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AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
São Paulo 2013
EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CHÁS DA PLANTA Camellia sinensis IRRADIADOS COM DIFERENTES ATIVIDADES DE ÁGUA
Gustavo Bernardes Fanaro
Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Aplicações
Orientadora: Profa. Dra. Anna Lucia Casañas Haasis Villavicencio
INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES Autarquia associada à Universidade de São Paulo
São Paulo 2013
EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CHÁS DA PLANTA Camellia sinensis IRRADIADOS COM DIFERENTES ATIVIDADES DE ÁGUA
Gustavo Bernardes Fanaro
Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Aplicações
Orientadora: Profa. Dra. Anna Lucia Casañas Haasis Villavicencio
Versão Corrigida Versão Original disponível no IPEN
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AGRADECIMENTOS
À Dra. Anna Lucia C. H. Villavicencio pela confiança e orientação, me
preparando desde a iniciação científica para a conclusão deste projeto;
À minha flor, Érica, por estar ao meu lado sempre me incentivando e
me tornando uma pessoa cada vez melhor.
Ao IPEN, especialmente ao Centro de Tecnologia das Radiações,
representado pelo Dr. Wilson Aparecido Parejo Calvo, gerente do CTR e pela Dra.
Margarida Hamada, chefe de divisão de pesquisa e desenvolvimento do CTR,
pelo constante apoio e pré-disposição em ajudar e buscar soluções;
À Dra. Neuza Mariko Aymoto Hassimotto pela valiosa colaboração,
assim como por disponibilizar seu laboratório e equipamentos, senão seria
impossível realizar esta pesquisa;
À Dra. Deborah Helena Markowicz Bastos pela colaboração e
ensinamentos que veem desde o mestrado e também por disponibilizar seu
laboratório e equipamentos.
Ao Dr. Benedito Corrêa do Instituto de Ciências Biomédicas II da
Universidade de São Paulo pela doação das cepas de fungos.
À Dra. Maria Elisabeth Machado Pinto e Silva da Faculdade de Saúde
Pública da Universidade de São Paulo por disponibilizar seu laboratório para a
realização das análises sensoriais.
Aos engenheiros Elizabeth Somessari e Carlos Gaia da Silveira, pelo
constante auxílio no processamento por irradiação das amostras;
Ao Marcos e à Claudia pela ajuda nos assuntos administrativos;
Aos colegas do laboratório, pela valorosa ajuda na realização deste
trabalho e pelos vários momentos de descontração: Michel, Renato, Amanda,
Flávio, Patrícia, Márcia e Vanessa;
Aos demais profissionais e bolsistas do Centro de Tecnologia das
Radiações, pelo convívio harmonioso e enriquecedor;
Ao CNPq, pelo auxílio financeiro;
Por todos aqueles que contribuíram tanto nesse trabalho, quanto na
minha formação.
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EFEITO DA RADIAÇÃO IONIZANTE EM CHÁS DA PLANTA Camellia sinensis
IRRADIADOS COM DIFERENTES ATIVIDADES DE ÁGUA
Gustavo Bernardes Fanaro
RESUMO
O chá é uma das bebidas mais consumidas no mundo. Os chás provenientes da
planta Camellia sinensis possuem altos teores de antioxidantes, o que significa
que podem ter diversos efeitos benéficos na preservação da saúde. Durante
séculos, a humanidade procura formas de conservar melhor e por mais tempo os
alimentos que consomem. O processo de irradiação de alimentos é uma técnica
amplamente utilizada em todo o mundo e é indicada por diversos órgãos de
saúde e sanitários de diversos países. A radiação interage com o material
causando dois tipos de efeitos, o efeito direto e o efeito indireto. No efeito direto a
radiação interage com a molécula de DNA, causando a quebra dessa molécula,
inativando a célula. No efeito indireto, que representa 70% da interação, a
radiação quebra a molécula de água presente no meio, em um processo chamado
de radiólise, criando uma série de radicais livres que vão interagir com os
componentes celulares, levando a morte da célula. Portanto, o objetivo deste
trabalho foi estudar os efeitos da radiação gama em dois tipos de chás da planta
Camellia sinensis irradiados com diferentes valores de atividade de água. As
amostras de chá verde e chá preto tiveram suas Aw ajustadas a três valores (Aw
alta, Aw média e Aw baixa). As amostras foram irradiadas em fonte de 60Co nas
doses de 0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10,0 kGy. As análises utilizadas foram:
microbiologia por semeadura de superfície, quantificação de fenólicos totais,
análise da atividade antioxidante por ORAC e identificação e quantificação dos
principais antioxidantes presente nessas bebidas. Foi possível constatar que
quanto maior a quantidade de água livre presente no meio, menor foi a dose para
realizar o controle microbiológico. O chá verde mostrou ser um pouco mais
suscetível a irradiação com alta Aw do que o chá preto, pois houve variação da
quantidade de fenólicos e flavonóides, diminuindo a quantidade desses
compostos em algumas doses, mas também houve aumento da quantidade em
outras doses. Entretanto em ambos os chás, essas mudanças podem ser
consideradas insignificantes, uma vez que não houve diferença da atividade
antioxidante em doses de até 10 kGy. A dose de 5,0 kGy foi a dose mínima que
garantiu o controle microbiológico e não causou alterações nos parâmetros
analisados.
