Efecto del Estrés Oxidativo en la Resistencia Multidrogas en Células de

Cáncer de Colon HT29

Yenith Alexandra Cuellar Sáenz

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Medicina

Bogotá, Colombia

2016

Efecto del Estrés Oxidativo en la Resistencia Multidrogas en Células

de Cáncer de colon HT29

Yenith Alexandra Cuellar Sáenz

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Bioquímica

Director (a):

Ph.D. Martha Leonor Pinzón Daza Profesora Titular de Carrera, Unidad de Bioquímica

Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas Universidad del Rosario

Línea de Investigación:

Mecanismos bioquímicos y moleculares de la respuesta celular activada por estrés Grupo de Investigación:

Grupo de Investigación Bio-Bio (Bioquímica – Biotecnología) Universidad del Rosario

Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, Universidad del Rosario Bogotá, Colombia

2016

Amor a mi patria

Amor a la libertad

Dignidad personal

Cumplimiento del deber

Devoción a la Ciencia

Devoción al trabajo

Respeto a la justicia y a mis semejantes

Afecto a los míos, parientes, discípulos y amigos

Bernardo Houssay.

Agradecimientos

A la Dra. Martha Pinzón por darme la oportunidad de realizar este proyecto, por su confianza en mi trabajo, por su apoyo constante en todos los retos que se presentaron, por sus enseñanzas y su amistad.

A la Dr. Ruth Garzón por abrirme las puertas del grupo de Investigación Bio-Bio

A todos los miembros del Grupo de Investigación Bio-Bio por sus aportes y sus constantes enseñanzas durante el desarrollo de este proyecto

Al Dr. Francisco Nualart por la valiosa asesoría académica y turística durante mi estadía de investigación en su laboratorio.

A todos los miembros del Laboratorio de Neurobiología y Células Madres, Neuro-CellT de la Universidad de Concepción por su ayuda, su amabilidad, sus enseñanzas y su paciencia.

Al equipo administrativo del Centro de Microscopía Avanzada por su asesoría científica y su paciencia.

A la Maestría en Bioquímica y especialmente a los profesores Carlos Guerrero y Luis Alberto Gómez, por cambiar totalmente mí forma de pensar y de vivir la ciencia.

Al Fondo para la Investigación de la Universidad del Rosario (FIUR) por la financiación de este proyecto, a Colciencias y al programa de Jóvenes Investigadores y a la División Universidades del Banco Santander por el apoyo económico otorgado en forma de beca para la realización de la pasantía en Chile para la realización de este proyecto.

A la Universidad Nacional de Colombia por el apoyo económico para la asistencia a eventos académicos

A mis compañeros de laboratorio Carolina, Daniel, Mara y July por las discusiones científicas y filosóficas, por las risas y el apoyo en los momentos difíciles

A Diego por su cariño, su apoyo constante, su compañía y complicidad en esta aventura

A mis papas Marlen y Marco, a mi hermano Andrés y a mi abuelita Lucrecia. Ustedes son el motor esencial de mi vida, han sido y serán siempre la luz en la oscuridad, la alegría en los momentos más tristes, la esperanza en los momentos de angustia y frustración, son mi motivo para seguir luchando todos los días, los amo.

A Dios por darme la fortaleza para seguir adelante en los momentos de desesperación, por las oportunidades y por bendecirme al poner en mi camino a todos los aquí mencionados

Resumen y Abstract

RESUMEN

La resistencia a fármacos antineoplásicos es un problema frecuente en el uso de la quimioterapia en cáncer. Esta se relaciona con factores como: 1) la activación de la resistencia a multidrogas (MDR: Multiple Drug Resistance) asociada a la presencia de transportadores unidos a adenosín trifosfato ATP (transportadores ABC) como la glicoproteína P (Pgp P-Glycoprotein) entre otros, que expulsan el fármaco al exterior de las células; 2) la heterogeneidad del tejido; 3) el microambiente tumoral; 4) la respiración mitocondrial anormal; 5) la vascularización; 6) los mecanismos de reparación del Ácido desoxirribonucleico DNA (Deoxyribonucleic acid) y 7) la apoptosis. Diversos estudios han demostrado que la señalización celular, que conduce a estos procesos moleculares, depende de la respuesta celular al estrés oxidativo generado y a la regulación que pueda efectuarse. Las especies reactivas de oxígeno (ROS: Reactive Oxygen Species) oxidan componentes celulares como el DNA, las proteínas y los ácidos grasos. En el caso de las proteínas, estas al ser oxidadas modifican su función normal, generando efectos en la señalización celular e incrementando aún más el estrés oxidativo. La modulación de ROS podría ser no sólo un pre-requisito para el desarrollo del tumor sino una medida de la Resistencia a multidrogas.

En este proyecto se realizó un estudio in vitro, con células de cáncer de colon HT29 las cuales fueron sometidas a condiciones de hipoxia química y/o incubación con Doxorrubicina, con el fin de generar estrés oxidativo, el cual fue evaluado a través de la medición de niveles de ROS. Se hizo una determinación del efecto que tiene el aumento en los niveles de ROS frente a la expresión de los transportadores ABC Pgp y BCPR (Breast Cancer Resistance Protein o Proteína de Resistencia de Cáncer de Mama). Adicionalmente y considerando que en la resistencia a multidrogas pueden existir mecanismos de evasión de la apoptosis asociados al estrés oxidativo, se evaluó el efecto de estos tratamientos sobre la expresión de las proteínas proapoptóticas PUMA (modulador de apoptosis sobre regulado por p53) y Bax (Proteína X asociada con la proteína 2 de linfoma de células B Bcl-2). Teniendo en cuenta que la respuesta a hipoxia conduce a la activación del factor inducible por hipoxia (HIF1α) como regulador de la señalización, en este estudio se hizo la evaluación de su actividad y su relación con la resistencia a multidrogas. Como respuesta al estrés oxidativo se ha evaluado la endonucleasa humana APE-1 (Endonucleasa apurínica apirimidínica de mamíferos). Esta es una enzima con actividad reparadora del DNA y con actividad en la regulación transcripcional de diferentes factores de transcripción. Su sobreexpresión se ha visto en células tumorales y confiere resistencia a varios fármacos usados en la terapia anti cáncer; por lo cual, se considera que la resistencia a multidrogas podría estar ligada a la función de APE-1, que además regula la activación del gen de resistencia a multidrogas MDR1, que codifica para el transportador Pgp. En este trabajo se determinó el efecto de la actividad redox de la endonucleasa APE-1 a través de su inhibición, en los niveles de ROS y en la resistencia multidrogas mediada por los transportadores ABC Pgp y BCPR. Esta es una vía que tiene gran importancia ya que puede considerarse como una ruta alternativa que utilizan las células tumorales y que incrementaría aún más la MDR. Finalmente, se buscó determinar el efecto de las ROS sobre la expresión de transportadores ABC a través del uso del antioxidante N-Acetilcisteína.

Estos resultados permitieron sugerir un modelo hipotético en el cual 1) la generación de ROS inducidas por Doxorrubicina en normoxia e hipoxia química podrían activar mecanismos de resistencia a multidrogas y 2) la respuesta al estrés oxidativo mediada

x Resumen y Abstract

por APE-1 podría regular la expresión, localización en membrana o actividad de Pgp y BCRP. Adicionalmente se plantea que el factor de transcripción HIF1α podría generar cambios en la activación de la vía apoptótica asociada al tratamiento con Doxorrubicina. Estas alteraciones en los transportadores y en la activación de la vía apoptótica asociados al estrés oxidativo, estarían asociados con la resistencia multidrogas en células de cáncer de colon.

Palabras Clave: Resistencia a multidrogas, cáncer, estrés oxidativo, Doxorrubicina, hipoxia, apoptosis, ABCB1 (Pgp o MDR1), ABCG2 (BCRP).

ABSTRACT

The resistance against antineoplasic drugs is a common problem in the use of chemotherapy in cancer. This is related to factors such as: 1) the activation of multidrug resistance (MDR: Multiple Drug Resistance) associated with the presence Adenosine triphosphate ATP-Binding Cassette transporters (ABC Transporters) as the P-glycoprotein (Pgp) among others, which allows the efflux of the drug outside of the cells; 2) heterogeneity of the tissue; 3) the Tumor Microenvironment; 4) the abnormal mitochondrial respiration; 5) vascularization; 6) Deoxyribonucleic acid DNA (Deoxyribonucleic acid) repair mechanisms and 7) apoptosis. Several studies have shown that the cellular signaling that leads to these molecular processes depends on the cellular response to oxidative stress and its regulation. Reactive Oxygen Species (ROS: Reactive Oxygen Species) oxidize cellular components such as DNA, proteins, and fatty acids. In the case of proteins, oxidation modifies their normal function, generate effects in cell signaling and further increase the oxidative stress. ROS modulation could not be only a prerequisite for the development of the tumor but could be also a measure of resistance to drugs.

This project was an in vitro study of HT29 colon cancer cells which were subjected to conditions of hypoxia and/or incubation with Doxorubicin in order to generate oxidative stress which was evaluated through ROS levels measure. It was evaluated the effect of increasing ROS levels on the Pgp and BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) expression. Additionally, and considering that drug resistance could involve apoptosis evasion mechanisms associated with oxidative stress, the effect of these treatments on the expression of the pro-apoptotic proteins PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis) and Bax (B-cell lymphoma-2 protein associated X protein) was evaluated. The response to hypoxia induces the activation of the Hypoxia Inducible Factor (HIF1α) as a regulator of signaling, for that reason HIF1α activation and its relation to drug resistance were evaluated. In addition, as a mechanism of response to oxidative stress, the APE-1 (Apurinic/Apyrimidinic) endonuclease, was evaluated.

This endonuclease is an enzyme with DNA repair and transcriptional regulation activity on different transcription factors. Its overexpression has been noted in tumor cells and confers resistance to several drugs used in anticancer therapy; according to this, it has been postulated that resistance to drugs could be linked to the APE-1 function which

Resumen y Abstract

regulates the activation of the MDR1 multidrug resistance gene, which encodes for the Pgp transporter. In this work, it was determined the effect of the APE-1 redox activity, on ROS levels and on the drug resistance mediated by the ABC transporters Pgp and BCRP (Breast Cancer Resistance Protein) through APE-1 inhibition. This pathway has a great relevance because it could be considered as an alternative route used by the tumor cells and would further increase the MDR. Finally, we sought to determine the effect of ROS on the expression of ABC transporters using the antioxidant N-acetylcysteine.

These results allowed us to suggest a hypothetic model where 1) ROS generation induced by Doxorubicin in normoxic and chemical hypoxic conditions could activate drug resistance mechanisms and 2) response to oxidative stress mediated by APE-1 could regulate expression, membrane localization or activity of Pgp and BCRP. Additionally, it was proposed that HIF1α could be associated with changes in the apoptotic pathway activation in response to Doxorubicin treatment. These alterations in the transporters levels and in the apoptotic pathway could be related to multidrug resistance in colon cancer cells.

Keywords: Drug Resistance, Cancer, Oxidative Stress, Doxorubicin, Hypoxia, Apoptosis, ABCB1, ABCG2.

XII contenido

Contenido

RESUMEN .................................................................................................................. IX

1. Introducción ....................................................................................................... 1

2. Planteamiento del Problema .......................................................................... 3

3. Justificación ....................................................................................................... 5

4. Objetivos ............................................................................................................. 6

4.1 General ............................................................................................................... 6

4.2 Específicos......................................................................................................... 6

5. Marco Teórico .................................................................................................... 7

5.1 Carcinoma colorrectal: características generales y tratamiento ............... 7

5.2 Mecanismos de resistencia a medicamentos............................................... 8

5.2.1 Resistencia multidrogas MDR (Multidrug Resistance): Eflujo de

fármacos anti-cáncer - Transportadores ABC .............................................. 9

5.2.2.1 .................................................................... Glicoproteína P Pgp (P-

Glycoprotein) .............................................................................................. 10

5.2.2.2 ...... Proteína asociada a resistencia multidroga MRP (Multidrug

Resistance Protein) ................................................................................... 10

5.2.2.3 ......... Proteína de resistencia en cáncer de seno BCRP/ABCG2

(Breast cancer resistance protein) .......................................................... 11

5.2.2 Resistencia a Muerte celular ............................................................ 11

5.3 Estrés oxidativo, hipoxia y mecanismos de resistencia a quimioterapia 12

5.3.1 Quimioterapia y estrés oxidativo ..................................................... 13

5.3.2 Hipoxia, estrés oxidativo y quimioresistencia ................................ 13

5.3.2.1 ....................................................... Factores inducibles por Hipoxia

(HIFs) ........................................................................................................... 14

5.3.3 Respuesta celular al estrés oxidativo ............................................. 15

5.3.3.1 ................................................................................ Sistema glutatión

oxidado/reducido ....................................................................................... 15

5.3.3.2 ............................................................................ROS y señalización

celular .......................................................................................................... 15

Contenido

5.3.3.3 ..................... Endonucleasa APE-1 y factor de transcripción AP-

1 16

6. Metodología ...................................................................................................... 18

6.1 Mantenimiento de los cultivos celulares ...................................................... 18

Objetivo específico 1: Determinar el efecto de la Doxorrubicina y/o la

hipoxia química en la generación de especies reactivas de oxígeno ............ 18

6.2 Modelos experimentales de tratamiento para la Inducción de estrés

oxidativo y/o hipoxia química ................................................................................ 18

6.3 Evaluación de la generación de Especies Reactivas de Oxígeno

(ROS) ....................................................................................................................... 19

6.4 Viabilidad celular por azul de Tripán ............................................................ 19

Objetivo específico 2: Evaluar el efecto de las ROS en la actividad del

factor de transcripción HIF-1 α ............................................................................. 20

6.5 Evaluación de la activación de HIF1α ......................................................... 20

Objetivo específico 3: Establecer la relación entre la actividad de APE-1 y

de HIF1α con la expresión de los transportadores Pgp y BCRP .................... 21

6.6 Modelo experimental de tratamiento para la inhibición de la actividad

redox de APE-1 ...................................................................................................... 21

6.7 qRT-PCR para la evaluación del mRNA de proteínas ABC Pgp y

BCRP ....................................................................................................................... 21

6.8 Evaluación de la localización celular de Pgp, BCRP y acumulación de

Doxorrubicina por microscopía confocal ............................................................. 23

Objetivo específico 4: Determinar el efecto de antioxidantes en la

expresión de los transportadores Pgp y BCRP ................................................. 25

6.9 Protección frente al estrés oxidativo ............................................................ 25

Objetivo específico 5: Evaluar la relación entre el estrés oxidativo inducido

por Doxorrubicina y/o hipoxia química el proceso apoptótico ......................... 26

6.10 Apoptosis: Ensayo fluorimétrico de caspasa 3 ..................................... 26

6.11 Reacción en Cadena de Polimerasa qRT-PCR para la evaluación del

mRNA de proteínas proapoptóticas PUMA y Bax ............................................. 26

6.12 Análisis estadístico .................................................................................... 27

7. Resultados ........................................................................................................ 28

Las especies reactivas de oxigeno modulan la viabilidad de las células

de cáncer de colon .................................................................................................... 28

El estrés oxidativo podría estar relacionado con la actividad de HIF-1α 33

El uso de la Doxorrubicina y/o la hipoxia química modulan la activación

del mecanismo MDR a nivel de proteína ............................................................. 34

XIV contenido

Los niveles de mRNA de Pgp se incrementan por el uso de la

Doxorrubicina en un medio hipóxico ................................................................... 40

La inhibición de la endonucleasa APE-1 aumenta la cantidad de especies

reactivas de oxígeno e inhibe la actividad de HIF 1α ...................................... 42

La endonucleasa APE-1 podría regular la expresión de los

transportadores Pgp y BCRP ................................................................................. 46

Las ROS podrían regular la expresión y/o actividad de los

transportadores Pgp y BCRP en condiciones de estrés oxidativo ............. 50

La Doxorrubicina y/o la hipoxia química podrían regular la activación de

vías de muerte celular .............................................................................................. 60

8. Discusión .......................................................................................................... 64

9. Conclusiones ................................................................................................... 73

10. Perspectivas ..................................................................................................... 75

11. Productos de Investigación y Reconocimientos .................................... 76

12. Anexos ............................................................................................................... 77

Anexo 1: Ensayos preliminares ROS y Viabilidad celular con H2O2 ......... 77

Anexo 2: Estandarización del uso de anticuerpos para la

inmunodetección por IHC en tejido ...................................................................... 79

Anexo 3: Curvas de eficiencia para los genes B-actina, BAX, BCRP

(ABCG2) y Pgp (MDR1) ............................................................................................ 81

Anexo 4: Estandarización del uso del inhibidor de APE-1 E3330 ............. 82

Anexo 5: Datos del análisis estadístico por .................................................... 85

Anexo 6: Estandarización evaluación niveles de ROS y uso de

antioxidantes .............................................................................................................. 91

Anexo 7: Evaluación de mRNA PUMA por PCR convencional ................... 92

Anexo 8. Resumen gráfico metodología .......................................................... 94

13. Bibliografía........................................................................................................ 97

Contenido

Lista de Figuras

Figura A 1. Evaluación de la generación de ROS y de viabilidad en células HT29-WT................ 78

Figura A 2. Inmunohistoquímica en tejido de Glioblastoma para la inmunodetección de Pgp y

BCRP. ........................................................................................................................................... 80

Figura A 3. Curvas de Eficiencia qRT-PCR para los genes Beta-actina, BCRP (ABCG2), Pgp

(MDR1). ....................................................................................................................................... 81

Figura A4 Evaluación de la Viabilidad en células HT29-WT. ...................................................... 83

Figura A 5 Evaluación de los niveles de ROS células HT29-WT con E3330. ................................ 84

Figura A 6. Estandarización del uso de antioxidantes en células HT29-WT.. ............................. 91

Figura A 7. PCR Convencional para PUMA en células HT29-WT ................................................. 93

Figura A 8. Resumen gráfico de la metodología empleada para la evaluación de los objetivos

planteados en el proyecto. ......................................................................................................... 94

Lista de Tablas

Tabla 1. Secuencias de primers para los mRNA de proteínas ABC evaluadas por qRT-PCR ....... 22

Tabla 2. Concentraciones y cantidades de reactivos empleadas en la qRT-PCR ........................ 22

Tabla 3. Parámetros para la adquisición de imágenes por microscopía confocal ...................... 24

Tabla 4. Secuencias de primers para los mRNA de proteínas proapoptóticas evaluadas por qRT-

PCR .............................................................................................................................................. 26

Tabla 5. Anticuerpos primarios y secundarios seleccionados para la inmunicitoquímica y

detección por microscopía confocal de Pgp y BCRP. .................................................................. 34

Tablas Anexas

Tabla A 1 Anticuerpos primarios probados para la detección por IHC de Pgp y BCRP ............ 79

Tabla A 2 Análisis estadístico por t-Student para los niveles de ROS en células HT29-WT

evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina (Doxo), Cloruro de Cobalto

(Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en presencia del inhibidor E3330

(Doxo+E; Co+E; Doxo+Co+E). . .................................................................................................... 85

Tabla A 3 Análisis estadístico por t-Student para los niveles de ROS en células HT29-DxR

evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina (Doxo), Cloruro de Cobalto

(Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en presencia del inhibidor E3330

(Doxo+E; Co+E; Doxo+Co+E). ...................................................................................................... 86

Tabla A 4 Analisis estadístico por t-Student para los niveles del transportador Pgp en a) células

HT29-WT y b)HT29 DxR evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina

(Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en

presencia del inhibidor E3330 (E3330+Doxo;E3330+Co; E3330+Doxo+Co) ............................... 87

XVI contenido

Tabla A 5 Análisis estadístico por t-Student para los niveles del transportador BCRP en a) células

HT29-WT y b)HT29 DxR evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina

(Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en

presencia del inhibidor E3330 (E3330+Doxo;E3330+Co; E3330+Doxo+Co).. ............................. 88

Tabla A 6 Análisis estadístico por t-Student para los niveles del transportador Pgp en a) células

HT29-WT y b)HT29 DxR evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina

(Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en

presencia del antioxidante NAC (NAC+Doxo; NAC+Co; NAC+Doxo+Co). ................................... 89

Tabla A 7 Análisis estadístico por t-Student para los niveles del transportador BCRP en a) células

HT29-WT y b)HT29 DxR evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina

(Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en

presencia del antioxidante NAC (NAC+Doxo; NAC+Co; NAC+Doxo+Co). ................................... 90

Tabla A 8 Concentraciones y cantidades de reactivos empleadas en la PCR convencional ........ 92

Tabla A 9 Protocolo PCR convencional PUMA y B-Actina ........................................................... 93

Contenido

Lista de Símbolos y Ab reviaturas

5-FU 5-Fluoruracilo

5-FU/LV Fluoruracilo-Leucovorina

Ac-DEVD-AMC Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metilcumarina

AP-1 Activator Protein-1 (Proteína Activadora-1)

APE-1/Ref-1 Endonucleasa Apurínica apirímidinica/ Factor efector redox-1 (Apurinic apyrimidinic endonuclease redox effector factor-1)

ATCC American Type Culture Collection (colección americana de cultivos tipo)

ATP Adenosine triphosphate (adenosín trifosfato)

Bad Bcl-2-associated death promoter (promotor de muerte asociado con Bcl-2)

Bak Bcl-2 homologous antagonist killer (Proteína Destructora del Antagonista Homólogo bcl-2)

Bax Bcl-2-associated X protein (Proteína X asociada con Bcl-2)

Bcl-2 B-cell lymphoma-2 protein (proteína de linfoma de células B)

Bcl-XL B-cell lymphoma extra large (proteína extra grande de linfoma de células B)

BCRP/ ABCG2

Breast Cancer Resistance Protein (Proteína de Resistencia en Cáncer de mama)/ ATP-binding cassette sub-family G member 2 (miembro 2 de la sub-familia G de proteínas de unión a ATP)

BH3 BCL-2 Homology 3 Domain 3 (Dominio 3 de Homología BCL2)

Bid BH3 interacting-domain death agonist (proteína agonista de muerte de interacción por dominios BH3)

BSA Albumina sérica bovina

cDNA DNA complementario

CHAPS 3-[(3-Colamidopropil)- dimetilamonio]-propano sulfonato

CoCl2 Cloruro de Cobalto

CODDD C-terminal oxygen-dependent degradation domains (dominio C-terminal de degradación dependiente de oxígeno)

XVIII contenido

CRC cáncer colorrectal

CRE Elementos de respuesta a cAMP

CT Ciclo Umbral en qRT-PCR (Cycle Threshold)

CUL-2 Cullin-2

DAB Diaminobencidina

dATP Desoxiadenosina trifosfato

dCTP Deoxicitidina trifosfato

DEPC Detilpirocarbonato

DFO Deferroxamina

dGTP Deoxiguanosina trifosfato

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (Medio de Eagle modificado por Dulbecco)

DMSO Dimetilsulfóxido

DNA Desoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucléico)

DNA Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico)

dNTPs Desoxirribonucleótido trifosfato

Doxo Doxorrubicina

DTT Ditiotreitol

dUTP Deoxiuridina trifosfato

EDTA ácido etilendiaminotetraacético

EGFR receptor del factor de crecimiento epidermal

Ero1 Endoplasmic Reticulum oxidoreductase 1 (Oxidoreductasa 1 del Retículo endoplasmático)

