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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
ANA FLÁVIA SPADACCINI SILVA
Londrina 2016
EFEITO DA IRRADIAÇÃO ULTRASSÔNICA CONTÍNUA EM
FIBROBLASTOS L929
ANA FLÁVIA SPADACCINI SILVA
Cidade ano
AUTOR
Londrina
2016
EFEITO DA IRRADIAÇÃO ULTRASSÔNICA CONTÍNUA EM
FIBROBLASTOS L929
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado entre Universidade Estadual de Londrina - UEL e Universidade Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências da Reabilitação Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
Ana Flávia Spadaccini Silva
EFEITO DA IRRADIAÇÃO ULTRASSÔNICA CONTÍNUA EM FIBROBLASTOS
L929
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Ciências da Reabilitação,
área e concentração em Ciências da Saúde, como requisito parcial para a obtenção
do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
_________________________________________ Prof. Dr. Rodrigo Franco de Oliveira
(Orientador) Universidade Norte do Paraná - UNOPAR
_________________________________________ Prof. Dr. Deise Aparecida de Almeida Pires Oliveira
(Membro Interno) Universidade Norte do Paraná - UNOPAR
_________________________________________ Prof. Dr. Berlis Ribeiro dos Santos Menossi
(Membro Externo) Universidade Estadual do Norte do Paraná - UENP
Londrina, 02 de dezembro de 2016.
Dedico este trabalho à minha família, os quais sempre me incentivaram em todos os meus sonhos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus, que na sua infinita misericórdia me permitiu
viver este sonho e me sustentou até aqui. Agradeço também, por ter nos
presenteado com a Sua mãe. Mãe essa que esteve à frente de cada etapa, cada
passo dado neste trabalho.
Serei eternamente grata aos meus pais, Renato e Angela, por todos os
esforços realizados, por sempre estarem ao meu lado, por todo o apoio, por serem
a minha base e alicerce. Deus não poderia ter me dado pais melhores, os quais
muitas vezes privaram seus próprios sonhos para realizar os meus.
Estendo o agradecimento a toda a minha família, os quais sempre me
apoiaram e rezaram por mim. Em especial à minha afilhada Camila, por ser um raio
de sol que me alegra em todos os momentos e à minha avó Adelina, por todas as
orações à Deus, intercedendo por mim.
Agradeço ao meu noivo, Amauri, o qual esteve ao meu lado o tempo todo
dizendo que tudo ia dar certo. Obrigada por muitas vezes deixar seu trabalho para
me ajudar, por ter paciência e compreensão. Obrigada por ser meu porto seguro,
aquele para quem eu sempre quero voltar depois de um longo dia.
Ao meu orientador, Professor Rodrigo Franco Oliveira, meu muito obrigada!
Por ter me dado a oportunidade de um dia iniciar no Programa de Mestrado como
aluna especial, por ter me dado um voto de confiança em me orientar e por ser um
profissional exemplar, o qual quero seguir. Estendo o meu agradecimento à sua
esposa, Professora Deise Almeida Pires Oliveira, por colaborar com o trabalho e
com a minha formação profissional, e por todo o apoio dado nesta caminhada.
À minha amiga-irmã, Mayra, também dirijo os meus agradecimentos, por
todos os momentos que vivenciamos juntas. Em toda a minha formação profissional
pude contar com a sua parceria, e espero que esta dure para sempre. Agradeço
por estar por perto sempre, e por comer doce comigo para aliviar a tensão mesmo
estando de regime para o casamento.
Agradeço à todas as meninas do laboratório, toda ajuda foi essencial!
Simples coisas fazem a diferença. Obrigada por não medirem esforços, sempre
ajudando na realização deste trabalho.
Agradeço à Professora Berlis Ribeiro dos Santos Menossi, por ter aceitado
ser membro da banca deste trabalho, mas acima de tudo, por ter participado da
minha formação profissional na graduação e hoje estar colaborando de alguma
forma com a minha pós-graduação. Grande foi a sua contribuição no meu
profissionalismo hoje, sendo a primeira que me incentivou a um dia fazer o
mestrado.
De uma forma geral, agradeço a todos, professores e amigos, que de alguma
forma colaboraram com o presente estudo e com a minha formação profissional.
“Tudo tem seu tempo. Há um momento oportuno para tudo que acontece debaixo do céu”.
(Eclesiastes 3, 1)
RESUMO
As investigações da aplicação do ultrassom para promover reparo tecidual e cicatrização
pode demonstrar diferenças quando os efeitos são analisados in vitro. Tendo em vista a
variedade de parâmetros e a escassez de estudos in vitro que demonstrem os efeitos do
ultrassom contínuo, o objetivo do presente estudo foi analisar o efeito do ultrassom
terapêutico contínuo em cultura celular de fibroblastos L929. As células L929 foram
cultivadas em garrafas de 25 cm³ contendo 90% de meio MEM, suplementados com 10%
soro fetal bovino, com 1% antibiótico e antimicótico e mantidas na estufa de CO2 em
atmosfera de 5% a 37°C. Para a irradiação com o ultrassom, as células foram subcultivadas
em placas de 12 poços e divididas em três grupos: Controle, 0,3 W/cm²-100% 1MHZ e 0,6
W/cm²-100% 1MHz, sendo irradiadas e avaliadas seguindo os tempos de incubação: 24, 48
e 72 horas. A viabilidade celular foi avaliada pelo teste de citotoxicidade MTT, e para
analisar a morfologia celular, as células foram observadas diariamente, antes dos demais
testes, em um microscópio óptico e através da microscopia de fluorescência, utilizando os
marcadores rodamina-faloidina para analisar citoesqueleto e o DIOC6 para retículo
endoplasmático, foi possível observar as estruturas celulares. As doses 0,3 W/cm²-100% e
0,6 W/cm²-100%, associadas ao modo contínuo apresentaram resultados diferentes. A dose
0,3W/cm² apresentou viabilidade celular de 111,96% nas primeiras 24 horas, porém, não
apresentou diferença significativa (p=0,06). Em seguida, houve uma diminuição na
viabilidade celular nos tempos 48 horas para 55,56% (p=0,00) e 78,43% em 72 horas
(p=0,00). Esta mesma dose apresentou discreta alteração celular, retração dos filamentos de
actina do citoesqueleto e redução do número de vesículas do retículo endoplasmático. Já a
dose média 0,6W/cm² apresentou menor viabilidade celular em todos os tempos quando
comparada à dose 0,3W/cm² (p=0,00). Além da viabilidade, também apresentou alterações
na morfologia celular, acompanhada de agregação de fragmentos celulares e perda de adesão
da cultura, observados pela microscopia óptica. Ambas as doses podem ter produzido o
efeito de cavitação, e na ausência do efeito de absorção e atenuação normal dos tecidos in
vivo, ocasionaram diminuição da viabilidade celular quando aplicadas por 2 minutos em
intervalos de 24 horas por 3 dias. Portanto, sugere-se que o modo contínuo seja associado a
intensidades baixas para evitar danos à cultura e às estruturas celulares.
PALAVRAS-CHAVE: Ultrassom; Cultura celular; Fibroblastos
ABSTRACT
Investigations of ultrasound application to promote tissue repair and healing may
demonstrate differences when effects are analyzed in vitro. Considering the variety of
parameters and the lack of in vitro studies demonstrating the effects of continuous
ultrasound, the objective of the present study was to analyze the effect of continuous
therapeutic ultrasound on L929 fibroblast cell culture. L929 cells were grown in 25 cm³
bottles containing 90% MEM medium, supplemented with 10% fetal bovine serum, 1%
antibiotic and antimycotic and maintained in the CO2 oven in 5% atmosphere at 37 °C. For
irradiation with ultrasound, cells were subcultured into 12-well plates and divided into three
groups: Control, 0.3 W/cm²-100% 1MHZ and 0.6 W/cm²-100% 1MHz, irradiated and
evaluated, following the incubation times: 24, 48 and 72 hours. The cell viability was
evaluated by the MTT cytotoxicity test, and to analyze the cell morphology, the cells were
observed daily, before the other tests, in an optical microscope and by fluorescence
microscopy, using rhodamine-phalloidin markers to analyze cytoskeleton and the DIOC6 for
endoplasmic reticulum, it was possible to observe the cellular structures. The doses 0.3
W/cm²-100% and 0.6 W/cm²-100%, associated to the continuous mode presented different
results. The 0.3W/cm² dose presented cellular viability of 111.96% in the first 24 hours, but
did not present a significant difference (p=0.06). Thereafter, there was a decrease in cell
viability at 48 hours for 55.56% (p=0.00) and 78.43% at 72 hours (p=0.00). This same dose
presented a slight cellular alteration, retraction of the actin filaments of the cytoskeleton and
reduction of the number of vesicles of the endoplasmic reticulum. Meanwhile, the mean dose
0.6 W/cm² presented lower cell viability at all times when compared to the 0.3W/cm² dose
(p=0.00). In addition to the viability, it also presented alterations in cellular morphology,
accompanied by aggregation of cellular fragments and loss of culture adhesion, observed by
optical microscopy. Both doses may have produced the effect of cavitation, and in the
absence of the effect of absorption and normal attenuation of the tissues in vivo, caused a
decrease in cell viability when applied for 2 minutes, with 24 hours of intervals, for 3 days.