IONIZING RADIATION EFFECT ON TEAS OF Camellia sinensis PLANT
IRRADIATED WITH DIFFERENT WATER ACTIVITIES
Gustavo Bernardes Fanaro
ABSTRACT
Tea is the most consumed beverage in the world. Teas from Camellia sinensis
plant have high levels of antioxidants, which mean that they may have several
beneficial effects on health preservation. For centuries, mankind looks for ways to
conserve better and for a longer time the food that they eat. The food irradiation
process is a largely technique used worldwide, and is recommended by many
health agencies and authorities of several countries. The radiation interacts with
the material causing two kinds of effects, the direct and the indirect effect. In the
direct effect the radiation interacts with the DNA molecule, breaking it, and then
inactivates the cell. In the indirect effect, which represents 70% of the interaction,
the radiation breaks the water molecule in a process denominated radiolysis,
creating a number of free radicals that will interact with the cellular components,
leading to the cell death. Therefore, the aim of this work is to study the effects of
gamma radiation on two kinds of tea from Camellia sinensis plant irradiated with
different water activities. The green tea and black tea samples had their Aw
adjusted to three values (high Aw, medium Aw, and low Aw). The samples were
irradiated in 60Co source at doses of 0, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 5.0, 7.5, and 10.0 kGy.
The analyses used were: microbiology by plate count, total phenolic compounds
quantification, antioxidant activity by ORAC assay, and identification and
quantification of main antioxidants in these beverages. It was noted that the
greater the quantity of free water present in the medium, the lower was the dose to
achieve microbiological control. The green tea showed to be a little more
susceptible to irradiation by high Aw once there was more variation in the amount
of flavonoids and phenolics than the black tea, decreasing the amount of these
compounds in some doses, but increasing the amount in other ones. However in
both teas, these changes can be considered insignificant, since there was no
difference in antioxidant activity at doses up to 10 kGy. The dose of 5.0 kGy was
the minimum dose that secured the microbiological control and had no changes on
the parameters analyzed.
SUMÁRIO
Página
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 15
2 OBJETIVO ........................................ ................................................................. 18
3 REVISÃO DA LITERATURA ........................... .................................................. 19
3.1 Atividade de água ........................................................................................... 19
3.2 Camellia sinensis ............................................................................................ 20
3.2.1 Chá verde ..................................................................................................... 25
3.2.2 Chá preto ..................................................................................................... 25
3.3 Antioxidantes ................................................................................................... 26
3.3.1 Absorção dos antioxidantes ......................................................................... 30
3.4 Cuidados na produção .................................................................................... 32
3.5 Irradiação ........................................................................................................ 34
3.6 Radiólise da água ........................................................................................... 39
3.7 Radicais livres ................................................................................................. 43
4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................. .................................................... 46
4.1 Amostras ......................................................................................................... 46
4.2 Atividade de água (Aw) ................................................................................... 46
4.3 Irradiação ........................................................................................................ 47
4.4 Microbiologia ................................................................................................... 47
4.4.1 Contaminação artificial ................................................................................. 48
4.5 Extração de compostos solúveis ..................................................................... 48
4.6 Determinação de compostos fenólicos totais .................................................. 48
4.7 Atividade antioxidante ..................................................................................... 49
4.8 Separação, identificação e quantificação de biocompostos ............................ 50
4.9 Análise sensorial ............................................................................................. 51
4.10 Análise estatística ......................................................................................... 52
5 RESULTADOS ...................................... ............................................................ 53
5.1 Aw ................................................................................................................... 53
5.2 Microbiologia ................................................................................................... 53
5.3 Fenólicos totais ............................................................................................... 58
5.4 Atividade antioxidante ..................................................................................... 64
5.5 Identificação e quantificação dos biocompostos ............................................. 67
5.6 Análise sensorial ............................................................................................. 72