Factor de Transcripción pVHL

Factor de transcripción von Hippel–Lindau

Contenido

GSH-GSSH Glutatión Reducido-Glutatión oxidado

GST Glutatión S-Transferasa

GST Glutatión S transferasa

H2DFCDA 5(6)-carboxi-2,7-diclorodihidrofluoresceína

H2O2 Peróxido de hidrógeno

H2O2 Peróxido de hidrógeno

HEK293T células embrionarias de riñón

HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-etanosulfónico (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)

HIF1α Hypoxia inducible factor 1α (Factor inducible por hipoxia 1α)

HIFs Hypoxia Inucible Factors (Factores inducibles por hipoxia)

HRE Hypoxia responsive Element

HRP Horseradish peroxidase (peroxidasa de rabano)

HT29 WT Línea celular de adenocarcinoma colorrectal fenotipo silvestre (Wild Type WT)

HT29 DxR Línea celular de adenocarcinoma colorrectal fenotipo resistente a Doxorrubicina (DxR)

IHC Inmunohistoquimica

KCL Cloruro de potasio

KRAS Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene Homolog

MCF7 Línea de Cáncer de Seno Michigan Cancer Foundation-7

MDR Multidrug Resistance (Resistencia Multidrogas)

MgCl2 Cloruro de Magnesio

MGMT la O6-Metilguanina-DNA metiltransferasa

mRNA Ácido Ribonucléico Mensajero

XX contenido

MRP Proteína asociada a resistencia multidroga MRP (Multidrug Resistance Protein)

Na3VO4 Ortovanadato de sodio

NAC N-Acetilcisteína

NADPH Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato

NFE2L2 Nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (factor 1 asociado al factor nuclear eritroide 2

NF-kB Factor Nuclear kB

NO Óxido nitrico

NODDD N-terminal oxygen-dependent degradation domains (dominio N-terminal de degradación dependiente de oxígeno)

O2 Molécula de oxígeno

O2- • Anión superóxido

Pb Pares de bases

PBS PhosphateSaline Buffer (Bufer fosfato salino)

PCR Polymerase Chain Reaction (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

PFA Paraformaldehído

PGP/MDR1 P-Glycoprotein (Glicoproteína-P) /Multidrug Resistance Protein 1 (Proteína de Resistencia a Multidrogas)

PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride (fluoruro de fenilmetilsulfonilo)

PTEN fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato 3-fosfatasa

PUMA p53 upregulated modulator of apoptosis (modulador de apoptosis sobre regulado por p53)

qRT-PCR Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR (PCR cuantitativa de transcripción inversa)

RIPA Radioimmunoprecipitation assay buffer

ROS Reactive Oxygen Species (Especies Reactivas de Oxígeno)

RNA Ribonucleic Acid (Ácido Ribonucléico)

Contenido

RNS Reactive Nitrogen Species (Especies Reactivas de Nitrógeno)

RNS Especies Reactivas de Nitrogeno (Reactive Nitrogen Species)

SOD Superóxido Dismutasa

TOP1 Gen que codifica para Topoisomerasa I

Topo IIα topoisomerasa IIα

TPB Tris-Phosphate Buffer (Búfer Tris-Fosfato)

Transportadores ABC

Transportadores de membrana dependientes de ATP

Tris-HCl Tris base-Ácido Clorhídrico

TrxSH Tioredoxina

UDG Uracil DNA glicosilasa

UV ultravioleta

VEGF Vascular endothelial growth factor (Factor de crecimiento endotelial vascular)

XXII contenido

Símbolos

°C Grados centígrados

µg Microgramos

µL Microlitros

µM Micromolar

µm Micrómetros

cm2 Centímetros cuadrados

G Gravedades

h Horas

kDa Kilodalton

min Minutos

mL Mililitros

mM Milimolar

pH Potencial de hidrógeno

rpm Revoluciones por minuto

U Unidades

Λ Longitud de onda

1

1. Introducción

El cáncer es un problema de salud a nivel mundial siendo actualmente una de las principales causas de muerte, estimándose que 14,1 millones de nuevos casos y 8,2 millones de muertes asociadas con cáncer ocurrieron en el año 20121. Se proyecta que para el año 2030 habrá 26 millones de nuevos casos de cáncer y cerca de 17 millones de muertes relacionadas con cáncer por año, considerando el afianzamiento de factores de riesgo modificables (tabaquismo, dieta occidental e inactividad física) y el crecimiento de la población mundial con mayor expectativa de vida2. Adicionalmente, se estima que cerca de un 85% de los casos de cáncer en humanos se asocian con tumores sólidos en donde el éxito de la terapia depende en gran medida de la eficiencia de la entrega del agente terapéutico a las células tumorales3. Sin embargo, la resistencia a la quimioterapia explicada por múltiples factores como un eflujo acelerado del fármaco, procesos de activación o inactivación del agente terapéutico, evasión de la apoptosis entre otros, se convierte en una limitante en el ataque a la enfermedad4.

Algunos de los agentes quimioterapéuticos comúnmente empleados en la actualidad tienen como característica la inducción de estrés oxidativo en los sistemas biológicos, favoreciendo la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) las cuales interactúan con lípidos, ácidos nucleicos y proteínas, interfiriendo así con las funciones celulares vitales5,6. Sin embargo, se sugiere que las ROS pueden regular la activación de algunos de los mecanismos empleados por las células tumorales para evadir la toxicidad asociada a la quimioterapia. Por ejemplo, inhibiendo la apoptosis o regulando la expresión de transportadores de membrana como Pgp que regulan el eflujo de fármacos desde el interior de la célula, lo cual se ha evidenciado en esferoides de tumores de próstata, células endoteliales de la barrera hematoencefálica, y células de carcinoma pulmonar y cervical7–

10. Sin embargo, se desconoce si dicha regulación se da en cáncer de colon.

Adicionalmente se ha evidenciado que en tumores sólidos existe una proporción importante de células hipóxicas que presentan alteraciones en su cinética de proliferación, en el ciclo celular y en diferentes vías de señalización; lo cual les confiere una resistencia relativa a la radioterapia y a ciertos agentes citotóxicos11. Los factores de trascripción inducibles por hipoxia HIF son los principales mediadores de la respuesta hipóxica, encontrándose sobre-regulados en diferentes tipos de cáncer en humanos, siendo HIF1 una de las isoformas que se ha asociado con la resistencia a quimioterapia12. Uno de los múltiples mecanismos que podrían explicar la relación del factor de transcripción HIF1α con la resistencia a quimioterapia es la modulación del eflujo de fármacos a través de la regulación de la expresión del gen de resistencia a multidrogas (MDR1), que codifica para el transportador de membrana Pgp el cual puede reducir la concentración intracelular de diferentes agentes

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quimioterapéuticos13. De forma similar se reporta que el gen ABCG2 que codifica para la proteína BCRP ampliamente descrita por su función en el desarrollo de resistencia multidrogas, es también regulada por el factor de transcripción HIF1α14. La disminución en la presión parcial de oxígeno o hipoxia se puede considerar también un modulador del estrés oxidativo, pues la disponibilidad de oxígeno también regula la tasa de transporte de electrones a nivel mitocondrial, produciendo cambios redox en los transportadores de electrones que incrementan la producción de ROS y el estrés oxidativo15,16.

Dentro de los mecanismos asociados a la respuesta al estrés oxidativo, se encuentra la endonucleasa humana APE-1/Ref-1, una enzima central involucrada en la reparación del daño en el DNA ocasionado por estrés oxidativo. Esta proteína nuclear endonucleasa apurínica/apirimidínica APE-1, está encargada de mantener el estado reducido de los factores de transcripción Fos y Jun, y promover la formación de la proteína activadora AP-1, la cual se ha detectado en mayores niveles en extractos nucleares de células de cáncer de colon expuestas a hipoxia17,18. Se ha evidenciado también elevación en los niveles de mRNA de APE-1 que ocurre tempranamente tras la inducción de hipoxia y es persistente hasta que se restaura la oxigenación del ambiente celular17. Esta endonucleasa además de su actividad en la reparación por escisión de bases del DNA, ha mostrado actividad como regulador transcripcional en la expresión génica; por ejemplo, a través de la regulación redox de la unión de diversos factores de transcripción al DNA incluyendo AP-1, HIF1α, p53, entre otros, y se ha evidenciado su función como regulador de la expresión de Pgp en células embrionarias de riñón HEK 293T sugiriéndose un posible papel en la regulación del desarrollo de resistencia a quimioterapia mediada por esta glicoproteína19–22 . Igualmente la función de APE-1 ha mostrado ser de gran importancia en la regulación de mecanismos que protegen a la célula tumoral del daño oxidativo, evidenciándose que las especies reactivas de oxígeno regulan su activación23.

Considerando la complejidad de los mecanismos que regulan el desarrollo de resistencia a quimioterapia, es de gran interés el estudio de la función del estrés oxidativo en la resistencia a multidrogas a partir del uso de fármacos como la Doxorrubicina en un ambiente hipóxico en células de cáncer de colon. Las ROS podrían favorecer alteraciones en el transporte de fármacos asociadas a la señalización a través de la endonucleasa APE-1 y la

activación de factores de transcripción como HIF1α.

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2. Planteamiento del Problema

Uno de los principales inconvenientes en el desarrollo de terapias efectivas en el tratamiento del cáncer, es la resistencia a la quimioterapia, la cual se ha evidenciado en diferentes tipos de tumores sólidos incluyendo cáncer de seno, ovario, pulmón, tracto gastrointestinal entre otros24. En cáncer de colon hay una alta tasa de resistencia a quimioterapia evidenciándose respuesta a la terapia sistémica solo en un 50% de los casos25.

La pobre efectividad de los esquemas de tratamiento actuales se ha asociado principalmente al desarrollo de la Resistencia Multidrogas o MDR (Multidrug Resistance) en la cual las células cancerosas se hacen resistentes a un amplio espectro de fármacos no relacionados estructuralmente y con diferentes mecanismos de acción4,26,27.

Los modelos de estudio in vitro de cáncer de colon, han permitido evaluar la asociación entre el desarrollo de quimioresistencia con la aparición del fenotipo MDR y la importancia de los transportadores ABC como Pgp en este proceso28,29. Considerando esto, las células de la línea HT29 de cáncer de colon humano se emplearon como modelo para el estudio de los factores asociados al desarrollo de MDR en respuesta al tratamiento con Doxorrubicina. Este fármaco es una antraciclina empleada en el tratamiento de diversos tipos de cáncer cuya característica principal es la generación de especies reactivas de oxígeno, hecho que podría estar involucrado en la resistencia asociada a su uso30.

Dentro de los factores relacionados con la resistencia a quimioterapia, se reconoce que el estrés oxidativo es un evento importante que contribuye con esta situación. Se ha demostrado que células resistentes a quimioterapia tienen una mayor expresión de enzimas antioxidantes como glutatión31. Algunos estudios indican que la sobreexpresión de factores como NFE2L2, que podrían reducir ROS, confiere resistencia a fármacos en células epiteliales de cáncer de pulmón y ovario 32. Igualmente, la disminución de la enzima antioxidante glutatión-S-transferasa (GST), induce apoptosis en células de cáncer de seno MCF733. Otro de los factores involucrados en la respuesta a estrés oxidativo durante la quimioterapia es la endonucleasa APE-1, que a través de su función reparadora del DNA y de su función redox, se ha asociado con el desarrollo de resistencia a multidrogas19,34. Recientemente, algunos investigadores han demostrado además que APE-1 puede traslocarse a nivel mitocondrial en la respuesta a estrés oxidativo en donde puede actuar como un mecanismo protector previniendo la apoptosis35. De esta manera, se ha demostrado que la regulación de los niveles de ROS podría ser uno de los mecanismos de resistencia a la quimioterapia adquirida en varios tipos de cáncer.

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La endonucleasa de mamíferos APE-1 es una proteína ubicua y multifuncional36. Además de su función reparadora, APE-1 tiene actividades regulatorias de transcripción únicas y aparentemente distintas. Es un activador reductivo de c-Jun in vitro de ahí que se conozca también como Ref-1 (redox effector factor-1)19. APE-1 es a menudo sobreexpresada en células tumorales y se ha demostrado que niveles alterados y una distribución intracelular no homogénea se presentan en varios tipos de cáncer37–39. Un alto nivel de expresión de APE-1 también se ha asociado con resistencia a quimio y radioterapia. Además, la desregulación de APE-1 induce a apoptosis y también sensibiliza a células de cáncer a la quimioterapia40.

En estudios previos se han evaluado diferentes formas de disminuir la resistencia a quimioterapia41, así mismo se han reconocido algunos factores que pueden estar asociados al mecanismo de acción de la MDR42. Es así como es de gran importancia evaluar el mecanismo de regulación de las ROS y su papel en el desarrollo de la resistencia a multidrogas en células de cáncer de colon. Entender estos procesos es de vital importancia para contribuir al desarrollo de futuras terapias a base de fármacos, debido a que la modulación de las ROS se podría considerar no solamente como un prerrequisito para el desarrollo del tumor, sino también una medida de la resistencia a fármacos y del fenotipo MDR. Sumado a esto, los niveles críticos de ROS podrían también ser utilizados como un marcador de la eficacia de los fármacos que determinaría el progreso de la respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer.

Considerando lo anterior se plantea resolver la pregunta: ¿qué efecto tiene el estrés oxidativo en la resistencia a multidrogas asociada con la expresión de las proteínas de Pgp y BCRP y en la alteración del proceso apoptótico?

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3. Justificación

El cáncer colorrectal (CRC) es una de las formas más comunes de cáncer, siendo el tercer tipo de cáncer con mayor incidencia a nivel mundial en hombres y el segundo en mujeres causando el 8,5% de las muertes asociadas con cáncer43. Aunque la tasa de mortalidad a nivel mundial ha disminuido, en regiones como Suramérica por sus recursos limitados, esta sigue en aumento; en Colombia es el cuarto tipo de cáncer de mayor incidencia (7,9%) y el tercero de mayor mortalidad (8,5%)1,43. Un 90% de adenocarcinomas son originados en las células epiteliales de la mucosa colorrectal 44, siendo el resultado de la acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas que favorecen el crecimiento clonal de las células que las adquieren, y la progresión a nivel morfológico y molecular45. Se describe que cerca de una cuarta parte de los pacientes con cáncer colorrectal, son incurables para el momento del diagnóstico y la mitad de los pacientes que se someten a cirugía potencialmente curativa podrían desarrollar metástasis46. Aunque la quimioterapia actual ha permitido una mejoría notoria en la supervivencia de estos pacientes, en los casos de CRC metastásicos la supervivencia es aproximadamente 20 meses y la mayoría de pacientes aún muere por causas relacionadas con esta condición47.

En dependencia de la agresividad del tumor y del ambiente tumoral, la respuesta a la quimioterapia y/o radioterapia es variable, debido al efecto propio de los fármacos y de la radiación dando lugar a lo que se conoce como la resistencia multidrogas o MDR. Esta puede darse a partir de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) que pueden estar involucradas en la resistencia a múltiples fármacos, a través de su efecto en la regulación de diferentes vías de señalización. Es así como el entendimiento de la regulación de las ROS y su función en el desarrollo de la MDR mediada por los transportares Pgp y BCRP, o a través de la inhibición del proceso apoptótico, así como también la propia respuesta al estrés oxidativo, podría ser de importancia para contribuir al desarrollo de futuras terapias.

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4. Objetivos

4.1 General

Establecer la relación entre el estrés oxidativo inducido y la resistencia a Doxorrubicina en la línea celular de cáncer de colon HT-29 en condiciones de normoxia e hipoxia química.

4.2 Específicos

4.2.1 Determinar el efecto de la Doxorrubicina y/o la hipoxia química en la generación de especies reactivas de oxígeno

4.2.2 Evaluar el efecto de las ROS en la actividad del factor de transcripción HIF-1 α

4.2.3 Establecer la relación entre la actividad de APE-1 y de HIF1α con la expresión de los transportadores Pgp y BCRP en respuesta al tratamiento con Doxorrubicina

4.2.4 Determinar el efecto de antioxidantes en la expresión de los transportadores Pgp y BCRP

4.2.5 Evaluar la relación entre el estrés oxidativo inducido por Doxorrubicina y/o hipoxia química y el proceso apoptótico

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5. Marco Teórico

5.1 Carcinoma colorrectal: características generales y tratamiento

El carcinoma colorrectal (CRC) es el resultado de la acumulación progresiva de alteraciones genéticas y epigenéticas que llevan a la transformación del epitelio colónico normal en adenocarcinoma de colon45. Este proceso de tumorigénesis colorrectal se ha denominado secuencia pólipo-carcinoma, en el cual la activación mutacional de oncogenes junto con la inactivación de supresores tumorales, tienen un papel fundamental en el desarrollo de CRC48.

En cuanto al tratamiento del cáncer colorrectal se describe que en etapas en las que la enfermedad se presenta a nivel local, se indica el manejo quirúrgico con la resección del segmento afectado del intestino junto con la eliminación de su drenaje linfático. Tras la resección primaria del tumor generalmente se recomienda la terapia adyuvante con el objetivo de reducir el riesgo de recaída y fallecimiento del paciente.49

En cuanto al tratamiento farmacológico el 5-Fluoruracilo es el agente de primera línea en CRC. Este actúa como inhibidor de la timidilato sintasa causando un daño letal en la síntesis y reparación del DNA50,51. El efecto citotóxico del 5-Fluoruracilo (5-FU) es potenciado por el aumento en los niveles intracelulares de folatos reducidos por lo cual se ha empleado en combinación con Leucovorina (LV, 5’-formiltetrahidrofolato) en CRC en estadio II y III, evidenciándose un beneficio significativo en la supervivencia de los pacientes con esta condición52–54. La Capecitabina, un profármaco del fluoruracilo que permite la administración oral, se ha usado en monoterapia en CRC estadio III con efectividad similar a la terapia 5-FU/LV55,56. Sin embargo, se presenta resistencia inherente o adquirida a estos agentes, considerando además que la efectividad del tratamiento es dependiente de los niveles y de la actividad de la timidilato sintasa57

Otra alternativa es la combinación de agentes citotóxicos como Oxaliplatino e Irinotecán que se administran junto con 5-FU/LV58. El Oxaliplatino es un derivado de diaminociclohexano platino que, una vez metabolizado, es capaz de inducir entrecruzamientos entre las hebras del DNA que impiden su adecuado procesamiento en la célula, evidenciándose eficacia en CRC en estadios I y III59,60. Sin embargo para las terapias con compuestos del tipo platino, hay una alta tasa de resistencia asociada a una baja captación celular del fármaco, deficiente formación de aductos en el DNA o alteraciones en genes de reparación61. Por otra parte, el Irinotecán actúa inhibiendo la

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topoisomerasa I, favoreciendo la formación de rupturas de doble cadena y la consecuente muerte celular62. El Irinotecán en combinación con 5-FU/LV aumenta significativamente la supervivencia global en comparación con la terapia estándar 5-FU/LV siendo altamente activo en cáncer colorrectal metastásico resistente a fluoruracilo 63,64. Sin embargo también se evidencia resistencia a Irinotecan asociada una captación reducida del fármaco o con una expresión disminuida de la Topoisomerasa I o mutaciones en el gen que la codifica (TOP1)65.

El uso de anticuerpos monoclonales contra blancos biológicos específicos incluyendo el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y el receptor del factor de crecimiento epidermal (EGFR), es una de las alternativas que ha tomado gran importancia en el tratamiento del cáncer de colon 52. Dentro de este grupo de medicamentos se encuentran el Bevacizumab (anticuerpo anti VEGF-A), el cual en estudios clínicos mostró un aumento en la supervivencia global respecto al tratamiento sin el anticuerpo monoclonal66. Sin embargo se describe que su uso puede llevar a la selección de las células tumorales que sobreviven en condición de hipoxia y los beneficios de su uso en CRC aún son limitados67. Por otra parte el Cetuximab y Panitunumab, actúan inhibiendo el receptor EGFR, modulando así la señalización y el crecimiento tumoral, permitiendo una mejoría significativa en la supervivencia global y en la supervivencia libre de progresión en comparación con terapia de soporte68,69. Sin embargo, el uso de estos compuestos en terapia combinada con la quimioterapia tradicional ha mostrado efectos adversos graves y su efectividad está limitada por mutaciones en el gen KRAS70,71.

La Doxorrubicina es una antraciclina empleada de forma rutinaria en el tratamiento de diferentes tipos de cáncer incluyendo cáncer de seno, de pulmón, gástrico, de ovario, de tiroides entre otros. Se han propuesto dos mecanismos para su acción anticancerígena 1) intercalándose en el DNA y generando disrupción de la reparación en el DNA mediada por la topoisomerasa II y 2) por generación de radicales libres principalmente especies reactivas de oxígeno que generan daño en las membranas celulares, proteínas y DNA30. Este agente exhibe un amplio espectro de actividad siendo uno de los fármacos más efectivos en el tratamiento de tumores sólidos, empleándose en el tratamiento de cáncer colorrectal; sin embargo, tiene como limitantes importantes en su uso el desarrollo de quimioresistencia asociada a Pgp y su cardiotoxicidad y riesgo de mielosupresión72,73.

5.2 Mecanismos de resistencia a medicamentos

Aunque la quimioterapia empleada ha logrado mejorar la supervivencia global y la supervivencia libre de enfermedad en cáncer de colon, la tasa de respuesta a las terapias sistémicas actuales es del 50% aproximadamente, desarrollándose resistencia en casi todos los pacientes25. Aunque hay algunos factores farmacológicos que pueden afectar la respuesta a la quimioterapia, los diferentes factores celulares tienen un papel principal en el desarrollo de quimioresistencia en células tumorales. La quimioresistencia puede manifestarse de forma intrínseca o adquirida, siendo una característica común en ambos casos el desarrollo de un fenotipo resistente a una variedad de agentes diferentes estructural y funcionalmente. La quimioresistencia es un fenómeno multifactorial que involucra diferentes mecanismos dentro de los que se encuentran los que se presentan a continuación74 .

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5.2.1 Resistencia multidrogas MDR (Multidrug Resistance): Eflujo de fármacos anti-cáncer - Transportadores ABC

Uno de los mecanismos de resistencia multidrogas más estudiados es la que involucra la reducción de la acumulación del fármaco, asociada a su eflujo desde el interior de la célula siendo las proteínas de la superfamilia de transportadores de membrana dependientes de ATP (ATP-Binding Cassette) quienes facilitan el eflujo del fármaco75. Esta superfamilia comprende un grupo de 49 proteínas de membrana distribuidas en 7 subfamilias diferentes que pueden traslocar una gran variedad de sustratos a través de membranas intra y extra celulares76. Los transportadores ABC se expresan de forma constitutiva no solo en células tumorales, sino también en células de la barrera hematoencefálica promoviendo una mayor protección al cerebro, con el fin de mantener su homeostasis. Así mismo estos transportadores han sido identificados en tejidos normales del intestino, cerebro, hígado, páncreas entre otros, y su función estaría relacionada con la absorción y secreción de sustancias endógenas y exógenas77.

Los transportadores ABC están conformados en general por 4 dominios: dos transmembranales TMD (Transmembrane Domains) embebidos en la membrana lipídica y dos de unión a nucleótido localizado en el citoplasma. Estos funcionan a través de diferentes cambios conformacionales dependientes de sustrato y de nucleótido que resultan en la translocación del sustrato a través de la membrana78(Figura 1).