Therefore, it is suggested that the continuous mode must be associated with low intensities
to avoid damage to the culture and cellular structures.
KEYWORDS: Ultrasound; Cell culture; Fibroblasts
LISTA DE FIGURAS
Revisão de Literatura
Figura 1: Diferença entre fibroblasto e fibrócito .................................................................. 19
Figura 2: Vibração das ondas ultrassônicas quando penetram o tecido ............................... 21
Artigo
Figura 1: Esquema dos tempos de irradiação e avaliação de acordo com o protocolo ........ 34
Figura 2: Comparação da média de proliferação celular intra-grupo .................................. 36
Figura 3: Microscopia óptica: células L929 irradiadas com ultrassom ................................ 38
Figura 4: Microscopia de fluorescência ............................................................................... 39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Comparação intra-grupo nos tempos de incubação analisados ............................ 35
Tabela 2: Comparação das médias de proliferação celular entre os grupos ........................ 37
LISTA DE SIGLAS
UST - Ultrassom terapêutico
US - Ultrassom
EGF - fator de crescimento de epiderme
FGF - fator de crescimento dos fibroblastos
PDGF - fator de crescimento de derivados de plaquetas
TGF-β - fator de transformação do tecido
VEGF - fator de crescimento endotelial vascular
TIMPs - inibidores de metaloproteinases
KGF - fator de crescimento dos queratinócitos
MF - Microscopia de fluorescência
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 15
2- JUSTIFICATIVA............................................................................................................ 17
3- OBJETIVOS................................................................................................................... 18
3.1- Objetivo Geral .......................................................................................................... 18
3.2- Objetivos Específicos ............................................................................................... 18
4- REVISÃO DA LITERATURA....................................................................................... 19
4.1- PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO......................................................................... 19
4.1.1 Fase Inflamatória ................................................................................................. 19
4.1.2 Fase Proliferativa................................................................................................. 19
4.1.3 Fase de Remodelação .......................................................................................... 21
4.2- CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS ............................................................................. 21
4.3- ULTRASSOM .......................................................................................................... 23
4.3.1 Efeitos gerais do Ultrassom................................................................................. 24
4.3.2 Efeito Piezoelétrico ............................................................................................. 25
4.3.3 Cavitação ............................................................................................................. 25
4.3.4 Atenuação e Absorção ......................................................................................... 26
4.3.5 Regimes de pulso do ultrassom: pulsado e contínuo .......................................... 27
4.3.6 Estudos da irradiação ultrassônica in vitro .......................................................... 28
4.3.7 Aplicação clínica do ultrassom ........................................................................... 29
5- ARTIGO.......................................................................................................................... 30
9- CONSIDERAÇÕES GERAIS........................................................................................ 47
10 – REFERÊNCIAS......................................................................................................... 48
ANEXOS............................................................................................................................. 56
15
1- INTRODUÇÃO
A terapia ultrassônica vem sendo utilizada para promover o reparo de diversos tecidos,
principalmente do sistema musculoesquelético, devido ao fato de ser não-invasiva, segura e
de baixo custo, sendo que, o mecanismo de ação da mesma se dá através das ondas
ultrassônicas que causam vibrações e colisões moleculares, aumentando consequentemente a
atividade molecular1,2.
O aumento da atividade molecular causada pelo ultrassom terapêutico (UST) produz
efeitos nas células e tecidos através dos mecanismos térmicos e não térmicos. Os efeitos
térmicos são produzidos por ondas ultrassônicas contínuas, que levam a uma alteração térmica
nos tecidos, resultando numa elevação da temperatura tecidual. Os não térmicos resultam do
efeito mecânico da energia do ultrassom terapêutico, causando alterações como
micromassagem e cavitação estável dentro dos tecidos3,4.
Entre os parâmetros de aplicação do UST, a frequência do transdutor pode ser de 3
MHz, sendo esta mais superficial, com profundidade de 1 a 2 cm, ou de 1 MHz que atinge
tecidos mais profundos de 3 a 5 cm e o tempo de aplicação é influenciado pelo tamanho da
área a ser tratada e pela área de radiação efetiva (ERA) do transdutor³.
Os efeitos produzidos pelo UST dependem, também, do regime de pulso da energia
acústica, o qual pode ser contínuo ou pulsado. Quando aplicado o contínuo, a onda
ultrassônica é gerada continuamente durante toda a aplicação, sendo a energia produzida
100% do tempo. Já no pulsado, a intensidade é periodicamente interrompida e nenhuma
energia é produzida durante o período desligado5. Entretanto, na prática é extremamente difícil
distinguir os efeitos térmicos e não-térmicos, pois, as interações entre estes ocorrem
simultaneamente5.
A energia ultrassônica pode ser uma modalidade potente na geração de efeitos
biológicos. Dentre os efeitos terapêuticos, o ultrassom pode induzir efeitos como o
aquecimento dos tecidos, além de cavitação, ativação de gases, estresse mecânico ou outros
processos indeterminados6.
Além destes efeitos biológicos, o ultrassom possui ainda a ação de inibição da
atividade inflamatória, resultando na produção de mediadores químicos que ativam a
proliferação de fibroblastos, sendo estes fibroblastos células do tecido conectivo, as quais são
importantes para o restabelecimento do tecido e remodelação pós-lesão7.
No entanto, as investigações da aplicação do UST para promover reparo tecidual e
16
cicatrização pode demonstrar diferenças quando os efeitos são analisados in vitro. A
propagação da energia ocorre de partícula a partícula. Isso resulta em áreas de compressão e
rarefação, e esses são os efeitos da ação mecânica nas células analisadas. Os parâmetros do
ultrassom são diversos, fazendo com que seja difícil o controle e a reprodutibilidade dos
mesmos em culturas in vitro8.
Portanto, o presente estudo teve como objetivo analisar o efeito da irradiação
ultrassônica contínua 1MHz em fibroblastos L929.
17
2- JUSTIFICATIVA
A literatura traz uma grande variedade de parâmetros inconclusivos a respeito do US,
sendo que nela, diversos estudos demonstram os efeitos do US no regime de pulso pulsado,
entretanto, ainda são escassos estudos que analisem os efeitos da irradiação com o regime de
pulso contínuo. Além do fato de que, ao analisar in vitro, podemos observar os efeitos
causados a nível celular, os quais podem diferir e apresentar dificuldades para controlar 1, 4, 8,
76, 77, 78, 93, 97, 101, 102.
18
3- OBJETIVOS
3.1- Objetivo Geral
Analisar o efeito da irradiação ultrassônica contínua 1MHz em células fibroblásticas
L929.
3.2- Objetivos Específicos
Avaliar a viabilidade celular;
Avaliar as estruturas celulares, Retículo Endoplasmático e Citoesqueleto;
Identificar parâmetros de dosimetria de acordo com a irradiação do ultrassom no
regime de pulso contínuo.
19
4- REVISÃO DA LITERATURA
4.1- PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO
4.1.1 Fase Inflamatória
Esta fase inicia imediatamente após a lesão e pode durar até 48 ou 72 horas. Nesta
primeira fase, ocorrem hemostasia, migração de leucócitos e início da cascata de reparação
tecidual. Inicialmente, em resposta a agentes inflamatórios, há diminuição do afluxo
sanguíneo pela vasoconstrição. Com extravasamento de sangue dos vasos lesionados,
plaquetas são ativadas pelas substâncias da matriz extracelular que envolve o endotélio,
fazendo com que tenha início os processos de adesão e agregação celular9.
Em resposta a produção endotelial de eicosanoides e leucotrienos, há um aumento
progressivo da permeabilidade vascular às células migrantes e substâncias biologicamente
ativas. Deste processo surgiram elementos essenciais para a continuação fisiológica da
cicatrização: um arcabouço de fibrina, necessário para a migração das células que chegarão, e
os primeiros fatores de crescimento com atividade10,11.
Visando degradar elementos da matriz extracelular e tecido necrótico para facilitar a
migração celular no leito cruento, neutrófilos e macrófagos utilizam, além da fagocitose,
metaloproteinases (proteinases de elementos da matriz). Macrófagos também são importantes
por produzirem uma diversidade de fatores de crescimento, dentre os quais se incluem: fator
de crescimento de epiderme (EGF), fator de crescimento dos fibroblastos (FGF), fator de
crescimento de derivados de plaquetas (PDGF), fator de transformação do tecido (TGF-β) e
fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)11.
A quimiotaxia de fibroblastos e sua proliferação é uma das funções dos três primeiros
fatores de crescimento, sendo que FGF também atua positivamente na migração e proliferação
de queratinócitos, e TGF-β na deposição de elementos da matriz pelos fibroblastos. O VEGF
e o FGF atuarão como potentes fatores angiogênicos12,13.
