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Un estudio realizado para determinar si Passoflora ligularis "granadilla" tiene algun efecto negativo en el crecimiento de cepas bacterianas como S. aureus. Ademas de realizar su respectivo tamizaje fitoquímico preliminar y una evaluacion de toxicidad del extracto de esta planta
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EFECTO DEL EXTRACTO ETANOLICO DE Passiflora ligularis Juss. “granadilla” EN EL CRECIMIENTO DE UNA CEPA
BACTERIANA DE Staphylococcus aureus
RESUMEN
Un problema actual que afronta la medicina es la resistencia que vienen adquiriendo
microorganismos patógenos, una bacteria Staphylococcus aureus muestra un claro
ejemplo de ello. Es así que la presente investigación busco determinar si el extracto
de “granadilla” tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de una cepa de S. aureus
en condiciones de laboratorio, además de determinar su toxicidad. Para ello se
preparó un extracto etanólico de las hojas de granadilla, y haciendo uso del método
de difusión en disco Bauer se evaluó el diámetro de inhibición. Los Grupos C3 (100
mg/ml) y C4 (200 mg/ml), los de mayor concentración, fueron los únicos que
mostraron diferencias significativas en relación al grupo control (C) con un nivel de
significancia p<0.05. En el bioensayo con Artemia salina se encontró que los
tratamientos C, D Y E presentan diferencias significativas con respecto al grupo
control con un nivel de significancia p<0.05, sin embargo el tratamiento B cuya
concentración fue de 1 µg/ml no mostro significancia alguna respecto al grupo control
(A).
Se concluye que el extracto de P. ligulares es moderadamente toxico y que posee un
reducido potencial de inhibición frente al crecimiento de S. aureus.
Palabras claves: Passiflora ligularis, Staphylococcus aureus, inhibición, toxicidad,
Artemia salina.
I. INTRODUCCIÓN
Las plantas medicinales han acompañado al ser humano desde la más remota
antigüedad, no hay cultura que no haya desarrollado su propia flora medicinal, la
cual es generalmente transmitida por tradición oral (Salaverry y Cabrera, 2014). Ya
desde tiempos inmemoriales numerosas poblaciones indígenas de todo el mundo,
algunas de niveles culturales muy elevadas, tuvieron como base de supervivencia el
uso de diversos productos que extraían de los bosques que constituían su habitad.
Entre tales productos se encuentran los empleados con fines medicinales (Vattuone
y col., 2010). Dentro de su flora Perú cuenta con especies vegetales muy variadas,
con propiedades medicinales, las cuales no se han difundido debido al escaso
conocimiento científico que se tiene de ellas y al poco apoyo que en general se le
brinda a la investigación.
Actualmente el consumo de frutas y verduras está ganando la atención de
todo el mundo por los beneficios para la salud que incluye propiedades
cardioprotectoras, contra el cáncer, anti-diabéticas y anti-obesidad. Los compuestos
bioactivos como polifenoles, incluyendo los flavonoides, taninos, catequinas,
vitaminas C y E, β -caroteno, etc., y varios otros confieren estos beneficios
protectores de la salud. La mezcla de estos compuestos puede proporcionar una
mejor protección debido a sus efectos sinérgicos (Saravanan y Parimelazhagan,
2014).
El género Passiflora constituye una enorme riqueza, tanto a nivel
económico, como nutricional y de recursos genéticos. Algunas pasifloras tienen
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propiedades sedativas, antiespasmódicas y "antibacteriales". Es bien conocido por
sus usos comerciales, muchas especies son ampliamente cultivadas para la
producción de frutas. Otras especies se utilizan como plantas ornamentales por sus
flores de colores vivos. El conocimiento farmacológico del género Passiflora indica
su potencial para el desarrollo de fármacos ansiolíticos y sedantes. Un número
significativo de especies ha sido utilizado en la medicina popular tradicional en
muchos países, como remedio para tratar la ansiedad, el insomnio, la histeria, la
epilepsia, los espasmos y el dolor (Carvajal de Pabón y col., 2011).