Figura 1. Mecanismo básico de la función de los transportadores ABC. El ligando se une con una alta afinidad a los dominios transmembranales (TMD Transmembrane Domains), induciendo un cambio conformacional en los dominios de unión a nucleótido (NDB Nucleotide Binding Domain), aumentando su afinidad por el ATP. La energía liberada por la formación del dímero NBD cerrado causa un cambio conformacional en los TMD, lo que permite la extrusión del ligando (fármaco) fuera de la célula. La hidrólisis del ATP como consecuencia del cierre del dímero NBD, induce la separación del dímero resultando en posteriores cambios conformacionales en los TMD. Finalmente, la liberación de fosfatos y luego de ADP restablece el transportador a la conformación dímero abierto de NBD para comenzar nuevamente el ciclo. Adaptado de Linton KJ (2007) Structure and Function of ABC Transporters [Figura 5]. Physiology 22, 122-130)228 .

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Algunas de las proteínas de esta familia que están involucradas en el desarrollo de la MDR se describen a continuación.

5.2.2.1 Glicoproteína P Pgp (P-Glycoprotein)

Uno de los primeros transportadores para los cuales se evidenció que su sobreexpresión podría conferir un fenotipo de resistencia múltiple a medicamentos fue la glicoproteína P (Pgp), producto de la expresión del gen ABCB1 (o MDR1). Esta proteína comprende 12 subunidades transmembranales y participa en el eflujo una amplia gama de sustratos hidrofóbicos79. Se ha identificado su expresión en diferentes tejidos y cultivos de células humanas y de mamíferos evidenciándose mayores niveles en la superficie apical de células del intestino, conductos biliares del hígado y túbulos proximales del riñón, sugiriéndose el papel de esta proteína en la excreción de metabolitos endógenos y xenobióticos80.

Por otra parte, la sobreexpresión de MDR1 confiere una resistencia significativa a una amplia variedad de agentes quimioterapéuticos que incluyen taxanos (ej. Paclitaxel), alcaloides de la vinca (Ej. Vincristina), antraciclinas (Ej. Doxorrubicina) entre otros y se ha asociado con una disminución en la supervivencia y pobre pronóstico en diferentes tipos de cáncer81,82. El mecanismo por el cual Pgp combina la hidrólisis del ATP con el movimiento de fármacos a través de la membrana plasmática y los detalles de la interacción entre el sustrato y el transportador no han sido totalmente elucidados. Una de las teorías más aceptadas propone que Pgp reconoce compuestos hidrófobos incrustados en la cara interior de la membrana plasmática y los expulsa al exterior de la célula favoreciendo la formación de un gradiente de concentración a través de la membrana83. La inhibición de este transportador se ha planteado como alternativa terapéutica para modular la resistencia de las células cancerosas a la quimioterapia. Para tal fin se han empleado moléculas pequeñas sintéticas o de origen natural, anticuerpos monoclonales que se unen a porciones del transportador impidiendo el eflujo de fármacos, o estrategias que tienen como blanco la expresión de estos receptores lo cual ha permitido mejorar la biodisponibilidad del fármaco administrado84.

5.2.2.2 Proteína asociada a resistencia multidroga MRP (Multidrug Resistance Protein)

La familia de proteínas de membrana MRP incluye 13 miembros de los cuales 9 muestran capacidad de transporte de fármacos. MRP1 a MRP3 y MRP6 y MRP7 contienen tres dominios transmembranales, mientras que MRP4, MRP5, MRP8, y posiblemente MRP9 son más cortas, pues carecen del primer dominio transmembranal, sin embargo en todos los casos las proteínas poseen un ligando citoplasmático y dominios de unión a nucleótido85 Esta proteína es de gran importancia en la detoxificación de células cancerígenas a través del eflujo rápido de conjugados solubles en agua de fármacos citotóxicos y derivados reducidos por la glutatión S-reductasa (GSH). Además se ha reportado su sobreexpresión en células endoteliales de la membrana vascular, lo cual podría limitar la entrada de fármacos citotóxicos y prevenir que estos alcancen una concentración que pueda eliminar las células cancerígenas86,87

Se ha descrito el posible papel de MRPs en la formación de resistencia intrínseca o adquirida a fármacos en tumores. Las MRPs se expresan en células normales en donde cumplen funciones importantes en diferentes procesos celulares como el eflujo de intermediarios endógenos del metabolismo y en la protección frente a agentes tóxicos. Sin

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embargo, se ha evidenciado su sobreexpresión en diferentes tumores sólidos incluyendo el de seno, pulmón, próstata y en adenocarcinoma colorrectal por lo cual este transportador se ha implicado en el desarrollo de resistencia de múltiples tipos de cáncer. 88,89

5.2.2.3 Proteína de resistencia en cáncer de seno BCRP/ABCG2 (Breast cancer resistance protein)

La observación del eflujo de fármacos dependiente de ATP en células que no sobreexpresaban las proteínas Pgp o MRPs sugería la existencia de otras proteínas que pudieran llevar a cabo esta función. Esto fue evidenciado en células de cáncer de mama MCF-7 resistentes a quimioterapia que sobre expresaban una proteína novedosa de la subfamilia G de ABC que fue denominada BCRP90. El gen BCRP codifica para una proteína de 655 aminoácidos de 72 kDa con un dominio de unión a nucleótido y seis dominios transmembranales, que funciona como homodímero u homomultímero91. Su expresión ha sido detectada en tejidos normales encontrándose que los mayores niveles se dan en placenta, sincitiotrofoblasto, microvasos cerebrales, endotelio, vénulas, hígado, colon entre otros, sugiriendo que su función en tejidos normales es importante para la protección frente a agentes xenobióticos tóxicos. Además, se ha reportado que su actividad podría también afectar la farmacocinética de diferentes agentes anticancerígenos de administración oral como Irinotecán, Topotecán, derivados de Campotecina, Metotrexato entre otros90,92. Por otra parte se ha detectado su sobre expresión en tumores sólidos incluyendo el colon, de esófago , de endometrio, de pulmón y melanoma sugiriendo un papel importante de esta proteína en el desarrollo de quimioresistencia93. Se ha evidenciado que BCRP y Pgp comparten parcialmente la especificidad de sus sustratos lo cual puede llevar a un efecto sinérgico de estos transportadores limitando la penetración del fármaco a través de las barreras fisiológicas94.

5.2.2 Resistencia a Muerte celular

Otro mecanismo de quimioresistencia en cáncer está asociado a la desregulación de genes y proteínas que modulan el proceso de muerte celular programada o apoptosis. El tratamiento de cáncer por quimioterapia o radioterapia busca inducir la muerte de las células cancerosas, lo cual ocurre principalmente por apoptosis, sin embargo en una gran parte de los casos la terapia falla en la inducción de la activación del programa apoptótico derivándose de allí la resistencia a la terapia95. Se describe que la pérdida de función de p53, la regulación a la alta de proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 o Bcl-XL, la supresión de factores pro-apoptóticos como es el caso de la proteína Bax y la sobreexpresión del receptor factor de crecimiento epidérmico (EGFR), pueden alterar la respuesta apoptótica normal de la célula frente al daño en el DNA, favoreciendo la evasión del procesos de apoptosis luego de la quimioterapia96. Bajo condiciones que favorecen la supervivencia celular, las proteínas Bcl2 antiapoptóticas como Bcl-2 o Bcl-XL se unen e inhiben a las proteínas proapoptóticas Bak y Bax, inhibiendo así la vía intrínseca de apoptosis97. Por otra parte se sugiere que las proteínas pro-apoptóticas solo-BH3 (BCL-2 Homology 3 Domain 3 o Dominio 3 de Homología BCL2) como PUMA activan corriente abajo a las proteínas proapoptóticas Bak y Bax iniciando la liberación mitocondrial de factores apoptogénicos98. Los niveles de proteínas pro y antiapoptóticas tienen un papel crítico en la regulación de la apoptosis y se ha evidenciado una regulación a la alta de las proteínas pro-supervivencia y

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regulación a la baja de Bax en glioblastoma recurrente de forma independiente del tratamiento99. Igualmente en cáncer colorrectal se ha evidenciado una mayor expresión de Bcl-XL en comparación con el tejido sano circundante, sugiriéndose una función importante de estas proteínas en el desarrollo de resistencia, además se ha evidenciado su importancia en la invasividad y potencial metastásico de las células de cáncer de colon100,101.

5.3 Estrés oxidativo, hipoxia y mecanismos de resistencia a quimioterapia

La regulación de la homeostasis redox es un proceso fundamental para el mantenimiento de las funciones celulares normales y garantizar la supervivencia celular. Las células cancerosas se caracterizan por un aumento en la glicólisis aeróbica (Efecto Warburg) y altos niveles de estrés oxidativo. Dicho estrés se define como el desbalance entre los niveles de oxidantes y antioxidantes, ejercido por las especies reactivas de oxígeno ROS entre otras. Estas especies reactivas pueden actuar como moléculas de señalización en procesos de proliferación y diferenciación o a altas dosis inducir daño a componentes celulares como DNA, lípidos y proteínas 102,103.

Se ha propuesto que las ROS y de manera similar las especies reactivas de nitrógeno RNS (Reactive Nitrogen Species) podrían tener un papel fundamental en el desarrollo de cáncer a través de diferentes mecanismos que incluyen: 1) Inducción de daño estructural en el DNA, generando mutaciones o alteraciones cromosómicas que podrían estar involucradas en la alteración de la expresión de proto-oncogenes o genes supresores tumorales, que ocurren durante la promoción y progresión del tumor, permitiendo la expresión del fenotipo mutante104; 2) Alteración de vías de señalización citoplasmáticas y nucleares; 3) Modulación de la actividad de genes y proteínas que responden a estrés y regulan procesos de proliferación, diferenciación y apoptosis105.

Las ROS son moléculas derivadas del oxígeno (O2) que pueden oxidar otras moléculas, y

pueden estar en forma de radicales libres (O2- •: anión superóxido) o como peróxido de

hidrogeno (H2O2) tras conversión del radical por la superóxido dismutasa (SOD) 106. Los

radicales principales que se encuentran a nivel intracelular son el superóxido (O2- •)

producido por una reducción incompleta del oxígeno en sistemas de transporte de electrones o como producto de sistemas enzimáticos específicos, y el óxido nítrico (NO) generado por enzimas óxido nítrico sintasas. El superóxido y el NO son altamente reactivos y pueden conformar ROS o RNS.107

En células de mamífero se han identificado diferentes fuentes de ROS incluyendo: 1) La mitocondria, en donde se han identificado siete sitios de producción de superóxido, siendo los de mayor capacidad los sitios de unión a ubiquinona en los complejos enzimáticos I y III de la cadena de transporte de electrones108; 2) El retículo endoplásmico (principalmente el citocromo P450, enzimas b5, diamino oxidasa y Ero1); 3) Los peroxisomas, principalmente por oxidación de ácidos grasos, D-amino oxidasa ácida, L-2 hidroxiácido oxidasa y urato oxidasa; 4) El citosol, relacionadas con óxido nítrico sintasa, lipooxigenasa; y 5) La membrana plasmática (por NADPH (Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) oxidasas, lipooxigenasas) y el espacio extracelular (xantina oxidasa) 109.

A nivel mitocondrial la principal especie reactiva que se genera es el anión superóxido como resultado de la reducción monoelectrónica del O2

en la cadena de transporte de electrones.

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Este es dismutado por la superóxido dismutasa en H2O2 y puede difundir dentro de la célula, en donde es removido a nivel citosólico por sistemas antioxidantes como catalasas, glutatión peroxidasas o tioredoxin peroxidasas.110

5.3.1 Quimioterapia y estrés oxidativo

Se ha descrito que varios agentes quimioterapéuticos pueden inducir un aumento en el estrés oxidativo a través del incremento en la producción de ROS, siendo aquellos que generan altos niveles de estas especies las antraciclinas (Doxorrubicina), agentes alquilantes, complejos de coordinación de platino (Cisplatino), epipodofilotoxinas (Etopósido) y campotecinas (Topotecán) 111. Durante la apoptosis inducida por quimioterapia en células cancerosas, la cual involucra la liberación del Citocromo C de la mitocondria, la NADPH deshidrogenasa y la Coenzima Q reducida, redireccionan los electrones del sistema de transporte de electrones hacia el oxígeno resultando en la formación de radicales superóxido 112. Adicionalmente, el estrés oxidativo inducido por fármacos puede darse a través de diferentes vías enzimáticas relacionadas con el sistema microsomal monooxigenasa, xantina oxidasa, reacciones de Fenton y Haber Weiss, entre otros, con lo cual se espera la inducción de procesos citotóxicos que generen la muerte o la inhibición en la proliferación de las células tumorales113.

5.3.2 Hipoxia, estrés oxidativo y quimioresistencia

La disminución en la presión parcial de oxígeno o hipoxia se ha relacionado también con el estrés oxidativo. En condición de hipoxia hay una reducción de la tasa de transporte de electrones mitocondrial, produciendo cambios redox en los transportadores de electrones que incrementan la producción de ROS 15,16. Cuando los mecanismos celulares de defensa antioxidante son insuficientes para inactivar ROS, se genera una condición de estrés oxidativo que genera daño en lípidos, proteínas, azúcares y ácidos nucleicos alterando diferentes funciones celulares103,114. Esto es de particular importancia en tumores sólidos considerando que una de las características principales de estos, y de su microambiente, es la aparición de regiones hipóxicas que se han asociado con un peor pronóstico de los pacientes en los que se encuentran, y podrían estar relacionadas con la resistencia a quimioterapia y radiación. Se describe que la hipoxia podría promover el fenotipo maligno de las células cancerígenas, aumentar la tasa de mutación y la expresión de genes asociados con angiogénesis, lo cual puede asociarse con la resistencia a la quimioterapia y a la radiación115.

Adicionalmente, se ha sugerido en diferentes estudios que las ROS podrían tener también algún efecto sobre la regulación de la actividad del factor inducible por hipoxia (HIF1α), el cual es uno de los factores de transcripción principales en la señalización celular en condición de hipoxia15,116,117. Se ha evidenciado que altos niveles de ROS en condición de normoxia podrían incrementar la actividad de HIF1α, mientras que en hipoxia el efecto de ROS aún es tema de controversia pues algunos autores sugieren que estas favorecerían la degradación de HIF1α, mientras que otros plantean una regulación a la alta de la expresión del factor de transcripción a través de las ROS118,119.

Algunos de los mecanismos que explican el papel de la hipoxia en la a quimioterapia en cáncer, incluyen la dependencia de muchos agentes quimioterapéuticos de formar radicales libres derivados del oxígeno y la inducción de factores inducibles por hipoxia HIFs (hypoxia- inducible factors), los cuales regulan la expresión de diversos genes involucrados en la

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tumorigénesis120. Por otra parte, se ha descrito que en condición de hipoxia en células de cáncer de colon hay una regulación a la baja en la expresión de las proteínas proapoptóticas Bid y Bad, siendo el factor inducible por hipoxia necesario para la regulación de Bid. Adicionalmente, se ha reportado una disminución en la apoptosis inducida por quimioterapia, lo cual sugiere que HIF1α podría ser uno de los reguladores del desarrollo de quimioresistencia en condición de hipoxia en células de cáncer121.

5.3.2.1 Factores inducibles por Hipoxia (HIFs)

Los factores inducibles por hipoxia son factores de transcripción que se unen al DNA y se asocian con diversos cofactores. Bajo condiciones de hipoxia dichos factores transactivan un gran número de genes induciendo varias respuestas adaptativas frente a la baja tensión de oxígeno122. HIF-1 es un heterodímero compuesto por las subunidades HIF1α y HIF1β, siendo la expresión de HIF1α inducible por hipoxia de forma exponencial en células expuestas a saturaciones de oxígeno inferiores al 6% 123. El dímero HIF1α/β estabilizado, se une a los elementos de respuesta a hipoxia HRE (Hypoxia Response Elements) que contienen la secuencia consenso 5’-[A/G]CGTG-3’ en el DNA, ubicadas en el promotor de diferentes genes que son blancos transcripcionales de HIF1.122

En condiciones de normoxia, la enzima prolilhidroxilasa hidroxila los dominios Nitrógeno y Carbono terminales de degradación dependiente de oxígeno (NODDD y CODDD) de HIF1α, lo cual hace a este factor de transcripción más afín al supresor tumoral de von Hippel–Lindau (pVHL). Posteriormente, HIF1α es rápidamente degrada vía proteasoma tras su reconocimiento por parte del complejo formado por múltiples proteínas (pVHL–elonginaB–elonginaC–Cullin2–RING box), que dirige a las subunidades HIF1α a proteólisis por la vía Ubiquitina-proteasoma124. Las prolilhidroxilasas requieren oxígeno para su actividad catalítica por lo cual, en condiciones de hipoxia, se impide la prolilhidroxilación de HIF1α. Esto permite que HIF1α escape del reconocimiento por parte del complejo pVHL ubiquitin-ligasa y se acumule en el núcleo. En su forma estable HIF1α se dimeriza con HIF1β. Este heterodímero se une a la secuencia HRE en su gen blanco e interactúa con diferentes coactivadores transcripcionales, transactivando un grupo de genes específicos que regulan la respuesta adaptativa a hipoxia, incluyendo algunos de gran importancia en procesos como la eritropoyesis, angiogénesis, metabolismo de glucosa, apoptosis y proliferación celular122,125. Algunos metales conocidos como agentes miméticos de hipoxia (como cloruro de cobalto CoCl2 y Deferroxamina DFO), se unen específicamente a las prolilhidroxilasas que tienen un centro de unión a hierro crítico para su actividad enzimática. Estos agentes miméticos pueden remplazar el hierro en su centro de unión en la enzima por ejemplo con Cobalto inactivando la hidroxilación de HIF1α126

La expresión de HIF1α se ha detectado en la mayoría de tumores sólidos examinados, incluyendo tumores cerebrales, de vejiga, seno, colon, ovario, próstata entre otros, mientras que la expresión el factor de transcripción en el tejido normal o en tumores benignos no fue detectada127. Adicionalmente, la expresión de HIF se puede ver afectada por otros mecanismos incluyendo la activación de oncogenes como EGFR y la pérdida de la función de supresores tumorales (p53, PTEN)128

Una gran variedad de genes sensibles a hipoxia, esenciales para la homeostasis intracelular, local y sistémica, están sobre expresados, siendo la condición de hipoxia y por tanto la actividad de HIF regulada en procesos de metástasis, recurrencia tumoral, resistencia a quimioterapia y radioterapia129. Adicionalmente, se ha reportado que en

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condiciones de hipoxia, HIF1α es uno de los principales reguladores de la expresión de ABCB1 y de la función de Pgp, sugiriendo un posible papel de este factor de transcripción en el desarrollo de resistencia a quimioterapia en cáncer13.

5.3.3 Respuesta celular al estrés oxidativo

Aunque el peróxido de hidrógeno y el óxido nítrico son mediadores importantes de procesos celulares, altos niveles de estas o de especies más reactivas como el radical hidroxilo y peroxinitrito pueden dañar componentes celulares y llevar a la muerte celular. Por tal motivo, la célula ha desarrollado mecanismos antioxidantes enzimáticos o no enzimáticos que pueden remover estas especies oxidativas. Los mecanismos antioxidantes no enzimáticos incluyen amortiguadores celulares como ácido ascórbico, glutatión (GSH), tocoferol, flavonoides y carotenoides130.

5.3.3.1 Sistema glutatión oxidado/reducido

El Glutatión (GSH) y su aparato enzimático relacionado, funcionan como un sistema de detoxificación efectivo de importancia en la protección de las células frente al daño inducido por radicales libres y se plantea que podrían influenciar la respuesta a terapias adyuvantes en cáncer31. El Glutatión es un tripéptido (γ-L-glutamil-L-cisteinil-glicina) que puede presentarse en sus formas tiol-reducida (GSH) y disulfuro oxidada (GSSG), siendo la forma GSH la predominante encontrándose un 90% en el citosol y un 10% en la mitocondria, funcionando como agente detoxificador de xenobióticos y/o sus metabolitos131.

Este sistema detoxifíca un amplio número de sustancias lo que podría ser problemático en el caso de agentes alquilantes. Una característica común dentro de sus sustratos es la naturaleza electrofílica de sus dominios citotóxicos, que les permite interaccionar con el grupo tiol de la forma reducida de GSH de manera espontánea, formando compuestos menos tóxicos y solubles en agua132. Se describe que muchos tumores, incluyendo de seno, vejiga, pulmón y colorrectal han mostrado niveles aumentados de GSH, GST (Glutatión S transferasas) o enzimas relacionadas en comparación con tejidos normales, lo cual podría funcionar como un mecanismo de defensa frente al estrés oxidativo y químico133.

5.3.3.2 ROS y señalización celular

Se ha descrito que uno de los efectos de la presencia de las ROS en el ambiente tumoral estaría relacionado con la regulación de la expresión de proteínas asociadas al fenotipo de resistencia múltiple en cáncer. Dentro de estas se reporta que las ROS podrían regular la expresión de Pgp de una forma dosis dependiente en donde bajas concentraciones de ROS regulan a la baja la expresión de Pgp; mientras que altas concentraciones de estas especies, resultan en un aumento en los niveles de la proteína134. Igualmente se ha evidenciado que el estrés transitorio y crónico pueden regular a la alta la expresión de Pgp en células endoteliales de microvasos de cerebro de ratón135.

Por otra parte, dentro de los mecanismos de regulación redox se encuentran aquellos relacionados con la función de proteínas que involucra la oxidación y reducción de residuos cisteína, lo cual implica la regulación de la actividad transcripcional de diferentes proteínas,

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específicamente factores de transcripción cuya unión al DNA parece ser redox-regulada a través de la oxidoreducción de residuos cisteína críticos en los dominios de unión al DNA.113.

5.3.3.3 Endonucleasa APE-1 y factor de transcripción AP-1

Uno de los moduladores redox de gran interés en el estudio de la respuesta celular al estrés oxidativo es la enzima factor efector redox -1 (Redox Factor Ref-1), también denominada APE-1, HAP1, o APEX1. Esta molécula tiene dos funciones enzimáticas distintas: 1) En su región C-terminal funciona como una enzima de reparación del DNA, que involucra la reparación de nucleótidos apurínicos/apirimidínicos (AP) requerida tras la exposición a radiaciones ionizantes, ROS o radiación Ultravioleta (UV); 2) En su región N-terminal contiene la secuencia de localización nuclear y un dominio regulatorio redox, en el cual los residuos de cisteína se encargan de la modificación redox-dependiente de factores de transcripción como la proteína activadora AP-1, el factor nuclear kB (NF-kB), p53, HIF1α entre otros 136,137. Se han evidenciado alteraciones en la distribución subcelular de APE-1 en el tejido tumoral respecto al tejido normal por ejemplo en carcinoma colorrectal. En la mucosa colorrectal normal la localización nuclear de la endonucleasa es predominante en las células menos diferenciadas, mientras que células más diferenciadas del epitelio colónico superficial presentan localización citoplasmática de APE-1. Sin embargo, el proceso de tumorigénesis altera dicha distribución, evidenciándose en adenomas y carcinomas que la localización puede ser nuclear o citoplasmática con predominancia de esta última.138 Igualmente, el aumento en la expresión de APE-1 se ha evidenciado en distintos tipos de cáncer incluyendo de seno, cervical, de colon, glioma, pulmón y ovario asociándose su sobreexpresión y localización a nivel plasmático con un peor pronóstico139,140. Por otra parte, la inhibición de APE-1 en células de melanoma y glioma, ha permitido potenciar el efecto de agentes citotóxicos como temozolomida, haciendo de APE-1 un blanco atractivo para el desarrollo de terapias anticáncer en los casos de resistencia múltiple141.

