EFECTO DEL COLESTEROL Y LA DIMETIL FORMAMIDA SOBRE LA

CRIOSUPERVIVENCIA DE ESPERMATOZOIDES DE CABALLOS CRIOLLOS

COLOMBIANOS.

ANA MARÍA MESA G., Zoot.

Trabajo de grado presentado como requisito final para optar al título de

Magíster en Ciencias –Biotecnología

Asesor Guillermo Henao Restrepo

MV. M.Sc Ciencias Básicas Biomédicas

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MEDELLÍN MAESTRÍA EN CIENCIAS – BIOTECNOLOGÍA

FACULTAD DE CIENCIAS MEDELLÍN

2010

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RESUMEN El proceso de criopreservación induce daños irreversibles en espermatozoides equinos, estos daños se ven reflejados en disminución de la fertilidad del semen descongelado. En la membrana plasmática ocurren daños significativos después de que ésta comienza una transición desde el estado líquido a un estado en gel, lo cual sucede durante el descenso de la temperatura. En el estado de gel la membrana se vuelve más rígida y porosa; induciendo disrupciones y haciéndola susceptible a daños producidos por moléculas extracelulares y por cristales de hielo. Aunque se han logrado avances usando crioprotectores como el glicerol, estos pueden llegar a ser tóxicos para los espermatozoides de esta especie. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del colesterol y la dimetil formamida sobre la criosupervivencia del semen de caballos criollos colombianos. Para esto se recolectó semen de diez caballos; cada eyaculado se congeló bajo el mismo protocolo en nitrógeno líquido, pero con variaciones del crioprotector (glicerol 5% o DMF 5%) y la adición o ausencia de colesterol como modificador de membrana (1,5 mg ciclodextrinas con colesterol por cada 120 x 106 células). El colesterol fue adicionado en moléculas de ciclodextrinas, las cuales tienen la capacidad de transferir colesterol hacia y desde la membrana plasmática por gradiente de concentración. La criosupervivencia se evaluó estimando varios tipos de movilidad evaluados por el software analizador de imágenes SCA. La vitalidad e integridad de membrana post descongelación se estimó usando tinción con eosina nigrosina y mediante el test hipo-osmótico respectivamente. Al incubar el semen con el colesterol antes del proceso de congelación, se presentó un aumento significativo del porcentaje de movilidad total y progresiva, de la velocidad de los espermatozoides y del porcentaje de espermatozoides rápido y una disminución del porcentaje de espermatozoides con movilidad lenta. Adicionalmente se incrementó el porcentaje de espermatozoides vivos y con integridad de membrana (P<0.05). Al comparar la dimetil formamida con el glicerol como agente crioprotector se encontró una mejora en todos los parámetros evaluados cuando la dimetil formamida fue usada (P<0.05). Al utilizar ambos procedimientos conjuntamente la criosupervivencia mejoró debido a los efectos aditivos del crioprotector y modificador de membrana, pero no hubo interacción entre estos dos factores. Estos resultados pueden contribuir a la estandarización de técnicas de congelación de semen para caballos criollos y así obtener las ventajas que el mejoramiento genético brinda mediante el uso efectivo de la inseminación artificial.

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ABSTRACT The freezing process induces irreversible damage in equine sperm, which is reflected in a decreased fertility of thawed semen. Significant damage is due to membrane changes during the transition from a liquid to a gel state, which occurs as the temperature decreases. In this latter state the membrane becomes rigid and porous inducing disruptions and making it susceptible to damage caused by molecules and extracellular ice crystals. Additionally; it has been reported that glycerol has a toxic effect when used as cryoprotectant on equine spermatozoa. The objective of this study was to evaluate the effect of cholesterol and dimethyl formamide on the cryosurvival of paso fino stallion sperm. Semen was collected from ten paso fino stallions, each ejaculate was frozen using the same protocol in liquid nitrogen, but with variations in the cryoprotectant (glycerol 5% or 5% DMF) and the addition or absence of cholesterol treatment (1,5 mg cholesterol loaded cyclodextrins for each 120 x 106 cells). Cholesterol was added in cyclodextrin molecules, which have the capacity to transfer cholesterol in and from the membrane by concentration gradient. The cryosurvival was evaluated estimating various types of motility, measured using image analyzer software SCA. The vitality and membrane integrity after thawing was estimated using eosin nigrosine staining and by hypo-osmotic test respectively. Sperm incubated with cholesterol prior to the freezing process had a significant effect improving the percentage of total motility and progressive motility, sperm velocity and percentage of rapid sperm along with a decreased percentage of sperm with slow motility. Additionally, there was an improvement in the percentage of live spermatozoa and spermatozoa with an intact membrane (P <0.05). By comparing the dimethyl formamide with glycerol as cryoprotective agent found an improvement in all parameters evaluated when dimethyl formamide was used (P <0.05). When both procedures were used jointly, cryosurvival was improved due to the additive effects of cryoprotectant and the cholesterol, but there was no interaction between these two factors. These results may contribute to the standardization of semen freezing techniques for this type of horses and get the benefits that genetic improvement provides through the effective use of artificial insemination.

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Agradecimientos Quisiera agradecer a mi familia, por su apoyo y excelente ejemplo; a esto debo mis éxitos académicos y mi formación personal. Al profesor Guillermo Henao; además de su disponibilidad y asesoría académica le agradezco la libertad de permitirme trabajar en el tema y especie de mi agrado además de la confianza y apoyo que me dio para poder escribir este proyecto desde cero. Al Doctor Gabriel Toro que por medio de su empresa Embryotransfer me apoyó técnica y logísticamente; sin su experiencia, empeño y entusiasmo este trabajo hubiera sido mucho mas complejo. Adicionalmente, a Karen Reina por su ayuda durante todo el proceso de recolección de muestras y consecución de algunos ejemplares. Agradezco a la Universidad Nacional por mi formación académica y financiación parcial de este proyecto a través del laboratorio de procesamiento de semen San Pablo. A la maestría de Ciencias animales de la Universidad de Antioquia que igualmente ha contribuido en mi formación, y a su grupo de investigación biogénesis en el cual comprendí la dinámica de la investigación en mi área de estudio. A todos los laboratorios que donaron materiales y prestaron equipos para la ejecución de este experimento. A mis compañeros Yasser Lenis y Carlos Hernández por la ayuda en la adquisición de otros reactivos y materiales, también a mis amigos de ésta maestría con los cuales disfrute y aprendí mucho durante estos dos años. A todos mis profesores que han contribuido a mi formación académica, en especial a Guillermo Correa por solucionar mis dudas estadísticas, a Ariel Tarazona por su disposición y respuestas a mis preguntas técnicas y al profesor Omar Camargo quién aconsejó y motivó la formulación de este proyecto. Agradezco al profesor Víctor Atencio García, director del Centro de Investigación Piscícola de la Universidad de Córdoba por permitirme realizar la evaluación de las muestras en su laboratorio y a mi compañero de maestría Gregorio Martínez por realizar este contacto y colaborarme durante la evaluación.