P. ligularis es una planta originaria de América Tropical, nativa y cultivada
por los antiguos peruanos debido a sus deliciosos frutos; es una especie trepadora
mediante zarcillos, completamente glabra, con tallos cilíndricos de varios metros de
longitud, cultivada en los Valles Interandinos, Región Andina y Sierra peruana
ubicados entre los 800 – 2500 m.s.n.m. (Mostacero y col., 2009). Dada las
propiedades curativas de esta planta, se utilizan tanto las hojas como el fruto en la
industria química y farmacológica. Se trata de una fruta con propiedades diuréticas
y digestivas, la infusión de las hojas de la planta se utiliza para controlar la fiebre y
la tifoidea (Medina, 2006). La decocción del tallo y la cascara del fruto se usa en
patología digestiva, respiratoria y afecciones hepáticas. La infusión y tintura de las
hojas y tallos es útil para tratar hipertensión, diabetes, cistitis, anemia y diarrea.
Hojas y tallo en decocción, para baños externos, son útiles en afecciones de la piel.
El fruto, las hojas tiernas y las flores tienen propiedades analgésicas, diuréticas,
contra el dolor abdominal, sedante, baja la fiebre, expulsa parásitos intestinales,
fluidifica el moco bronquial y es cicatrizante (Restrepo de Fraume y col., 2005).
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Por sus propiedades medicinales, los frutos del género Passiflora son una
alternativa para el control de enfermedades digestivas, por lo cual tienen un alto
potencial de mercado. Estudios recientes mostraron que las partes herbales (hojas y
flores) de este género poseen propiedades bioactivas y farmacológicas altamente
efectivas (Li y col., 2011), una de ellas es la actividad ansiolítica encontrada en los
extractos de la flor (Pallo, 2012). Dhawan y col., (2004) en P. edullis y P. incarnata
determinaron la presencia de compuestos activos como alcaloides, fenoles,
cianogenicos y flavonoides glicosilados. Por otra parte indican que los alimentos
ricos en compuestos polifenólicos tienen alta relación con la capacidad antioxidante;
igualmente Bisignano y col., (1999) encontraron que la actividad antimicrobiana
está estrechamente ligada a los compuestos bioactivos presentes en las partes
herbales de las plantas.
A pesar del desarrollo de numerosos medicamentos antimicrobianos en los
últimos años, la incidencia de resistencia a los fármacos múltiples por
microorganismos patógenos ha aumentado. Hoy en día las propiedades terapéuticas
de polifenoles vegetales también han demostrado efectos antimicrobianos por
causar daño estructural o funcional a la membrana celular bacteriana. Varios
estudios también han demostrado que las frutas ricos en polifenoles ejercen tanto los
efectos antioxidantes y antimicrobianos (Saravanan y Parimelazhagan, 2014).
Staphylococcus aureus es el mayor patógeno humano causante de
infecciones a la piel y tejidos, neumonía, septicemia e infecciones por dispositivos
asociados. La emergencia de cepas resistentes a meticilina y otros agentes
antibacteriales ha llegado a ser una preocupación mayor especialmente en el
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ambiente hospitalario, esto es por la alta mortalidad debido a las infecciones
sistémicas ocasionadas por Staphylococcus aureus (Mamani y col., 2006).
Desde el primer aislamiento de S. aureus resistente a la oxacilina (SAOR)
obtenido en Inglaterra en 1961, se ha ido incrementando el número de casos de
aislamientos resistentes hasta llegar a la actualidad. Tanto es así, que en la
actualidad SAOR constituye un patógeno en la que este microorganismo se
encuentra distribuido en todo el mundo en porcentajes variables hospitalario
frecuente, que produce estancias en el hospital más largas y costos de salud
crecientes, con una proporción de mortalidad alta (Perazzi y col., 2010).
En este contexto y por lo expuesto anteriormente la presente investigación
tiene como finalidad evaluar en el laboratorio el efecto inhibitorio que produce el
extracto etanólico de Passiflora ligularis en el crecimiento de una cepa de
Staphylococcus aureus, y determinar mediante el bioensayo de toxicidad en Artemia
salina si dicho extracto es inocuo para la salud.