Uno de los factores de transcripción activados por la endonucleasa humana APE-1 es AP-1. Este es un factor de transcripción dimérico que contiene miembros de las familias JUN, FOS, ATF y MAF en diferentes combinaciones que se unen a los elementos de respuesta 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) o elementos de respuesta a cAMP (CRE) en sus genes blanco142,143. Los miembros de esta familia tienen un dominio conservado de tipo cremallera de leucina el cual es responsable de la dimerización, la cual es requisito para su unión al DNA. La actividad de AP-1 es regulada por diferentes tipos de estímulos que incluyen citoquinas, factores de crecimiento, señales de estrés y estímulos oncogénicos que pueden generar cambios en la expresión de las subunidades de AP-1, pueden controlar la estabilidad de su mRNA, generar alteraciones a nivel post-traduccional o favorecer interacciones específicas con otros factores de transcripción y cofactores144,145.

Para el factor de transcripción AP-1 se describe que su unión al DNA ocurre solo si sus residuos cisteína (154 en fos y 272 en Jun) están en su forma reducida sugiriendo un papel del estado redox celular en la regulación de la actividad de este factor de transcripción 146. Por otra parte, su actividad se ha asociado con funciones a nivel del ciclo celular, diferenciación, apoptosis y oncogénesis, evidenciándose que los genes de c-jun y c-fos son activados retroviralmente y poseen potencial oncogénico, y que las proteínas c-jun y c-fos relacionadas son requeridas para la transformación oncogénica inducida por las proteínas Ras constitutivamente activas147. Por ejemplo, se ha evidenciado una mayor expresión de

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c-Jun y JunB, componentes esenciales del factor de transcripción AP-1, en tumores colorrectales en comparación con el epitelio normal, sugiriendo que estas proteínas tendrían una función importante en la regulación del crecimiento del epitelio colónico y la tumorigénesis colorrectal148.

Dentro de las funciones de AP-1 se ha propuesto su papel en la regulación de diferentes proteínas transportadoras de fármacos, considerando que su actividad se ha visto incrementada en líneas celulares resistentes a quimioterapia149,150. Se ha reportado que el promotor de Pgp en humanos tiene sitios de unión para AP-1, el cual tendría un función en la activación transcripcional de este transportador ABC, evidenciándose además que células transfectadas con c-Jun presentan mayores niveles de expresión del RNA de MDR1 y de la proteína Pgp79.

Por otra parte, se ha evidenciado que en condición de hipoxia hay una inducción de la unión de AP-1 a sus genes blanco y un aumento en la expresión de c-Jun y Jun B 151. Como se explicó anteriormente, HIF1α es el factor de transcripción regulador de la respuesta a hipoxia y se reporta que podría también estar involucrado en la regulación de la expresión de AP-1 152. Adicionalmente, se reporta que AP-1 podría potenciar la actividad transcripcional inducida por HIF1α, sugiriendo la cooperación de estos dos factores de transcripción en condiciones de hipoxia. Sin embargo, se desconoce si esto ocurre en la regulación de la expresión de Pgp y si las ROS y/o APE-1 podrían tener alguna función en

esta posible relación de cooperación153,154.

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6. Metodología

6.1 Mantenimiento de los cultivos celulares

Para este estudio se utilizó la línea celular HT29 de adenocarcinoma colorrectal (American Type Culture Collection ATCC® HTB38™) establecida a partir de un tumor primario de colon humano y que posee morfología epitelial. A partir de esta línea celular se generó la línea HT29 Resistente a Doxorrubicina (HT29-DxR) que fue suministrada por el Departamento de Oncología de la Universidad de Turín. Esta línea fue generada cultivando las células HT29 de fentotipo silvestre (HT29-WT) con medio de cultivo suplementado con Doxorrubicina en concentración de 68 nmol/L de acuerdo al protocolo previamente publicado por Riganti y col155.

Las células se cultivaron en medio mínimo esencial de Eagle modificado de Dulbecco DMEM (Gibco®), suplementado con suero fetal bovino al 10% (Gibco®) y antibiótico antimicótico (Gibco®) a una temperatura de 37°C y con una atmosfera de CO2 al 5%. Se realizaron cambios del medio cada tercer día y el cultivo se mantuvo hasta una confluencia máxima del 80% de acuerdo con la recomendación del fabricante. Para separar las células adheridas, estas se lavaron 3 veces con solución de Buffer Fosfato salino (PBS) (pH: 7,2) y fueron desprendidas mediante tripsinización con 1 mL de solución tripsina-EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético; 0.025%-0.03% v/v respectivamente) durante 5 minutos en incubadora a 370C. La metodología se describe a continuación de acuerdo con los objetivos específicos propuestos.

Objetivo específico 1: Determinar el efecto de la Doxorrubicina y/o la hipoxia química en la generación de especies reactivas de oxígeno

6.2 Modelos experimentales de tratamiento para la Inducción de estrés oxidativo y/o hipoxia química

Las células HT29-WT y HT29-DxR fueron sometidas a diferentes condiciones de estrés oxidativo y/o hipoxia para estudiar el efecto de las mismas sobre la producción de ROS y la regulación de la vía de señalización APE-1-HIF1α- Pgp/BCRP. Para tal fin, posterior a 24 horas de la siembra de las células, el medio de cultivo para todas las condiciones fue cambiado por medio que contenía los reactivos de acuerdo a la condición experimental. Las células fueron tratadas por diferentes tiempos con Peróxido de Hidrógeno (H2O2) 200 µM

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146, Cloruro de Cobalto (CoCl2) 100 µM 156,157 para la inducción de hipoxia química,

Doxorrubicina (Doxo) 5 µM 158, o la combinación Cloruro de Cobalto y Doxorrubicina en las

mismas concentraciones que en los tratamientos individuales.

6.3 Evaluación de la generación de Especies Reactivas de Oxígeno (ROS)

Para determinar el efecto de las diferentes condiciones de estrés oxidativo sobre la producción celular de ROS se empleó el marcador fluorogénico diacetato de 5(6)-carboxi-2,7-diclorodihidrofluoresceína (H2DFCDA) Image-iT™ LIVE Green ROS Detection (Invitrogen)159. Brevemente 100.000 células/cm2 se cultivaron en cajas de cultivo de 96 pozos con 200 µL de medio (Corning Costar®) y 24 horas después se iniciaron los tratamientos de acuerdo a la condición a evaluar. Una vez cumplido el tiempo de tratamiento se retiró el medio y se realizaron 3 lavados con 100 µL de PBS. Posteriormente se adicionó la sonda H2DFCDA en concentración 10 µM diluida en PBS y se incubaron las células por 30 minutos a 37°C con este agente. Se retiró la sonda y se hicieron 2 lavados con PBS frío posterior a lo cual se adicionaron 100 µL de buffer de lisis RIPA (Radioimmunoprecipitation assay buffer) que contenía: Tris-HCl (Tris base-Ácido Clorhídrico) pH 7,4 50mM, EDTA 5 mM, Tritón X-100 0,5%, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), Na3VO4 (Ortovanadato de sodio) y cocktail inhibidor de proteasas (Bio-Rad®). Se permitió la lisis por 5 minutos en frío posterior a lo cual se adicionaron 150 µL de PBS frío resuspendiendo varias veces. La caja de 96 pozos fue centrifugada a 2000 rpm por 5 minutos posterior a lo cual se tomaron 200 µL de sobrenadante que fueron transferidos a una caja oscura para lectura de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia media se determinó en el Equipo lector de multiplacas de lectura multi-modo Cytation 3 Imagine Reader (BioTek®) (λexcitación: 360 nm /λemisión: 460 nm).

Los resultados de fluorescencia obtenidos fueron normalizados por microgramo (µg) de proteína, empleando para su cuantificación el método del ácido bicinconínico (BCA) con el kit Pierce™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Brevemente a 25 µL del extracto proteico o del blanco (PBS y búfer de lisis) se adicionaron 200 µL de solución de trabajo (50 partes de reactivo A (carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, ácido bicinconínico y tartrato de sodio en hidróxido de sodio 0,1 M) y 1 parte de reactivo B (Sulfato cúprico 4%). Esta mezcla fue incubada por 30 min a 37°C en placa de 96 pozos. Posteriormente se realizó la lectura de absorbancia en el Equipo lector de multiplacas de lectura multi-modo Cytation 3 Imagine Reader (BioTek®) (λabsorbancia: 562 nm) y la concentración de proteína se

determinó empleando una curva de calibración construida con concentraciones conocidas de albumina sérica bovina.

6.4 Viabilidad celular por azul de Tripán Para la determinación de la viabilidad celular en las diferentes condiciones de tratamiento se empleó el método de exclusión de Azul de Tripán. Se preparó una dilución 1:5 de la suspensión celular en la solución de Azul de Tripán y se mezcló por pipeteo. Posteriormente se tomó una alícuota de la mezcla que fue colocada en cámara de Neubauer para la realización del conteo de células viables (no coloreadas) y células no viables (coloreadas en azul) con lo cual se calculó el porcentaje de células viables de acuerdo a la siguiente ecuación:

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𝐶é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 (%) =𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑖𝑙𝑖𝑙𝑖𝑡𝑟𝑜 (𝑚𝐿) 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑖𝑐𝑢𝑜𝑡𝑎

𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑖𝑐𝑢𝑜𝑡𝑎𝑥100

Objetivo específico 2: Evaluar el efecto de las ROS en la actividad del factor de

transcripción HIF-1 α

6.5 Evaluación de la activación de HIF1α

Las proteínas nucleares se extrajeron empleando el kit para extracción nuclear (Active Motif) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente tras los tratamientos establecidos, se retiró el medio de cultivo, se realizó un lavado con PBS frío suplementado con inhibidor de fosfatasas y se adicionaron 3 mL de este PBS a la caja del cultivo en frío en el cual se retiraron las células por raspado. La suspensión de células fue centrifugada a 2000 rpm a 4°C y el pellet fue resuspendido por pipeteo en búfer hipotónico y transferido a eppendorf de 1,5 mL en hielo, en donde se mezcló la suspensión en vórtex y se incubó por 25 minutos en hielo. Posteriormente se adicionaron 25 µL de detergente y se mezcló por vórtex 10 s, tras lo cual la suspensión se centrifugó a 14000 rpm por 1 min y el sobrenadante fue retirado y almacenado a -80°C (extracto citoplasmático). El pellet fue resuspendido en búfer de lisis (suplementado con DTT a una concentración final de 1 mM) y se adicionaron 2,5 µL más de detergente. Esta suspensión se incubó por 30 minutos en plataforma de agitación a 150 rpm posterior a lo cual se centrifugó a 14000 rpm por 10 minutos y el sobrenadante (extracto nuclear) fue alicuotado y almacenado a -80°C para los ensayos posteriores.

La actividad de HIF-1 se evaluó a partir de 20 μg de proteína de extracto nuclear con el kit TransAM™ HIF-1 Transcription Factor Assay Kit. Para tal fin los 20 μg de extracto nuclear fueron diluidos en búfer de lisis (Trans AM™ búfer de lisis, con DTT 1 mM y coctel inhibidor de proteasas) hasta un volumen de 10 µL. Se adicionaron 40 µL de buffer de unión (Buffer AM4 y DTT 1mM) y los 10 µL del extracto nuclear a los pozos previamente recubiertos con oligonucleótido que contiene el elemento de respuesta a hipoxia (Hypoxia responsive element HRE). Esta mezcla fue incubada por 1h en agitación a 100 rpm. Posteriormente se realizaron 3 lavados con buffer de lavado 1x y se adicionó el anticuerpo anti-HIF1 (dilución 1:500) con incubación por 1h en agitación. Tras los respectivos lavados se realizó la incubación con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano HRP (Horseradish peroxidase) (dilución 1:1000) por 1h posterior a lo cual se realizaron lavados y se incubaron los pozos con la solución de coloración por 10 minutos, posterior a lo cual se adicionó la solución de detención de la reacción. La lectura de absorbancia se realizó a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm160.

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Objetivo específico 3: Establecer la relación entre la actividad de APE-1 y de

HIF1α con la expresión de los transportadores Pgp y BCRP

6.6 Modelo experimental de tratamiento para la inhibición de

la actividad redox de APE-1

Con el objetivo de evaluar la función de la actividad redox de APE-1 sobre la expresión del transportador ABC Pgp, se empleó el inhibidor de APE-1 E3330 (Sigma-Aldrich®) que fue reconstituido en DMSO obteniendo un stock de concentración final 1000 µM y se usó de acuerdo a lo reportado en la literatura161. Las células fueron incubadas con E3330 (10 µmol/L) por diferentes tiempos de tratamiento en presencia o no de los estímulos previamente descritos para las diferentes condiciones de estrés oxidativo y/o hipoxia. En las células tratadas con DMSO no se evidenciaron cambios significativos en los niveles de ROS respecto a las células no tratadas.

6.7 qRT-PCR para la evaluación del mRNA de proteínas ABC Pgp y BCRP

Tras los tratamientos para cada condición a evaluar se realizó la extracción de RNA. Para tal fin, se adicionó 1 mL de TRIzol® (Life Technologies) retirando las células adheridas por resuspensión con este agente y se transfirió la suspensión obtenida a un tubo eppendorf de 1,5 mL libre de ribonucleasas. Posteriormente se adicionaron 200 µL de cloroformo con agitación por inversión e incubación por 3 min a temperatura ambiente tras lo cual se centrifugó la mezcla a 12000 g a 4°C por 15 min (Centrífuga Sigma 1-15K). El sobrenadante (Fase acuosa) fue transferido a un eppendorf de 1,5 mL libre de ribonucleasas en donde se realizó la precipitación del RNA con 500 µL de isopropanol frío con incubación por 10 minutos. Posteriormente se centrifugó la mezcla a 12000 g por 10 minutos a 4°C, se descartó el sobrenadante y el pellet fue lavado con etanol al 75% libre de ribonucleasas siendo posteriormente centrifugado a 12000 g por 5 min a 4°C. Se descartó el sobrenadante y el pellet fue resuspendido en 50 µL de agua calidad biología molecular (95284 Sigma-Aldrich®). El RNA fue cuantificado en el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (ThermoFisher Scientific®) y la relación de absorbancias 260/280 fue empleada para analizar la calidad del RNA extraído. La integridad del RNA fue verificada por electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y posteriormente se prepararon diluciones de concentración 500 ng/ µL que se almacenaron a -80°C para su uso posterior.

Previo a la síntesis de cDNA el RNA extraído fue tratado con DNAse I (Invitrogen®) para la eliminación del DNA genómico. Para tal fin a 1000 ng (2 µL de 500 ng/µL) de RNA extraído se adicionaron 1 µL de DNAsa Buffer 10x, 1 µL de DNAsa I y 6 de µL de agua calidad biología molecular. La mezcla se incubo por 10 minutos a temperatura ambiente, posterior a lo cual se adicionó 1 µL de EDTA 25 mM calidad biología molecular y se incubó la mezcla a 65°C por 10 min. Para la síntesis de cDNA se empleó la transcriptasa reversa (Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR – Thermo Scientific). Brevemente por cada reacción de síntesis de cDNA se mezclaron 4 µL de Mix de Reacción 5x, 2 µL de Maxima Enzyme Mix, 11 µL de RNA de concentración 500 ng/µL tratado con DNAse I y 3 µL de agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 20 µL. La mezcla se incubó por 10 min

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a 25 °C seguido de una incubación por 15 min a 50°C, finalizando la reacción a 85°C por 5 min.

Para la evaluación cuantitativa de los cambios en los niveles de mRNA de los genes Pgp y BCRP se empleó la técnica qRT-PCR. Se emplearon primers específicos para cada uno de estos genes (Tabla 1) y se usó el coctel Platinum®SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG que viene en una concentración 2x y contiene Platinum® Taq DNA polimerasa, colorante SYBR® Green I Tris-HCl, KCl, MgCl2 6 mM, deoxiguanosina trifosfato dGTP (Deoxyguanosine triphosphate) 400 µM, Desoxiadenosina trifosfato dATP (Deoxyadenosine triphosphate) 400 µM, Deoxicitidina trifosfato dCTP (Deoxycytidine triphosphate) 400 µM, Deoxiuridina trifosfato dUTP (Deoxyuridine Triphosphate) 800 µM, uracil DNA glicosilase (UDG), y estabilizadores. Para cada gen a evaluar se preparó una mix de reacción (Tabla 2) y se corrió el programa de qRT-PCR específico en el sistema de detección DNA Engine Opticon® 2 System.

Para la estandarización de la eficiencia de amplificación se realizaron curvas para cada gen, a partir de una mezcla de los cDNA de las muestras a evaluar (2 µL de cada uno) con la cual se realizaron diluciones sucesivas en agua calidad biología molecular (Anexo 3). Allí se graficó el CT (Ciclo umbral) de cada dilución frente al logaritmo de la concentración y se obtuvieron las eficiencias. Los valores de CT fueron corregidos para cada gen de acuerdo al método de Pffalf y los resultados están representados como la expresión relativa (ER)

167. El gen beta-actina fue empleado como gen constitutivo de referencia.

Tabla 1. Secuencias de primers para los mRNA de proteínas ABC evaluadas por qRT-PCR

Tabla 2. Concentraciones y cantidades de reactivos empleadas en la qRT-PCR

Gen Sentido Secuencia 5’-3’ Tamaño

Pb*

Temperatura estandarizad

a °C

BCRP Sentido GCATCGATCTCTCACCCTGG

239 pb 60°C Antisentido ATTGCTGCTGTGCAACAGTG

Pgp Sentido CAGAGTCAAGGAGCATGGCA

104 pb 60°C Antisentido

TCAGAGTTCACTGGCGCTTT

Beta-actina

Sentido GCCAACACAGTGCTGTCT 113 pb 60°C

Antisentido GGAGCAATGATCTTGATCTT

Reactivo Concentración Inicial

Volumen para 1 reacción (µL)

Concentración Final

Agua calidad biología molecular

No aplica Completar a 20 µL

No aplica

SYBR® Green 2x 10 1x

Primer Sentido 10µM 2 1 µM

Primer Antisentido 10µM 2 1 µM

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6.8 Evaluación de la localización celular de Pgp, BCRP y acumulación de Doxorrubicina por microscopía confocal

Para la evaluación de Pgp, BCRP y Doxorrubicina por microscopía confocal 80.000 células totales HT29-WT y DxR fueron sembradas en cajas de cultivo de 24 pozos las cuales contenían laminillas circulares previamente irradiadas en ultravioleta (30 min). Estas laminillas fueron previamente tratadas con polilisina-L (0,1 mg/ml), lavadas con PBS y secadas. Luego de 24 horas de cultivo se iniciaron los tratamientos a evaluar por 12 o 24 horas, posterior a lo cual se retiró el medio y se realizaron 3 lavados con PBS. La fijación de las células se realizó incubando con paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS por 30 min, posterior a lo cual se adicionó 1 mL de PFA al 0,4% en PBS y se almacenaron las células a 4°C hasta el momento de la incubación con el anticuerpo primario.

Para la inmunodetección se retiró el PFA al 0,4% y se realizaron 3 lavados de 10 min con búfer Tris-Fosfato (TPB) (pH 7.8), posterior a lo cual se incubaron las laminillas con 40 µL de una mezcla que contenía los anticuerpos primarios: anticuerpo policlonal anti-Pgp hecho en conejo (Life Span BioSciences LS-C178472) dilución 1:50 y anticuerpo policlonal anti-BCRP hecho en cabra (Santa Cruz sc-25156) dilución 1:50 en albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, toda la noche en cámara húmeda. Posteriormente las laminillas fueron lavadas con TPB y se incubaron por dos horas en cámara húmeda con 40 µL de una mezcla que contenía anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo anti conejo DayLight™549 (λExc: 555 nm/ λEms: 569 nm) (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) dilución 1:200, anticuerpo anti-cabra Alexa Fluor® 488 (λExc: 493 nm/λEms: 520 nm) (Jackson

Immunoresearch, West Grove, PA, USA) dilución 1:200 y Hoechst 33342 (1:1000, Invitrogen®). Luego se realizaron 3 lavados de 10 min en búfer TPB y las laminillas fueron montados en portaobjetos empleando el medio de montaje Fluoromount™ (Sigma-Aldrich). Para la detección de Doxorrubicina se consideró el espectro de absorción y emisión reportado en la literatura para este fármaco (Figura 1). A partir de esta información se establecieron los parámetros para su detección por microscopía confocal (Tabla 6)162.

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Tabla 3. Parámetros para la adquisición de imágenes por microscopía confocal

Parámetro Canal 1 Canal 2 Canal 3 Canal 4

Longitud de onda de detección

(filtros)

410-488 nm 490-560 nm 560-622 nm 638-747 nm

Porcentaje de poder del Láser

7,5% 6,0% 7,0% 1,0%

Longitud de onda del Láser

405 nm 488 nm 561 nm 633 nm

Color del canal

Longitud de onda de excitación

405 nm 488 nm 561 nm 633 nm

Longitud de onda de emisión

449 nm 525 nm 591 nm 693 nm

Pinhole 28 µm 60 µm 36 µm 42 µm

Ganancia del detector

718 700 715,11 700

Ganancia Digital 1 1 1 1

Las imágenes multicanal fueron adquiridas secuencialmente en el Microscopio Confocal Espectral y Dos Fotones (Confocal NLO 780, Carl Zeiss, Germany) con el Software ZEN

Figura 2.. Espectro de emisión y absorción de Doxorrubicina. Absorción (__) y emisión (----) de Doxorrubicina libre de 0,01mg/mL, y espectro de emisión de Doxorrubicina encapsulada (…..) de 0,2 mg/mL, todas en solución acuosa (Adaptado de Dai X (2008). Fluorescence intensity and lifetime imaging of free and micellar-encapsulated doxorubicin in living cells [Figure 3]. Nanomedicine Nanotechnology, Biol. Med. 4, 49–56)

25

2.1 (Black) versión 11.0 (© Carl Zeiss Microscopy GmbH) del Centro de Microscopía Avanzada de la Universidad de Concepción. Para cada línea celular y condición de tratamiento se montaron dos réplicas a partir de las cuales se adquirieron mínimo 10 imágenes por tratamiento empleando en todos los casos los mismos parámetros de adquisición para cada canal con el objetivo EC Plan-Neofluar 40x (Tabla 6). El número de células cuantificadas fue del rango de 200-800 células por tratamiento, siendo este rango asociado el efecto citotóxico de algunos de los tratamientos y por tanto al número de células que era posible identificar por campo. Igualmente se tomaron algunas imágenes con el objetivo de inmersión lan-Apochromat 63x las cuales no se cuantificaron, solo fueron empleados para la construcción de los paneles de imágenes mostradas en la sección de resultados.