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TABLA DE CONTENIDO

LISTA DE TABLAS 6

LISTA DE FIGURAS 6

1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 7 2. HIPOTESIS Y OBJETIVOS 8

2.1 Objetivos Generales 8 2.2 Objetivos específicos 8

3. MARCO TEÓRICO REFERENCIAL 9 3.1 Introducción 9 3.2 Consecuencias de la criopreservación 9 3.3 Efecto del colesterol en la membrana plasmática 10 3.4 Crioprotectores 11

4. DISEÑO METODOLÓGICO 13 4.1 Reactivos 14 4.2 Preparación de CLC 14 4.3 Recolección del semen 14 4.4 Procesamiento del semen 15 4.5 Congelación del semen 15 4.6 Descongelación del semen 15 4.7 Evaluación del semen 15

4.7.1 Concentración espermática 15 4.7.2 Movilidad espermática 15 4.7.3 Integridad de membrana 15 4.7.4 Vitalidad espermática 16

4.8 Análisis estadístico 16 5. RESULTADOS 18

5.1 Caracterización del semen del caballo criollo colombiano 18 5.2 Efecto del crioprotector 19 5.3 Efecto del colesterol 23

6. DISCUSIÓN 27 7. CONCLUSIONES 30 8. BIBLIOGRAFÍA 31

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LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Tratamientos 14

Tabla 2. Edad de los caballos y características de los eyaculados utilizados en el experimento 19

Tabla 3. Efecto de la congelación sobre parámetros espermáticos en caballo 19

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. flujograma para los procesos de recolección, procesamiento y análisis de muestras de semen

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Figura 2. Efecto del crioprotector sobre la movilidad espermática post descongelación 19

Figura 3. Efecto del crioprotector sobre la movilidad espermática total post descongelación 19

Figura 4. Registro de velocidades usando el software Sperm Class Analyzer SCA 20

Figura 5. Efecto del crioprotector sobre los tipos de trayectoria espermática post descongelación 21

Figura 6. Efecto del crioprotector sobre índices de linealidad y oscilación post descongelación. 21

Figura 7. Efecto del crioprotector sobre la vitalidad post descongelación 22

Figura 8. Efecto del crioprotector sobre la integridad de membrana post descongelación 22

Figura 9. Efecto del colesterol sobre la movilidad espermática post descongelación. 23

Figura 10. Efecto del colesterol sobre la movilidad espermática total post descongelación 23

Figura 11. Efecto del colesterol sobre los tipos de trayectoria espermática post descongelación 24

Figura 12. Efecto del colesterol sobre índices de linealidad y oscilación post descongelación

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Figura 13. Efecto del colesterol sobre la integridad de membrana y la vitalidad espermática 25

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1. DEFINICIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

La criopreservación de semen ha sido una biotecnología usada eficientemente en bovinos tipo leche por más de cinco décadas, sin embargo esta técnica es limitada para otras especies de importancia en el sector pecuario como los equinos y los porcinos. La utilización de semen congelado podría impulsar la industria equina, permitiendo preservar a largo plazo espermatozoides de ejemplares sobresalientes y la distribución de su semen alrededor del mundo. Sin embargo esta técnica solo será optada por los criadores de caballos, cuando la fertilidad con semen congelado-descongelado sea aceptable. En la actualidad, no existe un protocolo de congelación para semen de caballos que presente resultados en fertilidad comparables con los obtenidos con el uso de semen refrigerado [1-4]. La membrana plasmática es la primera barrera física de los espermatozoides y es el sitio más susceptible a daños producidos en el proceso de congelación [5]. Durante este proceso ocurren modificaciones físicas y en la composición lipídica de la membrana plasmática del espermatozoide. Estas modificaciones podrían favorecer los daños irreversibles y letales que sufren los espermatozoides y que se reflejan en la disminución de la fertilidad con el semen descongelado [2, 3, 5, 6]. Adicionalmente durante el proceso de congelación los espermatozoides deben resistir el estrés osmótico que causa la adición y remoción del crioprotector necesario para la congelación [5]. El glicerol ha sido el crioprotector más usado para congelar semen, pero este tiene efectos tóxicos en el espermatozoide [7-12] que podrían ser evitados mediante el uso de crioprotectores alternos como la dimetil formamida [7, 8, 13, 14]. Los caballos criollos colombianos poseen características fenotípicas altamente deseables como la velocidad y suavidad con la que ejecutan sus andares y el brío en su temperamento, lo cual lo han posicionado como uno de los caballos de silla más apetecidos en el mundo [15, 16]. Con el crecimiento de la industria equina en nuestro país y el auge progresivo que tiene el caballo criollo colombiano en el exterior, la demanda de semen congelado tiende a aumentar, debido a los beneficios que ofrece inseminar con semen congelado respecto al uso de semen refrigerado. Uno de los mayores beneficios del semen congelado con respecto al refrigerado, es poderlo almacenar por tiempos prolongados lo cual permite transportar el semen a largas distancias y distribuirlo internacionalmente [17, 18]. Adicionalmente el uso de semen congelado puede traer beneficios económicos para los dueños de los reproductores, ya que con este método el eyaculado es usado más eficientemente que cuando se preserva por medio de la refrigeración [17, 18]. Los avances en la estandarización de técnicas de congelación para semen de este tipo de caballos, son una excelente oportunidad para que este proceso sea más eficiente y para obtener las ventajas que el mejoramiento genético brinda mediante el uso efectivo de la inseminación artificial [19]. Disminuir el estrés fisiológico que los espermatozoides experimentan durante la congelación, mediante el uso de crioprotectores más adecuados y modificadores de membrana, pueden mejorar los parámetros post descongelación de semen congelado [7, 12, 13, 20-27].

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2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS Hipótesis: La adición de colesterol y dimetil formamida al semen antes de la criopreservación afecta la viabilidad, movilidad e integridad de membrana de espermatozoides de caballos criollos colombianos.

2.1 Objetivo General Evaluar el efecto de la adición de colesterol y dimetil formamida antes de la criopreservación sobre la viabilidad, movilidad e integridad de membrana de espermatozoides de caballos criollos colombianos. 2.2 Objetivos Específicos

o Evaluar el efecto del colesterol sobre parámetros de movilidad, integridad de membrana y

sobrevivencia post congelación en el semen de caballos criollos colombianos. o Comparar la dimetil formamida y el glicerol como crioprotectores para la congelación de semen en

caballos criollos colombianos. o Evaluar la interacción entre el uso de colesterol como modificador de membrana y la acción de los

crioprotectores (glicerol y DMF).

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3. MARCO TEÓRICO REFERENCIAL 3.1 Introducción

Durante las últimas décadas ha sido notable el incremento en el uso de biotecnologías reproductivas; en este sentido el sector equino no es la excepción. En nuestro medio la inseminación artificial tiene una buena acogida entre los criadores de caballos, la principal razón es la facilidad de transportar el semen en vez de transportar los animales para los servicios. La mayor parte del semen utilizado para la inseminación artificial en caballos es refrigerado, esta técnica es popular porque en la mayoría de los casos el semen refrigerado tiene una tasa de fertilidad aceptable [28], sin embargo, el uso de éste se limita debido a que los espermatozoides son viables y presentan resultados de fertilidad admisibles únicamente durante un tiempo determinado de aproximadamente de 40 horas [18].

El semen congelado ofrece beneficios adicionales a los que ofrece el uso de semen refrigerado. El empleo de esta técnica permite que se haga una distribución internacional de éste; el semen congelado de un ejemplar puede garantizar la propagación de su genotipo en caso de enfermedad, muerte o lesión del reproductor. El uso de semen congelado permite que el calendario de eventos o exposición de los caballos no deba ser interrumpido para la recolección de semen, además posibilita la opción de que reproductores con problemas de comportamiento sean castrados y que su genética pueda continuar siendo propagada [19]. También permite la inseminación en un tiempo más preciso, debido a que el semen es enviado con anterioridad y va a estar disponible en el momento óptimo para la inseminación. Por último, congelar el semen permite un uso más eficiente del eyaculado; se puede procesar y congelar la totalidad del eyaculado que resultaría en promedio entre 10 y 12 dosis [17], mientras que cuando se procesa semen refrigerado, solamente se realiza una o dos inseminaciones y el resto del eyaculado es descartado debido a su corta vida media.

