pseudomonas fluorescensCHAO

4. Pseudomonas putidawcs

5. Rhizophagus intraradices + Pseudomonas fluorescensCHAO

6. Rhizophagus intraradices + Pseudomonas putidawcs

Las plantas se desarrollaron en condiciones controladas de luz con un fotoperíodo

de dieciséis horas luz y ocho oscuridad, y en un intervalo de temperatura entre 24-

27 °C durante 12 semanas. Las plantas de todos los tratamientos recibieron riego

una vez a la semana con Solución de Long- Ashton al 5% (v/v) manteniéndose la

humedad constante al 50% de la capacidad de campo.


33

Las plantas de Sorgo fueron cosechadas después de 12 semanas, se enjuagaron

con agua destilada, a las raíces se les determinó el volumen y porcentaje de

micorrización.

A la parte aérea de la planta se le determinó longitud aérea y peso seco a 70 °C

durante 48 hrs, hasta alcanzar peso constante.

Los datos obtenidos fueron analizados mediante una prueba de ANOVA de factores

múltiples y se obtuvieron gráficos de cajas, estos análisis fueron realizados con el

programa Statistica.


34

6. RESULTADOS

Las concentraciones de metales pesados en el suelo del jal se muestran en la Tabla

2.

Tabla 2. Concentraciones de metales pesados determinados en el suelo de la

Mina La Rica.

La muestra compuesta de suelo mostró las siguientes características. Tabla 3.

Tabla 3. Características químicas del suelo de la Mina La rica, después de diluirlo

1:3.

Parámetro determinado Valor obtenido

pH 8.5

Capacidad de Campo 22.8%

Materia Orgánica 0.97 %

Capacidad de Intercambio

Iónico

7.76 meq/100 grs. de

suelo.

Ag

(mg/kg)

Cu

(mg/kg)

Zn

(mg/kg)

Pb

(mg/kg)

P total

(mg/kg)

P

intercambiable

(mg/kg)

Q1 9.2 438 12,100 5,200 1,215 0

Q2 9 519 9,600 3,640 1,265 0

Q3 10.6 472 10,700 4,200 1,232 0

Promedio 9.6 476.33 10,800.00 4,346.67 1,237.33 0

DesvStd 0.87 40.67 1,253 790 25 0


35

5.1 EFECTO DE LA INOCULACIÓN DE HMA Y BAM EN EL CRECIMIENTO

ÁEREO

Los resultados obtenidos en cuanto al crecimiento aéreo y vigor de la planta son

visiblemente mayores en el tratamiento inoculado con el hongo micorrízico

arbuscular Rhizophagus intraradices más la bacteria auxiliar de la micorriza

Pseudomonas fluorescens CHAO, respecto a los otros cinco tratamientos (Figura

9).

Figura 9. Comparación del crecimiento aéreo entre las plantas testigo y los cinco tratamientos, inoculados con

HMA, BAM o ambos inóculos. (A) Testigo. (B) Testigo y plantas inoculadas con Rhizophagus intraradices. (C)

Testigo y plantas inoculadas con Pseudomonas fluorescens CHAO. (D) Testigo y plantas inoculadas con

Pseudomonas putidawcs. (E) Testigo comparado y plantas inoculadas con R. intraradices + Pseudomonas

fluorescensCHAO. (F) Testigo y plantas inoculadas con conR. intraradices + P. putidawcs.


36

5.2 PORCENTAJE DE MICORRIZACIÓN

El porcentaje de micorrización fue una de las variables clave de esta investigación,

ya que uno de los objetivos principales es la evaluación del porcentaje de

micorrización en presencia de las Bacterias Auxiliares de la Micorriza. Los

resultados fueron evidentes mostrando un incremento estadístico significativo

(α=0.05) en el porcentaje de micorrización de las raíces inoculadas con el Hongo

Micorrízico Arbuscular R. intraradices y la Bacteria Auxiliar de la Micorriza

Pseudomonas fluorescens CHAO, obteniendo un porcentaje de micorrización

promedio superior en el tratamiento inoculado con R. intraradices + P. fluorescens

CHAO de 67% respecto a los dos tratamientos inoculados con el HMA solo o con el

hongo más la BAM P. putida wc, con 30.66 y 39.4% de micorrización

respectivamente.