Con el fin de cuantificar las diferencias obtenidas entre las diferentes condiciones de tratamiento, las imágenes (aumento 40x) fueron cuantificadas en el Software Imaris®

(Bitplane. Oxford Instruments Company). Para la cuantificación de los transportadores de membrana Pgp y BCRP se generaron regiones de interés de 1,5 µm esféricas que fueron colocadas manualmente sobre las uniones intercelulares en donde la detección de las proteínas fue más homogénea. Para la cuantificación de la acumulación de Doxorrubicina a nivel nuclear, se generaron superficies automáticas con los mismos parámetros de creación para todas las imágenes (Canal: 3, diámetro de la esfera de mayor tamaño: 10 µm, Límite inferior de fluorescencia: 400 UFL (Unidades de Fluorescencia), Límite superior de fluorescencia: 31596, detalle de área superficial: 1,0 Unidades). Para los datos obtenidos por tratamiento se generaron histogramas y se aplicó el test de Shapiro-Wilk con el cual se comprobó la distribución normal de los datos, se eliminaron los datos por encima del cuantil 90 y por debajo del cuantil 10.

Objetivo específico 4: Determinar el efecto de antioxidantes en la expresión de

los transportadores Pgp y BCRP

6.9 Protección frente al estrés oxidativo

Con el fin de evaluar si los cambios en los niveles de los transportadores ABC observados en las condiciones de estrés oxidativo y/o hipoxia podrían estar relacionados o no con la presencia de ROS, se empleó N-acetilcisteína (NAC) en concentración final en el medio de 1 mM en co-tratamiento con los agentes descritos para la inducción de estrés oxidativo y/o hipoxia. Esto considerando reportes en la literatura en los que se evidencia la efectividad de NAC en la protección frente a estrés oxidativo tanto en pretratamiento como en co-tratamiento con el agente estresor163. Este agente fue reconstituido en PBS para la obtención de un stock de 0,1 M. En la etapa de estandarización se empleó además ácido ascórbico igualmente en co-tratamiento en diferentes concentraciones generadas a partir de un stock 0,1M preparado en PBS.

26

Objetivo específico 5: Evaluar la relación entre el estrés oxidativo inducido por

Doxorrubicina y/o hipoxia química el proceso apoptótico

6.10 Apoptosis: Ensayo fluorimétrico de caspasa 3

Para evaluar la apoptosis en las diferentes condiciones de estrés oxidativo e hipoxia se

empleó el Kit de determinación fluorimétrica de Caspasa 3 (Sigma®) de acuerdo a las

instrucciones del fabricante164. Brevemente las células a una confluencia del 80% se

incubaron de acuerdo con los tiempos de tratamiento definidos y se usaron células sin

tratamiento como control negativo. Luego el medio fue aspirado, la caja de cultivo se colocó

en hielo y se adicionaron 200 µL de búfer de lisis (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina-

etanosulfónico (HEPES) pH 7,4 200 mM, 3-[(3-Colamidopropil)- dimetilamonio]-propano

sulfonato (CHAPS) 25 mM y Ditiotreitol (DTT) 25 mM) incubando con este búfer por 10

minutos. Posteriormente las células adheridas se retiraron por raspado y fueron transferidas

a un tubo eppendorf en donde se centrifugaron a 13000 rpm por 15 min a 4°C tras lo cual

se recolectó el sobrenadante y se cuantificó la proteína por el método de BCA.

Posteriormente se mezclaron 20 µg de proteína con 2,5 µL de sustrato Ac-DEVD-AMC (Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metilcumarina) en una concentración final de 20 µM y búfer de ensayo (HEPES 200 mM pH 7.4 con CHAPS al 1%, 50 mM DTT, 20 mM EDTA) hasta un volumen final de 250 µL. De esta mezcla se transfirieron 200 µL, a una placa de 96 pozos para lectura de fluorescencia (λexcitación: 380 nm /λemisión: 460 nm). Los

resultados se expresaron como veces de cambio en los niveles de fluorescencia por µg de proteína respecto a las células no tratadas.

6.11 Reacción en Cadena de Polimerasa qRT-PCR para la evaluación del mRNA de proteínas proapoptóticas PUMA y Bax

Se empleó la metodología descrita previamente para la evaluación de Pgp y BCRP por qRT-PCR. Los primers empleados en este caso se describen en la tabla 4.

Tabla 4. Secuencias de primers para los mRNA de proteínas proapoptóticas evaluadas por qRT-PCR

*Pb: pares de bases

Gen Sentido Secuencia 5’-3’ Tamaño

Pb*

Temperatura estandarizada

°C

PUMA Sentido GACCTCAACGCACAGTACGAG

98 pb 60°C Antisentido GACCTCAACGCACAGTACGAG

BAX Sentido CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG

155 pb 60°C Antisentido CCAGCCCATGATGGTTCTGAT

Beta-actina

Sentido GCCAACACAGTGCTGTCT 113 pb 60°C

Antisentido GGAGCAATGATCTTGATCTT

27

6.12 Análisis estadístico

Todos los experimentos se realizaron por triplicado. En algunos casos solo fue posible hacer duplicados. Las diferencias entre las diferentes condiciones de tratamientos se analizaron por t de student considerando la normalidad de los datos. Un p valor < 0.05 se consideró significativo. El programa JMP SAS se empleó para el análisis de los datos.

28

7. Resultados

Las especies reactivas de oxigeno modulan la

viabilidad de las células de cáncer de colon

Considerando los modelos experimentales para la inducción de estrés oxidativo y/o hipoxia química, se evaluó el efecto de las diferentes condiciones sobre los niveles de ROS. A las 12 horas de tratamiento con cada estímulo los cambios en los niveles de ROS son leves respecto a las células no tratadas.

A las 24 horas de tratamiento con Doxorrubicina (Doxo) se observó un incremento significativo en los niveles de ROS frente a las células no tratadas (P Valor ≤0,0001); mientras que en las células tratadas con cloruro de cobalto (se abrevió como Co) no hubo cambios significativos. Por otra parte, en la combinación Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co), a las 24 horas los niveles de ROS fueron significativamente mayores respecto a las células no tratadas (P valor≤ 0,0032). Sin embargo, el incremento fue menor respecto al tratamiento con Doxorrubicina (Figura 3). Se evidencia que este modelo permite evaluar las alteraciones en los niveles de ROS asociadas al estrés oxidativo inducido por Doxorrubicina y el posible papel de la hipoxia química en su regulación.

29

Con el objetivo de evaluar si la regulación del estrés oxidativo en el tratamiento con Doxorrubicina durante la hipoxia química podría estar asociado con la resistencia a este medicamento, se evaluaron los niveles de ROS en células HT29 del fenotipo Doxorresistente DxR en las condiciones de tratamiento previamente descritas (Figura 4).

Las células HT29-DxR presentan un incremento menor en los niveles de ROS respecto a las células HT29-WT al tratamiento con Doxo (P valor≤0,0028). Se observa además que en el tratamiento con Doxo+Co, no hubo cambios respecto al tratamiento con Doxorrubicina sola, a diferencia de lo que ocurre en las células HT29-WT que presentan una tendencia a la reducción de ROS en la combinación Doxo+Co.

Figura 3. Evaluación de los niveles de ROS en células HT29-WT tratadas con Doxorrubicina y/o Cloruro de cobalto. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por 12 y 24 horas, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). 12 h n=3; 24 h n=8, t de student, * = p valor <0.05. (UR: Unidades Relativas)

30

Los resultados preliminares utilizando el H2O2 como inductor de estrés oxidativo (Anexo 1)

mostraron un incremento en los niveles de ROS que pueden estar asociados a la

disminución en la viabilidad celular hasta las 24 horas. Teniendo en cuenta estos resultados

y considerando la diferencia observada en los niveles de ROS al tratamiento con Doxo,

frente a la combinación Doxo+Co a las 24 horas para las dos líneas celulares, se evaluó el

efecto de estos tratamientos sobre la viabilidad celular (Figura 5). Para las células HT29-

WT en los tratamientos con Doxo y Doxo+Co hubo una disminución significativa de la

viabilidad (P valor Doxo <0,0001; P valor Doxo+Co <0,0001) frente a las células no tratadas;

y aunque la disminución en la combinación fue menor, no se encontraron diferencias

significativas respecto al tratamiento con solo Doxorrubicina.

En los resultados de número de células viables tampoco se observan diferencias

significativas entre los tratamientos Doxo frente a Doxo+Co (P valor≤0,0698). Sin embargo,

tanto para el porcentaje de viabilidad como para el número de células totales, hay una

tendencia hacia un menor efecto de la Doxorrubicina en la viabilidad celular, cuando esta

se usa en la combinación Doxo+Co.

Figura 4 Evaluación de los niveles de ROS células HT29-WT y DxR. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por 24 h, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). WT n=8; DxR n=2, t

31

b)

a)

Figura 5. Evaluación de la viabilidad en células HT29-WT. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por 24 horas, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). Se muestran: a) Porcentaje de Viabilidad; b) Número de células totales. n=3, t de student, * = p valor <0.05

32

a)

b)

Figura 6. Evaluación de la Viabilidad en células HT29-DxR. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por 24 horas, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). Se muestran: a) Porcentaje de Viabilidad; b) Número de células totales. n=3, t de student, * = p value <0.05

33

Las células HT29-DxR no presentaron cambios significativos por efecto de uso de la Doxo

sola o en la combinación Doxo+Co en un tiempo de 24 horas en la viabilidad celular (Figura

6). Estos resultados podrían estar asociados con la respuesta al estrés oxidativo

ocasionada por Doxorrubicina. Este tipo celular presentó un incremento en la cantidad de

ROS a las 24 horas; sin embargo, comparado con las células HT29 WT este no fue tan

drástico. La cantidad de ROS para los tratamientos con Doxo fue significativamente mayor

para las células HT29-WT frente a las células HT29 DxR (P valor≤0,0028). Este mismo

comportamiento se evidenció para el tratamiento Doxo+Co (P valor≤0,0484), siendo la

diferencia entre los dos tipos celulares menor en este último caso, posiblemente debido a

que el incremento para la combinación en las células WT fue menor respecto al tratamiento

solo con Doxo (Figuras 3 y 5).

El estrés oxidativo podría estar relacionado con la

actividad de HIF-1α Considerando los cambios observados por efecto de los diferentes tratamientos en los

niveles de ROS, se evaluó la actividad de HIF1α en las mismas condiciones (Figura 7). La

actividad de HIF1α se incrementa con el uso de cloruro de cobalto de forma significativa

respecto a las células no tratadas (P valor<0,0001) y de acuerdo con la literatura156.

Figura 7. Actividad de HIF1 en células HT29-WT. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por diferentes tiempos, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). n=2, t de student, * = p value <0.05. UR (Unidades Relativas).

34

Es así como en las células HT-29, por efecto de uso del cloruro de cobalto, se observó

dicho incremento. Igualmente, en las células tratadas con Doxo+Co se observó un aumento

significativo en la actividad de HIF1α a las 24 horas de tratamiento (P valor<0,0001), sin

que a las 12 horas se observaran cambios en la actividad del factor de transcripción frente

a las células sin tratamiento. Estos resultados indican que el tratamiento con cloruro de

cobalto solo o en combinación con Doxorrubicina, permite obtener una actividad de HIF1α

significativamente mayor a las 24 horas de tratamiento, respecto a las células no tratadas.

Por tal motivo, se definió este tiempo de tratamiento para posteriores experimentos.

El uso de la Doxorrubicina y/o la hipoxia química modulan

la activación del mecanismo MDR a nivel de proteína

Uno de los mecanismos por los cuales las células de cáncer desarrollan resistencia a quimioterapia es la sobreexpresión de los transportadores ABC que permiten el eflujo de fármacos, dentro de estos se encuentran BCRP y Pgp165. Con el objetivo de evaluar si el estrés oxidativo inducido por Doxorrubicina en condición de normoxia o de hipoxia química podría generar cambios en la expresión y/o localización en membrana de los transportadores Pgp y BCRP, se hizo una evaluación de los mismos por microscopía confocal en las diferentes condiciones de tratamiento. Las diluciones y los anticuerpos a emplear se estandarizaron por IHC (Anexo 2) y se seleccionaron los anticuerpos con los que se obtuvo tinción positiva en tejidos de glioblastoma (Tabla 5).

Tabla 5. Anticuerpos primarios y secundarios seleccionados para la inmunicitoquímica y detección por microscopía confocal de Pgp y BCRP.

Anticuerpo primario Dilución Anticuerpo secundario

Anti BCRP (ABCG2) policlonal D-20 Santa Cruz sc-25156 hecho en cabra

1:50 Anti-Cabra conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) di

Anti-Pgp (MDR1) policlonal LifeSpan Biosciences LS c178472 hecho en conejo

1:50 Anti-Conejo conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)

Para evaluar el efecto de la Doxorrubicina sobre los niveles de Pgp se midieron niveles de la proteína Pgp localizados en membrana después de 12 y 24 horas de tratamiento (Figura 8).

Para las células HT29-WT y HT29-DxR hubo un aumento significativo en los niveles de Pgp a partir de las 12 horas de tratamiento con Doxorrubicina, siendo mayor a las 24 horas frente a las células no tratadas. Igualmente, para las células HT29-DxR tratadas con Doxorrubicina, el incremento en los niveles de Pgp fue significativamente mayor respecto a lo que sucede en las células HT29-WT, tanto a las 12 como a las 24 horas (P valor para los dos tiempos<0,0001). Este resultado permitió evidenciar que la Doxorrubicina efectivamente induce la expresión y/o localización en membrana de este transportador y que dicho efecto es aún mayor en las células HT29-DxR.

35

a)

b)

Figura 8 Evaluación por microscopia confocal de la localización celular de Pgp células HT29-WT y HT29-DxR tratadas con Doxorrubicina (Doxo) por 12 o 24 h, o las células permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). a) Imágenes representativas para las células HT29-WT y HT29-DxR (40x); Resultado de la cuantificación de las imágenes para Pgp. t de student, *,+, ‡ = p value <0.05. (UR: Unidades Relativas).

36

Teniendo en cuenta que la Doxorrubicina estaría regulando la expresión y/o localización de Pgp a las 24 horas de tratamiento, los tratamientos con cloruro de cobalto, Doxorrubicina y su combinación se realizaron en este tiempo de tratamiento para la evaluación de los niveles de los transportadores ABC.

Inicialmente en las células sin tratamiento, se observó que los niveles de fluorescencia asociada a la localización en membrana de Pgp fueron mayores para las células HT29-DxR frente a las células HT29-WT, siendo esta diferencia significativa (P valor <0,0001).

El tratamiento con cloruro de cobalto aumentó significativamente los niveles de Pgp respecto a las células no tratadas (P valor <0,0001), siendo este efecto significativamente mayor para las células HT29-WT frente a las HT29-DxR (P valor <0,0001). A diferencia de lo anterior, el tratamiento con Doxorrubicina incrementó significativamente los niveles de Pgp en mayor proporción en las células HT29-DxR (P valor <0,0001) (Figura 9). Por otra parte, el tratamiento combinado generó un aumento significativo en los niveles de Pgp respecto a las células sin estímulo (P valor <0,001), siendo los niveles de Pgp similares para las dos líneas celulares. En este último caso los niveles de los dos transportadores para las dos líneas celulares, fueron menores respecto a las células tratadas con Doxorrubicina.

En cuanto al transportador BCRP los niveles fueron significativamente mayores para las células HT29-WT respecto a las células HT29-DxR (P valor<0,0001). Los tratamientos con cloruro de cobalto y Doxorrubicina, generaron un aumento significativo en los niveles de BCRP respecto a las células no tratadas (P valor<0,0001). Para el tratamiento con cloruro de cobalto, los niveles de BCRP fueron significativamente mayores para las células HT29-WT respecto a las HT29-DxR. Para la Doxorrubicina los niveles fueron mayores en las HT29-DxR. Para el tratamiento en combinación Doxo+Co se observó un aumento significativo en los niveles del transportado BCRP (P valor <0,0001), siendo significativamente mayores para las células HT29 WT frente a las HT29 DxR (P valor <0,0001).

Se observa que tanto para Pgp como para BCRP, la Doxorrubicina ejerce un efecto inductor de los niveles de estos transportadores, siendo dichos niveles mayores en las células que ya han adquirido el fenotipo resistente.

37

a)

38

b)

39

d)

c)

Figura 9. Evaluación por microscopia confocal de la localización celular de Pgp y BCRP en células HT29-WT y HT29-DxR tratadas con Doxorrubicina (Doxo) 5 µM, Cloruro de Cobalto (Co) 100 µM o su combinación. Los tratamientos se realizaron por 24 h o las células permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas. Imágenes representativas para las células a) HT29-WT y b) HT29-DxR (63x); Resultado de la cuantificación de las imágenes para c) Pgp y d) BCRP. t de student, *,+, ‡ = p value <0.05. (UFL: unidades de fluorescencia).

40

Los niveles de mRNA de Pgp se incrementan por el uso

de la Doxorrubicina en un medio hipóxico

Previamente se evidenció que Doxorrubicina y cloruro de cobalto solos o en combinación, generaron cambios en los niveles de los transportadores para las dos líneas celulares. Sin embargo, se desconoce si dichos efectos podrían darse a nivel transcripcional. Considerando esto, se evaluaron los niveles del mRNA de Pgp y BCRP en las dos líneas celulares tratadas con Doxorrubicina y/o cloruro de cobalto por qRT-PCR (Figura 10). Las curvas de eficiencia para estos genes se muestran en los anexos (Anexo 3).

Se evidencia que para Pgp el cloruro de cobalto no generó cambios en los niveles del mensajero; sin embargo, el tratamiento con Doxorrubicina sí generó aumento en los niveles, siendo este significativo para la línea HT29-DxR (P valor≤0,0012). Por otra parte, para el tratamiento en combinación, el incremento fue significativamente mayor para las dos líneas respecto a las células no tratadas, siendo de 31,3 veces para la línea HT29-WT y de 63,9 veces para las células HT29-DxR, respecto a las células no tratadas (P valor<0,0001).

Para BCRP, en las células HT29-WT se evidenció una reducción en los niveles del mensajero para el tratamiento con Doxorrubicina (P valor<0,0001), siendo esta reducción menor cuando el tratamiento era en combinación con cloruro de cobalto en comparación con las células no tratadas. Por otra parte, para las células HT29-DxR se observó una reducción en los niveles del mensajero, tanto en los tratamientos individuales como en el tratamiento combinado (P valor<0,0001). Estos resultados no concuerdan con lo evidenciado previamente a nivel de proteína, y aunque sugieren que aparentemente los tratamientos evaluados regulan la expresión de BCRP, la regulación post-transcripcional puede asociarse con estas diferencias. Por otro lado, es de destacar que el aumento en la expresión de mRNA de Pgp en el tratamiento Doxo+Co es muy alta para ambos tipos celulares.

41

a)

b)

Figura 10. qRT-PCR para la evaluación de los niveles relativos de mRNA de a) Pgp y b) BCRP. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por 24 h, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas) n=3. Los valores fueron ajustados por la eficiencia de cada gen, se empleó b-actina como gen constitutivo. t de student, * = p value <0.05.

42

La inhibición de la endonucleasa APE-1 aumenta la

cantidad de especies reactivas de oxígeno e inhibe la

actividad de HIF 1α Uno de los mecanismos de la respuesta a estrés oxidativo activado por quimioterapia es la endonucleasa APE-1. Esta enzima es inducida a nivel transcripcional por las ROS y está involucrada en la regulación redox de los factores de transcripción HIF1α, AP-1 entre otros, a través de su dominio regulatorio. Se ha evidenciado que dicha actividad regulatoria es requerida para la función transactivadora de estos factores de transcripción, por lo cual se plantea que esta enzima podría ser de importancia en la respuesta a estrés oxidativo inducido por Doxorrubicina 166. La molécula E3330 se utilizó como inhibidor especifico de la actividad redox de APE-1 con el objetivo de evaluar si esta enzima podría tener algún rol en la respuesta a estrés oxidativo inducido por Doxorrubicina en condición de hipoxia, y su papel en el desarrollo de la resistencia multidrogas. En la etapa de estandarización se seleccionó el tratamiento con E3330 10µM. Este permitió un aumento en los niveles de ROS, sin cambios significativos en la viabilidad celular tras las 24 horas del tratamiento (Anexo 4).

Inicialmente, se evaluó en las células HT29-WT el efecto de la presencia del inhibidor en la generación de ROS asociada al tratamiento con Doxorrubicina y/o cloruro de cobalto. Dicha evaluación se hizo también en las células resistentes a Doxorrubicina con el fin de evaluar que efecto tendría la inhibición de APE-1 sobre la regulación de ROS inducidas por Doxorrubicina durante la hipoxia química, en células que ya presentan el fenotipo de resistencia al fármaco (Figura 11).

En las células HT29-WT tratadas con cloruro de cobalto y/o Doxorrubicina en presencia del inhibidor, hubo un aumento significativo en los niveles de ROS respecto a las células no tratadas (P valor Co+E≤ 0,0325; P valor Doxo+E <0,0001; P valor Doxo+Co+E <0,0001), siendo dicho incremento mayor para el tratamiento con Doxorrubicina, con una leve reducción cuando el tratamiento se da durante la hipoxia química. En cuanto a Doxorrubicina, se evidencia que los niveles de ROS en presencia de E3330 (UR= media 6,3± S.D:2,02) son significativamente mayores respecto al tratamiento con Doxorrubicina sin el inhibidor (UR= media 4,35±S.D1,77) (P valor≤0,0131). Para el tratamiento combinado con Doxo+Co, se observó que en presencia de E3330 el incremento en los niveles de ROS (UR= media 5,14±S.D 1,5) fue también significativamente mayor respecto a las células sin el inhibidor (UR= media 3,46±S.D 1,11) (P valor=0,0318). Los datos del análisis estadístico se presentan en el anexo 5.

En las células HT29-DxR los tratamientos generaron un aumento en los niveles de ROS de menor magnitud respecto a lo evidenciado en las células de fenotipo silvestre. Para el tratamiento con Doxorrubicina en presencia de E3330 se observó un aumento en los niveles relativos de ROS levemente mayor (UR= media 2,37±S.D 0,73) respecto a lo observado con solo Doxorrubicina (UR= media 1,78±S.D 0,34); aunque esta diferencia no fue significativa. Sin embargo, en el tratamiento combinado Doxo+Co en presencia de E3330, los niveles relativos de ROS (UR= media 1,90±S.D 0,36) fueron muy similares a lo observado en dicho tratamiento combinado sin el inhibidor (UR= media 1,83±S.D 0,47). Estos resultados estarían indicando que la respuesta a estrés oxidativo inducido por

43

Doxorrubicina, y por tanto la regulación de ROS en células de fenotipo silvestre y de fenotipo Doxorresistente en condición de hipoxia, podría ser mediada por mecanismos diferentes.

a)

b)

Figura 11 Evaluación de los niveles de ROS en células HT29-WT y DxR en presencia de E3330. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación en presencia de E3330 por 24 h, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas; E: E3330). Como control se emplearon además las células tratadas solo con E3330. a) HT29-WT n=5 y b) HT29-DxR n=5 (réplicas técnicas), t de student, * = p value <0.05. (UR: Unidades Relativas).

44

Con el objetivo de evaluar el efecto de E3330 sobre la actividad de HIF1 en las diferentes condiciones de tratamiento, se evaluó la actividad del factor de transcripción por ELISA (Figura 12).