6 CONCLUSÃO ....................................... ............................................................. 75
7 TRABALHOS FUTUROS ............................... ................................................... 76
ANEXOS ............................................................................................................... 77
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................ ............................................. 90
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1 - Esquema de obtenção do chá verde e chá preto .............................. 24
FIGURA 2 - Estruturas dos diferentes tipos de catequinas e teaflavinas
encontrados na planta C. sinensis ........................................................................ 28
FIGURA 3 - Estrutura básica de três tipos de flavonóides encontrados na planta
C. sinensis............................................................................................................. 28
FIGURA 4 - Símbolo internacional para alimentos irradiados ............................... 38
FIGURA 5 – Curva de calibração utilizada para quantificação de fenólicos totais
nos chás verde e preto irradiados com diferentes doses e atividade de água,
utilizando ácido gálico como padrão ..................................................................... 58
FIGURA 6 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw baixa ..................... 78
FIGURA 7 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw média .................... 79
FIGURA 8 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw alta ........................ 80
FIGURA 9 - Cromatogramas do chá verde irradiado com diferentes doses de
radiação e Aw ....................................................................................................... 81
FIGURA 10 - Cromatogramas do chá preto irradiado com Aw baixa .................... 82
FIGURA 11 - Cromatogramas do chá preto irradiado com Aw média ................... 83
FIGURA 12 - Cromatogramas do chá preto irradiado com Aw alta ....................... 84
FIGURA 13 - Cromatogramas do chá verde irradiado com diferentes doses de
radiação e Aw ....................................................................................................... 85
FIGURA 14 - Cromatograma e espectros de abosrção U.V. dos padrões: (1)
Epigalocatequina; (2) Epicatequina; (3) Epicatequina galato ................................ 86
FIGURA 15 - Cromatograma e espectros de abosrção U.V. dos padrões: (1)
Catequina; (2) Epicagalotequina galato; (3) Catequina galato .............................. 87
FIGURA 16 - Cromatograma e espectros de abosrção U.V. do mix de padrões de
Teaflavina.............................................................................................................. 88
FIGURA 17 - Cromatograma e espectros de abosrção U.V. dos padrões: (1)
Cafeína; (2) Miricetina; (3) Kaempferol ................................................................. 89
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1- Diferentes valores de atividade de água dos diferentes tipos de chá
utilizados ............................................................................................................... 53
TABELA 2 - Contaminação fúngica, em UFC/g, da planta de chá verde irradiada
com diferentes doses de radiação e Aw ............................................................... 54
TABELA 3 - Contaminação fúngica, em UFC/g, da planta de chá preto irradiada
com diferentes doses de radiação e Aw ............................................................... 54
TABELA 4 – Valores da contaminação artificial por fungos, em UFC/g, da planta
de chá verde irradiada com diferentes doses de radiação e Aw ........................... 56
TABELA 5 – Valores da contaminação artificial por fungos, em UFC/g, da planta
de chá preto irradiada com diferentes doses de radiação e Aw ............................ 56
TABELA 6 - Quantidade de fenólicos totais, em mgEAG/100 mL de chá verde, de
C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água ......................... 59
TABELA 7 - Quantidade de fenólicos totais, em mgEAG/100 mL de chá preto, de
C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água ......................... 61
TABELA 8 - Valores de ORAC, em mmolET/100 mL de chá verde, de C. sinensis
irradiada com diferentes doses e atividades de água ........................................... 65
TABELA 9 - Valores de ORAC, em mmolET/100 mL de chá preto, de C. sinensis
irradiada com diferentes doses e atividades de água ........................................... 66
TABELA 10 - Quantidade de flavonóides e cafeína, em mg/100 mL de chá verde,
identificados em C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água
.............................................................................................................................. 68
TABELA 11- Quantidade de teaflavinas totais e cafeína, em mg/100 mL de chá
preto, identificados em C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de
água ...................................................................................................................... 70
TABELA 12 – Valores das características globais (odor, aparência e sabor) de chá
verde e preto irradiados com diferentes doses de radiação .................................. 73
LISTA DE ABREVIATURAS
C Catequina
EC Epicatequina
ECG Epicatequina galato
EGC Epigalocatequina
EGCG Epigalocatequina galato
Aw Atividade de água
↓Aw Atividade de água baixa
→Aw Atividade de água média
↑Aw Atividade de água alta
15
1 INTRODUÇÃO
O chá é uma das bebidas mais consumidas no mundo. Anteriormente,
seu consumo concentrava-se em países da Ásia e Europa, panorama que vem
mudando ao longo dos últimos anos. O crescente interesse pela bebida deve-se a
vários estudos que a mostram como fonte de antioxidantes e a relação inversa
entre seu consumo e o risco de doenças degenerativas como câncer e doenças
do coração (Matsubara & Rodriguez-Amaya, 2006a,b; Saito et al., 2006; Santana-
Rios et al., 2001b).