De acuerdo al número de estructuras fúngicas observadas relevantes para

determinar el porcentaje de micorrización que incluye la observación de vesículas,

hifas y arbúsculos, también los resultados fueron superiores en el tratamiento

inoculado con R. intraradices + P. fluorescens CHAO con un promedio de

estructuras fúngicas observadas de 40.2 en 60 campos observados, con respecto

a los otros dos tratamientos inoculados con el HMA y la BAM P. putica wcs, en los

cuales se observó un promedio de 18.39 y 23.64 estructuras fúngicas

respectivamente (Tabla 4 y Figura 10).

Tabla 4. Porcentaje de micorrización observado en los tratamientos inoculados con el HMA R.

intraradices y las dos BAM P. fluorescens CHAO y P. putida wcs.

Tratamiento

N° de estructuras fúngicas observadas promedio

% de micorrización promedio

Rhizophagus intraradices 18.39 30.66

R. intraradices+ P. putida wcs

23.64 39.4

R. intraradices + P. fluorescens CHAO

40.2 67


37

Las raíces procesadas muestran una diferencia clara entre los tres tratamientos

inoculados con el HMA y las dos BAM, haciendo notable el elevado número de

estructuras fúngicas en un solo campo en el tratamiento inoculado con con R.

intraradices + P. fluorescens CHAO (Figura 10).

Fue de gran relevancia la observación de un número superior de vesículas

observadas en el tratamiento inoculado con R. intraradices + P. fluorescens con un

promedio de aproximadamente 50% más vesículas observadas que en el

tratamiento inoculado únicamente con el HMA, y un 30% más vesículas observadas

respecto al tratamiento inoculado con el HMA y con la BAM P. putida.

Figura 10. Estructuras fúngicas (vesículas e hifas) características de hongos micorrízico

arbusculares observadas en las plantas inoculadas con R. intraradices y las dos BAM,


38

También se observó un número superior de arbúsculos de hasta un 300% más que

en el tratamiento inoculado únicamente con el HMA y hasta un 500% más elevado

que el número de arbúsculos observado en el tratamiento inoculado con el HMA y

con la BAM P. putida wcs (Figura 11).

Figura 11. Arbúsculo observado en raíz de S.vulgare inoculada con R. intraradices + P. fluorescens

CHAO. 40X.

En el tratamiento inoculado con R. intraradices + P. fluorescens CHAO se obtuvo el

mayor porcentaje de micorrización, las estructuras fúngicas observadas en las

preparaciones se evidencian en la figura 12.

Figura 12. Estructuras fúngicas características de hongos micorrízico arbusculares en raíces de S.

vulgare, en el tratamiento inoculado con R. intraradices + P. fluorescens CHAO, teñidas con fucsina

ácida. A) Vesículas e hifas observadas en raíz. 10X. B) Arbúculos observados en raíz. 40X C)

Vesículas 100X. V= Vesículas, H= Hifas y A= Arbúsculos.


39

5.3 LONGITUD DE LA PARTE AÉREA

Los resultados obtenidos en cuanto a la longitud de la parte aérea fueron superiores

en el tratamiento inoculado con R. intraradices y P. fluorescens CHAO con un

promedio de 28 cm., mientras que el segundo tratamiento con gran longitud fue el

inoculado únicamente con P. fluorescens CHAO con una longitud de 25.3 cm (Tabla

5 y Figura 13).

Tabla 5. Longitud de la parte aérea promedio observado en los tratamientos testigo

e inoculados con el HMA R. intraradices y con las dos BAM P. fluorescens CHAO y

P. putida wcs.

En los tres tratamientos inoculados con el HMA R. intraradices, como anteriormente

se mencionó, se obtuvo una mayor longitud en el inoculado también con P.

fluorescens CHAO, no solo distinguiéndose por una mayor altura sino también por

un mayor vigor vegetal y un color verde ligeramente más intenso comparado con

los otros dos tratamientos, se observó menor vigor y un color ligeramente más

amarillento en el tratamiento inoculado con R. intraradices y Pseudomonas putida

wcs (Figura 13 y 14).