Por otro lado, existen dos desventajas por las cuales el uso de semen congelado en equinos es menos utilizado que el refrigerado: a) En la mayoría de reproductores la tasa de concepción con semen congelado es menor a la obtenida con semen fresco o refrigerado [1-4], b) la otra es que existe una gran variabilidad entre reproductores en la capacidad del semen de resistir el proceso de congelación y descongelación [1, 4].

Tanto el componente genético, como las características seminales del semen fresco influyen sobre los resultados post criopreservación [29]. Por ejemplo, estudios previos indican que la raza Mangalarga Marchador tiene porcentajes de movilidad post descongelación inferiores a otras razas tipo salto [22, 29]. Hasta el momento no existen publicaciones que comparen las características seminales del Caballo Criollo Colombiano con otras razas, pero por información verbal de veterinarios que trabajan en el área, se presume que esta raza tiene parámetros seminales deficientes tanto en semen fresco como en semen congelado. Sin embargo, es necesario corroborar con evidencia científica esta especulación.

3.2 Consecuencias de la criopreservación

El proceso de congelación tiene efectos marcados sobre los espermatozoides; varios de estos efectos pueden ser dañinos e incluso letales para las células, lo cual produce una subsecuente reducción en la fertilidad [1-4]. Los efectos negativos de la congelación sobre los espermatozoides incluyen tanto alteraciones en la estructura como en la funcionalidad de las membranas [3, 5, 30] reducción en la

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movilidad progresiva [31, 32], alteraciones morfológicas [33] y generación de especies reactivas de oxígeno que producen daños en los fosfolípidos de membrana y en la cromatina [34-39].

La reducción en la fertilidad del semen congelado puede ser atribuida a alteraciones en la estructura y función de la membrana durante el enfriamiento, la congelación y la descongelación [5]. Ensayos in vitro muestran que estas alteraciones en la membrana se ven reflejadas en disminución de la movilidad, viabilidad e integridad de membrana en espermatozoides que han sido criopreservados, comparados con espermatozoides de semen fresco [3]. Cuando la membrana plasmática comienza un estado de transición desde el líquido a temperatura ambiente al gel que ocurre a bajas temperaturas, se inician daños significativos en el espermatozoide [2]. En este estado de gel la membrana se vuelve más rígida y porosa, esto ocurre porque hay una reorganización de los lípidos y proteínas de membrana, induciendo disrupciones y haciéndola más susceptible a moléculas extracelulares y daños producidos por cristales de hielo intracelulares [3, 6].

Los principales lípidos que conforman la membrana son fosfolípidos y colesterol; la relación entre estos difiere ampliamente entre especies. Especies como los humanos y los conejos poseen una relación colesterol/fosfolípidos muy alta. Mientras más alta sea esta relación, la temperatura en la que ocurre la transición de fase disminuye y sí la relación es lo suficientemente alta no ocurre transición de la membrana a estado de gel. Esta es la causa por la cual los espermatozoides de estas especies sufren menores daños de membrana al ser congelados [40]. Los equinos, los bovinos y los porcinos tienen una relación molar colesterol/fosfolípidos de 0.36, 0.45 y 0.26 respectivamente [41], con esta relación los espermatozoides equinos transforman la membrana a un estado de gel cuando la temperatura desciende los 18°C [1].

3.3 Efecto del colesterol en la membrana plasmática

Además de los daños que ocurren en la membrana, la capacitación espermática y la reacción acrosómica resultan de una serie de reacciones bioquímicas en las que participan los lípidos de membrana. Como parte de las etapas del proceso de capacitación de los espermatozoides están: el flujo de colesterol desde la membrana plasmática, la disminución en la relación colesterol/fosfolípidos y la subsecuente desestabilización de ésta [42]. Se ha reportado que los espermatozoides de porcinos pierden aproximadamente el 50% del colesterol en la membrana después de que el semen ha sido criopreservado [43]; en equinos se ha reportado una disminución del 28% del colesterol en la membrana después del proceso de congelación [24]. Esta podría ser una de las principales causas del efecto de capacitación prematura que se observa en espermatozoides congelados [44], también podría ser una explicación por la cual las células criopreservadas no permanecen viables en el tracto reproductivo de la hembra tanto tiempo como las de semen fresco [45] y por lo cual se requiere inseminar a un tiempo más cercano a la ovulación [19].

El colesterol puede ser incorporado o extraído de las membranas plasmáticas mediante el uso de ciclodextrinas [24-27, 37]. Las ciclodextrinas son oligosacaridos cíclicos con un centro hidrofóbico capaz de incorporar lípidos [46]. Éstas tienen la capacidad de transferir colesterol hacia y desde la membrana plasmática por gradiente de concentración [47]. Cuando las ciclodextrinas cargadas con colesterol (CLC) son adicionadas a semen bovino antes de criopreservarlo, se obtienen mayores porcentajes de espermatozoides móviles y con membranas intactas después de descongelar, comparandolo con el tratamiento control [25, 27]. Este procedimiento también ha sido probado en caballos y se encontró qué

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los espermatozoides tratados con colesterol mediante esta técnica aumentaron significativamente el porcentaje de membranas intactas después de la congelación y aumentó el porcentaje de células móviles en semen de reproductores cuyo semen independientemente de la calidad inicial en fresco, arrojaba malos resultados después de la criopreservación. También los espermatozoides tratados con CLC antes de la congelación pudieron llevar a cabo una capacitación exitosa y fueron capaces de unirse a la zona pelúcida [24]. Los espermatozoides bovinos tratados con colesterol han sido usados para fertilización in vitro sin diferencias significativas con respecto a los espermatozoides control [26], sin embargo los resultados en campo indicaron que el semen tratado con colesterol incrementó las tasas de concepción desde 50% a 59% [26].

3.4 Crioprotectores

Los crioprotectores son adicionados al semen para proteger las células antes de la congelación, sin embargo éstos también son un factor estresante para los espermatozoides y potencialmente pueden afectar al semen. Un crioprotector óptimo es aquel que tiene bajo peso molecular y alta solubilidad en agua, que permeabiliza rápidamente la célula y que posee baja toxicidad [20, 48-50]. El Glicerol ha sido el crioprotector más frecuentemente utilizado, sin embargo, a altas concentraciones puede ser tóxico para los espermatozoides [7]. Para la congelación de semen equino el glicerol se utiliza usualmente a concentraciones de 2.5 a 6% [8, 9]; bajo estas concentraciones ha mostrado toxicidad cuando es agregado a semen fresco [10]. Se ha reportado que el glicerol como agente tóxico en la célula altera la permeabilidad y estabilidad de la membrana, posiblemente también causa cambios físicos en la organización y viscosidad del citoplasma e induce la formación de uniones no covalentes de proteínas con la superficie de la membrana del espermatozoide [11]. Al glicerol se le atribuye también la inducción de alto estrés osmótico debido a que posee mayor peso molecular que otros crioprotectores y por esto penetra más lentamente en la célula [12], además, se ha reportado que tiene también efectos contraconceptivos en la yegua [10].