4.1.2 Fase Proliferativa
O segundo estágio do processo de cicatrização é a fase de proliferação, que inicia por
volta do quarto dia após a lesão e se estende até 21 dias. Ela é caracterizada por angiogênese,
fibroplasia e reepitelização. Na fibroplasia ocorre migração e proliferação de fibroblastos,
sendo que, fibroblastos são células fusiformes com núcleo elíptico que constituem o maior
20
número de células do tecido conjuntivo, e sintetizam grande parte da matriz extracelular que
o compõe14, 15, 16, 17.
Na derme, tecido conjuntivo denso não-modelado, os fibroblastos são importantes na
secreção de proteoglicanos, fibronectina, elastina, laminina e colágeno, que é a proteína mais
abundante nos seres humanos e o principal componente da pele, constituindo 80% do peso
seco da derme e a base de sua estrutura e resistência9.
Nesta fase, migração e proliferação de fibroblastos ocorrem a partir das margens
livres da ferida e de células mesenquimais, ao passo que os principais estímulos
quimioatraentes e mitogênicos dos primeiros serão o EGF e o PDGF. Por outro lado, PDGF e
TGF-β induzirão a diferenciação dos fibroblastos em miofibroblastos, os quais expressam
α−actina, α−miosina e desmina15,16.
Estes fibroblastos diferenciados possuem capacidade de se contrair e se expandir,
movimentando-se, assim, pela ferida. Durante a movimentação dos miofibroblastos, ocorre
deposição de fibronectina sobre o arcabouço de fibrina. A nova estrutura de fibronectina é
denominada de fibronexus16.
Assim, começa a deposição de colágeno na ferida que se ligará à fibronectina em um
sítio diferente da fibrina. Na matriz extracelular cutânea ele pode se ligar à fibronectina e
laminina, sendo que nas células ele se conecta a receptores de integrina, estruturas estas supra-
reguladas pelo TNF-α18, 15, 17, 19.
Particularmente, na matriz dérmica há essencialmente dois tipos de colágeno: tipo I
e tipo III, correspondendo respectivamente a cerca de 80-85% e 15-20% do total desta
proteína. O tipo I apresenta diâmetro total de 1 a 20 μm e está localizado principalmente na
derme reticular, a mais profunda da pele. Já o colágeno tipo III, apresenta diâmetro de 0,5 a 2
μm e está presente, em sua maioria, na derme papilar, localizada mais superficialmente15, 17,
19.
Os fibroblastos também produzem TGF-β FGF, inibidores de metaloproteinases
(TIMPs) e fator de crescimento dos queratinócitos (KGF), sendo que este último tem ação
mais efetiva na reepitelização10,15.
A migração dessas células cessa pelo contato entre elas, com posterior síntese de
membrana basal e moléculas de adesão, além da queda da expressão de substâncias pró-
migração (ativador de plasminogênio, por exemplo). Além disso, a epiderme influencia o
processo de cicatrização produzindo VEGF, PDGF e TGF-β20, 21, 16, 15.
21
4.1.3 Fase de Remodelação
A terceira e última fase do processo de cicatrização é a remodelação, a qual inicial
ao final da fase proliferativa e pode se estender até 3 meses. Sendo o colágeno o principal
componente da derme, esta etapa constitui-se da mudança do tipo de colágeno que a compõe
e de sua disposição. O colágeno tipo III, inicialmente mais abundante que o tipo I, vai sendo
degradado mais ativamente com o decorrer do tempo, enquanto que o colágeno I vai tendo
sua produção aumentada pelos fibroblastos10,15.
Juntamente com a substituição do tipo de colágeno, ocorre uma alteração em sua
organização, a qual muda de fibras paralelas dispostas aleatoriamente para entrelaçadas e
organizadas ao longo das linhas de stress10,15.
Enquanto PDGF estimula maior degradação de colágeno I e síntese de colágeno III,
TGF-β induz maior secreção do primeiro e sua menor degradação por aumento da expressão
de TIMPs e menor da de MMPs, sendo a remodelagem e a contração da ferida parcialmente
controlada pela relação entre eles16, 10, 15.
A última fase do processo de cicatrização é responsável pelo aumento da resistência
do tecido. Ao final da primeira semana após o surgimento da ferida, ocorre restauração de 3%
da resistência da pele íntegra; da terceira semana, 30%, e de três meses, 80%, o que implica
em uma diminuição da deposição de colágeno, do número de ligações cruzadas feitas entre
monômeros desta substância e da mudança do tipo III para o tipo I10, 9.
4.2- CÉLULAS FIBROBLÁSTICAS
O tecido conjuntivo se constitui de fibroblastos, macrófagos, células
mesenquimatosas, indiferenciadas, mastócitos, plasmócitos e leucócitos, sendo que, os
fibroblastos são as células mais comuns. São responsáveis pela formação das fibras e do
material intercelular amorfo. Além disso, possuem a função de sintetizar colágeno, fibras
elásticas, reticulares e mucopolissacarídeos²².
Os fibroblastos originam-se de uma célula mesenquimal indiferenciada, e pode ser
considerado como a principal célula presente no tecido conjuntivo. Ela é responsável pela
formação das fibras colágenas, reticulares e elásticas, além das proteoglicanas e glicoproteínas
multiadesivas que fazem parte da matriz extracelular. As células fibroblásticas são atribuídas
também a formação de fatores de crescimento, que controlam a proliferação e a diferenciação
celular23, 24, 25.
22
Podem ser encontrados em sua forma ativa (fibroblasto) ou em repouso (fibrócito) e
são diferenciados pelo seu núcleo e citoplasma, os quais são ilustrados na Figura 1. Os
fibroblastos possuem vários prolongamentos citoplasmáticos irregulares, núcleo com
cromatina pouco densa, nucléolo pouco evidente e citoplasma rico em retículo endoplasmático
rugoso (RER) e aparelho de Golgi proeminente. Os fibrócitos, por sua vez, são menores,
delgados, de aspecto fusiforme, com núcleo menor e mais escuro e citoplasma com pouca
quantidade de RER23, 25.
Figura 1 – Diferença entre fibroblasto e fibrócito.
Fonte: JUNQUEIRA E CARNEIRO, 2013.
Dentre as estruturas presentes nas células, destacam-se citoesqueleto e o retículo
endoplasmático (RE), estruturas importantes na morfologia celular, uma vez que suas funções
estão diretamente relacionadas à proliferação celular26.
O citoesqueleto desempenha papel importante na morfologia celular por influenciar a
adesão e o crescimento da mesma, sendo constituído principalmente pela proteína actina,
disposta em filamentos e microtúbulos. Essa rede de actina é determinante para a vida celular,
pois fornece uma estrutura rígida de proteção ao núcleo e confere elasticidade da membrana
celular. Alterações no citoesqueleto permitem que a célula possa migrar, dividir-se e manter
a sua forma26.
O RE é encontrado na maioria das células, ocupando cerca de 10% do volume celular
formado por uma rede de membranas interconectadas na forma de tubos ou cisternas. Dois
tipos de retículo endoplasmáticos são observados: liso (ou agranular) e rugoso (ou granular)16.
23
O retículo endoplasmático liso, ou agranular é responsável pela síntese de hormônios
e de lipídios, a desintoxicação celular e o armazenamento de cálcio, enquanto que o retículo
endoplasmático rugoso, em parceria com os polirribossomos, tem um papel importante na
síntese de exportação de proteínas. As proteínas são capturadas pelo RE, por receptores
presentes na sua membrana, assim que começam a ser sintetizadas pelo complexo de
ribossomo16.
4.3- ULTRASSOM
Vários métodos terapêuticos para cicatrização têm sido descritos na literatura.
Tratamentos como laser de baixa potência, campos eletromagnéticos, estimulação mecânica
e terapia por ultrassom são aplicações que incluem efeitos locais e sistêmicos. Porém, muitos
dos estudos são contraditórios no que diz respeito à escolha do melhor recurso e parâmetros
dosimétricos adequados3, 27, 28.
Dentre os recursos presentes na literatura para o reparo tecidual, encontra-se o
ultrassom (US), que consiste de um transdutor piezoelétrico, podendo ser composto de cristais
de quartzo, Titanato zirconato de chumbo e de Titanato de Bário. Estes quando expostos às
cargas elétricas sofrem alterações em sua conformação estrutural causando transmissão de
ondas ultrassônicas29.
O US trata-se de uma potente ferramenta para os fisioterapeutas, por se tratar de um
recurso acessível que proporciona facilitação dos processos de reparação tecidual, que ocorre
através dos efeitos de compressão e rarefação mecânica, obtidos a partir da cavitação sônica
e sua interação com os diversos tecidos biológicos. Os resultados desta interação com os meios
biológicos são: formação de micro-bolhas, aumento da permeabilidade da membrana,
formação de novas redes capilares e síntese de colágeno pelos fibroblastos35, 36, 37, 38.
O mesmo é amplamente utilizado na prática clínica com aplicações diagnósticas e
terapêuticas, para tratar patologias articulares e para acelerar o processo de cicatrização de
feridas, por se tratar de um recurso seguro, não-invasivo e de baixo investimento para a prática
clínica. Especialmente, quando voltado à reparação de diversos tecidos, em particular, o
musculoesquelético1, 4, 33, 34, 39, 40, 41.