Tratamiento

Longitud Promedio por tratamiento

(cm)

Testigo 18.08

Rhizophagus intraradices 21.43

Pseudomonas fluorescens CHAO

25.3

Pseusomonas putida wcs 23.8

P. fluorescens CHAO + Rhizophagus intraradices

28

P. putida wcs + R. intraradices

23.56


40

Figura 13. Plántulas de sorgo donde se observa la longitud de la parte aérea entre los tres

tratamientos inoculados con el HMA R. intraradices.

Figura 14. Plántulas de sorgo donde se aprecia la diferencia en altura y vigor de las mismas

micorrizadas y creciendo con una de las dos bacterias en estudio.


41

5.4 VOLUMEN RADICAL

El volumen de la raíz es otro parámetro de gran importancia ya que permite evaluar

el efecto del HMA y las BAM en el desarrollo radicular relacionado con una mayor

absorción de nutrientes. En este caso el mayor promedio obtenido fue en las raíces

inoculadas con el HMA y la BAM P. fluorescens con un valor de 0.76 cm3 (Tabla 6 y

Figura 15). En esta varible no se observó diferencia estadística significativa.

Tabla 6. Volumen promedio obtenido en los tratamientos testigo e inoculados con el HMA R.

intraradices y con las dos BAM, P. fluorescens CHAO y P. putida wcs.

Figura 15. Volumen radical en plantas inoculadas con el HMA y las BAM. A) Planta inoculada con

R. intraradices + P. putida wcs , B) Planta inoculada con R. intraradices + Pseudomonas

fluorescens CHAO.

Tratamiento

Promedio del Volumen por tratamiento (cm3)

Testigo 0.32


Pseudomonas fluorescens CHAO 0.33

P. putidawcs 0.425

P. fluorescens CHAO+ R. intraradices

0.76

P. putida wcs + R. intraradices 0.70


42

5.5 BIOMASA DE LA PARTE AÉREA

Los resultados obtenidos en la determinación de Biomasa de la Parte Aérea fueron

mayores en el tratamiento inoculado con P. fluorescens CHAO y R. Intraradices con

un peso seco de 0.0946 gr., presentando aproximadamente 67% de mayor biomasa

que el tratamiento inoculado con P. Putida wcs y R. Intraradices (Tabla 7).

Tabla 7. Peso seco promedio obtenido en los tratamientos testigo e inoculados con el HMA

R. intraradices y con las dos BAM, P. fluorescens CHAO y P. putida wcs.

Tratamiento

Promedio del peso seco por tratamiento (gr.)

Testigo 0.0246


Pseudomonas fluorescens CHAO 0.0633

P. putida wcs 0.0564

P. fluorescens CHAO + R. intraradices

0.0946

P. putida wcs + R. intraradices 0.0524


43

7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

ANOVA

Los Resultados obtenidos en el Análisis de Varianza (ANOVA) mostró diferencias

signiticativas (α=0.05) entre las plantas de Sorghum vulgare de los tratamientos

testigo, los inoculados con el HMA R. irregularis, los inoculados con el HMA y la

BAM P. fluorescens CHAO y con la BAM P. putida wcs, en cuanto a los resultados

obtenidos en la obtención de los parámetros de Porcentaje de Micorrización,

Longitud de la parte aérea y Biomasa de la parte aérea. En cuanto a los resultados

obtenidos en la determinación de volumen radical, el valor de significancia fue de

0.086338 por lo tanto no hay diferencias significativas entre los valores de volumen

radical de las plantas de los seis tratamientos.

Tabla 8. Valores de varianza obtenidos en el análisis estadístico para los

parámetros: Porcentaje de micorrización, Longitud de la parte aérea, Volumen

Radical y Biomasa de la parte aérea.

ANOVA

Parámetro

Valor de Significancia

α= 0.05

Porcentaje de Micorrización

0.004114

Longitud de la parte aérea

0.045965

Volumen Radical

0.086338

Biomasa de la parte aérea

0.019614


44

7. DISCUSIÓN

Los resultados de Análisis de Varianza obtenidos en los seis tratamientos, fueron

analizados con un nivel de confianza de 95% y un valor de significancia de 0.05

(α=0.05).