En los últimos tiempos se han probado otros crioprotectores con menor peso molecular que el glicerol y al parecer con una toxicidad más baja. Entre los crioprotectores alternativos se han destacado el etilen glicol, la dimetil formamida, la glutamina y el dimetil sulfóxido [7]. Estudios recientes han reportado que el etilen glicol muestra resultados comparables a los del glicerol, siendo éste un posible substituto [7]; el dimetil sulfóxido mostró no ser comparable al glicerol puesto que generó menor porcentaje de movilidad post descongelación [13, 51]; cuando la glutamina y el glicerol se usaron conjuntamente hubo un aumento de la movilidad post descongelación [21], sin embargo, la glutamina parece tener toxicidad osmótica sí es usada en altas concentraciones [21, 52]; la dimetil formamida ha mostrado tener resultados crioprotectores similares [7, 23] o superiores [8, 13, 22] comparados con el glicerol y es un crioprotector benéfico para espermatozoides de caballos con bajas tasas de supervivencia post descongelación, como los de caballos de la raza Mangalarga marchador [22]. Hasta ahora no se ha reportado efecto tóxico del Dimetil formamida sobre espermatozoides.

Varios estudios han comparado resultados in vivo entre semen criopreservado con diferentes tipos de crioprotectores. Medeiros en el 2003 (citado en [20]) reporta un estudio en cual se inseminaron 30 yeguas con semen descongelado de un mismo reproductor, que había presentado bajos resultados cuando su semen era congelado con glicerol. La movilidad progresiva fue de 18% con glicerol y de 48% con dimetil formamida. Ninguna de las yeguas (0/15) quedó preñada al ser inseminada con el semen procesado con

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glicerol mientras que el 40% (6/15) de las yeguas inseminadas con semen congelado con dimetil formamida fueron diagnosticadas gestantes. Otro estudio reportó que a pesar de no haber diferencias en la movilidad de semen procesado con glicerol y dimetil formamida, las tasas de preñez fueron significativamente mayores 47% (14/30) cuando el diluyente contenía dimetil formamida en comparación con el 14% (5/34) cuando el semen fue diluido en glicerol [14]. En resumen, el proceso de congelación causa cambios severos en la membrana de los espermatozoides, estos cambios pueden disminuir la fertilidad de los reproductores donantes de semen. Las características espermáticas dependen de diferentes factores entre los que esta la raza, de la variabilidad en los parámetros seminales, depende la resistencia del semen al proceso de congelación. El uso de semen congelado tiene desventajas como la disminución en la fertilidad y la variabilidad en los resultados de este proceso, sin embargo, las ventajas de tener semen de un reproductor disponible, inclusive después de su muerte, superan estas desventajas. Agregar colesterol a espermatozoides de caballo aumenta las tasas de criosupervivencia. Este es un procedimiento que altera la relación colesterol/fosfolípidos que parece ser benéfico para la criopreservación de semen de caballos en general, pero más importante para caballos cuyos espermatozoides tienen problemas al resistir el proceso de congelación, como al parecer son los caballos criollos colombianos. Utilizar Dimetil formamida podría ser la mejor opción para reemplazar el glicerol, particularmente para caballos con bajas tasas de congelación, mejorando la calidad del semen post descongelación.

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4. DISEÑO METODOLÓGICO:

La recolección y procesamiento de las muestras se realizó en el criadero La Loma, ubicado en el municipio de Envigado. La evaluación de movilidad se realizó en el Centro de Investigación Piscícola de la Universidad de Córdoba CINPIC. La lectura de la prueba de viabilidad se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín y la evaluación de la integridad de membrana se hizo en el Laboratorio de Procesamiento de Semen San Pablo, perteneciente a la Universidad Nacional de Colombia.

El experimento se llevó a cabo en diez caballos criollos colombianos. Cada experimento constó de cuatro tratamientos; Cada eyaculado se dividido en cuatro y se congeló en nitrógeno líquido utilizando el mismo protocolo y con las siguientes variaciones.

Tabla 1. Tratamientos Tratamiento 1 Tratamiento 2 Tratamiento 3 Tratamiento 4 Crioprotector: Glicerol 5% Glicerol 5% DMF 5% DMF 5% Modificador de Membrana: no CLC* No CLC* *1,5 mg ciclodextrinas con colesterol por cada 120 x 106 células

La concentración de crioprotector y modificador de membrana a utilizar se determinó teniendo como base reportes exitosos publicados para dimetil formamida [7, 22] y para colesterol [24] en otras razas.

Figura 1. flujograma para los procesos de recolección, procesamiento y análisis de muestras de semen.

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A continuación se especificara detalladamente cada uno de los procedimientos a utilizados.

4.1 Reactivos

Todos los reactivos químicos fueron procedentes de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) excepto la metil-β-ciclodextrina de TCI América y el colesterol de Alfa Aesar.

4.2 Preparación de CLC

La solución de ciclodextrina cargada con colesterol fue preparada como lo describen Purdy y Graham [27]. En un tubo de ensayo se disolvió 200 mg. de colesterol en 1ml. de cloroformo. En otro tubo de ensayo se diluyó 1 gr. de metil-β-ciclodextrina en 2ml. de metanol. Se adicionó una alícuota de 450 µl de la solución de colesterol a la solución de ciclodextrina y se mezcló hasta que la solución estuviera homogénea. En una caja de petri, se removió el solvente usando una corriente de nitrógeno gaseoso. Los cristales resultantes se dejarón secar 24h y luego se pasaron a un recipiente de vidrio y permanecieron almacenados a 22°C hasta su uso.

La solución de trabajo CLC (ciclodextrina cargada con colesterol) se preparó agregando 50mg. de CLC a 1ml. de TALP (medio Tyrodes-Albumina-Lactato-Piruvato modificado) mezclándolo vigorosamente en un vortex e incubándolo en un baño serológico a 37°C hasta el momento de ser utilizado.

4.3 Recolección del semen:

Se emplearon 10 caballos criollos colombiano de los cuales a cada uno se le recolectó un eyaculado, los criterios de inclusión dentro de la población para muestreo fueron: buena condición corporal, rango de edad entre 4 y 16 años y buen estado de salud. Las muestras de semen fueron colectadas usando la metodología de colección con vagina artificial (modelo Hannover, Minitub; Landshut, Alemania) con la ayuda de una yegua en estro. La fracción de gel fue removida con un filtro que se incorporó a la vagina artificial.

4.4 Procesamiento del semen:

Cada eyaculado libre de gel se diluyó en TALP a una concentración final de 120x106 espermatozoides/ml. luego fue dividido en 4 alícuotas numeradas al azar según el tratamiento a realizar. A los tratamientos 2 y 4 se les adicionó la solución de trabajo de CLC (1.5 mg de CLC/120x106 células) y fueron incubados a temperatura ambiente (~22°C) por 15 minutos. Todos los tratamientos se diluyeron a una concentración 1:1 (v:v) usando diluyente Kenney modificado (45% sucrosa, 29% glucosa y 26% leche descremada), las muestras fueron centrifugadas a 400 gravedades por 12 minutos. El sobrenadante fue removido y se estimó la concentración del presipitado, las células fueron resuspendidas en un diluyente de congelación (50% solución lactosa al 11%, 20% yema de huevo, 22% glucosa, 5.4% citrato de sodio, 5.4% EDTA, 1.2% bicarbonato de sodio) y 5% del crioprotector (tratamientos 1 y 2 glicerol y tratamientos 3 y 4 DMF) a una concentración final de 200x106

espermatozoides/ml. El semen se empacó en pajillas de 0.5 ml.

4.5 Congelación:

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Las pajillas fueron puestas en forma horizontal sobre una gradilla de congelación de semen en una caja de Porex, durante 15 minutos a 6 cm. por encima del nivel de nitrógeno como lo describen Medeiros et al. [48] Después de este tiempo las pajillas se sumergieron en nitrógeno líquido donde permanecieron almacenadas por tres meses hasta el momento de la descongelación.