Apresenta um tipo de energia não-ionizante, que tem sido usada em várias aplicações
terapêuticas, incluindo sonoforese (droga transdermal ultrassônica) e em patologias
odontológicas, eliminando a formação de coágulos sanguíneos, e aumentando a
24
permeabilidade da membrana30, 31, 32.
Além de ser uma terapia não invasiva, as ondas acústicas de baixa frequência têm
melhor penetração no tecido que ondas acústicas de alta frequência devido seu comprimento
de onda, sendo assim, o US de baixa frequência pode facilmente penetrar o tecido profundo31.
As ondas acústicas, quando penetram a pele, geram vibrações em componentes
celulares, incluindo os fluídos intracelulares e extracelulares e membrana celular, causando
movimentos de partículas, a este efeito mecânico, atribui-se o efeito de micromassagem42, 43.
Esta vibração das ondas nos tecidos está ilustrada na Figura 2.
Figura 2 – Vibração das ondas ultrassônicas quando penetram o tecido.
Fonte: dravivianypaolucci.blogspot.com
Acesso: 10/09/2016
4.3.1 Efeitos gerais do Ultrassom
Dentre os recursos disponíveis para o tratamento de lesões, a utilização de terapias
alternativas não-invasivas na cicatrização tecidual tem mostrado de fundamental importância
para o estímulo da preservação das funções fisiológicas, da estrutura celular e para a melhora
na qualidade do tecido neoformado. Neste sentido, a energia ultrassônica é um dos
procedimentos físicos adjuvantes mais utilizados em fisioterapia e medicina regenerativa para
o tratamento de diversas doenças4, 44.
Seus efeitos terapêuticos têm se mostrado benéficos no tratamento de uma grande
variedade de condições, como cicatrização de úlceras, estímulo à neovascularização em
tecidos isquêmicos, integração de enxertos de pele total, consolidação de fraturas e também
na cicatrização tendinosa45, 46, 47, 44, 48.
25
Além destes efeitos, o US induz mudanças fisiológicas como ativação de fibroblasto,
colágeno e diminuição de células inflamatórias por aceleração do metabolismo celular e,
quando aplicado de maneira adequada, pode reduzir a dor49, 50.
4.3.2 Efeito Piezoelétrico
O US é uma modalidade de energia sonora longitudinal, de penetração profunda, que,
ao ser transmitida aos tecidos biológicos, é capaz de produzir alterações celulares por efeitos
mecânicos. A transmissão ocorre pelas vibrações das moléculas do meio através do qual a
onda se propaga. Este meio irradiado oscila ritmicamente com a frequência do gerador
ultrassônico por efeito piezoelétrico, ao comprimir e expandir a matéria³.
O efeito piezoelétrico foi descoberto no final do século XIX por Jacques e Pierre Curie,
sendo definido como uma propriedade de alguns tipos de cristais, como o de quartzo, sal
rochelle e turmalina. Quando submetidos a uma pressão mecânica, a estrutura cristalina
produz uma tensão elétrica proporcional, de forma inversa, quando um campo elétrico é
aplicado, a estrutura se deforma produzindo alterações dimensionais no material51.
O mecanismo de piezoeletricidade é um advento físico característico de certos
materiais que, quando deformados por uma ação mecânica, desenvolvem cargas elétricas em
sua superfície. O contrário também é verdadeiro, ou seja, ao se colocar um material
piezoelétrico sob um campo elétrico, este material sofrerá deformação mecânica51.
Uma pressão deve ser aplicada com o intuito de gerar um aumento no potencial
elétrico, sendo este efeito chamado de piezoelétrico. Segundo Zorlu52, a aplicação do
ultrassom gera um aumento do potencial elétrico da pele, induzindo o processo de
remodelação após uma lesão.
4.3.3 Cavitação
A cavitação é a formação e pulsação de bolhas de gás ou vapor nos fluidos devido a
mudanças pressóricas induzidas pelo US. Existem dois tipos de cavitação: a cavitação estável
e cavitação instável, sendo a primeira responsável pela produção dos efeitos terapêuticos
desejados e a segunda pelos efeitos deletérios as células53, 54, 55, 56, 57.
A cavitação estável define a presença de bolhas de gás nos fluídos devido à energia
ultrassônica42. Estas bolhas são em diferentes espessuras e tamanhos dependendo do tipo do
sinal do ultrassom e com o movimento do fluído local, o qual é chamado de microtransmissão.
26
Ter Haar58 mostrou que o sinal ultrassônico em uma frequência de 1,5 MHz e uma intensidade
de 150 mW/cm² geram bolhas maiores que 10 mm no fluído corporal.
O processo pelo qual pequenas bolhas em um líquido são forçadas a oscilar na presença
de um campo sonoro é chamado de cavitação não-inercial ou estável. No entanto, quando um
volume de líquido é submetido a uma pressão suficientemente baixa, pode ocorrer o
rompimento da bolha, sendo consequência deste efeito a cavitação instável60.
A cavitação instável pode ser produzida por equipamentos de ultrassom em altas ou
baixas frequências e associado às altas temperaturas, geradas pelo fenômeno de cavitação que
são suficientes para destruir o tecido focalizado, mas existe a grande vantagem de que o tecido
circundante tratado permanece inalterado61. Porém, os efeitos da cavitação no tecido apesar
de possuírem aplicações terapêuticas, ainda pouco estudados e, às vezes, estes efeitos podem
ser imprevisíveis e difíceis de controlar62, 63.
4.3.4 Atenuação e Absorção
À medida que o US atravessa o tecido, parte da energia é refletida pelas estruturas que
se encontram em sua trajetória, o que caracteriza espalhamento, e parte da energia é absorvida
pelo próprio meio, levando a um aquecimento local ou absorção39.
A atenuação ou perda da energia pelo feixe sonoro deve-se a esses dois mecanismos,
em que a absorção representa 60-80% da perda de energia39. Nos tecidos biológicos, a
atenuação deve-se principalmente aos mecanismos de absorção pelos quais a energia
mecânica das ondas ultrassônicas é convertida em calor e reflexão da energia
ultrassonográfica nas interfaces teciduais39, 64.
O estudo da atenuação sônica vem sendo utilizado no meio acadêmico como uma
forma para a caracterização de materiais, onde pode-se relacionar a atenuação com a
impedância acústica definida como a dificuldade que a onda encontra ao se propagar no
meio65, 66, 67, 68.
A diferença de impedância entre materiais faz com que apenas uma parte da energia
sônica que atinge a superfície seja transmitida para o outro meio, outra parte da energia é
refletida, sendo assim a impedância se caracteriza como uma perda por transmissão, o que tem
ligação direta com a perda de intensidade do feixe sônico e a atenuação. Quando uma onda se
propaga em um meio ela perde parte de sua energia em determinado percurso ou espessura,
cujo efeito de dispersão do pulso sônico está intrinsecamente ligado a microestrutura do
material69, 65.
27
4.3.5 Regimes de pulso do ultrassom: pulsado e contínuo
O ultrassom apresenta dois regimes de pulso, sendo que em ambos, pulsado ou
contínuo, o US induz respostas, as quais são provenientes de dois efeitos: térmico e atérmico1,
34, 70.
O efeito térmico é, geralmente, acompanhado do regime de pulso contínuo em
intensidades mais altas, o que pode condicionar a célula a uma excitação que aumenta a
atividade celular, por meio da associação entre a cavitação estável e a transmissão acústica71.
Este efeito é importante na indução das respostas fisiológicas nas regiões
lesionadas57. Isto influencia o processo de angiogênese, condrogênese, ossificação
intramembranosa, e remodelação óssea pelo aumento da circulação local, a força tênsil dos
tecidos conectivos e regeneração tecidual, envolvendo o movimento bioquímico das
moléculas como cálcio e potássio através da membrana celular72, 73.
São encontrados, ainda, efeitos como na expressão de RNA específico para cartilagem
em cultura de condrócitos e hipertrofia das fibras musculares74, 1. Entretanto, diversos estudos
indicam que os efeitos térmicos do US provocam efeitos deletérios, como perda de adesão e
alterações na morfologia celular, na fase aguda da lesão53, 54, 55, 56, 57.
Já o efeito atérmico, obtido através do regime de pulso pulsado, habitualmente é
direcionado ao tratamento de lesões agudas, por melhorar a qualidade e velocidade da
recuperação sem aumentar a temperatura local75.
Os efeitos atérmicos do US observados na aplicação pulsada de baixa intensidade
são: aceleração no processo de reparo tecidual, angiogênese, formação de tecido de granulação
e fibroblastos, e consequente síntese de colágeno76.
A terapia ainda favorece a redução do número de leucócitos e macrófagos no interior
da lesão, a modulação na atividade biossintética e expressão de integrinas e estimulação de
sistemas anti-inflamatórios em células de membrana sinovial77, 78.
Estudos mostram que mecanismos atérmicos estariam envolvidos na produção dos
efeitos terapêuticos primários do US, isto é, a estimulação da regeneração tecidual por meio
do aumento da permeabilidade e difusão em nível de membrana celular, influxo de cálcio
intracelular e alterações na atividade elétrica do tecido nervoso79, 80.