En términos de porcentaje de raíz micorrizada en los tratamientos inoculados con el

hongo micorrízico arbuscular solo y en inoculación doble, en el ANOVA se obtuvo

un valor de significancia igual a 0.004114, resultando menor a 0.05 por lo tanto se

rechaza la hipótesis nula y los valores son concluyentes para validar la hipótesis de

trabajo, es decir que el aumento en el porcentaje de Micorrización se debe al efecto

de los inoculantes y no al azar. En cuanto a la Longitud de la parte aérea, en el

ANOVA se obtuvo un valor de significancia igual a 0.045965, resultando menor a

0.05, por lo tanto se rechaza la hipótesis nula y se concluye que el aumento en la

longitud de la parte aérea entre los tratamientos testigo y los inoculados con el HMA,

y las BAM se debió al efecto de estos inoculantes y no al azar.

En relación al volumen radical, en el ANOVA se obtuvo un valor de significancia

igual a 0.086338, resultando mayor a 0.05 por lo tanto no hubo diferencia

significativa entre los tratamientos inoculados con el hongo y aquellos con

inoculación doble.

El aumento en la Biomasa de la parte aérea de las plantas del tratamiento testigo y

los inoculados con el Hongo Micorrízico Arbuscular Rhizophagus intraradices y con

las BAM P. fluorescens CHAO y P. putida wcs mostró diferencia estadística

significativa con un valor de significancia igual a 0.019614, rechazando la hipótesis

nula, por lo tanto el aumento en la biomasa de las plantas se debió al efecto de los

inoculantes y no al azar.

Una de las hipótesis del efecto benéfico observado en las plantas inoculadas con

Rhizophagus intraradices en el suelo de jal, es la capacidad de los HMA de sintetizar

ácidos orgánicos y glicoproteínas que precipitan o secuestran elementos


45

potencialmente tóxicos disminuyendo su toxicidad, (Schützendübel y Polle 2002;

Atimanav y Alok, 2004; González et al., 2008).

El efecto benéfico provocado por las bacterias auxiliares de la micorriza,

especialmente Pseudomonas fluorescens CHAO, se dio gracias a la capacidad de

estas bacterias de solubilizar Fósforo y su potencial producción de antibióticos.

Estas bacterias solubilizan fuentes de Fósforo orgánico e inorgánico a través de la

síntesis de fosfatasa o reduciendo el pH del suelo (Rodríguez y Fraga, 1999). Lo

que permite proponer que dado que en el suelo utilizado para la experimentación el

Fósforo intercambiable fue bajo y por ello no fue detectado en la determinación, las

BAM solubilizaron el P no intercambiable, beneficiando así tanto al hongo como a

la planta, permitiendo un buen desarrollo vegetal y la colonización de los HMA en la

rizósfera. Aunado a ello además de ser una BAM es también una Bacteria

Promotora del Crecimiento Vegetal, y se ha descrito su capacidad como supresora

de patógenos, como productora de fitohormonas como Ácido Indolacético y Ácido

Salicílico (Hernández et al., 2004), lo que mejora el desarrollo vegetal (Khan, 2006).

En un estudio realizado por Vivas et al., (2003), muestran que la inoculación dual

de bacterias aisladas de suelos perturbados y HMA pueden mejorar la simbiosis de

HM, en particular cuando las condiciones son adversas, complementándose el

papel del HMA con el de las BAM, por lo tanto este fue un punto clave para

establecer esta simbiosis en el suelo perturbado aunque específicamente en suelos

perturbados por actividad minera, no se había comprobado el establecimiento y la

persistencia de esta simbiosis ni su efectividad aunque si la presencia de HMA en

estos suelos (Juárez, et al., 2011).


46

8. CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos con el hongo micorrízico arbuscular Rhizophagus

intraradices en inoculación dual con P. fluorescens conducen al establecimiento y

buen crecimiento de la planta de sorgo, bajo las condiciones extremas del suelo de

jal.

El sinergismo entre estos dos organismos resultó mejor que cuando se inocularon

R. intraradices + Psedomonas putida.

De acuerdo con las concentraciones de metales pesados encontradas en el suelo

del jal de la mina “La Rica”, estos suelos sobrepasan los límites permisibles para un

jal, por lo tanto deben de ser sometidos a un proceso de remediación para su

recuperación y estabilización. La revegetación de la zona con plantas gramíneas

inoculadas con microorganismos benéficos es una opción factible debido a la

localización de la mina en medio de una zona poblada, posteriormente la

estabilización del ecosistema podría tener como finalidad incorporarlo a procesos

productivos sin afectar el entorno ni la calidad de los productos.