Segundo uma lenda chinesa, o chá foi descoberto acidentalmente por
um imperador há 4.000 anos, enquanto há relatos que os chineses consomem
essa bebida desde 3.000 A.C. (Ferrara et al., 2001).
Chá é definido como produto constituído de uma ou mais partes de
espécie(s) vegetal(is) inteira(s), fragmentada(s) ou moída(s), podendo ser ou não
fermentado, tostada(s), constantes de Regulamento Técnico de Espécies
Vegetais para o Preparo de Chás (Brasil, 2005).
Nos últimos anos, houve um grande aumento no consumo de chás de
todos os tipos, principalmente os provenientes da planta Camellia sinensis (L) O.
Kuntze, uma planta da família Theaceae, que dependendo do beneficiamento
dado pela indústria, pode dar origem a diversos tipos de chás. Os mais comuns
são o chá branco, verde, oolong e preto (Prado et al., 2005).
O aumento no consumo é devido ao fato de chás de C. sinensis
possuírem altos teores de antioxidantes, o que significa que podem ter efeitos
benéficos tanto na conservação de alimentos, quanto na preservação da saúde
humana quando presentes regularmente na dieta (Becker et al., 2004), podendo
ser considerado um alimento funcional.
16
Entre os antioxidantes presentes na C. sinensis os mais ativos e
frequentemente encontrados são os compostos fenólicos, como as catequinas
(C), epigalocatequina (EGC), epigalocatequina galato (EGCG), epicatequina (EC),
epicatequina galato (ECG); teaflavinas e flavonóides como a miricetina,
quercetina e o kaempferol (Bianchi & Antunes, 1999).
Os antioxidantes promovem esses benefícios, pois atuam por meio de
um ou mais dos seguintes mecanismos: indução de várias enzimas que são
ativadas na via metabólica de drogas, como no metabolismo de inativação de
substâncias carcinogênicas e mutagênicas; sequestro de espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio; no sistema de checagem das células quando estas estão
em divisão e no processo de apoptose (Dreosti et al., 1997; Mukhtar & Ahmed,
1999; Tijburg et al., 1997; Yang et al., 2000).
Durante séculos, a humanidade procura formas de conservar melhor e
por mais tempo os alimentos que consomem. A preservação e o armazenamento
desses alimentos a baixa temperatura estão entre as técnicas de preservação
mais antigas que se conhece. Já uma das técnicas que se destaca, é o
tratamento dos alimentos por radiação gama (Chmielewski & Haji-Saeid, 2004;
Farkas, 2006; Masefield, 2004).
Os alimentos são irradiados com as mais diversas finalidades tais
como: desinfecção de agentes causadores de doenças, prolongar o tempo de
vida útil do produto, inibir o brotamento, inativação de organismos que degradam
o alimento, retardo da maturação, entre outros (Diehl, 2002; Villavicencio et al.,
2007). A característica da radiação de alta energia é causar ionização no meio em
que é absorvida, ou seja, é capaz de remover elétrons de seus orbitais, seja em
átomos ou moléculas (ICGFI, 1995).
O processo de irradiação pode inibir a divisão de células vivas, como
microrganismos, promovendo uma alteração em sua estrutura molecular (Brasil,
2001a). As células vegetativas são, geralmente, mais sensíveis à radiação
ionizante do que bolores e leveduras que, por sua vez, são mais resistentes do
que os esporos bacterianos (Diehl, 1995; Monk et al., 1995).