4.6 Descongelación de semen:

Las pajillas fueron removidas del tanque de nitrógeno y descongeladas en agua a 37°C durante 30 segundos [7].

4.7 Evaluación del semen

La concentración espermática del semen fresco fue estimada por medio de un espectrofotómetro (spermacue, Minitub; Landshut, Alemania), el resultado de esta medición se utilizó para determinar la cantidad de diluyente y de tratamiento a adicionar. La movilidad total en semen fresco fue evaluada de forma independiente por dos observadores calificados en un microscopio de contraste de fase a 40x de aumento, en cinco campos de la muestra tomados al azar. La media de las observaciones fue reportada como el porcentaje de espermatozoides con movilidad total. Los parámetros de movilidad del semen descongelado se reportaron después de evaluar la muestra usando el software analizador de imagen SCA (Sperm Class Analyzer. Microptic SL, SCA VET 01), con la ayuda de un microscopio de contraste de fase (Nikon Eclipse 50i, Japón). Para su evaluación se diluyó el contenido de la pajilla en diluyente Kenney modificado a una relación 1:4, (v:v) y se dejó por 10 minutos a temperatura ambiente [24]. Después de esto se depositaron 10 μl del semen diluido en una cámara Makler (Sefi Medical Instruments Ltd, Israel) y se enfocó en el microscopio de contraste de fase a un aumento de 10x donde fue analizado por el SCA. Las variables de movilidad analizadas fueron las siguientes:

• Porcentaje de movilidad: Porcentaje de espermatozoides que presentaron algún grado de movimiento [53].

• Progresividad: Porcentaje de espermatozoides que presentaron movimiento activo hacia adelante [54].

• Movilidad rápida (tipo A): Porcentaje de espermatozoides evaluados con velocidad mayor a 90 μm/s

• Movilidad media (tipo B): Porcentaje de espermatozoides evaluados con velocidad mayor a 10 pero menor de 90 μm/s

• Movilidad lenta (tipo C): Porcentaje de espermatozoides evaluados con velocidad menor a 10 μm/s

• Velocidad curvilínea (VCL): Promedio de la velocidad absoluta, distancia recorrida de los espermatozoides evaluados sobre unidad de tiempo [55].

• Velocidad lineal (VSL): Promedio de la trayectoria lineal recalculada de los espermatozoides evaluados sobre unidad de tiempo [55].

• Velocidad media (VAP): Promedio de la trayectoria media recalculada de los espermatozoides evaluados sobre unidad de tiempo [55].

• Linealidad (Lin): describe la curvatura del trayecto, se calcula así: VSL/VAP [53]. • Oscilación (Wob): describe el movimiento lado a lado de la cabeza del espermatozoide, se calcula

así: VAP/VCL [53].

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La integridad de membrana fue evaluada usando un test hipo osmótico en agua destilada, así: se incubó una alícuota de 100 μl de semen en 200μl de agua destilada para una osmolaridad de 100 mOsmol/L, a 37°C durante 5 minutos [56]. La respuesta de los espermatozoides está basada en la semi-permeabilidad de la membrana celular intacta que causa que los espermatozoides se hinchen en condiciones hipo-osmóticas, debido a que la entrada de agua produce expansión en el volumen celular. Los espermatozoides íntegros se diferenciaran por enrollamiento de las colas. Se observaron 200 células por muestra bajo un microscopio de contraste de fase con un objetivo de 40x. Se reportó el porcentaje de colas enrolladas como el porcentaje de espermatozoides con membranas integras. El porcentaje de espermatozoides vivos se evaluó usando la técnica de tinción con eosina/nigrosina modificado (citrato de sodio al 3%) y observando los extendidos en un microscopio a 100x [57], se contó un mínimo de 200 espermatozoides por muestra. Se consideraron como muertos los espermatozoides que toman el primer colorante (coloración rosada) y como vivos aquellos que no toman el colorante (transparentes).

4.8 Análisis estadístico

El experimento se realizó con base en un diseño de bloques completos al azar con 10 repeticiones. Se bloqueó por caballos, con la intención de controlar la variabilidad ya reportada existente entre estos [1, 29], de manera que las medidas de los tratamientos fueran comparables. Los tratamientos se organizaron con base en una estructura factorial 2x2. Se evaluaron las variables: Porcentaje de movilidad, progresividad, movilidad rápida, movilidad media, movilidad lenta, velocidad lineal, velocidad curvilínea, velocidad media, linealidad, oscilación (tambaleo), Integridad de membrana y viabilidad. Cada una de las respuestas se representa mediante el siguiente modelo lineal: Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + Фk + εijk, i=1,2; j=1, 2; k=1, 2, ..., 10 Donde: Yijk: Respuesta (porcentaje de movilidad, progresividad, movilidad rápida, movilidad media, Movilidad lenta, velocidad lineal, velocidad curvilínea, velocidad media, linealidad, oscilación (tambaleo), Integridad de membrana y viabilidad) al i-ésimo nivel del factor crioprotector, en el j-ésimo nivel del factor modificador de membrana, en el k-ésimo caballo. μ: Efecto general de la media en cada una de las variables respuestas. αi: Efecto del i-ésimo nivel factor crioprotector (Glicerol o DMF) βj: Efecto del j-ésimo factor modificador de membrana (sin o con colesterol) αβij: Efecto de la interacción entre el factor crioprotector y el factor modificador de membrana εijk: Variable aleatoria normalmente distribuida, con media cero y varianza σ2. Se realizó un análisis de varianza para cada una de las variables respuesta: Porcentaje de movilidad, progresividad, movilidad rápida, movilidad media, movilidad lenta, velocidad lineal, velocidad curvilínea, velocidad media, linealidad, oscilación, integridad de membrana y viabilidad. Posteriormente, acorde con los resultados del Análisis de Varianza se realizaron pruebas para la comparación de medias. Debido a que las variables respuesta eran proporciones binomiales, se requirió emplear una transformación angular solo en algunas de las variables para que éstas satisficieran los supuestos de normalidad.

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Para los análisis se utilizó el procedimiento GLM del programa estadístico SAS (versión 9.1 para Windows, 2003). Se utilizó un modelo de estadística descriptiva para los parámetros seminales evaluados en semen fresco, con el fin de aportar a la caracterización de éste.

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5. RESULTADOS

5.1 Caracterización del semen del caballo criollo colombiano

Los siguientes son los datos del material biológico que se utilizó en el proyecto. En semen fresco se midió concentración y el volumen y la viabilidad y se estimo la movilidad total. En la tabla 2 se presentan los datos de cada caballo con la respectiva media y desviación por característica.

Tabla 2. Edad de los caballos y características de los eyaculados utilizados en el experimento

Edad Volumen Concentración esp. Movilidad total estimada Viabilidad ID (Años) (ml.) (millones/ml) (%) (%)

C1 10 49 153 60 73 C2 16 70 153 55 68 C3 4 100 221 80 79.5 C4 9 120 150 70 70 C5 8 60 224 80 81.4 C6 4 40 283 55 75.7 C7 4 100 210 70 62.8 C8 10 50 287 85 73.5 C9 14 40 209 82 69.1 C10 5 75 202 75 80.2 Media±SD 8.4±4.3 70.4±28.0 209.2±49.1 71.2±11.2 73.3±6

Todos los parámetros evaluados en el semen fresco fueron afectados significativamente por la congelación (tabla 3). En general la congelación aumentó la proporción de espermatozoides que presentaban una morfología anormal y disminuyó las proporciones de espermatozoides móviles y vivos.