Por lo tanto los resultados obtenidos en este trabajo experimental permiten

establecer las bases para un nuevo concepto de revegetación en áreas perturbadas

por la actividad minera, implementando tanto HMA como bacterias PGPR´s y que a

su vez son auxiliares de la micorriza, que es un tema que no se ha abordado con la

debida profundidad, y en el cual no se ha mostrado el debido interés por parte de

las Instituciones Gubernamentales encargadas de la protección al medio ambiente,

dado que hay países con gran historia dentro de la actividad minera en América

Latina como son Chile, Argentina, Perú, Brasil y México, es importante buscar

alternativas que recuperen los ecosistemas, para mejorar la calidad de vida tanto

de flora y fauna de los sitios perturbados.


47

9. PROSPECTIVAS DE LA INVESTIGACIÓN

Se han utilizado los HMA para remediación y estabilización de suelos contaminados

(Alvarado et al., 2011; Gaur y Adholeya, 2004; González, 2005), también se han

utilizado bacterias Pseudomonas para remediación de suelos (González, 2005;

Cruz, 2008), pero no existe evidencia del uso de un HMA y una BAM para

estabilización de suelos contaminados por actividad minera, lo que vislumbra una

opción para estabilizar suelos, algunas de las opciones que daría mayor solidez a

esta investigación serían:

Se sugiere probar con diferentes concentraciones de diferentes metales

pesados como los aquí analizados entre ellos Plomo, Cobre, Plata y Zinc en

suelos estériles y adicionando concentraciones conocidas, para evaluar la

eficiencia del HMA y la BAM en los cuales se observó el mejor rendimiento

en esta investigación, de esta forma podrían conocerse el funcionamiento

óptimo de los inoculantes y sus intervalos de acción.

Con base en los resultados obtenidos en esta investigación se propone

aislar los microorganismos nativos de los suelos contaminados y observar su

eficacia en pruebas de laboratorio comparando con los consorcios

microbianos utilizados en esta investigación con el mejor rendimiento como

fue el tratamiento inoculado con R. intraradices y P. fluorescens.

Realizar pruebas de campo para evaluar la eficacia del consorcio microbiano

en suelos contaminados por actividad minera y evaluar supervivencia y

eficacia comparando con los consorcios microbianos nativos de esos suelos.

Sería interesante continuar con la investigación de mejoramiento de suelos

contaminados por actividad minera, probando no sólo consorcios

microbianos que mejoren la calidad del suelo y rendimiento vegetal sino

también utilizando la aportación de plantas acumuladoras de metales


48

pesados y plantas nativas de estos suelos contaminados evaluando el

rendimientos de cada una de ellas aunado a la inoculación con el consorcio

microbiano de mejor respuesta en esta investigación R. intraradices más P.

fluorescens.

Otra línea de investigación podría abrirse para evaluar el efecto en los suelos,

es decir en los parámetros fisicoquímicos del suelo, en la disponibilidad de

nutrientes y evaluar el efecto de estos microorganismos y las plantas que

podrían ser introducidas en los elementos originales de ecosistema. Evaluar

beneficios o daños posibles al ecosistema.


49

10. LITERATURA CITADA

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11. APÉNDICE

1. Determinación del pH (Valdés, 2005)

Reactivos

Agua destilada

Sol. Reguladora pH 4.0 y 7.0

a) En campo

Se toman 10 muestras representativas y se mezclan para formar una sola. Se

realiza la determinación inmediatamente.

b) En laboratorio

Se pesan 10g de la muestra de suelo, se coloca en un vaso de precipitados, se

agregan 20 mL de agua destilada y se mezcla con ayuda de un agitador.

Posteriormente se deja reposar la muestra durante 30 minutos; después de este

tiempo se agita y se hace la lectura con el potenciómetro previamente calibrado.