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II. MATERIAL Y METODOS
Área de estudio
La investigación se realizó en la ciudad de Trujillo, siendo los análisis de la
marcha fitoquímica, el bioensayo de toxicidad en Artemia salina y la prueba de
antibiograma con una cepa bacteriana, desarrollados en el Laboratorio de
Fitoquímica del Departamento Académico de Química biológica y Fisiología
Animal de la Universidad Nacional de Trujillo.
Planta y preparación del extracto etanólico
Las hojas de Passiflora ligularis “granadilla” se colectaron en los jardines de
la Ciudad Universitaria. Se lavaron en agua potable y agua destilada y se dejaron
secar a temperatura ambiente. Para la preparación del extracto se cortaron las hojas
en trozos muy pequeños y se colocó 70 gr de la muestra a macerar en 350 ml de
etanol de 96° durante un periodo de 7 días a temperatura ambiente, agitando el
envase por 5 minutos dos veces al día. Al cabo de ese tiempo, se procedió a reflujar
el macerado por 1 hora y media, el sobrenadante se filtró en caliente, se vertió en
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una placa Petri y se secó por per-vaporación hasta que se logre una consistencia
pastosa. El extracto seco se mantuvo en refrigeración hasta su posterior uso.
Marcha fitoquímica preliminar
Para la determinación de los distintos grupos de fitoconstituyentes del
extracto se realizó la marcha fitoquímica propuesta por Lock de Ugaz (1994) con
ligeras modificaciones (Figura 2).
Bioensayo de toxicidad en Artemia salina
Los nauplios de Artemia salina fueron obtenidos de un acuario de la ciudad
de Trujillo, una vez en laboratorio estos fueron colocados en un recipiente que
estuvo sometido a un constante burbujeo con una bomba de oxígeno. Para la
preparación de las distintas concentraciones se disolvió 20 mg de la muestra
(extracto) en 2 mL agua de mar (previamente filtrada). A partir de esta solución, se
prepararon diluciones de 1000, 100, 10 y 1 µg/mL, transfiriendo a cada vial 500, 50,
5 y 0.5 µL respectivamente. Fueron 3 viales por cada concentración (9 en total). Se
hizo también un grupo control que contuvo solo agua de mar. En cada vial se
colocaron 10 nauplios y se agregó agua de mar hasta completar 5 mL por vial.
Luego de 24 horas se contaron el número de individuos muertos en cada vial.
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Ensayo in-vitro de actividad antibacterial
La actividad antimicrobiana en los extractos de P. ligularis se determinó
utilizando el método de difusión en disco Bauer (1966). Para la preparación del
medio de cultivo, en 200 ml de agua destilada se diluyeron 4.2 gr de medio Müller
Hinton y 3 gr de Agar-agar Oxoid. Se vertió aprox. 10 ml de medio de cultivo en
placa Petri y posterior a la solidificación del medio se inoculó con una suspensión
bacteriana de Staphylococcus aureus (Gram-positiva). En la superficie del medio
inoculado fueron dispuestos discos de antibióticos de 5 mm de diámetro
previamente impregnados con el extracto a distintas concentraciones (200 mg/ml,
100 mg/ml, 50 mg/ml y 25 mg/ml). Las placas Petri fueron llevados a incubación
durante 24 h a una temperatura de 37 °C. Se utilizó además un control con agua
destilada. Se realizaron tres repeticiones para cada tratamiento. La medición de la
inhibición microbiana de los extractos frente a la de los controles se determinó
midiendo el diámetro de los halos.
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III. RESULTADOS
Fitoconstituyentes del extracto
Tabla 1. Presencia o ausencia de los distintos grupos de metabolitos secundarios en el extracto etanólico de las hojas de Passiflora ligularis.
Fitoconstituyentes cantidadFlavonoides +
Taninos +++Esteroides ++
Cardenólidos +Alcaloides +
(+)=Baja cantidad; (++)=Mediana cantidad; (+++)=Alta cantidad
Bioensayo de toxicidad
Tabla 2. Número de individuos vivos, muertos y porcentaje de letalidad en nauplios de Artemia salina expuestos a diferentes concentraciones del extracto etanólico de Passiflora ligularis.