Para la siguiente comparación se tomó como datos de congelación los promedios de los cuatro tratamientos y solo para este caso los datos de movilidad fueron evaluados sin la ayuda del software analizador de imagen.

Tabla 3. Efecto de la congelación sobre parámetros espermáticos en caballo. Parámetro Fresco Descongelado Viabilidad (%) 73.32 52.67* Movilidad total estimada (%) 71.20 48.67* Morfología Normal (%) 67.78 43.95*

Las medias con asterisco son significativamente diferentes; P<0.0005

El diseño experimental consistió en un efecto factorial 2x2, siendo los factores el crioprotector (niveles: glicerol o DMF) y el modificador de membrana (niveles: presencia o ausencia de colesterol). Uno de los propósitos de este diseño fue identificar sí existía interacción entre ambos factores. Los análisis de varianza para cada una de las variables (12 variables), indicaron que no existió interacción significativa entre los factores. Por lo tanto se presentaran resultados de manera independiente, es decir, solo se evalúan los efectos simples de cada factor.

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5.2 Efecto del crioprotector sobre parámetros seminales post-descongelación

El semen congelado con DMF como agente crioprotector aumentó significativamente el porcentaje de espermatozoides con movilidad total y progresiva post-descongelación al ser comparado con semen congelado con glicerol (figura 2). Estos datos fueron evaluados por el software analizador de imagen SCA. Para nuestro concepto y teniendo como referencia la evaluación de movilidad usada tradicionalmente, esto es sin la ayuda del software, el porcentaje de movilidad total leído por el equipo fue alto, sin embargo tendremos en cuenta estos valores conociendo que el equipo es altamente sensible a cualquier tipo de movimiento de las células.

Figura 2. Efecto del crioprotector sobre la movilidad espermática post descongelación. La figura 2A muestra el porcentaje de espermatozoides que se presentaron movilidad progresiva y la figura 2B el porcentaje de espermatozoides que presentó cualquier tipo de movimiento. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

El software discrimina el movimiento total en tres categorías diferentes según la velocidad en el movimiento de los espermatozoides de la siguiente manera. Tipo A: rápidos, fueron espermatozoides cuya velocidad en su movimiento superó las 90 μm/s. Tipo B: velocidad media, fueron espermatozoides cuya velocidad fue menor de 90 μm/s pero mayor a 10 μm/s y tipo C: o lentos fueron los espermatozoides con velocidad menor a 10 μm/s. El porcentaje de espermatozoides que presentaban movilidad tipo A post descongelación fue significativamente mayor cuando se utilizó DMF como crioprotector en vez de glicerol, lo mismo ocurrió con el porcentaje de espermatozoides con movilidad tipo B. En cambio El porcentaje de espermatozoides que presentaron la movilidad tipo C fue significativamente menor cuando se utilizó DMF como agente crioprotector (Figura 3).

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Figura 3. Efecto del crioprotector sobre la movilidad espermática total post descongelación, diferenciando tres velocidades distintas. La figura 3A representa el porcentaje de espermatozoides que presentaron movilidad tipo A (>90 μm/s). La figura 3B es el porcentaje de espermatozoides que presentó movilidad tipo B (<90 μm/s y >10 μm/s) y la figura 3C el porcentaje de espermatozoides que presentó movilidad tipo C (<10 μm/s). El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

Igualmente el software SCA mide la trayectoria de cada una de las células evaluadas determinando así la velocidad curvilínea VCL (velocidad absoluta), y recalcula la velocidad lineal VSL y la velocidad media VAP (Figura 4).

Figura 4. Registro de un espermatozoide analizando su velocidad curvilínea (VCL), velocidad lineal (VSL) y velocidad promedio (VAP), usando el software Sperm Class Analyzer SCA. [58]

En este experimento todos los tipos de velocidades post descongelación fueron significativamente mayores al utilizar DMF como agente crioprotector (Figura 5).

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Figura 5. Efecto del crioprotector sobre los tipos de trayectoria espermática post descongelación, La figura 5A muestra la velocidad curvilínea (VCL) media, la figura 5B muestra la velocidad lineal (VsL) media y figura 5C muestra la velocidad promedio (VAP) media. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

Para otros parámetros derivados de la movilidad tales como índices de linealidad y oscilación no hubo diferencia estadísticamente significativa al utilizar alguno de los dos crioprotectores, sin embargo se encontró un aumento en los índices al utilizar el glicerol como agente crioprotector (Figura 6).

Figura 6. Efecto del crioprotector sobre índices de linealidad y oscilación post descongelación. La figura 6A muestra el índice de linealidad media de los espermatozoides y la figura 6B muestra la oscilación medio de los espermatozoides. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

Al usar DMF como agente crioprotector hubo un aumento significativo en el porcentaje de espermatozoides vivos en comparación de cuando se usó glicerol como crioprotector, Figura 7B.

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Figura 7. Evaluación de viabilidad en espermatozoides post descongelación. En la figura 7A se observa el resultado de la coloración efectuada con la tinción eosina-nigrosina [57]. La figura 7B muestra el Efecto del crioprotector en el porcentaje de espermatozoides vivos. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

Al usar DMF como agente crioprotector hubo un aumento significativo en el porcentaje de espermatozoides vivos en comparación del grupo con glicerol Figura 8B.

Figura 8. Evaluación de integridad de membrana en espermatozoides postdescongelación. En la figura 8A se observa el resultado del test hiposmótico [57]. La figura 8B muestra el Efecto del crioprotector sobre el porcentaje de espermatozoides íntegros. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

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5.3 Efecto del colesterol como modificador de membrana sobre parámetros seminales post-descongelación

El semen tratado con colesterol como modificador de la membrana plasmática aumentó significativamente el porcentaje de espermatozoides con movilidad total y progresiva post-descongelación al ser comparado con semen no tratados (Figura 2).

Figura 9. Efecto del colesterol sobre la movilidad espermática post descongelación. La figura 9A muestra el porcentaje de espermatozoides que presentaron movilidad progresiva y la figura 9B el porcentaje de espermatozoides que presentaron cualquier tipo de movimiento. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

Según la clasificación que el software le hace al movimiento total según la velocidad, en Tipo A, B y C, el porcentaje de espermatozoides que presentaron la movilidad tipo A post descongelación, fue significativamente mayor cuando se usó colesterol como modificador de membrana, lo mismo ocurrió con el porcentaje de espermatozoides con movilidad tipo B. El porcentaje de espermatozoides que presentaron movilidad tipo C, fue significativamente menor cuando se utilizó colesterol como modificador de membrana (Figura 10).

Figura 10. Efecto del colesterol sobre la movilidad espermática total post descongelación, diferenciando tres velocidades distintas. La figura 10A muestra el porcentaje de espermatozoides que presentaron movilidad tipo A (>90 μm/s). La figura 10B muestra el porcentaje de espermatozoides que presentó movilidad tipo B (<90 μm/s y >10 μm/s) y figura 10C el porcentaje de espermatozoides que presentó movilidad tipo C (<10 μm/s). El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

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Igualmente el software SCA mide la trayectoria de cada una de las células evaluadas determinando así la velocidad curvilínea VCL (velocidad absoluta), y recalcula la velocidad lineal VSL y la velocidad media VAP. Todos los tipos de velocidades post descongelación fueron significativamente mayores al utilizar colesterol durante la congelación. (figura 11).