2. Determinación de materia orgánica (Valdés, 2005)

Reactivos

Dicromato de Potasio 1N

Ácido fosfórico al 85%

Ácido sulfúrico concentrado

Difenilamina

Sulfato de Hierro heptahidratado 1N

a) Oxidación de la Materia Orgánica

Se coloca 1g de suelo en un matraz Erlenmeyer, si es el suelo es muy rico en

materia orgánica se pesan de 0.25g a 0.5g. Se añaden 10 mL de dicromato de

potasio sobre el suelo y se mezcla.Se añaden 20 mL de ácido sulfúrico concentrado,


59

y se continua mezclando durante un minuto evitando que el suelo quede en las

paredes del matraz.

Se deja reposar la mezcla durante 30 minutos y simultáneamente se realiza un

ensayo de valoración del blanco.

b) Valoración por retroceso

Se diluye la muestra con 200 mL de agua destilada y se añaden 10 mL de ácido

fosfórico al 85% y 30 gotas del indicador de difenilamina; se valora por retroceso

con la solución de sulfato ferroso 1N, colocada en una bureta.

Se realizan los siguientes cálculos

Fórmula

% de materia orgánica = 10 (1 - P/T) x 0.67

Donde:

P = mL de solución de FeSO4 1N gastados por el problema.

T = mL de solución de FeSO4 1N gastado por el blanco.

3. Determinación de la Capacidad de Intercambio Iónico

Reactivos

Solución de CaCl2 1N pH 7.0

CH3 –CH2 –OH al 96%

Solución de NaCl pH 7.0

Solución de EDTA 0.1N

Solución Amortiguadora de pH 10.0

Solución de NH2 OH-HCl

Solución de KCN al 2%

Solución de Negro de ericromo T

Solución estándar de Ca 0.01N


60

Se pesan 5g de suelo y se colocan en un embudo de Buchner que contenga un

papel filtro. Se adicionan lentamente 10 mL de la solución CaCl2, cubriendo la

superficie de la muestra de suelo. La solución filtrada se desecha.

Se adicionan 10 mL de CH3 –CH2 –OH, cubriendo la superficie de la muestra de

suelo. La solución filtrada no se recolecta, esta operación se repite cuatro veces

más.

Se adicionan 10 mL de NaCl, cubriendo la superficie de la muestra de suelo. Se

recolecta la solución filtrada en un matraz Erlenmeyer. Se repite esta operación

cuatro veces más recolectando el filtrado. En este filtrado de NaCl se titulan los

iones calcio por el método de versenato.

3.1 Método del versenato

Al filtrado se le agregan 10 mL de la solución Amortiguadora pH 10, se adicionan 5

gotas de la solución de KCN, se agregan 5 gotas de la solución de NH2 OH-HCl, se

adicionan 5 gotas del indicador negro de ericromo T y se titula con la solución de

verseno hasta que el color de la solución vire de púrpura a color azul.

Se realizan los siguientes cálculos

Fórmula

CICT en meq por 100g de suelo = mL de EDTA x N x 100

g de muestra de suelo

Donde:

CICT = Capacidad de intercambio catiónico total

3.2 Normalización de la solución del EDTA

Se coloca una alícuota de 10 mL de la solución estándar de calcio en un matraz

Erlenmeyer adicionando 100 mL de agua destilada. Realizar esta operación por

duplicado o triplicado. A cada matraz se agregan 10 mL de solución amortiguadora

pH 10, se agregan 5 gotas de solución de KCN, se agregan 5 gotas del indicador


61

de negro de ericromo T y se titula con la solución de EDTA agitando frecuentemente

el matraz hasta obtener coloración azul .

Se realizan los siguientes cálculos:

Normalidad del EDTA (N) = 0.01 N X 10 mL____

mL de EDTA gastados

4. Tinción de Raicillas para determinar micorrización

Reactivos

Solución de KOH al 10%

Solución de HCl 1N

Fucsina ácida

Lactoglicerol

Se lavan las raíces con abundante agua para eliminar el suelo adherido. Se cortan

las raicillas en pedazos de 1cm en una caja de Petri, estás se colocan en viales y

se cubren con la solución de KOH, se calienta el vial en placa a 90°C durante 10

minutos o hasta que las raicillas liberan los pigmentos. Se elimina el KOH, se lava

de 2 a 3 veces con agua de la llave y se acidifica con HCl agitando de 5 a 10 minutos.

Se elimina el HCl sin lavar con agua, se cubren las raicillas con fucsina ácida y se

calienta en placa a 90°C durante 10 minutos.