A (control) B (1 µg/ml)C (10 µg/ml)
D (100 µg/ml)
E (1000 µg/ml)
Vivos 9 9 5 2 1
Muertos 1 1 5 8 9
Letalidad (%)
6.7 10 50* 76.6* 90*
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* p<0.05 = existe diferencia significativa entre la comparación de medias del grupo control respecto a los demás grupos.
Actividad antimicrobiana del extracto
Tabla 3. Diámetro de los halos de inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus luego de 24 h. expuestos a las diferentes concentraciones de extracto etanólico de Passiflora ligularis.
C (control)C1 (25 mg/ml)
C2 (50 mg/ml)
C3 (100 mg/ml)
C4 (200 mg/ml)
Diámetro de
inhibición (cm)
0.9 1.3 1.2 1.7* 2.5* a, b
S2 0 0.16 0.01 0.01 0.14
* p<0.05 = existe diferencia significativa entre la comparación de medias del grupo control respecto a los demás grupos.
a
p<0.05 = existe diferencia significativa entre la comparación de medias del grupo C4 y el grupo C1.
b p<0.05 = existe diferencia significativa entre la comparación de medias del grupo C4 y el grupo C2.
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IV. DISCUSION
El análisis fitoquímico preliminar indica que en las hojas de Passiflora
ligularis se hallan una gran cantidad de compuestos fenólicos tales como taninos y
flavonoides, una moderada cantidad de esteroides y la presencia de cardenólidos y
alcaloides. Pallo (2012) obtuvo resultados que se asemejan a los nuestro señalando
que esta especie posee una gran cantidad de flavonoides y taninos, además al ser su
análisis mucho más amplio que el nuestro pudo determinar la presencia de una
buena cantidad de compuestos lactónicos y quinonas. En efecto son estos
compuestos químicos con acciones farmacológicas, los denominados principios
bioactivos, que constituyen muchas veces los ingredientes primarios utilizados por
laboratorios farmacéuticos como punto de partida en el desarrollo de formas
comerciales que serán patentadas para su uso terapéutico (Lopez, 2012).
Nuestros resultados en el bioensayo con Artemia salina sugieren que el
extracto de las hojas de “granadilla” posee una moderada toxicidad. También se
verifica en la Tabla 2 que los tratamientos C, D Y E presentan diferencias
significativas con respecto al grupo control con un nivel de significancia p<0.05, sin
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embargo el tratamiento B cuya concentración fue de 1 µg/ml no mostro significancia
alguna respecto al grupo control (A). Esto quiere decir que a partir de la concentración de
10 µg/ml hacia adelante el extracto mostró un marcado porcentaje de letalidad frente a los
nauplios de A. salina y que el porcentaje de letalidad es directamente proporcional al
aumento de la concentración del extracto. Rojas y Diaz (2009) en condiciones
experimentales, determinaron que la administración oral a dosis repetidas durante
28 días del extracto metanólico de las hojas de Passiflora edulis, en ratas, no mostró
toxicidad fisiológica, morfológica, neurológica, de comportamiento, bioquímica
sanguínea ni a nivel anatomopatológico. El hecho de que ambas especies
pertenezcan a la misma familia y género brinda información necesaria para poder
sugerir que las plantas del género Passiflora no contienen en su composición
metabolitos que le confieran toxicidad a estas especies, de ser así la toxicidad podría
llegar a ser considerada únicamente moderada.
En cuanto a la capacidad de P. ligularis para inhibir el crecimiento
bacteriano de una Gram positiva los resultados se muestran en la Tabla 3. Las cepas
de Staphylococcus aureus expuestas a las diferentes concentraciones del extracto P.
ligularis mostraron una mayor inhibición en su crecimiento con respecto al grupo
control, sin embargo los grupos C3 (100 mg/ml) y C4 (200 mg/ml), los de mayor
concentración, fueron los únicos que mostraron diferencias significativas en
relación al grupo control (C) con un nivel de significancia p<0.05 la exposición de
la cepa a concentraciones menores, grupo C1 (25 mg/ml) y C2 (50 mg/ml)
prácticamente inhibió en absoluto el crecimiento de la bacteria. Cabrera y col.
(2014) determinaron que los extractos de Passiflora ligularis tienen la capacidad
para inhibir el crecimiento de cepas Gram negativa como E. coli y de Gram positiva
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como S. aureus, siendo en la primera el efecto mucho mayor que en la segunda.