Figura 11. Efecto del colesterol sobre los tipos de trayectoria espermática post descongelación, La figura 11A muestra la velocidad curvilínea (VCL) media, la figura 11B muestra la velocidad lineal (VSL) media y figura 11C muestra la velocidad promedio (VAP) media. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

Para la linealidad y oscilación no hubo diferencia estadísticamente significativa al utilizar o no modificador de membrana. Figura 6

Figura 12. Efecto del colesterol sobre índices de linealidad y oscilación post descongelación. La figura 6A muestra el índice de linealidad media de los espermatozoides y la figura 6B muestra la oscilación media de los espermatozoides. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

La prueba de integridad de membrana indicó que al usar colesterol como modificador de membrana se aumentó significativamente el porcentaje de espermatozoides vivos en comparación con no usarlo (Figura 13a). Para el parámetro de viabilidad, el uso de colesterol aumentó significativamente en el porcentaje de espermatozoides vivos en comparación al no utilizarlo (Figura 13B).

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Figura 13. Efecto del colesterol sobre la integridad de membrana y la viabilidad espermática. La figura 13A muestra el porcentaje de espermatozoides con integridad de membrana. La figura 13B muestra el porcentaje de espermatozoides vivos. El asterisco indica que hay diferencia estadísticamente significativa P<0.05

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6. DISCUSIÓN

El uso y desarrollo de biotecnologías reproductivas en machos requiere pruebas de laboratorio que evalúen la calidad del semen y es necesario que éstas estén correlacionadas con la fertilidad in vivo. El objetivo del análisis de semen es determinar el potencial fertilizante de una determinada muestra, de una manera sencilla y económica [59]. Un ejemplo de esto es la estimación de movilidad que se lleva a cabo frecuentemente tanto en semen fresco como descongelado, valores bajos de ésta son motivo de descarte del eyaculado para uso comercial. Sin embargo una combinación de varias pruebas permiten una mayor aproximación al potencial fertilizante del semen descongelado [60]. La movilidad refleja varios aspectos del metabolismo espermático; los espermatozoides equinos poseen características específicas como posición abaxial del flagelo y cabeza asimétrica, esto impide que el movimiento sea totalmente progresivo [61], por lo cual, es importante evaluar la movilidad total adicional a la movilidad progresiva. Usualmente la movilidad es evaluada bajo un microscopio de luz; estimando el porcentaje de células en movimiento, este método esta sujeto a la subjetividad introducida por error humano, esta subjetividad puede ser evitada si la evaluación es realizada mediante un software especializado. Kirk et al en el 2005 [62] encontró diferencia significativa al comparar los resultados de evaluación de movilidad obtenidos por estimación visual versus los arrojados por el software CASA, siendo mayor el porcentaje de movilidad que calcula el software. Los parámetros que tuvimos en cuenta han sido identificados como marcadores confiables de la calidad espermática obtenidos del CASA y correlacionados con fertilidad [63]. Por cuestiones logísticas y teniendo en cuenta que este tipo de software no es común en nuestro medio, solo para las evaluaciones post-descongelación contamos con esta herramienta. Las pruebas de viabilidad evalúan la integridad o no de la membrana, además de ser un indicador de vida espermática, señala la integridad y funcionalidad de la membrana plasmática, necesaria para el momento de la fertilización. La membrana plasmática recubre toda célula, sin embargo, en espermatozoides ésta consiste en tres compartimentos, la membrana acrosómica, post-acrosómica y el recubrimiento de la pieza intermedia y principal [59]. Por esto, diferentes pruebas de integridad de membrana actúan sobre compartimentos diferentes, un ejemplo es la prueba de viabilidad usando eosina-nigrosina que evalúa la integridad de la región post-acrosomal y tienen afinidad por ciertas regiones del ADN, mientras que el test hiposmótico evalúa la porción de la membrana que recubre la zona intermedia y principal [64], este indicador tiene una correlación positiva con la tasa de fertilidad [54]. Características seminales de los caballos utilizados Para la caracterización de los parámetros espermáticos de los ejemplares, analizamos 10 eyaculados de 10 caballos criollos colombianos. A pesar de que no es posible caracterizar el semen del caballo criollo colombiano con solo 10 ejemplares, la información obtenida del semen fresco permitió hacer una caracterización y descripción preliminar, que servirá de base para futuras investigaciones. Aunque existe alta variabilidad de las muestras seminales entre ejemplares [1, 65-67] y también dentro del mismo ejemplar [66, 68, 69], muchas asociaciones Europeas admiten una sola prueba como criterio de aceptación de caballos como reproductores, las explicaciones son controversiales e incluyen

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características como la edad, la raza, la frecuencia en los servicios y la duración del día [26, 29, 66, 70]. En el presente trabajo acogimos un solo muestreo por individuo para la evaluación de las características seminales en fresco y para los ensayos de criopreservación. Las asociaciones que registran los caballos criollos colombianos no hacen ninguna prueba reproductiva; por lo cual no hay datos con los cuales comparar los resultados del presente trabajo, el cual se constituye como el primer reporte de evaluación computarizada del semen para esta raza. Esto obligó a realizar las comparaciones con datos reportados para otras razas [29, 65], de lo anterior se pudo evidenciar que todas las características seminales se encuentran dentro de los rangos normales establecidos, esto sirve como prueba parcial para la utilización de tecnologías reproductivas como criopreservación e inseminación artificial en caballos criollos colombianos. La principal alteración morfológica fue encontrada en la cabeza, en contraste a lo reportado para la raza Lusitano, cuya mayor alteración morfológica con las anormalidades de pieza intermedia [65]. Efecto de la congelación sobre los parámetros seminales Actualmente no existe un protocolo unificado para la congelación de semen en caballos; los métodos y materiales varían ampliamente entre laboratorios [71]. En este experimento se aplicaron los procedimientos de colecta, congelación y descongelación que actualmente se utilizan en un laboratorio comercial y que están acordes con los reportes de la literatura científica.

El proceso de congelación disminuyó significativamente el porcentaje de espermatozoides vivos y móviles. Esto mismo ha sido previamente reportado por [1-4, 32], es ampliamente aceptado que la criopreservación presenta una serie de agentes dañinos para los espermatozoides, como el cambio en la temperatura, que favorece la formación de cristales de hielo y estos a su vez permiten el cambio en la presión osmótica en la fracción remanente. La adición y remoción de agentes crioprotectores puede provocar cambios en la presión osmótica y toxicidad, además de daños oxidativos entre otros [1]. Todos estos factores pueden llegar a ser letales, repercutiendo en la viabilidad y debilitando las funciones celulares de los espermatozoides sobrevivientes, lo cual se ve reflejado en la disminución de la movilidad evaluada. Otras causas de la disminución en la movilidad pueden estar asociadas al aumento en las anormalidades morfológicas, dentro de las cuales se han reportado daños en mitocondrias, acrosóma y flagelo; provocados por diferente factores del proceso de criopreservación [33].

Un resultado que generó controversia fue la discrepancia entre el porcentaje de espermatozoides vivos con el parámetro de movilidad total evaluada por el SCA. En algunos casos, la movilidad total alcanzó un promedio de hasta 90% mientras que en la misma muestra la viabilidad alcanzó un promedio de 55%. Una posible explicación es la sensibilidad del equipo, el cual es capaz de captar movimientos mínimos de espermatozoides muertos, cuando estos son empujados por espermatozoides vivos móviles. Una manera de evitar esta discrepancia en futuros estudios es configurar un umbral de velocidad en el equipo y solo considerar móviles aquellos espermatozoides que lo superen.