Porém, os efeitos térmicos e atérmicos do US não são separáveis, sendo que os efeitos
atérmicos são usualmente acompanhados por alguns aumentos na temperatura5.
Starkey81, em seu estudo, relata os efeitos de acordo com o delta de elevação da
28
temperatura: o aumento da temperatura em 1 °C aumenta o metabolismo; o aquecimento de 2
a 3 °C diminui a dor e o espasmo muscular; e o aumento de 4 °C ou mais, aumenta a
extensibilidade do colágeno e reduz a rigidez articular.
O efeito causado pelo US, no qual há aumento da movimentação molecular, também
gera calor no tecido. À medida que as estruturas vibram, a energia cinética das moléculas que
as compõem aumenta, fazendo com que haja produção térmica local. Em resposta a esse
estímulo, ocorre uma vasodilatação local, melhorando o aporte sanguíneo33, 3.
Apesar dos equipamentos de US serem capazes de produzir efeitos térmicos
fisiológicos significativos se utilizados com intensidades mais altas, intensidades menores são
mais indicadas por serem mais seguras e com menor produção de calor. Intensidades como
0,1 a 0,2 W/cm, por exemplo, evitam a produção excessiva de calor e apresentam eficácia
terapêutica82.
4.3.6 Estudos da irradiação ultrassônica in vitro
Estudos in vitro demonstraram que os efeitos do US parecem ser dependentes do tipo
celular, os quais promovem a síntese de DNA em osteoblastos humanos, fibroblastos de
gengiva e pele, células de periósteo, mas não em condrócitos55.
Quanto ao efeito do US sobre a proliferação celular, foi verificado por Johns79 que o
US contínuo e pulsado, em intensidades de 0,1 a 0,7 W/cm2, foi capaz de diminuir a taxa de
crescimento celular, evidenciando que o US nas frequências de 1 e 3 MHz em intensidades
variadas promove aumento da proliferação de fibroblastos e osteoblastos83.
Harvey84 utilizou o US contínuo 3MHz, nas intensidades 0,5 W/cm² e 2.0 W/cm² em
fibroblastos durante 4 dias em seu estudo e os mesmos reportaram aumento significativo na
quantidade de fibroblastos, resultando em aumento da síntese de colágeno e alteração da
membrana celular.
Diversos estudos relatam que o US é capaz de promover a proliferação de osteoblastos,
fibroblastos, células endoteliais e condrócitos. Sendo que além do efeito sobre a proliferação
celular, o US pode modular as características físicas de fibroblastos e a migração dos mesmos
na cultura55, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 92.
Porém, outros estudos relatam que o US não demonstrou de forma significativa os
efeitos sobre a proliferação de células provenientes de discos intervertebrais de bovinos, de
células uroepiteliais ou até mesmo relataram diminuição do número de fibroblastos após o
29
tratamento com US89, 88, 91.
No estudo de Oliveira et. al. 93 com irradiação ultrassônica pulsada em cultura de
fibroblastos, observou-se que intensidades entre 0,2 e 0,6 W/cm² foram benéficas às células.
Entretanto, intensidades maiores que 0,8 W/cm² induziram danos aos filamentos de actina e
ao núcleo da célula, podendo causar morte celular.
4.3.7 Aplicação clínica do ultrassom
O tratamento com a terapia ultrassônica pode induzir mudanças fisiológicas que
aumentam o reparo tecidual após a lesão, diminuindo a dor, quando é aplicado de acordo com
a lesão que está sendo tratada94.
Clinicamente, o US exerce tanto os efeitos térmicos quanto mecânicos. O efeito
térmico envolve o aumento na temperatura e metabolismo do tecido, na força tênsil do tecido,
e na velocidade de condução nervosa assim como a vasodilatação e elevação do fluxo
sanguíneo, analgesia e aceleração da consolidação de fraturas95, 33, 96.
O efeito térmico do US é considerado útil como tratamento e advém da atenuação que
a onda mecânica sofre ao atravessar os tecidos. Uma fração dessa atenuação causa a conversão
de energia em calor, por absorção, sendo seus efeitos: alterações vasculares e aumento de
extensibilidade do colágeno97, 98, 99.
Este recurso mostrou-se eficaz para redução do quadro nociceptivo, sendo que a forma
pulsada mostrou resultados mais precoces do que a forma contínua, contudo, ambas as formas
de aplicação não tiveram efeito sobre a formação e manutenção do edema agudo100.
Estudos in vivo demonstraram a aceleração do processo de reparo tecidual, sendo que
esse efeito depende da ação coordenada de diferentes tipos celulares presentes em tecidos
adjacentes ao tecido muscular, como por exemplo o conjuntivo¹².
Por fim, o UST pode reduzir edema, aliviar a dor e acelerar o processo de reparo.
Acredita-se que, a analgesia induzida pelo ultrassom terapêutico, pode ser resultado da
alteração da permeabilidade da membrana e melhora no metabolismo do tecido
musculoesquelético101.
30
5- ARTIGO
AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE E ESTRUTURAS CELULARES DE
FIBROBLASTOS L929 APÓS IRRADIAÇÃO ULTRASSÔNICA CONTÍNUA
Ana Flávia Spadaccini Silva¹, Deise Aparecida de Almeida Pires-Oliveira², Priscila Daniele
de Oliveira³, Stheace Kelly Szezerbaty4, Mayra Paula de Oliveira Lima¹, Jéssica Lúcio da
Silva¹, Rodrigo Franco de Oliveira²
1. Fisioterapeuta, mestranda do Programa de Pós-Graduação Ciências da Reabilitação –
Universidade Norte do Paraná
2. Fisioterapeuta, doutor, docente do Programa de Pós-Graduação Ciências da Reabilitação –
Universidade Norte do Paraná
3. Fisioterapeuta, doutoranda do Programa de Pós-Graduação Ciências da Reabilitação –
Universidade Norte do Paraná
4. Fisioterapeuta, mestre em Ciências da Reabilitação.
Endereço para correspondência
Rodrigo Franco de Oliveira
UNOPAR - Universidade do Norte do Paraná. Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde.
Laboratório de Cultura Celular. Av. Paris, 675. Jd. Piza, CEP: 86041-140, Londrina-PR.
e-mail: [email protected]
Fonte de financiamento: Fundação Nacional de Desenvolvimento do Ensino Superior
Particular (FUNADESP) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES).
Conflito de Interesse: Não há conflito de interesses.
31
RESUMO
As investigações da aplicação do ultrassom para promover reparo tecidual e cicatrização pode demonstrar
diferenças quando os efeitos são analisados in vitro. Tendo em vista a variedade de parâmetros e a escassez de
estudos in vitro que demonstrem os efeitos do ultrassom contínuo, o objetivo do presente estudo foi analisar o
efeito do ultrassom terapêutico contínuo em cultura celular de fibroblastos L929. As células L929 foram
cultivadas em garrafas de 25 cm³ contendo 90% de meio MEM, suplementados com 10% soro fetal bovino com
1% antibiótico e antimicótico e mantidas na estufa de CO2 em atmosfera de 5% a 37°C. Para a irradiação com o
ultrassom, as células foram subcultivadas em placas de 12 poços e divididas em três grupos: Controle, 0,3 W/cm²-
100% e 0,6 W/cm²-100%, sendo irradiadas e avaliadas seguindo os tempos de incubação: 24, 48 e 72 horas. A
viabilidade celular foi avaliada pelo teste de citotoxicidade MTT, e para analisar a morfologia celular, as células
foram observadas diariamente, antes dos demais testes, em um microscópio óptico e através da microscopia de
fluorescência, utilizando os marcadores rodamina-faloidina para analisar citoesqueleto e o DIOC6 para retículo
endoplasmático, foi possível observar as estruturas celulares. As doses 0,3 W/cm²-100% e 0,6 W/cm²-100%,
associadas ao modo contínuo apresentaram resultados diferentes. A dose 0,3W/cm² apresentou viabilidade
celular de 111,96% nas primeiras 24 horas, porém, não apresentou diferença significativa (p=0,06). Em seguida,
houve uma diminuição na viabilidade celular nos tempos 48 horas para 55,56% (p=0,00) e 78,43% em 72 horas
(p=0,00). Esta mesma dose apresentou discreta alteração celular, retração dos filamentos de actina do
citoesqueleto e redução do número de vesículas do retículo endoplasmático. Já a dose média 0,6W/cm²
apresentou menor viabilidade celular em todos os tempos quando comparada à dose 0,3W/cm² (p=0,00). Além
da viabilidade, também apresentou alterações na morfologia celular, acompanhada de agregação de fragmentos
celulares e perda de adesão da cultura, observados pela microscopia óptica. Ambas as doses podem ter produzido
o efeito de cavitação, e na ausência do efeito de absorção e atenuação normal dos tecidos in vivo, ocasionaram
diminuição da viabilidade celular quando aplicadas por 2 minutos em intervalos de 24 horas por 3 dias. Portanto,
sugere-se que o modo contínuo seja associado a intensidades baixas para evitar danos à cultura e às estruturas
celulares.