A las 12 horas de tratamiento no hubo diferencias significativas entre los diferentes tratamientos. En las células tratadas con cloruro de cobalto por 24 horas hay un aumento significativo en la actividad de HIF1 como se había mencionado anteriormente; sin embargo, dicha actividad del factor de transcripción se vio reducida significativamente cuando la hipoxia química es inducida en presencia de E3330 (P valor≤0,0002). Igualmente, para la combinación Doxo+Co en presencia de E3330, no se observaron cambios en la actividad de HIF1 respecto a las células no tratadas, a diferencia de lo que se había observado previamente en la evaluación sin el inhibidor. Estos resultados, junto con los obtenidos en la evaluación de ROS, permiten corroborar que E3330 estaría inhibiendo la actividad Redox de APE-1 involucrada en la regulación de la actividad transcripcional de HIF1.

Estos resultados no indican que HIF1 sea el único factor de transcripción afectado por la inhibición de APE-1, pues se debe considerar que esta endonucleasa regula la actividad transcripcional de otros factores de transcripción como AP-1, NFĸB, p53, entre otros166. Sin embargo, el propósito de este estudio se limita a evaluar el efecto de dicha regulación sobre HIF1.

45

a)

b)

Figura 12 Actividad Relativa de HIF1 en presencia de E3330. Las células fueron tratadas con Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2), con Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) y/o Doxorrubicina 5µM (Doxo) en presencia de E3330 por 12 o 24 horas, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). Como control se emplearon además las células tratadas solo con E3330. n=2, t de student, * = p value <0.05. UR (Unidades Relativas).

46

La endonucleasa APE-1 podría regular la expresión de los

transportadores Pgp y BCRP

Con el objetivo de evaluar si APE-1 como mecanismo de respuesta a estrés oxidativo podría estar involucrado en la regulación de la expresión y/o localización de Pgp y BCRP en membrana celular, se evaluaron por microscopía confocal las células HT29-WT y HT29-DxR tratadas con Doxorrubicina y/o cloruro de cobalto en presencia del inhibidor de APE-1 (E3330).

Tanto para Pgp como para BCRP en las dos líneas celulares, se observa cómo en presencia de E3330 los cambios en los niveles de los transportadores con los diferentes tratamientos, no son tan drásticos respecto a las células sin el inhibidor (Figura 13), según se había evidenciado previamente (Figura 9).

Las células HT29-WT y HT29 DxR tratadas con Doxo en presencia de E3330 (Doxo+E), presentaron niveles de Pgp y BCRP significativamente menores respecto a lo evidenciado previamente con el tratamiento solo con Doxo (P valor<0,0001). En las células HT29-WT con el tratamiento E3330+Doxo+Co, los niveles de Pgp y BCRP fueron significativamente menores respecto a Doxo+Co (P valor <0,0001). Por otra parte, para las células HT29-DxR con el tratamiento E3330+Doxo+Co, los niveles de Pgp significativamente menores respecto a Doxo+Co (P valor <0,0001), mientras que no hubo diferencias significativas para BCRP.

En los tratamientos con cloruro de cobalto en presencia del inhibidor (E3330+Co) no hubo cambios significativos en los niveles de los transportadores para las células HT29-WT. En las células HT29-DxR bajo el mismo tratamiento, sí hubo un aumento significativo para Pgp y BCRP respecto a las células no tratadas (p valor<0,0001). Sin embargo, los niveles de estos transportadores para HT29-DxR con E3330+Co, fueron significativamente menores respecto a lo evidenciado previamente con Co sin el inhibidor (p valor <0,0001).

La reducción en los niveles de Pgp y BCRP en presencia de E3330 en los tratamientos con cobalto para las dos líneas, se asociarían con el efecto inhibitorio indirecto que tendría E3330 sobre la actividad de HIF1α como se evidenció en el experimento de actividad de HIF1. En cuanto a los tratamientos con Doxorrubicina, para las dos líneas celulares se evidenció una drástica reducción del efecto del fármaco en presencia del inhibidor respecto a los resultados previos con solo Doxorrubicina. Esto sugeriría que, tanto en células sensibles como en las resistentes al tratamiento, la inducción de Pgp y BCRP por Doxorrubicina sería dependiente de la actividad redox de APE-1.

47

a)

48

b)

49

c)

d)

Figura 13. Evaluación por microscopia confocal de la localización celular de Pgp y BCRP en células HT29-WT y HT29-DxR tratadas con Doxorrubicina (Doxo) 5 µM, Cloruro de Cobalto (Co) 100 µM o su combinación en presencia de E3330. Los tratamientos se realizaron por 24 h o las células permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas, o se trataron solo con E3330 10 µM. Imágenes representativas para las células a) HT29-WT y b) HT29-DxR (63x); Resultado de la cuantificación de las imágenes para c) Pgp y d) BCRP. t de student, *,+, ‡ = p value <0.05. (UFL: unidades de fluorescencia).

50

Las ROS podrían regular la expresión y/o actividad de los

transportadores Pgp y BCRP en condiciones de estrés

oxidativo

Inicialmente se evaluó si el estrés oxidativo no asociado a quimioterapia, sino inducido por peróxido de hidrógeno, podría generar cambios en la localización de los transportadores en membrana. Se empleó N-Acetilcisteína 1 mM como antioxidante en co-tratamiento pues fue la condición que permitió una mayor reducción en los niveles de ROS durante la etapa de estandarización (Anexo 6).

En las células HT29-WT el tratamiento con NAC incrementó los niveles de Pgp y BCRP de forma significativa respecto a las células no tratadas (p valor <0,0001). Para las células HT29-DxR tratadas con NAC, los niveles de Pgp fueron significativamente menores y los niveles de BCRP fueron significativamente mayores en ambos casos respecto a las células no tratadas (p valor <0,0001).

En cuanto al tratamiento con H2O2, se observó un aumento significativo en los niveles de Pgp y BCRP en las dos líneas celulares frente a las células no tratadas (p valor <0,0001); siendo significativamente mayor para las células HT29-DxR respecto a las HT29-WT (p valor <0,0001). De forma similar para los tratamientos con H2O2, el aumento en los niveles de Pgp fue significativamente mayor respecto a las células con NAC tanto para la línea HT29-WT (p valor <0,0382) como para HT29-DxR (p valor <0,0001). Los niveles de BCRP fueron también significativamente mayores para las células tratadas con H2O2 respecto a las tratadas con NAC para ambas líneas celulares (p valor <0,0001).

Por otra parte, cuando las células fueron tratadas con el antioxidante y H2O2, se observó una reducción significativa en los niveles de los transportadores para las dos líneas celulares frente al tratamiento con solo peróxido (p valor <0,0001) (Figura 14). Estos resultados sugieren que posiblemente el estrés oxidativo podría estar regulando la expresión y/o localización en membrana de estos trasportadores.

51

a)

52

b)

53

c)

d)

Figura 14 Evaluación por microscopia confocal de la localización celular de Pgp y BCRP en células HT29-WT y HT29-DxR con NAC 1mM, H2O2 200 µM, o su combinación. Los tratamientos se realizaron por 24 h o las células permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). Imágenes representativas para las células a) HT29-WT y b) HT29-DxR (63x); Resultado de la cuantificación de las imágenes para c) Pgp y d) BCRP. t de student, *,+, ‡ = p value <0.05. (UR: Unidades Relativas).

54

Con el objetivo de evaluar si el estrés oxidativo podría tener alguna función en la regulación de la localización en membrana de los trasportadores Pgp y BCRP, en respuesta al tratamiento con Doxorrubicina en condición de normoxia o hipoxia química, se hizo la determinación por microscopía confocal de la localización celular de los transportadores en células HT29-WT y HT29-DxR, tratadas con Doxorrubicina y/o cloruro de cobalto en presencia del antioxidante NAC (Figura 15).

En las células HT29 WT el tratamiento con cloruro de cobalto en presencia de NAC (NAC+Co), no generó cambios significativos en los niveles de Pgp respecto a las células no tratadas; mientras que para BCRP hubo una reducción en sus niveles. Previamente se observó que con cloruro de cobalto había un incremento significativo en los niveles de los transportadores para las dos líneas. En las células HT29 DxR para el tratamiento NAC+Co se observó una reducción significativa en los niveles de Pgp (P valor <0,0001), mientras que para BCRP no hubo cambios significativos respecto a las células no tratadas.

Por otra parte, el tratamiento con Doxorrubicina en presencia de NAC (NAC+Doxo) en las células HT29-WT generó un aumento en los niveles de Pgp de forma similar a lo evidenciado solo con la Doxorrubicina. Sin embargo, para el transportador BCRP este efecto de la Doxorrubicina se vio atenuado en presencia de NAC, evidenciándose niveles significativamente menores de fluorescencia con el tratamiento en presencia del antioxidante (Doxo vs NAC+Doxo P valor<0,0001). En cuanto a las células HT29-DxR, se observó que la NAC anuló completamente el efecto de la Doxorrubicina sobre los niveles de Pgp y BCRP localizados en membrana, siendo los niveles de los transportadores significativamente menores para el tratamiento NAC+Doxo frente a Doxo (p valor <0,0001). Estos resultados podrían sugerir que en células que ya adquirieron el fenotipo Doxorresistente, la presencia de las ROS sería importante en la regulación de dichos transportadores. Sin embargo, se desconocen los posibles mecanismos por los cuales esto podría suceder.

Finalmente, el tratamiento combinado Doxo+Co en presencia de NAC (NAC+Doxo+Co) para las células HT29-WT, presentó niveles menores de Pgp frente al tratamiento con Doxo en presencia de NAC (NAC+Doxo). Por otro lado, los niveles de BCRP para la combinación NAC+Doxo+Co, fueron mayores respecto al tratamiento NAC+Doxo.

Para el caso de las células HT29-DxR con la combinación Doxo+Co, la presencia de NAC redujo los niveles de Pgp frente a la combinación sin el antioxidante. Los mayores niveles de BCRP se dieron para el tratamiento NAC+Doxo+Co frente a los demás tratamientos con antioxidante, aunque la presencia de NAC redujo los niveles del transportador de forma significativa respecto a los tratamientos con Doxo+Co previamente evaluados (P valor<0,0001).

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a)

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b)

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c)

d)

Figura 15. Evaluación por microscopia confocal de la localización celular de Pgp y BCRP en células HT29-WT y HT29-DxR tratadas con Doxorrubicina (Doxo) 5 µM, Cloruro de Cobalto (Co) 100 µM o su combinación en presencia de NAC. Los tratamientos se realizaron por 24 h o las células permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas, o se trataron solo con N-acetilcisteína (NAC 1mM). Imágenes representativas para las células a) HT29-WT y b) HT29-DxR (63x); Resultado de la cuantificación de las imágenes para c) Pgp y d) BCRP. t de student, *,+, ‡ = p value <0.05. (UFL: unidades de fluorescencia).

58

Considerando que la Doxorrubicina en normoxia o hipoxia química generó cambios en la

localización y/o expresión de los transportadores Pgp y BCRP, se intentó evaluar

indirectamente la actividad de los mismos determinando la acumulación celular de

Doxorrubicina a partir de las imágenes obtenidas por microscopía confocal. La

cuantificación se realizó en el software Imaris estableciendo los mismos parámetros de

generación de superficies indicados en la metodología (Figura 16).

En general, las células HT29-DxR presentaron una acumulación significativamente menor

de Doxorrubicina respecto a las células HT29 WT (P valor <0,0001), lo cual se asociaría

con los mayores niveles y mayor actividad de los transportadores Pgp y BCRP localizados

en membrana de las células resistentes.

Específicamente para las células HT29-WT se observa que con el tratamiento combinado

Doxo+Co los niveles de Doxorrubicina fueron significativamente mayores respecto a las

células tratadas solo con Doxorrubicina (P valor <0,0001), lo cual se correlaciona también

con lo evidenciado por microscopía confocal, en donde se evidenciaron menores niveles de

los transportadores en el tratamiento combinado. Estos resultados indicarían que HIF1α

podría estar regulando de alguna manera la expresión y/o localización o la actividad de los

transportadores en presencia de Doxorrubicina.

Figura 16. Acumulación de Doxorrubicina. Cuantificación de las imágenes de microscopia confocal para la evaluación de la acumulación de Doxorrubicina en células HT29-WT y HT29-DxR tratadas con Doxorrubicina (Doxo) 5 µM sola o en combinación con Cloruro de Cobalto (Co) 100 µM en presencia o no de E3330 (10 µM) o de NAC (1 mM). Los tratamientos se realizaron por 24 h. t de student, *,+, ‡ = p value <0.05. (UFL: unidades de fluorescencia).

59

Cuando estos tratamientos se hicieron en presencia del antioxidante NAC, se observó un

aumento significativo en la acumulación de Doxorrubicina, tanto para el tratamiento con

Doxorrubicina (NAC+Doxo) como para el tratamiento en combinación con hipoxia química;

(NAC+Doxo+Co) (P valor <0,0001) siendo mayor para este último en comparación con los

tratamientos sin el antioxidante. Esto podría asociarse con lo evidenciado para los niveles

del transportador BCRP, que presentó menores niveles para el tratamiento NAC+Doxo+Co

respecto al tratamiento sin el antioxidante; sin embargo, no tendría relación con lo

observado para Pgp.

Estos resultados de acumulación de Doxorrubicina junto con los de evaluación de niveles

de los transportadores, indicarían que en las células sensibles al fármaco posiblemente la

acción de HIF1 sobre la regulación de la expresión y actividad de los transportadores, podría

depender de las especies reactivas de oxígeno. Sin embargo, se desconoce el mecanismo

por el cual esto ocurre.

Cuando las células HT29-WT fueron tratadas con Doxorrubicina sola o en combinación con

cloruro de cobalto en presencia de E3330, la acumulación de Doxorrubicina fue mayor

respecto a los tratamientos sin el inhibidor (P valor <0,0001). Esto se relaciona con lo

observado en la microscopía confocal para los transportadores, en donde se observó cómo

el inhibidor reducía el efecto de los tratamientos en la inducción de los niveles de los

transportadores en membrana. Estos resultados sugieren que la endonucleasa APE-1

podría ser uno de los mecanismos que regulan la expresión y actividad de los

transportadores Pgp y BCRP, en respuesta al estrés oxidativo inducido por quimioterapia

en las células sensibles al tratamiento.

Respecto a las células HT29-DxR, a pesar de la reducción drástica observada en los niveles

de los transportadores, cuando los tratamientos se hicieron en presencia del antioxidante,

la acumulación de Doxorrubicina fue levemente menor respecto a los tratamientos sin el

inhibidor. Esta misma tendencia fue observada para los tratamientos en presencia del

inhibidor. Considerando que en las células HT29-DxR la acumulación de Doxorrubicina es

mucho menor respecto a las células HT29-WT, posiblemente el método empleado en la

cuantificación presente limitaciones para detectar cambios cuando los niveles de

fluorescencia son bajos. Por otra parte, considerando que de partida las células HT29-DxR

podrían presentar una alta actividad de los transportadores, los cambios en la acumulación

de Doxorrubicina podrían darse de forma temprana, por lo cual a las 24 horas podrían no

evidenciarse mayores cambios.

60

La Doxorrubicina y/o la hipoxia química podrían regular la

activación de vías de muerte celular

Uno de los mecanismos por los cuales la Doxorrubicina puede inducir muerte celular es a través de la activación de la vía apoptótica167. Por tal motivo, se evaluó si las condiciones de tratamiento podrían generar cambios en las proteínas asociadas a esta vía.

Con el objetivo de evaluar si los posibles mecanismos de protección asociados a la hipoxia química podrían relacionarse con alteraciones en la activación de la vía de muerte apoptótica, se evaluó la actividad caspasa-3 en diferentes tiempos de tratamiento con Cloruro de cobalto, Doxorrubicina o su combinación (Figura 17).

El tratamiento con Doxorrubicina en normoxia o hipoxia química induce la actividad caspasa-3. Sin embargo, este efecto no se mantiene en el tiempo evidenciándose una reducción gradual hasta las 12 horas con posterior aumento a las 24 horas, tanto para Doxorrubicina sola como para la combinación Doxo+Co, siendo la diferencia significativa respecto a los mismos tratamientos para las 12 horas (Doxo 12h vs 24h P valor≤0,0097; Doxo+Co 12h vs 24h P valor≤0,0024). Posterior a las 6 horas de incubación con cloruro de cobalto, la actividad de la caspasa 3 se vio disminuida. Esta disminución en la actividad de la caspasa 3 podría atribuirse a la actividad incrementada que puede tener HIF-1α en el tiempo. Sin embargo, no se observaron diferencias entre el tratamiento con Doxorrubicina sola o en combinación con cloruro de cobalto.

Figura 17. Actividad relativa de Caspasa-3 en células HT29-WT tratadas con Doxorrubicina y/o Cloruro de cobalto. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por diferentes tiempos, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). n=2, t de student, *, #,+ = p value <0.05. (UR: Unidades Relativas)

61

Considerando lo observado en el experimento de actividad de Caspasa-3, se evaluaron los niveles del mRNA de PUMA, proteína involucrada en las transducción de señales de muerte y considerada pro-apoptótica168. En los ensayos preliminares se evidenció que el peróxido de hidrógeno generaba una disminución en los niveles de mRNA de PUMA, sugiriendo que las células podrían estar activando mecanismos de protección frente al estrés oxidativo (Anexo 7). Considerando lo anterior, se sometieron las células a las diferentes condiciones de tratamiento por 12 y 24 horas, considerando las diferencias observadas en estos dos tiempos en el ensayo de actividad de caspasa-3.

Contrario a lo que se esperaba, las células tratadas con Doxorrubicina tanto a las 12 como a las 24 horas presentan una disminución significativa en los niveles de PUMA, (Figura 17) (NT vs Doxo 12 h P valor≤0,0003; NT vs Doxo 24h P valor ≤0,0002). Sin embargo, en el ensayo de caspasa-3 fue posible observar que el tratamiento con Doxorrubicina sola o en combinación con cloruro de cobalto a las 24 horas, presentaba una actividad caspasa-3 mayor. Por lo tanto, a pesar de la disminución de los niveles en PUMA, los tratamientos estarían induciendo la activación de la caspasa-3 efectora y así mismo la activación de la vía apoptótica. Por otra parte, tanto a las 12 como a las 24 horas, fue posible observar que en las células tratadas con Doxorrubicina y Cloruro de cobalto los niveles de mRNA de PUMA eran mayores respecto a los respectivos tiempos de tratamiento con Doxorrubicina,

Figura 18. qRT-PCR para la evaluación de los niveles relativos de mRNA de PUMA. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por diferentes tiempos, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). n=3, t de student, * = p value <0.05. (UR: Unidades Relativas). El análisis cuantitativo se realizó por el método de doble delta CT

62

siendo esta diferencia significativa para los tratamientos a las 24 horas (Doxo vs Doxo+Co 24 h P Valor<0,0001). Esto podría sugerir que la actividad de HIF1α estaría involucrada en el destino apoptótico de la célula durante el tratamiento con Doxorrubicina.

Se evaluaron también los niveles de mRNA para la proteína proapoptótica Bax para las

células HT29-WT y DxR (Figura 19). Se evidenció nuevamente que para las células HT29-

WT la expresión de la proteína proapoptótica, en este caso Bax, cuya activación en la vía

apoptótica es también dependiente de PUMA, se redujo significativamente tras el

tratamiento con Doxorrubicina (Doxo vs NT P Valor<0,0001). Sin embargo, tras el

tratamiento combinado Doxo+Co no hubo diferencias significativas en la expresión de Bax

respecto a las células con Doxorrubicina. Esto indicaría que la hipoxia no genera cambios

en la expresión de Bax durante el tratamiento con Doxorrubicina a diferencia de lo que

sucedió con PUMA.

En cuanto a las células HT29-DxR se observó una disminución en los niveles de Bax al

tratamiento con cloruro de cobalto (P Valor<0,0001); sin embargo, no se evidenciaron

cambios con Doxorrubicina respecto a las células no tratadas. Por otra parte, el tratamiento

con la combinación Doxo+Co, incrementó significativamente los niveles de Bax con un

aumento de aproximadamente 3 veces respecto a las células no tratadas (P Valor< 0,0001);

por lo cual se esperaría un incremento en la muerte celular, lo cual no fue evidente en los

ensayos de viabilidad. Esto podría asociarse con alteraciones corriente abajo de Bax que

permitirían evitar el proceso apoptótico. Sin embargo, es necesario realizar una evaluación

Figura 19. qRT-PCR para la evaluación de los niveles relativos de mRNA de Bax. Las células fueron tratadas con Doxorrubicina 5µM (Doxo), Cloruro de Cobalto 100 µM (CoCl2) o su combinación por 24 h, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas) n=3. Los valores fueron ajustados por la eficiencia de cada gen, se empleó b-actina como gen constitutivo. t de student, * = p value <0.05

63

de los niveles de la proteína anti-apoptótica Bcl-2, que permitiera concluir acerca de si estos

tratamientos estarían favoreciendo o no el proceso apoptótico.

64

8. Discusión

El desarrollo de la resistencia al tratamiento quimioterapéutico en diferentes tipos de cáncer con tumores sólidos, es uno de los principales obstáculos en la obtención de tratamientos efectivos4. La cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, son las principales opciones para contrarrestar el cáncer de colon y estas se utilizan en dependencia de la etapa y extensión de la enfermedad. En las etapas 0 y I, la cirugía puede ser suficiente; sin embargo, para estadíos más avanzados (II-V), la quimioterapia ayudada por la radioterapia parecen ser la única alternativa. Dentro de la quimioterapia, las principales opciones incluyen 5-FU y Leucovorina o Capecitabina. Estas formulaciones estarían en dependencia de la edad del paciente y sus necesidades de salud57,58.

Algunas combinaciones de medicamentos también son empleadas en dependencia del estadío de la enfermedad, sobre todo en etapas de la II-V, como por ejemplo: el régimen FOLFOX (5-FU, Leucovorina, y Oxaliplatino) o el régimen CapeOx (Capecitabina y Oxaliplatino) se usan con más frecuencia; aunque algunos pacientes pueden recibir 5-FU con Leucovorina o Capecitabina, 5-FU y Leucovorina por sí solos o junto con un medicamento de terapia dirigida; Irinotecán, solo o con un medicamento de terapia dirigida; Cetuximab solo, etc169. Otras formulaciones buscan dirigir el medicamento a la zona afectada como el uso de microesferas de 5-FU, derivados de Doxorrubicina como el polietilenglicol (PEG) liposomal, entre otras170.

En cáncer de colon, aunque los diferentes tratamientos quimioterapéuticos han logrado una mejoría en la respuesta y la supervivencia de los pacientes, la resistencia a estos fármacos es inevitable. Por ejemplo, para el 5-FU, uno de los mecanismos de resistencia sugeridos se asocia con la expresión aumentada de la timidilato sintasa, blanco primario del metabolito activo de este fármaco58,171. Por otra parte, en estudios donde se evalúa el uso del Irinotecán, un inhibidor de Topoisomerasa I, se describen mecanismos de resistencia asociados con bajos niveles del metabolito activo a nivel intratumoral que podrían estar relacionados con la expresión de los transportadores ABC, disminución de la expresión de Topoisomerasa I, y cambios corriente abajo como supresión de la apoptosis, alteraciones del ciclo celular o aumento en la reparación del DNA169,172. Para el caso del Oxaliplatino, la poca llegada del medicamento a nivel intratumoral se ha asociado con la expresión de los transportadores ABC, como también con la alteración de los mecanismos de regulación redox los cuales podrían jugar un rol importante en el desarrollo de la resistencia a este agente173.