Efecto de la DMF sobre los parámetros seminales

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El Glicerol es el agente crioprotector más frecuentemente utilizado para la congelación de semen en varias especies [3, 11] incluyendo caballos [71]. A pesar de esto en nuestro experimento todos los parámetros seminales evaluados mejoraron al utilizar la DMF como crioprotector alterno al glicerol. La capacidad superior como agente crioprotector de la dimetil formamida (DMF) es consistente con trabajos previos [7, 8, 14, 20, 22, 48]. Para que un crioprotector sea efectivo debe tener bajo peso molecular, ser soluble en agua y causar baja toxicidad [50]. El glicerol tiene mayor peso molecular que la DMF (92 vs 73) [72], esto le permite a la DMF penetrar la membrana más rápido produciendo así un cambio en el volumen celular menos drástico o de menor magnitud que el que puede producir el glicerol, lo cual se pudo haber visto reflejado en el mayor porcentaje de movilidad, espermatozoides vivos e íntegros encontrados cuando se utilizó DMF. Además del estrés osmótico que ejerce el glicerol en los espermatozoides, se ha sugerido que éste causa toxicidad por medio de efectos directos que ejerce sobre la membrana y sobre el metabolismo celular [3]; también se ha descrito que altera la bicapa lipídica modificando la tasa de permeabilidad de agua y los movimientos de iones transmembranales, interacciona con proteínas y lipoproteínas de membrana y su presencia aumenta la demanda energética celular [3]. Según nuestro conocimiento no se ha reportado toxicidad de la dimetil formamida como agente crioprotector de semen en caballos.

Los presentes hallazgos en cuanto a la acción superior de la DMF coinciden con Gómes et al. [22] los cuales compararon la acción de varias amidas (dimetil formamida, etil formamida, dimetil acetamida) y glicerol como agentes crioprotectores en la congelación de semen de caballos raza Mangalarga Marchador. Encontrando que el semen congelado con DMF tuvo una movilidad total superior al congelado con glicerol y al resto de sus otros tratamientos. Sin embargo, otros trabajos muestran resultados controversiales, Vidament et al. [8] usaron glicerol y DMF conjuntamente y encontraron que la movilidad no mejoraba con la combinación de estos crioprotectores y que el uso de la DMF presentaba resultados comparables con los del glicerol, mientras que Medeiros et al. [48] reportan que la asociación de glicerol con DMF presentó resultados de movilidad mejores que los del glicerol solo, pero esta asociación no tuvo diferencia con el tratamiento que uso únicamente DMF.

Efecto del colesterol sobre los parámetros seminales La relación colesterol fosfolípidos en la membrana plasmática juega un papel fundamental en la resistencia de las células al shock térmico [2, 40]. Las ciclodextrinas parecen proporcionar el vehiculo necesario para modificar esta relación [24-27, 47, 56]. Cuando se incubó el semen de caballos criollos colombianos con CLC (ciclodextrinas cargadas con colesterol) antes de la congelación se encontró un aumento significativo en el porcentaje de: movilidad total, progresiva, espermatozoides con velocidad rápida, espermatozoides vivos, con integridad de membrana y aumentaron las velocidades promedios. Estos hallazgos coinciden con el concepto de que especies que tienen alta relación molar de colesterol fosfolípidos son más resistentes al shock térmico [41]. Ha sido demostrado que al aumentar la concentración de colesterol en la membrana se disminuye la temperatura de transición y de esta manera la membrana permanece más fluida [1] siendo menos susceptible a daños mecánicos, lo cual se refleja notablemente en la evaluación de integridad de membrana; en la que los presentes resultados coinciden con los de otros experimentos similares en caballos [24, 56, 73].

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Para los parámetros de movilidad post descongelación el efecto del colesterol es controversial, los presentes resultados indican un aumento en la movilidad y coinciden con varios experimento similares en caballos [24, 74] y en toros [26, 27], sin embargo, otros trabajos en caballos no encontraron tal diferencia [56, 73]. Esto podría ser explicado debido a que la reducción de la movilidad post descongelación no necesariamente se debe atribuir a daños en la membrana [2]. Los parámetros de linealidad y oscilación fueron evaluados usando el software SCA. Se consideró importante porque a nuestro criterio los espermatozoides tratados con colesterol tenían deficiencia en la linealidad, sin embargo tales parámetros no dieron una diferencia significativa aunque el promedio de linealidad que es un parámetro deseado fue mayor cuando no se adicionó colesterol y el promedio de oscilación fue mayor al adicionar colesterol. Sin embargo se deben realizar estudios posteriores que aclaren si este parámetro tiene relación con la fertilidad. Zahn (2002) encontró una disminución en la fertilidad postdescongelación de espermatozoides tratados con CLC, debido a que al alterar la composición de la membrana se afecta la respuesta de los espermatozoides al proceso de congelación, y adicionalmente también afecta su capacitación y posterior reacción acrósomica, ya que el flujo de colesterol es una de las primeras etapas de la capacitación espermática [30]. Como al aumentar la cantidad de colesterol en la membrana, el tiempo de capacitación aumenta y por ende la inseminación debe realizarse antes, es necesario hacer estudios para determinar el momento óptimo de inseminación con semen tratado con CLC. Una alternativa planteada recientemente es la adición de ciclodextrinas post-descongelación para que por gradiente de concentración vuelvan a extraer el colesterol de las membranas, sin embargo el trabajo reportado por [56] no obtuvo los resultados esperados, la incógnita se mantiene sin ser resuelta.

El análisis estadístico indicó que no hubo interacción entre la presencia o ausencia de colesterol con los dos crioprotectores evaluados. Se sabe que el colesterol además de prevenir los daños mecánicos disminuye el estrés osmótico [56, 75], debido a que al aumentar la fluidez a bajas temperaturas aumenta también la permeabilidad de los crioprotectores a través de la membrana. Sin embargo en este caso la diferencia en el peso molecular de los crioprotectores no fue lo suficientemente grande como para que el colesterol influyera sobre la permeabilidad. El tratamiento al que le se le adicionó colesterol y se utilizó DMF como agente crioprotector tuvo el mejor rendimiento de los parámetros evaluados, pero esto fue debido posiblemente a los efectos aditivos de ambos.

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7. CONCLUSIONES

A pesar de no haberse realizado una comparación exhaustiva, se observó que las características seminales evaluadas en el semen fresco de los caballos criollos colombianos utilizados, son similares a las de caballos de otras razas y presentan parámetros compatibles con las exigencias técnicas para su uso en biotecnologías como la inseminación artificial y la criopreservación.

La congelación tiene un efecto deletéreo sobre los parámetros seminales evaluados, es necesario continuar planteando estrategias que aumenten el número de espermatozoides sobrevivientes y mejoren la funcionalidad de los que sobreviven al proceso.

El uso de DMF como agente crioprotector es una excelente alternativa para mejorar la movilidad espermática, la integridad de membrana y la viabilidad. Sin embargo, se requieren pruebas posteriores de fertilidad para verificar la superioridad de la DMF in vivo.

La adición de CLC antes de la congelación, mejoró todos los parámetros espermáticos evaluados. Futuros estudios son necesarios para probar la fertilidad in vivo del semen tratado con colesterol. El uso conjunto de dimetil formamida como crioprotector y la adición de colesterol durante la congelación mejora la respuesta de semen en caballos criollos colombianos debido a efectos aditivos de cada técnica, pero la presencia de colesterol en la membrana plasmática no tuvo influencia significativa sobre la permeabilidad del glicerol al compararlo con la dimetil formamida.

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8. BIBLIOGRAFÍA

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