17
A radiação ionizante quando é absorvida por um material biológico,
pode ter ação direta ou indireta sobre o material que recebeu este
processamento. O mecanismo primário no qual a radiação destrói os
microrganismos é dado pela quebra das fitas duplas de DNA causando inativação
dessa célula. Esse processo é dominante quando esporos secos de
microrganismos são irradiados. Já o efeito indireto é responsável por 70% de todo
efeito da radiação e é ocasionado pela interação da radiação com a molécula de
água, o que acaba por gerar os chamados radicais livres. Estes irão interagir com
outros constituintes do material biológico tratado com radiação, de maneira similar
aos que reagem nos alimentos. Esse efeito é importante em células vegetais, que
possuem uma abundante quantidade de água (Hayes et al., 1995; Monk et al.,
1995; Morehouse, 1998).
Esses radicais livres são produzidos, mesmo quando são utilizadas
baixas doses. A interação da água com o oxigênio pode aumentar intensamente a
produção desses radicais, principalmente o peróxido de hidrogênio (H2O2) que é
conhecido por ser um agente oxidante (Diehl, 2002).
Por muito tempo os alimentos irradiados foram estudados, até que se
chegou à conclusão que os alimentos submetidos ao processamento por
radiação, cuja dose utilizada não interferir nas propriedades sensoriais e na
composição do alimento, do ponto de vista toxicológico, são seguros para o
consumo humano (Delincée & Pool-Zobel, 1998; WHO, 1994).
18
2 OBJETIVO
Estudar o efeito da radiação gama em dois tipos de chás da planta
Camellia sinensis irradiados com diferentes valores de atividade de água.
19
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Atividade de água
Sabe-se há muito tempo, com origens que remontam à pré-história,
que existe uma relação, apesar de imperfeita, entre o conteúdo de água de um
alimento e sua perecibilidade. Processos de concentração e desidratação são
realizados como objetivo principal de diminuir o conteúdo de água de um
alimento, aumentando, ao mesmo tempo, sua concentração de soluto e, portanto,
aumentando sua vida de prateleira (Reid & Fennema, 2010).
Em um alimento, pode ser considerado que a água exista sob duas
formas: água combinada e água livre. Água combinada é a molécula de água que
faz parte de ligações químicas e, portanto, não é congelável, não pode ser
utilizada como solvente e possui alta energia de ligação. Água livre é considerada
a água disponível onde ocorrem reações químicas, enzimáticas e crescimento
microbiológico (Coultate, 1996).
A disponibilidade de água em um alimento (água livre) é denominada
como atividade de água (Aw). É definida como a relação entre a pressão do vapor
de água do alimento sobre a pressão do vapor de água pura a mesma
temperatura (Karmas, 1980; Leung, 1981). Esse conceito foi introduzido por Scott
em 1957 (Abdullah et al., 2000).
A força que promove as reações químicas com a água em um alimento
é proporcional ao potencial químico da água existente nele. Pela formulação ou
processamento, a atividade de água em um alimento pode ser variada e
controlada (Bone, 1969). O principal fator na estabilidade de um alimento não é,
portanto, o teor de umidade desse, mas sim a disponibilidade da água para o
crescimento de microrganismos e reações químicas (Coultate, 1996). A escolha
do parâmetro Aw em comparação ao conteúdo de umidade como parâmetro de
20
referência no processamento de alimentos e armazenamento destes é baseado
em um número de efeitos amplamente reconhecidos (Maltini et al., 2003):
• A Aw é determinante para o crescimento dos microrganismos.
• A Aw é bem relacionada com a maioria das reações de
degradação de natureza química, enzimática e física.
• Em alimentos compostos com vários ingredientes, a migração
de umidade obedece a Aw e não a quantidade de umidade.
O valor de Aw influencia diretamente na resistência de microrganismos
a tratamentos de conservação e aqueles que encontrados em alimentos com
baixa Aw são mais resistentes. Além disso, muitos dos microrganismos viáveis
nessas condições são produtores de toxinas e esporos (Laroche et al., 2005).
Os fungos que apresentam ocorrência em alimentos com baixa
atividade de água pertencem ao grupo dos fungos xerofílicos, ou seja, consegue
se desenvolver em Aw inferior a 0,85. A maioria dos fungos xerotolerantes
pertence aos gêneros Aspergillus e Penicillium (Hocking & Pitt, 1987). Essas
espécies de fungo conseguem se desenvolver a uma Aw por volta de 0,7 (Gock et
al., 2003).
O controle de crescimento desse tipo de fungo normalmente é feito
baixando a Aw para valores menores de 0,65 onde a incidência de contaminação
é menor (Abellana et al., 1999), porém os fungos xerotolerantes extremos
conseguem se desenvolver com Aw por volta de 0,61 em determinadas
temperaturas (Gock et al., 2003).