Resultados similares fueron obtenidos por Kannan y col. (2010) al exponer las
mismas bacterias frente al extracto de P. mollisima.
Tavares (2000) consideran que la posible causa de este efecto en el
crecimiento de E. coli son las alteraciones en la membrana celular en contacto con
extracto de Passiflora, debidas al efecto de las las saponinas que se encontraron en
dicha especie sobre la doble capa de lípidos presente en la membrana de las
bacterias Gram negativas. Los polifenoles vegetales también han demostrado
efectos antimicrobianos por causar daño estructural o funcional a la membrana
celular bacteriana. Varios estudios también han demostrado que las frutas ricos en
polifenoles ejercen tanto los efectos antioxidantes y antimicrobianos (Saravanan y
Parimelazhagan, 2014). Otros estudios también han confirmado la capacidad
inhibitoria de los extractos de Passiflora sobre distintos microorganismos
patógenos, Bendini y col. (2006) mostraron la presencia de actividad antimicrobiana
en extractos metanolicos de hojas de P. nitida y P. foetida sobre la cepa E. coli.
Alam Ripa y col. (2009) encontraron que los extractos cloroformicos de hojas y
tallos de P. edulis tienen efecto antimicrobiano sobre S. aureus y E. coli. Por último
Saravanan y Parimelazhagan (2014) indican que los frutos de P. ligularis posee
actividad antibacteriana contra bacterias Gram (+) y bacterias Gram (-), además
inhibe las cepas de hongos Candida albicans y Aspergillus niger presentando halos
de inhibición de 14,85 mm y 13,91 mm respectivamente en el método de difusión
en disco.
Con base en los resultados obtenidos podemos afirmar que el extracto de P.
ligularis mostró un reducido potencial inhibitorio con respecto a la cepa de
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Staphylococcus aureus debido a que en nuestros resultados solo se observaron halos
de inhibición a concentraciones muy elevadas del extracto. Aun así presenta una
buena actividad antibacteriana contra otras cepas Gram negativas y una marcada
actividad antifúngica. Es así como estos resultados para P. ligularis, posicionan a
esta especie vegetal como una posible potencial fuente de sustancias biocidas para
determinadas tipos de microorganismos patógenos con posible utilidad a nivel
comercial o como uso para tratamientos alternativos por lo que cabe considerar a
esta especie como un interesante objeto de estudio.
V. CONCLUSIONES
Se encontró que Staphylococcus aureus fue una bacteria muy resistente ante
el efecto inhibitorio del extracto de Passiflora ligularis, Así como también en el
bioensayo de toxicidad frente a Artemia salina se determinó que el extracto de las
hojas de esta especie fue moderadamente toxico.
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VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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14 |
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Tavares, W. (2000). Bacteria gram positivas problemas: resistencia do estafilococo, do enterococo e de pneumococo aos antimicrobianos. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 33,3.
15 |
Vattuone, M., Martinez, R. y Corzo, A. (2010). Actividad antimicrobiana de extracto de hojas de Caesalpinia paraguariensis, Par. Burk, “Guayacan”.
ANEXOS
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ANEXO 1
PREPARACION DEL EXTRACTO ETANOLICO
Figura 1. Obtención del macerado y puesto a secar
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ANEXO 2
MARCHA FITOQUIMICA
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Figura 2. Marcha fitoquímica preliminar
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Figura 3. Reacciones de identificación de metabolitos secundarios
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ANEXO 3
BIOENSAYO DE TOXICIDAD
Figura 4. Diluciones a diferentes concentraciones preparadas a partir del extracto para el bioensayo en Artemia salina
Figura 5. Colocación de los nauplios en cada vial
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ANEXO 4
ACTIVIDAD ANTIBACTERIAL
Figura 6. Diluciones a distintas concentraciones preparados a partir del extracto para el ensayo de inhibición de Staphylococcus aureus
Figura 7. Placas con medio de cultivo listas para sembrar
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Figura 8. Inoculación de las bacterias en las placas
Figura 9. Observación y medición del diámetro de los halos de inhibición
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