Existen varios mecanismos asociados a la resistencia adquirida y pueden ser diferentes para cada terapia citotóxica. En general la resistencia a la terapia tradicional citotóxica está acompañada por una disminución en la captación del fármaco por la célula de cáncer, o por un incremento en el eflujo de este hacia el exterior de la célula mediado por transportadores dependientes de ATP. Adicionalmente, la resistencia puede ser dada por cambios asociados con modificaciones genéticas o epigenéticas que pueden alterar la sensibilidad al fármaco165.

65

Algunos estudios demuestran que la señalización celular que conduce a procesos moleculares asociados con la resistencia a agentes quimioterapéuticos, depende de la señalización redox en la célula de cáncer174. El aumento en las especies reactivas de oxígeno y la respuesta a este incremento, se ven afectados en células de cáncer, sin embargo, algunos estudios consideran que este tipo de alteraciones podrían ser utilizados en pro de una terapia efectiva. Por otra parte, la suprarregulación de la capacidad antioxidante en la adaptación al estrés oxidativo propio de las células de cáncer, puede conducir a generar la resistencia a múltiples fármacos. Por tal razón, evaluar los mecanismos asociados con la resistencia a quimioterapia por la modulación de la vía redox podría conducir a importantes hallazgos terapéuticos175.

Los diferentes agentes quimioterapéuticos contra los cuales se desarrolla la resistencia no guardan similitudes entre sí, sin embargo una de las características que tienen en común es la inducción de estrés oxidativo a través del cual se busca ejercer un efecto citotóxico111. La inducción del estrés oxidativo aparentemente permite a la célula cancerosa desarrollar mecanismos de adaptación que le permiten sobrevivir y hacerse resistente al tratamiento175.

La hipoxia es una característica esencial del microambiente tumoral en cánceres sólidos, debido a una vascularización ineficiente y pobre difusión de oxígeno. En el ambiente hipóxico, los niveles elevados de ROS pueden activar los factores inducibles de hipoxia. El ambiente hipóxico puede ser comparable al efecto que produce el uso de sustancias como el CoCl2, este actúa como quelante de hierro necesario para que las prolilhidroxilasas actúen hidroxilando HIF-1a lo cual conduce a la translocación de HIF-1α al núcleo y su dimerización con HIF-1β, formando HIF-1176.Por esta razón es necesario considerar el posible papel de la hipoxia asociada al estrés oxidativo y por tanto del factor de transcripción de HIF1 en el desarrollo de resistencia multidrogas, pues se ha evidenciado su función en la regulación de la expresión de proteínas involucradas en procesos de apoptosis y de la proteína Pgp involucrada en la resistencia multidrogas13,121.

El efecto del estrés oxidativo generado por el uso de la Doxorrubicina en condición de normoxia e hipoxia química y su relación con la resistencia multidrogas, aún no ha sido bien documentada. De acuerdo con la literatura uno de los mecanismos de acción de la Doxorrubicina, involucra la capacidad de inducción de ROS, encontrándose en el grupo de agentes quimioterapéuticos que generan altos niveles de estas especies reactivas112. En células de cáncer de seno MCF-7 se ha reportado que la Doxorrubicina puede generar un aumento rápido en los niveles de ROS, siendo su producción principalmente a nivel mitocondrial generando cambios posiblemente asociados además con alteraciones en la viabilidad celular177. En este estudio se demostró que las especies reactivas de oxigeno incrementan con el tiempo durante el tratamiento, y que este incremento está asociado con la resistencia multidrogas pues las células HT29-DxR presentan un incremento menor en los niveles de ROS, respecto a las células HT29-WT al tratamiento con Doxorrubicina. El ambiente hipóxico podría modular la generación de especies reactivas de oxígeno. En las células HT29-WT el tratamiento con Doxo+Co generó una disminución en la generación de ROS frente al uso de Doxorrubicina sola. Por su parte las células HT29-DxR no presentaron cambios en los niveles de ROS por efecto de la hipoxia química.

66

En las células con un fenotipo resistente establecido HT29-DxR, la respuesta a estrés oxidativo aparentemente es diferente respecto a las células HT29-WT. Se ha reportado que en líneas celulares resistentes a Cisplatino, otro agente quimioterapéutico que en condiciones normales induce aumento en los niveles de ROS en líneas celulares de cáncer, los niveles de ROS suelen ser menores respecto a su línea parental178. De manera similar, se reporta que en células resistentes a Clorambucilo los niveles de ROS se reducen de manera temprana tras la exposición al fármaco, mientras que en las células parentales el aumento en los niveles de ROS se mantiene constante en el tiempo179. Estos hallazgos junto con los resultados obtenidos, podrían sugerir que, en las células resistentes a diferentes agentes quimioterapéuticos, podrían existir cambios en los mecanismos redox. Sin embargo, se desconoce el proceso por el cual durante el tratamiento continuo que se requiere para hacer a las células resistentes, las células sensibles al fármaco reducen los niveles de ROS para hacerse resistentes o si dicha reducción se genera una vez se ha establecido el fenotipo resistente180.

La modulación de la viabilidad celular podría estar mediada por las especies reactivas tal como se observa en este estudio y a su vez podría estar mediada por la hipoxia. Las diferencias entre los tratamientos Doxo frente Doxo+Co, indican que en el tratamiento en combinación hay aparentemente una menor efectividad del fármaco en la reducción del número de células viables, sugiriendo que la hipoxia química posiblemente mediada por HIF1α, estaría ejerciendo algún efecto que evita la muerte celular del grupo tratado con Doxorrubicina, favoreciendo así la resistencia al medicamento. Estos resultados concuerdan con lo reportado por Sullivan y Col., quienes evidencian que la exposición previa a hipoxia protege células de cáncer de colon y de seno del efecto de la Doxorrubicina y que dicho rol protector de la hipoxia es dependiente de HIF1181. Adicionalmente, se ha reportado que la inhibición de la expresión de HIF1α sensibiliza células de cáncer de colon LoVo frente a diferentes agentes quimioterapéuticos incluyendo Doxorrubicina y 5-Fluoruracilo182. Sin embargo, respecto a este posible rol protector de la hipoxia frente a la Doxorrubicina, se desconoce si uno de los posibles mecanismos podría estar asociados a la respuesta a estrés oxidativo.

La hipótesis planteada en este estudio conduce a evaluar el estrés oxidativo como modulador de la resistencia multidrogas, la cual se discute a través de tres preguntas importantes. Primera: ¿La generación de ROS inducidas por Doxorrubicina en condiciones de normoxia e hipoxia química podrían activar mecanismos de resistencia multidrogas? En segundo lugar: ¿La respuesta al estrés oxidativo mediada por APE-1 podría regular la expresión, localización en membrana o actividad de Pgp y BCRP, participando así en la resistencia multidrogas en células de cáncer de colon? Y en tercer lugar ¿la resistencia multidrogas podría estar relacionada con la alteración del proceso apoptótico mediado por el estrés oxidativo?

Para dar respuesta a la primera pregunta relacionada con la generación del estrés oxidativo y su capacidad de regular la expresión y/o localización de Pgp y BCRP podemos decir que,

67

a partir de los resultados obtenidos, la Doxorrubicina es un inductor de Pgp y BCRP, sin embargo, se desconoce si este efecto se asocia con la respuesta a estrés oxidativo. En estudios anteriores se ha propuesto que la Doxorrubicina podría aumentar la actividad del factor de transcripción FOXO3 como sensor de estrés citotóxico, el cual participa en la regulación de Pgp incrementando así su expresión183. Por otra parte, se ha reportado que diferentes agentes quimioterapéuticos pueden inducir la expresión del transportador BCRP, lo cual se ha relacionado con un proceso de regulación a nivel epigenético. El gen ABCG2(BCRP) es altamente susceptible a metilación, lo cual reprime su expresión y al parecer, dicha metilación es eliminada por diferentes agentes quimioterapéuticos favoreciendo la expresión del gen184. Sin embargo, tanto para Pgp como para BCRP no es claro cuál podría ser el rol de las ROS en su regulación, cuando estas son inducidas por el tratamiento quimioterapéutico.

La alteración en la expresión de los transportadores puede darse a nivel proteico y/o a nivel transcripcional. En cuanto a los cambios en los niveles de mRNA, para el caso de Pgp se ha reportado en células HT29 que los cambios en los niveles de mRNA no se relacionan con cambios en los niveles o actividad de la proteína. Esto podría estar asociado con una regulación del gen MDR1 dada no solo a nivel transcripcional, sino dependiente de eventos pos-transcripcionales como la desestabilización post-transcripcional del mRNA y el bloqueo traduccional de la expresión de Pgp185. En cuanto a la estabilización del mRNA de Pgp, se describe que esta puede estar diferencialmente regulada en células resistentes a Doxorrubicina frente a su línea parental (sensible al fármaco), siendo la vida media del mRNA de Pgp en las células sensibles, mucho más corta (aproximadamente 1 hora) frente a las células resistentes (12-16 horas), y aunque esto podría ser también dependiente del modelo celular, es otro aspecto a considerar en la regulación de la expresión de Pgp186. De manera similar, para BCRP se reporta una discordancia entre los cambios en los niveles de mRNA y los niveles de proteína187, la cual podría asociarse con la regulación transcripcional y postranscripcional que sufre ABCG2. Por ejemplo, en la línea S1 de cáncer de colón se ha encontrado que la vida media del mRNA de ABCG2 se mantenía por cerca de 16 horas en células de fenotipo resistente a Mitoxantrona; mientras que en la línea parental esta era solo de 6 horas. Se reporta que esto está asociado con la longitud de la región 3’ no traducida 3’-UTR (Un-translated region) de ABCG2, la cual en las células parentales permite la unión del micro RNA miR-519c reprimiendo la expresión del transportador, mientras que en la línea resistente que presenta una región 3’-UTR más corta, no se da la unión del miR-519c evitando así la represión de la expresión188. Además, habría que considerar las modificaciones pos-traduccionales que sufren estas proteínas relacionadas con la glicosilación, tráfico a membrana, reciclaje y degradación14,189.

Adicionalmente, se ha demostrado que los transportadores ABC Pgp (MDR113,190) y BCRP (ABCG2191) son blancos de regulación del factor de transcripción HIF1α en diferentes tipos de cáncer. En este estudio se verificó que el uso de Doxorrubicina asociada a la activación de HIF1α logra mantener una expresión aumentada de los transportadores a nivel transcripcional y a nivel proteico; sin embargo, el efecto a nivel del mRNA fue mucho más notorio para el caso de Pgp. Por consiguiente, la combinación de tratamiento (Doxo-Co), podría demostrar una asociación con el aparente papel de HIF1α como protector frente al estrés oxidativo inducido por Doxorrubicina, lo cual puede ocurrir a través de diferentes mecanismos. Estos mecanismos podrían estar relacionados con el favorecimiento del metabolismo glicolítico durante la hipoxia, atenuando la fosforilación oxidativa y por tanto

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previniendo la producción de ROS192. De esta manera los resultados obtenidos en este estudio permitirían sugerir que el uso de Doxorrubicina en células HT29 en un medio hipóxico, promovería de forma indirecta la resistencia a quimioterapia. Esto podría estar asociado con la cantidad de especies reactivas de oxígeno o con los mecanismos de regulación de las mismas, reportándose en la literatura por ejemplo que algunos agentes quimioterapéuticos como Paclitaxel pueden inducir los niveles de glutatión de forma dependiente de HIF1α193.

El rol del estrés oxidativo en la resistencia multidrogas aún no ha sido completamente dilucidado. Algunos estudios han reportado previamente en células de adenocarcinoma colorrectal (Caco-2) que el tratamiento con agentes no quimioterapéuticos, como es el caso de peróxido de hidrógeno o el nitroprusiato de sodio (donador de óxido nítrico), ambos inductores de estrés oxidativo, puede regular la expresión y/o actividad del transportador Pgp194,195. De forma similar se ha evidenciado en cultivos primarios de hepatocitos de rata que las células tratadas con peróxido de hidrógeno presentan mayores niveles y actividad de Pgp, efectos que fueron suprimidos cuando el tratamiento se hizo en presencia de un antioxidante196. Considerando estos antecedentes, se evaluó si el H2O2 podría generar cambios en los niveles de los transportadores en las líneas HT29-WT y HT29-DxR. Los resultados obtenidos en conjunto con los antecedentes, sugieren que en condiciones de estrés oxidativo la expresión y/o localización no solo de Pgp sino también de BCRP podrían estar reguladas por las ROS; sin embargo, no sugieren si el estrés oxidativo podría estar modulando también la actividad de los mismos.

En segundo lugar, y teniendo en cuenta que existen diferentes mecanismos de respuesta al estrés oxidativo se evaluó la acción de la endonucleasa APE-1 en este proceso. La endonucleasa APE-1 tiene funciones en la reparación del DNA posterior al daño oxidativo y como regulador redox de factores de transcripción. Su activación a nivel transcripcional se ha evidenciado en células humanas sometidas a estrés oxidativo, en las cuales ejerce su función en la reparación por escisión de base y funciona como un mecanismo de respuesta adaptativa al estrés genotóxico197. Igualmente su actividad como endonucleasa se ha asociado con una mayor resistencia a agentes alquilantes como temozolomida en glioblastoma198. Adicionalmente, la inhibición de su actividad redox con E3330 ha mostrado sensibilizar células madre de cáncer al tratamiento con 5-fluoruracilo, lo que sugiere que esta actividad podría también ser importante en la resistencia a quimioterapia17.

Inicialmente se establecieron las condiciones de inhibición de APE-1 a través de la molécula E3330 que permite una inhibición selectiva de la actividad redox de APE-1 sin afectar su actividad reparadora199,200. Se seleccionó la concentración de 10 µM que permitió evidenciar un incremento en los niveles basales de ROS (posiblemente asociados con inhibición de la actividad de APE-1) sin generar cambios significativos en la viabilidad celular. Además, con esta concentración se observó una reducción en la actividad de HIF1 tanto en las células tratadas con cloruro de cobalto, como en aquellas tratadas con cloruro de cobalto en combinación con Doxorrubicina, lo que permitió evidenciar la disminución en la actividad redox de APE-1 sobre este factor de transcripción.

69

Con base en los resultados, se observó que la inhibición de APE-1 para los tratamientos con Doxorrubicina en presencia de cloruro de cobalto, presentó menores niveles de ROS respecto a las células con Doxorrubicina. Esto podría asociarse con que la inhibición del cloruro de cobalto no sea completa durante las 24 horas de tratamiento. Aunque en la literatura se reporta en otros modelos celulares que tras 6 horas de tratamiento con E3330 se observan cambios en la localización subcelular de APE-1 trasladándose del núcleo al citoplasma lo que impediría su acción regulatoria sobre factores de transcripción, no se conoce el tiempo de inicio de su acción. Por otra parte para el cloruro de cobalto como inductor de HIF1α se reporta una inducción temprana de 2 horas en diferentes líneas celulares201, por lo cual se podría esperar que la inducción de HIF1 ocurriera antes de la inhibición de APE-1 con E3330.

En este trabajo se evaluó el papel de la Doxorrubicina y su inducción de estrés oxidativo en la activación de un mecanismo que involucraría a APE-1 y a HIF1α el cual podría regular la expresión y/o actividad de los transportadores ABC Pgp y BCRP. En este estudio fue posible evidenciar que las ROS inducidas por el tratamiento con Doxorrubicina estarían participando en la regulación de la expresión de estos transportadores y que en dicho proceso HIF1α podría estar involucrado de forma diferente en las líneas HT29-WT y HT29-DxR. Se ha reportado que APE-1 en su forma acetilada regula la expresión de Pgp a través de su unión a la RNA polimerasa II en el promotor del gen MDR1 (Pgp), siendo esta necesaria para el reclutamiento y ensamblaje de un complejo que incluye al factor de transcripción YB-1 y que regula la expresión de la proteína, sumado a ello también se sugiere que la actividad redox de APE-1 no es requerida para su efecto regulatorio22. Sin embargo, como se expuso anteriormente, E3330 inhibe específicamente la actividad redox de APE-1, lo que permitiría sugerir considerando los resultados obtenidos, que esta actividad sí estaría implicada en la regulación de la expresión y/o localización no solo de Pgp sino también de BCRP. Dicha regulación podría darse a nivel transcripcional. Se reporta que el tratamiento con E3330 como inhibidor de la actividad redox de APE-1, disminuye la actividad transcripcional de los factores de transcripción HIF1, NFĸB y AP-1202. Respecto a HIF1 como se describió anteriormente, se conoce que es un regulador de la transcripción de Pgp y BCRP. Por su parte para el caso del factor de transcripción AP-1, se describe que la activación de la vía de JNK (c-Jun-NH2-terminal Kinase) que culmina en la activación de AP-1, es requerida en la línea de cáncer de colon SW1116/HCPT para mantener su fenotipo de resistencia multidrogas asociada a la sobreexpresión del transportador BCRP203. Por otra parte, respecto a Pgp se ha descrito en líneas celulares de cáncer de pulmón que el efecto inductor de la Doxorrubicina sobre este transportador es dependiente de la activación de la vía JNK y por tanto de c-Jun204. Sin embargo, en células de carcinoma gástrico con fenotipo de resistencia multidrogas, la sobreactivación de la vía JNK-AP-1, regula negativamente la expresión y modula negativamente la actividad de Pgp205. Aunque estos reportes son contradictorios, sugieren que existe una asociación entre AP-1 y la regulación de Pgp, pero no se conoce si la función del factor de transcripción podría ser diferente una vez se establece el fenotipo resistente, o si la función de AP-1 esté determinada de manera diferente en cada caso por acción de cada corregulador de AP-1 (Ej. c-jun, c-fos). Por otra parte, aunque es claro que el papel de AP-1 en la posible regulación de Pgp y BCRP es dependiente de su activación por la vía JNK, se debe considerar que la actividad de APE-1 también regula la función de AP-1, lo que podría explicar su posible papel en la regulación de los transportadores.

70

Otra forma de evaluar la acción del estrés oxidativo es a través del uso del antioxidante NAC, un agente eficiente en la eliminación de especies reactivas de oxígeno que actúa como precursor de L-cisteína y glutatión, teniendo además capacidad reductora reaccionando directamente con radicales libres y ROS como peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo206–208. Este efecto de acuerdo a los reportes de literatura y similar a lo que ocurre con otros antioxidantes como ácido ascórbico, genera además una disminución en la actividad y niveles de proteína de HIF1α durante hipoxia física o química, asociada a que la estabilización de dicho factor de transcripción es dependiente de la presencia de ROS209–211. Las ROS inactivan la prolilhidroxilasa 2 (PHD2) a través de la oxidación que ejercen sobre el ion ferroso, el cual es esencial en la hidroxilación catalítica de las prolinas209. La inactivación de PHD2 por ROS, evita que HIF1α sea hidroxilado y posteriormente ubiquitinado, lo que evita su degradación, por tanto, la eliminación de ROS favorecería la degradación de HIF1α. Este efecto inhibidor de NAC sobre HIF1α y dependiente de ROS, explicaría lo evidenciado en este trabajo, en donde para las dos líneas celulares la presencia de NAC, reduce el efecto de la hipoxia química en la inducción de los niveles de los transportadores. Adicionalmente, se evidenció que en las células HT29-DxR la NAC eliminó el efecto de la Doxorrubicina en la inducción de Pgp y BCRP. Esto podría sugerir que, aunque en ambas líneas la Doxorrubicina induce los niveles de los transportadores, su efecto podría darse de forma diferente, siendo en las células HT29-WT mediado por mecanismos no dependientes de los niveles de ROS; mientras que en las células HT29-DxR, aparentemente el efecto de la Doxorrubicina sola y en hipoxia, sería dependiente de las especies reactivas y posiblemente también de la actividad de HIF1α. Por otra parte, puede que la NAC no sea igualmente eficiente en las dos líneas celulares en la eliminación de ROS, o que el efecto de la NAC se dé en forma diferente en el tiempo para las dos líneas. Por tal motivo, habría que evaluar los cambios en el tiempo de los niveles de ROS con los tratamientos que incluyen NAC para las dos líneas y si esto se ve reflejado en cambios en la expresión de las proteínas ABC.

Considerando que los niveles de los transportadores localizados en membrana, así como los niveles de mRNA de estos podrían no relacionarse directamente con la actividad, se evaluó la acumulación de Doxorrubicina. Esté fármaco es sustrato de Pgp212 y BCRP94 por lo cual su acumulación intracelular, que se da principalmente a nivel nuclear, podría asociarse indirectamente con la actividad de los transportadores . Esta evaluación se realizó a partir de las imágenes de microscopía confocal para los tratamientos con el fármaco de acuerdo a lo reportado en la literatura82. Para las células HT29-WT en hipoxia química, la acumulación de Doxorrubicina, menor respecto a las células solo con Doxorrubicina, se relaciona con los cambios en la expresión de los transportadores discutida previamente, sugiriendo que la hipoxia química y específicamente HIF1α regularía no solo la expresión sino también la actividad de estos transportadores durante el tratamiento con el agente quimioterapéutico. Para evaluar si este efecto podría estar relacionado con los niveles de especies reactivas se realizó la determinación en presencia del antioxidante NAC, con el cual a diferencia de lo que se esperaba, se observó un incremento en la acumulación de Doxorrubicina a pesar de que se habían evidenciado mayores niveles de Pgp con estos tratamientos. Sin embargo, la mayor acumulación de Doxorrubicina en presencia de NAC podría relacionarse con la disminución en los niveles de BCRP en membrana evidenciada previamente.

71

En tercer lugar, como se ha discutido previamente, los mecanismos de resistencia multidrogas no solo conducen a un aumento en la expresión de los transportadores ABC, sino también a una alteración del proceso apoptótico. Posteriormente y con el fin de establecer si la actividad de HIF podría tener algún efecto sobre las vías de muerte celular durante el tratamiento con Doxorrubicina, se evaluaron la actividad de caspasa-3 efectora de la vía apoptótica y los niveles de mRNA de la proteína proapoptótica PUMA y BAX.

Una primera evaluación fue la determinación de la actividad de la caspasa 3 que ha sido empleada como marcador de resistencia a quimioterapia en modelos in vivo e in vitro213,214. La Doxorrubicina sola o en combinación Cloruro de cobalto indujo la actividad caspasa-3, lo que sugeriría que el fármaco podría estar induciendo la vía apoptótica por mecanismos independientes de PUMA. Podría contemplarse también el hecho de que algunos estudios indican que la Doxorrubicina puede además activar la vía extrínseca de la apoptosis que conlleva a la activación de la caspasa efectora 3215. Los resultados de este estudio permitieron evidenciar que uno de los posibles mecanismos por los cuales la Doxorrubicina induce la muerte celular es aparentemente por la vía apoptótica. Sin embargo sería necesario complementar estos experimentos con evaluación de mRNA para Bcl-2 pues se reporta que en algunas células la sobre-expresión de proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 pueden asociarse con la resistencia a agentes quimioterapéuticos como etopósido216 y cisplatino217.

Adicionalmente, se hizo una evaluación del efecto del estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno sobre la inducción de la apoptosis. Se ha reportado el uso este agente como inductor de estrés oxidativo218 y en este estudio fue útil para evaluar los cambios en la apoptosis. Respecto a la expresión de la proteína proapoptótica PUMA se obtuvo una mayor expresión en las células no tratadas, lo cual podría asociarse con que el peróxido podría estar activando vías de muerte diferentes a la apoptosis como la vía de muerte por necrosis, siendo el destino de la célula determinado por los niveles de ROS219.