3.2 Camellia sinensis
Desde a antiguidade, as plantas têm sido utilizadas como
medicamentos, na prevenção, no tratamento e na cura de doenças em homens e
21
animais. Os povos primitivos iniciaram a identificação de vegetais que melhor se
adequavam ao uso medicinal, época de colheita, técnicas de extração e modos
de conservação (Bugno et al., 2005).
A revolução industrial e as descobertas de substâncias ativas em
plantas medicinais provocaram a substituição dos medicamentos vegetais por
produtos contendo princípios ativos deles extraídos, ou seus derivados sintéticos,
por meio de modificações estruturais e síntese de novas moléculas. Os produtos
naturais passaram a apresentar um significado místico e esta abordagem era
oposta ao novo modo de vida das sociedades industrializadas que consideravam
a utilização de produtos naturais como uma opção de pessoas incultas e de baixa
renda, não creditando a estes produtos qualquer valor farmacológico (Rates,
2001).
Porém, com o passar do tempo, as plantas continuaram sendo
importantes no desenvolvimento de novas drogas e na década passada, cerca de
30% dos fármacos prescritos foram derivados de plantas e dos 252 fármacos
considerados básicos ou essenciais pela Organização Mundial da Saúde (OMS)
nesse período, 11% foram exclusivamente de origem vegetal (Calixto, 2005). No
Brasil, desde a década de 80, as plantas medicinais e os fitoterápicos são
fornecidos no Sistema Único de Saúde (SUS) (Brasil, 2010).
No início desse século devido à ampla divulgação da relação entre
alimentação e saúde, a preocupação da sociedade ocidental com os alimentos
tem aumentado de forma exponencial (Anjo, 2004). Por esse motivo, tem-se
verificado uma tendência mundial do aumento na demanda por plantas e
preparações de origem vegetal como recurso terapêutico, influenciado por fatores
econômicos, sociais e culturais (Abu-Irmaileh & Afifi, 2003; Bent & Ko, 2004).
Pollonio (2000) define alimentos funcionais como qualquer substância
ou componente de um alimento que proporciona benefícios para a saúde,
inclusive na prevenção de doenças. Esses produtos podem variar de nutrientes
isolados, produtos de biotecnologia, suplementos dietéticos, alimentos
geneticamente construídos até os alimentos processados e derivados de plantas.
22
Para Borges (2001), eles devem exercer um efeito metabólico ou
fisiológico que contribua para a saúde física e para a redução do risco de
desenvolvimento de doenças crônicas. Nesse sentido, devem fazer parte da
alimentação usual e proporcionar efeitos positivos, obtidos com quantidades não
tóxicas e que não se destinem a tratar ou curar doenças, estando seu papel
ligado à redução do risco de contraí-las.
A American Dietetic Association (ADA) (2009) classifica todos os
alimentos como funcionais, pois todos contem nutrientes ou outras substâncias
que fornecem energia, sustentam o crescimento ou mantém e repararam
processos vitais. No entanto, alimentos funcionais possuem potencial efeito
benéfico na saúde quando consumidos como parte de uma dieta variada
fornecendo benefícios adicionais para saúde, reduzindo risco de doença e/ou
promovendo uma saúde ótima.
No Brasil, é definido como alimentos com alegações funcionais e deve
possuir “além de funções nutricionais básicas, quando se tratar de nutriente,
produzir efeitos metabólicos e ou fisiológicos e ou efeitos benéficos à saúde,
devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica”, devendo
desempenhar funções metabólicas ou fisiológicas no crescimento
desenvolvimento, manutenção e em outras funções normais do organismo
humano. A legislação não permite quaisquer alegações que façam referência à
cura ou a prevenção de doenças e para seu uso, deve possuir referências
científicas comprovando seus efeitos e os produtos com essa alegação devem ser
registrados (Brasil, 1999a,b).
Os fitoquímicos são substâncias produzidas naturalmente pelas
plantas, para protegê-las contra vírus, bactérias e fungos. Elas parecem ajudar na
preservação de alguns tipos de doenças e incluem centenas de substâncias como
carotenóides, flavonóides, isoflavonas, compostos fenólicos, licopeno, saponinas,
terpenos, sulfetos alílicos, indol entre outras (Simões et al., 2003).