Se colocan las raicillas en lactoglicerol para finalmente colocar 20 en el

portaobjetos en forma vertical, paralelas unas a otras, se coloca un cubreobjetos.

Se observa al microscopio a 100X para identificar las estructuras fúngicas: hifas,

arbúsculos, esporas y vesículas.

Se hace la estimación del porcentaje de colonización revisando tres campos

equidistantes


62

5. Solución Mineral de Long-Ashton (Furlan, 1981)

Macroelementos.

KNO3 400mg/L

K2SO4 350mg/L

Ca(NO3)2 .4H2O 900mg/L

NaH2PO4 .H2O 200mg/L

MgSO4 .7H2O . 7 H2O 500mg/L

Oligoelementos

MnSO4 .4H2O 2.25mg/L

CuSO4 .5H2O 0.25mg/L

ZnSO4 .7H2O 0.3mg/L

H3BO3 3.0mg/L

NaCL 5.0mg/L

(NH4)6 Mo7O24. 4H2O 0.05ml/L

EDTA-Fe13%4ml/L

Se ajusta el pH en un rango dentro de 6.5 y 6.8.


63

6. Resultados de ANOVA

Tabla 9. Resultados de ANOVA, de las determinaciones de longitud aérea, porcentaje de

Micorrización, volumen de la raíz y biomasa.

ANOVA del Porcentaje de Micorrización

S.S. Gl Media Cuadrática F p

Intergrupos 9631.041 1 9631.041 131.5825 0.000000 Intragrupos 1463.996 2 731.998 10.0008 0.004114 Error 731.939 10 73.194

7. Gráficos

Figura 16. Efecto de la interacción entre inoculante HMA- BAM, sobre el porcentaje de micorrización.

(1) Rhizophagus intraradices. (2) R. intraradices + P. putida wcs. (3) R. intraradices + Psedomonas

fluorescens CHAO.

ANOVA de Longitud aérea


Intergrupos 9063.393 1 9063.393 866.4811 0.000000

Intragrupos 172.635 5 34.527 3.3009 0.045965

Error 115.060 11 10.460

ANOVA del Volumen de la Raíz


Intergrupos 5.578713 1 5.578713 145.2102 0.000000

Intragrupos 0.500247 5 0.100049 2.6042 0.086338

Error 0.422600 11 0.038418

ANOVA de Biomasa


Intergrupos 0.051052 1 0.051052 140.8022 0.000000

Intragrupos 0.007907 5 0.001581 4.3617 0.019614

Error 0.003988 11 0.000363

Porcentaje de micorrización

1 2 3

Tratamiento

20

30

40

50

60

70

80

90

Porc

enta

je d

e m

icorr

izació

n (

%)


64

Figura 17. Efecto de la interacción entre inoculante HMA- BAM, sobre la longitud aérea. (1) Testigo.

(2) Rhizophagus intraradices. (3) Pseudomonas fluorescen. CHAO. (4) Pseudomonas putida wcs.

(5) R. intraradices + Psedomonas fluorescens CHAO. (6) R. intraradices + P. putida wcs.

Volumen de la Raíz

1 2 3 4 5 6

Tratamiento

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Vo

lum

en

de

la

ra

íz (

cm

3)

Figura 18. Efecto de la interacción entre inoculante HMA- BAM, sobre el volumen radical. (1) Testigo. (2)

Rhizophagus intraradices. (3) Pseudomonas fluorescens. CHAO. (4) Pseudomonas putida wcs. (5) R.

intraradices + Psedomonas fluorescens CHAO. (6) R. intraradices + P. putida wcs.

Longitud aérea

1 2 3 4 5 6

Tratamiento

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

Lo

ng

itu

d d

e l

a p

art

e a

ére

a (

cm

)


65

Biomasa

1 2 3 4 5 6

Tratamiento

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

Bio

ma

sa

(g

r)

Figura 19. Efecto de la interacción entre inoculante HMA- BAM, sobre la biomasa de la parte aérea.

(1) Testigo. (2) Rhizophagus intraradices. (3) Pseudomonas fluorescens. CHAO. (4) Pseudomonas

putida wcs. (5) R. intraradices + Psedomonas fluorescens CHAO. (6) R. intraradices + P. putida wcs.

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Efecto de microorganismos rizosféricos en Sorghum vulgare