PALAVRAS-CHAVE: Ultrassom; Cultura celular; Fibroblastos
32
1. INTRODUÇÃO
Dentre os recursos disponíveis para o tratamento de lesões, a utilização de terapias
alternativas não-invasivas no reparo tecidual tem mostrado de fundamental importância para
o estímulo da preservação das funções fisiológicas, da estrutura celular e para a melhora na
qualidade do tecido neoformado [1, 2].
Entre eles, podemos destacar o ultrassom (US), o qual é produzido por uma corrente
alternada que flui por um cristal piezoelétrico, alojado em um transdutor que gera uma energia
sonora. Esta, quando aplicada nos tecidos biológicos, é capaz de produzir alterações celulares
por efeitos mecânicos [3].
O aumento da atividade molecular causada pelo US produz efeitos nas células e tecidos
através dos mecanismos térmicos e não térmicos. Os efeitos térmicos são produzidos por
ondas ultrassônicas contínuas, que levam a uma alteração térmica nos tecidos, resultando
numa elevação da temperatura tecidual. Já os atérmicos, resultam do efeito mecânico da
energia do ultrassom, causando alterações como micromassagem e cavitação estável dentro
dos tecidos [1, 3].
Estes efeitos térmicos e atérmicos produzidos pelo ultrassom dependem do regime de
pulso da energia acústica, o qual pode ser contínuo ou pulsado. Quando aplicado o contínuo,
a onda ultrassônica é gerada continuamente durante toda a aplicação, sendo a energia
produzida 100% do tempo. Já no pulsado, a intensidade é periodicamente interrompida e
nenhuma energia é produzida durante o período de interrupção [5].
A energia ultrassônica pode ser uma modalidade potente na geração de efeitos
biológicos. Dentre os efeitos terapêuticos, o ultrassom pode induzir efeitos como o
aquecimento dos tecidos, além de cavitação, ativação de gases, estresse mecânico ou outros
processos indeterminados [6].
Além destes efeitos biológicos, o ultrassom possui ainda a ação de inibição da
atividade inflamatória, resultando na produção de mediadores químicos que ativam a
proliferação de fibroblastos. Sendo que, estes fibroblastos, são o principal tipo celular do
tecido conectivo e são cruciais para o restabelecimento do tecido e remodelação pós-lesão [7].
Este recurso tem sido amplamente utilizado na prática clínica, demonstrando
resultados positivos no reparo tecidual, entretanto, os seus parâmetros ainda vêm sendo
investigados e, estas investigações da aplicação do ultrassom para promover reparo tecidual e
cicatrização, podem demonstrar diferenças quando os efeitos são analisados in vitro [8].
Diversos estudos demonstram a ação do US pulsado [1, 9, 10, 11], entretanto, ainda
33
são escassos estudos que analisem os efeitos da aplicação do US contínuo. Tendo em vista a
variedade de parâmetros e a escassez de estudos in vitro que demonstrem os efeitos do US
contínuo, o objetivo do presente estudo foi avaliar a viabilidade e as estruturas celulares de
fibroblastos L929 após irradiação ultrassônica contínua.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
O presente estudo caracteriza um estudo do tipo experimental, o qual foi aprovado pelo
Comitê de Ética da Universidade Norte do Paraná – parecer 462.478 (CEP - UNOPAR). A
realização dos experimentos e a cultura das células foram todas realizadas Laboratório de
Cultura Celular (LACCEL-UNOPAR), sendo que, todos os experimentos foram realizados
em triplicata, a fim de evitar perda de amostra caso algum poço apresentasse contaminações.
2.1. Cultura celular
As células L929 (Mouse conjunctive tissue - ATCC), foram adquiridas pelo
Laboratório de cultura de célula - Instituto Adolfo Lutz - SP, Brasil e cultivadas em frascos
de 25 cm³ com 90% MEM (Minimum Essential Medium), suplementados com 10% SFB (soro
fetal bovino) com 1% antibiótico e antimicótico, e mantidas em uma estufa de CO2 em
atmosfera de 5% a 37°C.
2.2. Irradiação
O aparelho utilizado foi o Ultrassom da marca KLD – Biosistemas Equipamentos
Eletrônicos Ltda, Brasil, Avatar III, constituído de um transdutor de 1 MHz e ERA (effective
radiation area) de 1 cm², devidamente calibrado pelo fabricante.
Durante a irradiação, a distância do transdutor foi de 18 mm da cultura celular, de
acordo com as especificações do fabricante e, para fins de propagação de ondas mecânicas, a
irradiação foi mantida sempre na mesma posição em relação à face do transdutor [4].
Após a cultura apresentar 80% de confluência, foi realizada a tripsinização e foram,
então, subcultivadas em placas de 12 poços (100 mm² TPP) em uma densidade de 1x105
célula/ml. Em seguida, foram divididas em três grupos: Grupo 1 – controle, não recebeu
tratamento; Grupo 2 – irradiação do ultrassom com intensidade de 0,3 W/cm² no modo
contínuo 100%; Grupo 3 – irradiação do ultrassom com intensidade de 0,6 W/cm² no modo
contínuo 100%.
As células permaneceram por 24 horas em repouso para a sedimentação.
34
Posteriormente, iniciou-se a intervenção nos intervalos de 24, 48 e 72 horas. Os grupos 2 e 3
receberam o tratamento com 24 horas de intervalo, sendo observado o tempo de incubação
depois da irradiação. Após 24 horas da aplicação, as culturas foram avaliadas de acordo com
a figura 1.
Figura 1- Esquema dos tempos de irradiação e avaliação de acordo com o protocolo.
2.3. MTT - Teste de Citotoxicidade Celular
O teste de citotoxicidade celular foi aplicado para avaliar a viabilidade das culturas
que receberam tratamento em intervalos de 24 horas, 48 horas e 72 horas através do método
MTT [3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)-2.5-diphenyltetrazolium bromide]. Para a realização deste
teste, seguiu-se sempre o mesmo procedimento.
Primeiramente, foi retirado o meio dos poços e acrescentado 500 μl de MTT, sendo
em seguida incubados por 1 hora em 37°C em uma atmosfera de 5% CO2. Após este processo,
retirou-se o MTT e foram adicionados 500 μl de DMSO (Dimetil sulfóxido) em cada poço.
Foram, então, incubados novamente por 1 hora em 37°C em uma atmosfera de 5% CO2.
Após este processo, as amostras foram transferidas para placas de 96 poços, nas quais
a concentração de cristal de formazan foi quantificada espectroscopicamente por meio de um
leitor de microplacas (Leitor ELISA – SpectraCount – Packards Instrument, Offeburg –
Alemanha), em comprimento de onda de 546 nm.
2.4. Microscopia de Fluorescência
Para acompanhar os efeitos da irradiação ultrassônica, por meio de fluorescência, as
células L929 foram subcultivadas sobre lamínulas de vidro à densidade de 1x105 células/ml,
em placas TPP de 12 poços. O grupo selecionado para análises de microscopia de
35
fluorescência (MF) foi o grupo 0,3W/cm² no tempo 48 horas, devido ao resultado do teste de
viabilidade celular, para que se pudesse analisar o efeito deletério causado às células. Após a
irradiação, permaneceram incubadas por 24 horas, e, posteriormente, analisadas ao
microscópio de fluorescência, equipado com sistema fotográfico Leica MPS-30.
Os corantes fluorescentes usados nos estudos fluorimétricos foram adquiridos da
Invitrogen®. As células foram marcadas com corantes fluorescentes por incubação em meio
de cultura contendo o corante a 37C nas seguintes condições: rodamina-faloidina para
citoesqueleto e DIOC6 (3,3’- dihexyloxa carbocyanine iodide) (Molecular Probes Eugene,
Oregon,USA) para o retículo endoplasmático. Para completa aderência dos marcadores foi
utilizado o fixador Paraformoldeído PA 4% em PBS. Após estes procedimentos, a lamínulas
foram enxaguadas no escuro com tampão PHEM e posicionadas sobre lâminas com n-propil
galato, para serem posteriormente analisados.
2.5. Análise Estatística
Os dados foram analisados segundo o teste de Shapiro Wilk para verificar a
normalidade, e ao detectada a mesma, foram comparados pelo teste de variância ANOVA two
way com o pós-teste Tukey para comparação entre os grupos. As análises foram feitas através
do pacote estatístico Bioestat 5.0 e os gráficos segundo o GraphPad Prism 6. A significância
foi adotada em 5% (p≤0,05).
3. RESULTADOS
Ao analisar a viabilidade celular segundo o teste de citotoxicidade MTT, a tabela 1
mostra a variação das médias de viabilidade celular dos grupos nos tempos de incubação
analisados. O grupo controle não apresentou diferença significativa entre os tempos analisados
(p=0,51), enquanto que os grupos 0,3W/cm² e 0,6W/cm² mostraram diferenças entre os
tempos, sendo o p=0,00 em ambos os grupos. Houve aumento da viabilidade e proliferação
celular no grupo 0,3W/cm² nas primeiras 24 horas, entretanto, este não foi significativo. Já o
grupo 0,6W/cm² apresentou viabilidade celular semelhante ao grupo controle.