O chá é uma das bebidas mais populares. As infusões derivadas da
planta Camellia sinensis L. Kuntze são a segunda mais consumida em todo o
mundo, perdendo apenas para a água (Owuor et al., 2008). A C. sinensis pode
23
ser um arbusto ou árvore de até 16 metros de altura (Ferrara et al., 2001)
podendo ser cultivado em diversas regiões que possuem alta umidade,
temperaturas amenas e solos ácidos desde o nível do mar até altas montanhas
(Balentine et al., 1997).
Segundo uma lenda chinesa, o chá foi descoberto acidentalmente por
um imperador há 4.000 anos, enquanto de acordo com outros relatos, os chineses
tem bebido chá desde 3.000 A.C. e mais de 4 milhões de acres são utilizados
para seu cultivo. Essa bebida é consumida em todos os países do mundo e, em
alguns deles, têm “status” cerimonial (Ferrara et al., 2001; Sharangi, 2009).
Pesquisas arqueológicas reportadas por Jelinek em 1978 sugeriram que a infusão
de folhas de diferentes plantas selvagens e de árvores de chá é praticada ha mais
de 500.000 anos (Dufresne & Farnworth, 2001).
As folhas de chá são usadas tanto socialmente, quanto para o uso
medicinal. A medicina tradicional chinesa recomenda, desde 3.000 A.C. o
consumo do chá verde para o alívio de dores de cabeça, dores corporais,
digestão, melhoria do sistema imune, desintoxicação, como energético e para
prolongar a vida (Ferrara et al., 2001).
Segundo Weisburguer (1997), a história do chá como bebida data do
ano de 2.700 A.C. na China. No Japão o consumo de chá foi introduzido por volta
do século VI. Por um longo período, o chá apenas era consumido pelas camadas
mais altas da sociedade, tornando-se popular somente 700 anos depois. O
consumo então se difundiu por toda a Ásia e das colônias para as metrópoles (por
exemplo, da Indonésia para a Holanda e da Índia para o Reino Unido), onde em
meados do século XVII os ingleses divulgaram e popularizaram o chá por todo o
mundo.
A denominação “chá” no mundo refere-se a infusões obtidas apenas da
planta C. sinensis, sendo que para outros tipos de planta usa-se a denominação
“infusão”. Entretanto, o Regulamento Técnico de Espécies Vegetais para o
Preparo de Chás define “chá” como produto constituído de uma ou mais partes de
espécie(s) vegetal(is) inteira(s), fragmentada(s) ou moída(s), podendo ser ou não
fermentado, tostada(s) e considera 54 espécies vegetais como matéria prima para
24
essa bebida, entre as quais estão a banana (Musa romática), acerola (Malpighia
glabra), abacaxi (Bromelia ananas), baunilha (Vanilla romática), marmelo (Pyrus
cydonia ou Cydonia vulgaris), mirtilo (Vaccinium myrtillus); raízes como beterraba
(Beta vulgaris), cenoura (Daucus carota) e sementes como guaraná (Paullinia
cupana), entre outros (Brasil, 2005; Brasil, 2006).
Dependendo do processo utilizado, a C. sinensis pode dar origem a
mais de 300 tipos de chás, apesar de ser geralmente consumido na forma de chá
verde e chá preto (Rusak et al., 2008) (FIG. 1).
FIGURA 1 - Esquema de obtenção do chá verde e chá p reto
FolhasFolhas
VaporVapor
SecagemSecagem
Trituração Trituração
OxidaçãoOxidação
SecagemSecagem
Chá VerdeChá Verde Chá PretoChá Preto
FolhasFolhas
VaporVapor
SecagemSecagem
Trituração Trituração
OxidaçãoOxidação
SecagemSecagem
Chá VerdeChá Verde Chá PretoChá Preto
25
3.2.1 Chá verde
O chá verde é mais consumido no Japão, China e Coréia e para sua
obtenção as folhas extraídas são fumegadas (vapor), enroladas e, então secas
naturalmente (Santana-Rios et al., 2001a). Sua cor é verde devido à inativação da
enzima polifenoloxidase por meio do tratamento das folhas frescas pelo calor
(Koo & Noh, 2007).
Introduzido no Japão pela China, o chá verde rapidamente se tornou
uma das bebidas mais populares. Hoje, o seu “flavor” é utilizado na fabricação,
desde sorvetes até vários tipos de bebidas industrializadas (Yamaguchi &
Shibamoto, 1981).