En estudios previos se ha demostrado que HIF-1α y la proteína supresora de tumor p53, están involucradas en la respuesta celular a hipoxia. Sin embargo, la manera como estos dos factores de transcripción determinan el destino celular aún se desconoce 220.La proteína PUMA es un sensor general de estímulo de muerte celular por lo cual es importante conocer los mecanismos asociados a la regulación220. PUMA es un mediador de la apoptosis dependiente de p53 en un gran número de tipos celulares 168. Por ejemplo, las células de cáncer de colon HCT116 PUMA-knockout son altamente resistentes a la apoptosis inducida por la sobreexpresión de p53 o los agentes que alteran el DNA como: Doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5-FU), Cisplatino, Oxaliplatino, Etopósido y Campotecina 168,221. En diferentes líneas celulares se ha mostrado que, en respuesta al daño de DNA, p53 se activa y conduce a un aumento en la expresión de genes proapoptóticos como Noxa, PUMA y Fas. Igualmente, en células de cáncer resistentes a Cisplatino se ha demostrado que se presenta una alteración de los mecanismos mediados por p53 induciendo una disminución de los genes proapoptóticos Noxa y PUMA 222. Por tanto, se buscó evaluar si existían diferencias en la regulación del proceso apoptótico en las células HT29 en las diferentes condiciones de tratamiento. De esta manera, se observó que la hipoxia química inducida con CoCl2 promueve una disminución en la expresión a nivel de mRNA del gen PUMA. Esta misma

72

situación se evidenció cuando se hizo el tratamiento con Doxorrubicina. Sin embargo, la combinación de los tratamientos generó un aumento en la expresión de PUMA evidente a las 24 h, lo cual podría estar asociado con la cantidad de especies reactivas que podrían modular otros mecanismos de muerte diferentes a la apoptosis como se discutió previamente con el uso del H2O2.

Similar a lo evidenciado con PUMA, para la proteína proapoptótica Bax en las células HT29-WT, los tratamientos con Doxorrubicina disminuyeron los niveles del mensajero, así como también la Doxo asociada a la hipoxia química. En las células HT29-DxR, el efecto de disminución en la expresión del mRNA de BAX solo se dio por el uso de la hipoxia química; sin embargo, la Doxorrubicina no generó cambios en los niveles del mensajero para Bax, y la combinación aparentemente aumentó los niveles de mRNA de Bax. Las células tumorales pueden usar algunos mecanismos moleculares para suprimir apoptosis y adquirir resistencia a agentes inductores de apoptosis; por ejemplo, por la expresión de proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 o por la desregulación o mutación de proteínas proapoptóticas tales como BAX223. Es importante destacar que el uso del medicamento asociado a la hipoxia química promovió un incremento en la expresión del mRNA de PUMA y Bax para las células HT29-WT, sugiriendo que habría un efecto asociado a la hipoxia que favorecería la activación de esta ruta apoptótica.

Con base en estos resultados fue posible demostrar que el estrés oxidativo actuaría como modulador de la resistencia multidrogas, especialmente a través de favorecer un incremento en la actividad de los transportadores ABC, mientras que los procesos asociados a la disrupción de la muerte celular por apoptosis requieren más estudio.

73

9. Conclusiones

Este trabajo de tesis permitió concluir que hay un efecto importante de la Doxorrubicina

sobre el estrés oxidativo en células HT29 evaluado como niveles de especies reactivas de

oxígeno, además del efecto de la hipoxia química sobre dicha condición de estrés. Es así

como las ROS podrían favorecer mecanismos asociados a la resistencia a quimioterapia

en células de cáncer de colon.

Adicionalmente fue posible evidenciar cómo la hipoxia química a través de la activación del

factor de transcripción HIF1α, estaría ejerciendo un aparente efecto protector frente al

efecto de la Doxorrubicina que se vio reflejado en la menor generación de ROS, como

también en una menor expresión de los transportadores multidrogas Pgp y BCRP.

El entendimiento de los mecanismos de respuesta a estrés oxidativo, a través de la

inhibición de la actividad redox de la proteína APE-1, pusieron de manifiesto que ésta regula

la actividad de diferentes factores de transcripción incluyendo HIF1, y este a su vez podría

participar indirectamente en la regulación de la generación de ROS y en la expresión de los

transportadores Pgp y BCRP.

Se observó que en células HT29 que presentan un fenotipo sensible (WT) y aquellas con

un fenotipo resistente a Doxorrubicina (DxR) podrían presentarse mecanismos diferentes

en la regulación del estrés oxidativo, sin embargo, en las dos líneas la actividad redox de

APE-1 es necesaria en la expresión y/o la localización de las proteínas Pgp y BCRP en la

membrana celular.

La evaluación con el antioxidante N-acetilcisteína, presentada en este estudio, permitió

evidenciar que las ROS inducidas por el tratamiento con Doxorrubicina en las células que

ya han establecido un fenotipo resistente al fármaco, son necesarias para la regulación de

la localización y posiblemente de la expresión de los transportadores Pgp y BCRP, lo que

permitió identificar el papel de dichas especies reactivas en la resistencia multidrogas.

En la evaluación de la vía apoptótica se evidenció que los tratamientos con Doxorrubicina

y/o cloruro de cobalto estarían regulando la expresión de proteínas proapoptóticas (PUMA

y Bax); sin embargo, considerando que se desconoce el efecto de estos tratamientos sobre

las proteínas antiapoptóticas, no es posible concluir si dichos tratamientos estarían

induciendo o inhibiendo la activación de la vía de apoptosis.

La evidencia presentada en este trabajo pone de manifiesto la importancia del estrés

oxidativo en la quimioterapia como un modulador de la resistencia que podría ser utilizado

como un posible blanco terapéutico en la mejora de la terapia anti cáncer.

A partir de los resultados obtenidos en este trabajo se planteó un modelo hipotético. Se

propone que el tratamiento con Doxorrubicina induce un aumento en los niveles de ROS,

frente al cual HIF1α, en este caso inducido en su actividad con cloruro de cobalto, regularía

diferentes mecanismos que podrían ejercer un efecto protector frente a la acción del

fármaco. Por otra parte, la inducción de estrés oxidativo estaría induciendo la actividad de

APE-1 quién, a través de su actividad redox, podría estar regulando la actividad de

diferentes factores de transcripción que incluirían a HIF1 y posiblemente a AP-1, los cuales

74

directa o indirectamente, regularían la expresión y/o localización de los transportadores Pgp

y BCRP favoreciendo así la resistencia multidrogas (figura 20).

Figura 20 . Modelo hipotético del efecto del estrés oxidativo inducido por Doxorrubicina en la resistencia multidrogas mediada por la posible regulación de APE-1 sobre la expresión y/o localización de Pgp y BCRP.

75

10. Perspectivas

La siguiente fase de este trabajo consistirá en la evaluación de los mecanismos de resistencia multidrogas basados en la evaluación de la actividad de los transportadores ABC. Es importante reconocer con más detalle si la vía del estrés oxidativo conduce a modificar la respuesta de los transportadores como también su localización.

Por otra parte, es necesario evaluar el mecanismo de resistencia asociado con la inhibición del proceso apoptótico. Es importante destacar la necesidad de evaluar la expresión de genes antiapoptóticos versus los proapoptóticos a partir del silenciamiento de factores de transcripción involucrados en el estrés oxidativo.

Adicionalmente es necesario profundizar en la regulación del estrés oxidativo con el fin de mejorar la respuesta a los tratamientos en diferentes tipos celulares de cáncer.

76

11. Productos de Investigación y Reconocimientos

1. Presentación modalidad poster del trabajo “Doxorubicin-Resistance mediated by Hypoxia Controls Apoptosis in Colon Cancer Cells”. Evento: Better practice – Science based, evidence driven – International Pharmaceutical Federation (FIP) World Congress. Düsseldorf, Alemania. Octubre de 2015.

2. Presentación modalidad poster del trabajo: “P- glycoprotein could be modulated by doxorubicin on hypoxia conditions in colon cancer cells”. Evento: 6th Special Meeting ATP-Bindng Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases. Innsbruck, Austria. Marzo de 2016.

3. Artículo titulado: El factor inducible por hipoxia HIF-1α modula la resistencia a drogas en células de cáncer de colon. Revista de la Facultad de medicina. ISSN 0120-0011 y e-ISSN 2357-3848. 2016. Enviado. En revisión por pares.

4. Artículo titulado: Role of oxidative stress on doxorubicin resistance in colon cancer cells. Journal of Cellular Physiology. 2016. (Sometido)

5. Beca Jóvenes Investigadores de Colciencias para el desarrollo de este proyecto de investigación. Periodo 2015-2016.

6. Beca Iberoamérica. Jóvenes Profesores e Investigadores. Santander Universidades 2015. Para el desarrollo de una pasantía en la Universidad de Concepción, Chile. Octubre a diciembre de 2015.

7. Beca Dr. Joseph Steiner para asistir a la conferencia “ATP Binding Cassette (ABC) proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases”. Innsbruck, Austria. Marzo de 2016.

77

12. Anexos

Anexo 1: Ensayos preliminares ROS y Viabilidad celular con H2O2

Evaluación del efecto del estrés oxidativo inducido por peróxido de

hidrógeno en la viabilidad celular y en la generación de ROS.

Inicialmente se indujo estrés oxidativo con H2O2 para evidenciar la respuesta de las células HT29-WT frente al estímulo estresor y estandarizar el método de detección de ROS. Para tal fin las células fueron cultivadas en medio que contenía H2O2 en concentración 200 µM por diferentes tiempos (Figura A1).

El tratamiento con peróxido de hidrógeno generó una disminución significativa en la viabilidad celular de la línea HT29-WT posterior a las 3 horas de tratamiento. En cuanto a los niveles de ROS se observó un aumento significativo luego de la primera hora de tratamiento siendo los valores de 12 y 48 horas los de mayor incremento respecto a las células no tratadas. Por otra parte, se evidenció que el aumento en los niveles de ROS no era dependiente del tiempo de tratamiento, o, encontrándose a las 9 y 24 horas valores bajos similares a los de las células no tratadas.

78

a)

b)

Figura A 1. Evaluación de la generación de ROS y de viabilidad en células HT29-WT. Las células fueron tratadas con H2O2 200 µM por diferentes tiempos y fueron posteriormente se evaluaron: a) Los niveles de ROS y b) La viabilidad celular. n=3, t de student, * = p value <0.01. (UR: Unidades Relativas)

79

Anexo 2: Estandarización del uso de

anticuerpos para la inmunodetección por IHC

en tejido

Metodología IHC

Con el objetivo de estandarizar la inmunodetección de las proteínas Pgp y BCRP se

hizo una inmunohistoquímica en secciones tejido de Glioblastoma del banco de

muestras del Laboratorio de Neurobiología y Células Madres, Neuro-CellT de la

Universidad de Concepción, esto considerando reportes previos en los que se evidencia

la expresión de los transportadores Pgp y BCRP en ese tipo de tumores224,225. A partir

del tejido embebido en parafina se generaron con micrótomo secciones de 7 µm de

grosor fueron deparafinizadas en Histoclear® II y etanol 100°, seguido de hidratación

con agua destilada con etanol en concentraciones decrecientes (100°, 96°, 70°, 50°. 10

min en cada uno). La actividad peroxidasa endógena fue inhibida por incubación con

H2O2 al 10% en metanol por 15 minutos posterior a lo cual los tejidos fueron lavados

con TPB a temperatura ambiente 3 veces por 5 minutos e incubados por 18 horas en

cámara húmeda con anticuerpo primario en diferentes diluciones (Tabla A1) preparadas

en BSA al 1% en TPB. Posteriormente, se realizaron 3 lavados de 5 minutos con TPB,

se incubaron los tejidos con los respectivos anticuerpos secundarios conjugados con

HRP (dilución 1:1000) en BSA al 1% en TPB y se hizo el revelado en solución de

Diaminobencidina 0,7 mg/mL (DAB) por 15 min, posterior a lo cual se lavaron los tejidos

con agua común y luego con agua destilada. Adicionalmente se hizo una contra-tinción

con hematoxilina para observar los núcleos celulares.

Tabla A 1. Anticuerpos primarios probados para la detección por IHC de Pgp y BCRP

Anticuerpo primario Diluciones Anticuerpo secundario

Anti-BCRP (ABCG2) policlonal B-25 Santa Cruz sc-1309333 hecho en conejo

1:50 1:250

Anti-Conejo conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)

Anti BCRP (ABCG2) policlonal D-20 Santa Cruz sc-25156 hecho en cabra

1:20 1:100

Anti-Cabra conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)

Anti-Pgp (MDR1) policlonal C-19 sc-1517 hecho en cabra

1:50 1:250

Anti-Cabra conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)

Anti-Pgp (MDR1) policlonal LifeSpan Biosciences LS c178472 hecho en conejo

1:50 1:250

Anti-Conejo conjugado con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA)

80

Resultado

Se obtuvo tinción positiva para los anticuerpos Anti BCRP (ABCG2) policlonal D-20 Santa

Cruz sc-25156 hecho en cabra (dilución 1:20) y Anti-Pgp (MDR1) policlonal LifeSpan

Biosciences LS c178472 hecho en conejo (dilución 1:50), por lo cual fueron empleados para

la detección por inmunocitoquímica por microscopía confocal de las proteínas ABC Pgp y

BCPR (Figura A2).

Figura A 2. Inmunohistoquímica en tejido de Glioblastoma para la inmunodetección de Pgp y BCRP. El tejido procesado fue incubado con diferentes diluciones de los anticuerpos contra los dos transportadores. Se muestra la tinción obtenida para los anticuerpos Anti BCRP (ABCG2) policlonal D-20 Santa Cruz sc-25156 hecho en cabra (dilución 1:20) y Anti-Pgp (MDR1) policlonal LifeSpan Biosciences LS c178472 hecho en conejo (dilución 1:50)

81

Figura A 3. Curvas de Eficiencia qRT-PCR para los genes Beta-actina, BCRP (ABCG2), Pgp (MDR1). Se preparó una mezcla de diferentes cDNA a partir de la cual se prepararon diluciones sucesivas. Los valores de concentración se expresan como Logaritmo de la dilución correspondiente. Se muestra una regresión lineal de CT versus Log de la concentración.

Anexo 3: Curvas de eficiencia para los genes

B-actina, BAX, BCRP (ABCG2) y Pgp (MDR1)

82

Anexo 4: Estandarización del uso del

inhibidor de APE-1 E3330

Evaluación del efecto de E3330 en la viabilidad celular y en la

generación de ROS

Se evaluó el efecto de E3330 en diferentes concentraciones sobre la viabilidad celular. Se emplearon concentraciones de E3330 de 100 µM, 50 µM, 30 µM y 10 µM por 12 y 24 horas de acuerdo a lo reportado en la literatura161. Para la concentración de 100 µM no fue posible evaluar la viabilidad pues posterior a los tiempos de tratamiento el número de células viables era muy bajo. Se evidencia que la reducción en la viabilidad es significativa para los tratamientos con E3330 en las concentraciones de 30 y 50 µM a las 24 horas, mientras que la concentración de 10 µM no generó cambios significativos en el porcentaje de viabilidad en los tiempos evaluados. En cuanto al número de células viables se observa una disminución significativa en los tratamientos con E3330 50 µM a las 12 horas, y con E3330 50 µM y 30 µM a las 24 h mientras que con la concentración de 10 µM no se observaron cambios (Figura A4).

a)

83

Se evaluó además el efecto de E3330 en las diferentes concentraciones sobre los niveles de ROS (Figura A5)

Se evidencia que a las 12 horas de tratamiento hay un incremento significativo en los niveles

de ROS tanto para la concentración de 10 µM como para 30 µM, con posterior disminución

a las 24 horas para las dos concentraciones. Considerando que E3330 inhibe la función

redox de la endonucleasa APE-1 se esperaba de acuerdo a lo reportado en la literatura,

que su inhibición generara una aumento en los niveles de ROS161, entonces estos

resultados sugieren que estas dos concentraciones el inhibidor son efectivas. Para

posteriores experimentos se eligió la concentración de 10 µM que permitió obtener un

aumento significativo en los niveles de ROS sin generar cambios importantes en la

viabilidad celular

b)

Figura A4 Evaluación de la Viabilidad en células HT29-WT. Las células fueron tratadas con E3330 10 µM, 30 µM o 50 µM por 12 o 24 horas, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). Se muestran: a) Porcentaje de viabilidad y b) Número de células viables totales. n=2, t de student, * = p value <0.05

84

Figura A 5 Evaluación de los niveles de ROS células HT29-WT con E3330. Las células fueron tratadas con E3330 10 µM o 30 µM por 12 o 24 h, o permanecieron sin tratamiento (NT: No tratadas). WT n=2, t de student, * = p value <0.05. (UR: Unidades Relativas).

85

Anexo 5: Datos del análisis estadístico por t-student

Tabla A 2. Análisis estadístico por t-Student para los niveles de ROS en células HT29-WT evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina (Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en presencia del inhibidor E3330 (Doxo+E; Co+E; Doxo+Co+E). Se emplearon como controles las células No tratadas (NT) o tratadas solo con el inhibidor (E3330).

86

Tabla A 3 Análisis estadístico por t-Student para los niveles de ROS en células HT29-DxR evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina (Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en presencia del inhibidor E3330 (Doxo+E; Co+E; Doxo+Co+E). Se emplearon como controles las células No tratadas (NT) o tratadas solo con el inhibidor (E3330).

87

Tabla A 4.Analisis estadístico por t-Student para los niveles del transportador Pgp en a) células HT29-WT y b) HT29 DxR evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina (Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en presencia del inhibidor E3330 (E3330+Doxo;E3330+Co; E3330+Doxo+Co). Se emplearon como controles las células No tratadas (NT) o tratadas solo con el inhibidor (E3330).

a)

b)

88

Tabla A 5 Análisis estadístico por t-Student para los niveles del transportador BCRP en a) células HT29-WT y b) HT29 DxR evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina (Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en presencia del inhibidor E3330 (E3330+Doxo;E3330+Co; E3330+Doxo+Co). Se emplearon como controles las células No tratadas (NT) o tratadas solo con el inhibidor (E3330).

a)

b)

89

Tabla A 6 Análisis estadístico por t-Student para los niveles del transportador Pgp en a) células HT29-WT y b) HT29 DxR

evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina (Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y

Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en presencia del antioxidante NAC (NAC+Doxo; NAC+Co; NAC+Doxo+Co). Se

emplearon como controles las células No tratadas (NT) o tratadas solo con NAC

a)

b)

90

Tabla A 7 Análisis estadístico por t-Student para los niveles del transportador BCRP en a) células HT29-WT y b) HT29 DxR

evaluando las diferencias entre los tratamientos con Doxorrubicina (Doxo), Cloruro de Cobalto (Co), Doxorrubicina y

Cloruro de cobalto (Doxo+Co) y estos en presencia del antioxidante NAC (NAC+Doxo; NAC+Co; NAC+Doxo+Co). Se

emplearon como controles las células No tratadas (NT) o tratadas solo con NAC

a)

b)

91

Anexo 6: Estandarización evaluación niveles de ROS y uso de antioxidantes

Figura A 6. Estandarización del uso de antioxidantes en células HT29-WT. Las células fueron tratadas por 12 horas con peróxido de hidrógeno H2O2 en presencia de los antioxidantes ácido ascórbico (AA) y N-acetilcisteína (NAC) en diferentes concentraciones. n=3), t de student, * = p value <0.05. (UFL: Niveles de Fluorescencia)).

Se evidencia que para las concentraciones de ácido ascórbico (AA) de 100 y 25 µM hubo una disminución significativa en los niveles de ROS. Para la N-acetilcisteína se observa que todas las concentraciones empleadas generaron una disminución significativa en los niveles de ROS. Considerando que la mayor reducción se obtuvo con NAC 1mM se decidió emplear esta concentración para los experimentos posteriores.

92

Anexo 7: Evaluación de mRNA PUMA por PCR

convencional

Metodología

Para evaluar el efecto del tratamiento con H2O2 sobre sobre la expresión del gen PUMA en las células HT29-WT se empleó la técnica de PCR convencional. Esta determinación se realizó utilizando los siguientes primers: sentido 5’- GACCTCAACGCACAGTACGAG-3’ y antisentido 3’- AGGAGTCCCATGATGAGATTGT-5’ (Fragmento de 98 pb). Se empleó la Taq Polimerasa Recombinante Invitrogen® con la cual se preparó una mezcla de reacción que contenía Desoxirribonucleótido trifosfato dNTPs (deoxyribonucleotide triphosphate), cloruro de magnesio (MgCl2) y primers sentido y antisentido con un volumen total de 25 µL, y se corrió el programa en el termociclador T100™Bio-Rad con los ciclos de temperatura previamente estandarizados (Tabla 2). Posteriormente los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa empleando el reactivo GelRed Nucleic Acid Stain (Biotium®) para la detección de los ácidos nucleicos en luz ultra violeta y empleando un patrón escalera de DNA para estimar el peso molecular de los fragmentos obtenidos (50bp DNA Step Ladder Promega®). La imagen del gel en ultravioleta fue obtenida en el fotodocumentador MyECL™Imager Thermo Fisher Scientific.

Tabla A 8 Concentraciones y cantidades de reactivos empleadas en la PCR convencional

Reactivo Concentración Inicial

Volumen para 1 reacción (µL)

Concentración Final

Agua calidad biología molecular

No aplica Completar a 25 µL

No aplica

Buffer PCR 10x 2,5 1x

dNTPs 10mM 0,5 0,2 mM

MgCl2 50mM 0,75 1,5 mM

Primer Sentido 10µM 1,25 0,5 µM

Primer Antisentido 10µM 1,25 0,5 µM

Taq polimerasa 5 U/µL 0,2 2 U

93

Figura A 7. PCR Convencional para PUMA. Células HT29-WT tratadas con H2O2 200 µM por diferentes tiempos y fueron posteriormente evaluadas

Tabla A 9 Protocolo PCR convencional PUMA y B-Actina

Paso del Ciclo Temperatura Tiempo Ciclos

Desnaturalización Inicial 94°C 3 min 1

Desnaturalización 94°C 45 s

30 Anillamiento PUMA:56°C; B-

actina: 60°C 30 s

Extensión 72°C 1:30 min

Extensión final 72°C 10 min 1

Mantenimiento 4°C Infinito 1

Resultado

Evaluación del efecto del peróxido de hidrógeno sobre los niveles de

PUMA por PCR convencional Considerando que uno de los posibles mecanismos por los cuales el estrés oxidativo puede inducir muerte celular es la apoptosis, se evaluaron los niveles de mRNA de PUMA, proteína involucrada en procesos proapoptóticos226,227.

Se evidenció que para los tratamientos de 12 y 24 horas hay una disminución en los

niveles del mRNA de PUMA respecto a las células no tratadas. Llama la atención la

disminución en los niveles de PUMA a las 24 horas, tiempo en el cual también se

observaron niveles más bajos de ROS respecto a los tratamientos de 12 y 48 h. Estos

resultados podrían indicar que la célula podría estar activando mecanismos de defensa

frente a la apoptosis inducida por estrés oxidativo, evidentes a las 24horas de

tratamiento sin embargo los resultados de viabilidad indican que estos mecanismos

podrían no ser suficientes o que el peróxido podría estar induciendo otras vías de

muerte celular.

94

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8. R

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.

Anexo 8. Resumen gráfico metodología

95

96

97

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