36
Tabela 1 – Comparação intra-grupo nos tempos de incubação analisados.
24 horas 48 horas 72 horas P
Controle 89,58 ± 5,74 93,25 ± 1,90 91,90 ± 1,30 0,51
0,3 W/cm² 111,96 ± 2,60ab 55,56 ± 5,18a 78,43 ± 2,23b 0,00*
0,6 W/cm² 89,61 ± 10,76cd 47,64 ± 4,96ce 62,46 ± 5,98de 0,00*
*valores significativos
a- p=0,01; b- p=0,05; c- p=0,01; d- p=0,01; e- p=0,05
Conforme os resultados do pós-teste, o grupo 0,3 W/cm² apresentou diferença entre os
tempos 24 e 48 horas (p=0,01), sendo que houve uma diminuição da média de células viáveis
de 111,96% para 55,56%. Além desta, houve diferença também entre o tempo 24 horas para
72 horas, sendo que a mesma foi de 111,96% para 78,43% também estatisticamente
significativa (p=0,05). Já no grupo 0,6 W/cm² foi possível observar diferença entre todos os
tempos de incubação: 24 e 48 horas (p=0,01), 24 e 72 horas (p=0,01), 48 e 72 horas (p=0,05).
Houve diminuição na viabilidade celular de 89,61% no tempo 24 horas para 47,64 no tempo
48 horas e 62,46% no tempo 72 horas.
A figura 2 ilustra a viabilidade celular dos grupos nos três tempos de incubação
observados (24, 48 e 72 horas).
Figura 2- Comparação da média de viabilidade celular intra-grupo.
37
Como pode ser visto na Tabela 2, no tempo 24 horas não foi possível observar
diferença significativa entre os grupos, apesar de o valor ter aproximado do intervalo de
significância (p=0,06). Entretanto, os tempos 48 e 72 horas apresentaram diferenças
significativas (p-0,00) entre os grupos analisados.
Tabela 2 – Comparação das médias de proliferação celular entre os grupos.
Controle 0,3 W/cm² 0,6 W/cm² P
24 horas 89,58 ± 5,74 111,96 ± 2,60 89,61 ± 10,76 0,06
48 horas 93,25 ± 1,90ab 55,56 ± 5,18a 47,64 ± 4,96b 0,00*
72 horas 91,90 ± 10,76cd 78,43 ± 2,23ce 62,46 ± 5,98de 0,00*
*valores significativos (p≤0,05)
a- p=0,01; b- p=0,01; c- p=0,01; d- p=0,01; e- p=0,01
Quando analisados aos pares no pós-teste, no tempo 48 horas houve diferença entre o
grupo controle e 0,3 W/cm² (p=0,01) e controle e 0,6 W/cm² (p=0,01), sendo a média de
viabilidade celular do grupo 0,3 W/cm² maior em relação ao outro grupo. No tempo 72 horas,
houve diferença significativa tanto entre o controle e 0,3 W/cm² (p=0,01), controle e 0,6
W/cm² (p=0,01), quanto entre 0,3 W/cm² e 0,6 W/cm² (p=0,01). Neste tempo, o grupo controle
apresentou a maior média (91,90%), seguido do grupo 0,3 W/cm² (78,43%) e 0,6 W/cm²
(62,46%) respectivamente.
As culturas celulares foram observadas e fotografadas diariamente ao microscópio
óptico, o que permitiu visualizar algumas alterações morfológicas, de acordo com as
diferentes doses, as quais são ilustradas na figura 3.
38
Figura 3 – Microscopia óptica: acompanhamento das células fibroblásticas L929. A- Controle - 24 horas; B- Irradiado 0,3 W/cm² - 24 horas; C- Irradiado 0,6 W/cm² - 24 horas;
D- Controle – 48 horas; E- Irradiado 0,3 W/cm² - 48 horas; F- Irradiado 0,6 W/cm² - 48 horas;
G- Controle 72 horas; H- Irradiado 0,3 W/cm² - 72 horas; I- Irradiado 0,6 W/cm² - 72 horas
Ao visualizar a microscopia óptica, pode-se acompanhar as células durante o
experimento em todos os tempos de incubação. Destaca-se que, o grupo controle (Figura 3-
A, 3-D e 3-G) manteve a morfologia celular e a aderência da cultura, sendo que, apenas no
tempo 72 horas (Figura 3-G) apresentou células sem adesão, o que pode ter sido ocasionado
pela alta confluência e crescimento celular. No grupo 0,3 W/cm² (Figura 3-B, 3-E e 3-H), foi
possível notar que houve manutenção da morfologia celular, entretanto, algumas células
perderam adesão e alguns fragmentos celulares estavam presentes na cultura. Já o grupo 0,6
W/cm² (3-C, 3-F e 3-I), mostrou alteração na morfologia celular acompanhada de perda de
adesão e fragmentos celulares presentes no meio.
Para melhor compreensão do efeito da irradiação ultrassônica contínua sobre estruturas
celulares, analisadas a partir da MF, realizaram-se as marcações do Citoesqueleto (rodamina-
faloidina) e do RE (DIOC6), permitindo analisar as alterações nas estruturas celulares, uma
vez que essas estruturas apresentam papel fundamental no processo de proliferação celular, as
39
quais estão ilustradas na Figura 4.
Figura 4 – Microscopia de fluorescência
A- Citoesqueleto - Controle; B- Retículo Endoplasmático - Controle; C- Citoesqueleto - 0,3 W/cm²; D- Retículo
Endoplasmático - 0,3 W/cm².
Em relação ao citoesqueleto, no grupo controle, no tempo 48 horas (Fig. 4 A - estrela),
observou-se uma maior distribuição e organização dos filamentos de actina em toda célula,
quando comparado ao grupo irradiado 48 horas, (Fig. 4 C) onde observamos uma retração e
diminuição da rede de filamentos de actina, caracterizando um efeito negativo em relação a
atividade de remodelagem celular. Com relação ao RE, no grupo controle, no tempo de 48
horas (Fig. 4 B - seta), observou-se uma significativa distribuição do RE no citoplasma, com
número de vesículas e intensa marcação, quando comparado com o grupo irradiado US, 48
horas, no qual foi observado um número reduzido de vesículas, sugerindo diminuição na
atividade reticular (síntese proteica), quando comparado ao grupo controle.
4. DISCUSSÃO
Estudos in vitro demonstraram que os efeitos do US são dependentes dos parâmetros
utilizados e do tipo celular, sendo capazes de promover a proliferação de fibroblastos,
osteoblastos, células endoteliais, epiteliais, conjuntivas e condrócitos [12, 13, 14, 15, 16, 17].
40
Porém, outros estudos relatam que o US não demonstrou de forma significativa os efeitos
sobre células provenientes de discos intervertebrais de bovinos, de células uroepiteliais,
células musculares ou até mesmo relataram diminuição do número de fibroblastos após o
tratamento com US [15, 16, 18, 19], corroborando com os nossos achados, onde após
aplicação de US contínuo, observamos uma diminuição da viabilidade celular nos tempos 48
e 72 horas.
O presente estudo analisou a viabilidade de fibroblastos, através do ensaio de
citotoxicidade MTT, após a aplicação do ultrassom contínuo nas doses 0,3 W/cm² e 0,6
W/cm², onde foi possível observar um aumento na quantidade de células viáveis nas primeiras
24 horas em todos os grupos, seguido de uma queda na viabilidade celular no tempo 48 horas
nos grupos 0,3 e 0,6 W/cm².
Ambas as doses podem ter produzido o efeito de cavitação, e na ausência do efeito de
absorção e atenuação normal dos tecidos in vivo, ocasionou diminuição da viabilidade celular
quando aplicadas por 2 minutos em intervalos de 24 horas por 3 dias.
Através do aumento da pressão acústica, repetidas compressões e rarefações podem
causar bolhas microscópicas em forma biológica de fluidos que crescem em tamanho e
oscilam, podendo sofrer implosão, gerando a cavitação instável. Altas temperaturas podem
ocorrer dentro das bolhas e as forças geradas pelo colapso das bolhas podem causar a morte
celular através de processos mecânicos [20, 21, 22]. Estes efeitos podem ser atribuídos a
diminuição da viabilidade celular nos tempos 48 e 72 horas em ambas as doses aplicadas em
nosso estudo.
Intensidade, tempo e frequência apresentam, na literatura, muitas variações quando
associados ao regime de pulso contínuo. Segundo Alexander et. al. [23], a dose é a variável
mais estudada pelos pesquisadores e há indicações de que as menores doses são mais efetivas
para o reparo tecidual. Assim como em nosso estudo, a menor dose (0,3 W/cm²) apresentou
maior viabilidade celular quando comparada a dose 0,6 W/cm², melhorando assim, a fase
proliferativa do processo de reparo tecidual.
Bertolini et. al. [24] comparou o ultrassom contínuo e pulsado, irradiando durante 5
dias, com transdutor de 1 MHz, durante 3 minutos, sobre o tendão do calcâneo de ratos Wistar
com dose 0,4 W/cm². Observaram que o ultrassom terapêutico produziu diminuição de dor e
de edema, em animais com tendão calcâneo traumatizado, sendo que tal ação foi mais precoce
para o ultrassom na forma pulsada. A irradiação ultrassônica contínua do presente estudo,
também adotou dose baixa semelhante ao estudo acima citado, a qual mostrou efeitos
41
positivos em 24 horas quando comparada aos demais grupos.
Já com relação ao tempo de aplicação, Ng e Fung [25], em estudo experimental com
ratos, analisaram o ultrassom terapêutico no modo contínuo com intensidades entre 0,5 e 1,2
W/cm² e tempo de aplicação de 1 minuto. Observaram diferença com relação ao grupo
controle e na densidade de fibras de colágeno do tendão do calcâneo dos ratos. A alta
intensidade usada em um pequeno período de aplicação estimulou a regeneração do colágeno
independente da dose. O presente estudo, utilizando a dose 0,6 W/cm² semelhante às doses do
estudo de Ng e Fung, utilizou o tempo de irradiação de 2 minutos, o que pode ter fornecido
alta energia às células.
Os resultados do estudo de Gould et. al. [20] sugerem que o US de baixa frequência
modulou as características físicas dos fibroblastos e migração dos mesmos na cultura,
corroborando com o nosso estudo, visto que o US de baixa frequência promoveu alterações
na morfologia celular dos fibroblastos e em suas estruturas celulares.
No entanto, Harvey et. al. [21] aplicou o US contínuo 3 MHz, nas intensidades 0,5
W/cm² e 2.0 W/cm² em fibroblastos durante 4 dias. O mesmo reportou aumento significativo
na quantidade de fibroblastos, resultando em aumento da síntese de colágeno e alteração da
membrana celular. Assim como Zhou et. al. [12] encontrou que alta frequência (3MHz) e
baixa intensidade facilitou a síntese de DNA dos fibroblastos e aumentou significativamente
o número de fibroblastos pós irradiação ultrassônica. Ambos os estudos diferem dos nossos
achados, visto que no presente estudo foi adotado a baixa frequência 1MHz.
Entretanto, no estudo de Ohwatashi et. al. [22], usando a termografia para registrar os
momentos de temperatura emitidos pelo ultrassom 1MHz e 3MHz, notaram que a temperatura
aumenta próxima ao transdutor no 3 MHz enquanto que 1MHz longe do transdutor. Porém,
como conclusão do estudo, apenas a frequência deve ser levada em consideração ao aplicar o
ultrassom, mas também a absorção e reflexão do tecido. Fato este se associa também aos
nossos resultados, visto que, na ausência da atenuação normal do tecido, pode ter exposto as
células à uma alta quantidade de energia.
O efeito térmico do US está associado ao regime de pulso contínuo, e é considerado
útil como tratamento e o mesmo depende da atenuação que a onda mecânica sofre ao
atravessar os tecidos [26, 27, 28], além do que, De Deyne e Kirsch-Volders [27] observaram
que em fibroblastos cultivados, o impacto recebido das ondas ultrassônicas (1 W/cm2 - 20%)
do US nos seus protocolos, tenha sido maior do que em uma situação clínica, por isso ocorreu
a diminuição do número, em uma relação diretamente proporcional ao tempo de exposição.
42
Este fato pode explicar os resultados do presente estudo, no qual apresentou
diminuição de células viáveis nos tempos 48 e 72 horas. O tempo de aplicação de 2 minutos
com uma distância de 18mm da célula tratada podem ter exposto a cultura celular à um
estímulo maior do que na prática clínica. Quando a irradiação ultrassônica é aplicada in vivo,
os efeitos de atenuação e absorção fazem com que a energia que chega ao tecido seja menor
do que em ambiente in vitro.
Ao analisar as células em um microscópio óptico, foi possível observar que a dose 0,3
W/cm² promoveu discreta alteração da morfologia celular, com algumas células sem adesão,
enquanto que a dose 0,6 W/cm², mostrou alterar completamente a morfologia celular, grande
perda de adesão da cultura e fragmentos celulares presentes no meio de cultura, o que pode
ser atribuído a morte celular.
A microscopia de fluorescência foi realizada com o intuito de analisar as alterações
das estruturas celulares causadas pela aplicação do ultrassom contínuo. Quando analisamos o
citoesqueleto, no grupo irradiado, no tempo 48 horas, observamos uma retração e diminuição
da rede de filamentos de actina, caracterizando um efeito negativo em relação a atividade de
remodelagem celular. Com relação ao RE, foi observado um número reduzido de vesículas,
sugerindo diminuição na atividade reticular (síntese proteica), quando comparado ao grupo
controle.
No estudo de Oliveira et. al. [7] com irradiação ultrassônica pulsada em cultura de
fibroblastos, observou que intensidades entre 0,2 e 0,6 W/cm² são benéficas às células.
Entretanto, intensidades maiores que 0,8 W/cm² induziram danos aos filamentos de actina e
ao núcleo da célula, assim como no presente estudo, em a dose 0,3 W/cm² mostrou também
alterar as estruturas celulares.
No que diz respeito ao efeito térmico do US sobre as estruturas celulares, estudos
indicam que o US contínuo pode aumentar o fluxo sanguíneo por algum tempo após o
tratamento, no entanto, podem alterar organelas celulares e membranas de maneira reversível
ou irreversível, dependendo de sua magnitude [29], sendo o mesmo observado em nosso
estudo no qual as estruturas celulares, citoesqueleto e RE, apresentaram alterações no tempo
48 horas quando analisados pela microscopia de fluorescência.
As doses do estudo associadas ao regime de pulso contínuo apresentaram resultados
distintos. A dose baixa (0,3W/cm²) aumentou a viabilidade celular, ainda que não
significativa, nas primeiras 24 horas, seguida de uma diminuição na viabilidade celular nos
tempos 48 e 72 horas, além de que esta mesma dose não causou grandes danos celulares. Já a
43
dose média (0,6W/cm²), além de apresentar as menores porcentagens de viabilidade celular
comparada aos demais grupos, promoveu alterações na morfologia celular, acompanhada de
agregação de fragmentos celulares no meio de cultura e perda de adesão, observados pela
microscopia óptica.
Os efeitos do US contínuo ainda são pouco encontrados na literatura, sendo
necessários mais estudos os explorem, visto que os mesmos possuem grande importância na
aplicação clínica, porém, podem ser imprevisíveis e difíceis de controlar.
Segundo Watson [30], o ultrassom terapêutico pode aumentar o fluxo sanguíneo local
e, como produz efeito estimulante sobre mastócitos, plaquetas e leucócitos em geral, além de
poder causar a degranulação de mastócitos e consequente aumento inicial do processo
inflamatório, o quadro inicial de uma lesão poderia ser agravado. O mesmo pode ter ocorrido
no presente estudo, entretanto, como já citado, o ultrassom é um otimizador do processo
inflamatório, o qual também mostrou em nosso estudo efeitos positivos no tempo 24 horas.
Apesar de apresentar menor porcentagem que no tempo 24 horas, do tempo 48 horas
para 72 horas houve aumento na viabilidade celular. Este crescimento pode ter ocorrido
devido à troca de meio de cultura realizada diariamente ou através da liberação de fatores de
crescimento induzidos pela aplicação do US contínuo. Este crescimento sugere também que
o US contínuo poderia precisar de um intervalo de aplicação, respeitando um tempo de
incubação de 48 horas para uma nova irradiação, para tanto estudos analisando maior tempo
de incubação, como 96 horas ou até mesmo 120 horas, podem ser realizados para identificar
os efeitos tardios do US contínuo na cultura celular.
5. CONCLUSÃO
Concluímos que a utilização do US 1MHz, através do regime de pulso contínuo, seja
associado a baixas intensidades, observando o tempo e a fase de reparo da lesão. Além disso,
sugere-se que estudos que analisem os efeitos tardios do US contínuo, 1 e 3 MHz, com
intervalo maior entre as irradiações, sejam realizados.
44
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47
9- CONSIDERAÇÕES GERAIS
Os efeitos do ultrassom contínuo ainda são pouco encontrados na literatura, sendo
necessários mais estudos que os explorem, visto que os mesmos possuem grande importância
na aplicação terapêutica, apesar de serem imprevisíveis e difíceis de controlar.
Apesar de apresentar aumento na viabilidade celular no tempo 24 horas, houve uma
diminuição na viabilidade celular no tempo 48 horas em todos os grupos, a qual pode ter sido
ocasionada devido à uma cavitação instável que, na ausência dos efeitos de absorção e
atenuação dos tecidos, causou efeitos deletérios aos fibroblastos L929.
Porém, mesmo com a diminuição da viabilidade celular, a menor dose causou singelas
alterações na morfologia celular e sua porcentagem de viabilidade celular foi maior que a dose
0,6W/cm² em todos os tempos analisados.
Portanto, sugere-se que o regime de pulso contínuo seja associado a baixas intensidades
para evitar danos às culturas celulares, além de ser levada em consideração a frequência a ser
utilizada e a fase do processo de reparo tecidual.
48
10 - REFERÊNCIAS
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ANEXOS
Projeto de Pesquisa
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Normas da revista
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69