3.2.2 Chá preto
O chá preto representa 90% do consumo total mundial, sendo a Índia a
maior produtora e exportadora desse tipo de chá (Bhattacharyya et al., 2007). Seu
processamento segue algumas etapas utilizadas para chá verde, mas com a
diferença de que as folhas são esmagadas ou quebradas, sofrendo o processo de
oxidação, antes de serem secas (Santana-Rios et al., 2001a).
Nesse processamento, as catequinas presentes nas folhas sofrem
oxidação, o que é muito importante para o desenvolvimento de cor e sabor da
bebida. A oxidação é enzimática por ação das polifenoloxidases presentes nos
vacúolos das células. Para a enzima ser liberada destes vacúolos, as folhas
precisam ser trituradas e deixadas expostas ao oxigênio do ar. Anteriormente,
acreditava-se que o processo era fermentativo e, por este motivo, é ainda
conhecido como “fermentação” para a produção do chá preto (Matsubara &
Rodriguez-Amaya, 2006a,b).
O tempo de fermentação é fundamental para a qualidade final do chá.
É nesse processo que as folhas mudam da cor verde para a cor marrom e o
aroma de gramínea é transformado em floral (Bhattacharyya et al., 2007).
26
Os benefícios associados ao consumo de chá têm sido atribuídos a
altas concentrações de antioxidantes, como as catequinas e sua capacidade de
sequestrar radicais livres (Ho et al., 2010).
3.3 Antioxidantes
Nos seres humanos existe um balanço homeostático em que
mecanismos bioquímicos especiais, tanto endógenos, quanto exógenos, são
suficientes para neutralizar as Espécies Reativas do Oxigênio (ERO). Entretanto,
em alguns casos, estes mecanismos podem se tornar ineficientes ou a produção
destas espécies instáveis podem se tornar ineficientes por algum motivo (Sen et
al., 1994; Packer, 1997).
Os mecanismos bioquímicos de inativação das ERO podem ser
endógenos, como o sistema enzimático formado pela superóxido-dismutase,
glutationa-peroxidase e catalase, ou exógenos, que são compostos provenientes
exclusivamente da dieta ou de suplementação, denominados antioxidantes
(Amarowiez et al., 2004).
Antioxidante é “qualquer substância que, presente em baixas
concentrações quando comparada a do substrato oxidável, atrasa ou inibe a
oxidação deste substrato de maneira eficaz”, que possuem o potencial de
neutralizar os radicais livres, retardando ou inibindo a sua ação de oxidação. Os
antioxidantes estão em constante atividade nos organismos vivos, necessitando
estar em quantidades suficientes para neutralizar os efeitos tóxicos dos radicais
livres que são constantemente produzidos. Quando esta equivalência não existe,
ocorre o estresse oxidativo (Becker et al., 2004).
Os alimentos de origem vegetal são fontes de diversos compostos que
apresentam atividade antioxidante. Diversos trabalhos têm demonstrado a
importância do consumo de alimentos que contenham substâncias com atividade
antioxidante para a preservação de doenças cardiovasculares, câncer e
desordens cerebrais degenerativas relacionadas ao envelhecimento (Chu et al.,
2000; Liyana-Pathirana & Shahidi, 2006; Luximon-Ramma et al., 2003).
27
Um dos principais grupos de antioxidantes encontrados nas plantas,
em especial nos chás, são os compostos fenólicos, com destaque para a classe
dos flavonóides. A classe dos polifenóis compreende cerca de 5.000 espécies,
que são classificados em flavonóides (por exemplo, catequinas no chá;
isoflavonas em feijão, apigenina, quercetina e luteína em hortaliças e antocianinas
em frutas) e não flavonóides (ácidos clorogênicos em café) (Ota et al., 2010).
Os flavonóides além da atividade antioxidante demonstram outras
atividades biológicas importantes, tais como atividades anti-inflamatória,
antialérgica, antimicrobiana, anticarcinogênica e efeitos imuno-estimulantes
(Nijveldt et al., 2001). A atividade antioxidante dos compostos fenólicos é devida
principalmente às suas propriedades redox, que permitem que eles ajam como
agentes redutores ou doadores de hidrogênio. Além disso, estudos demonstram
que os compostos fenólicos apresentam a capacidade de quelar metais (Atoui et
al., 2005).
Estudos epidemiológicos associam o consumo de C. sinensis com
baixo risco de diversos tipos de câncer (Sato & Myata, 2000; Toit et al., 2001) e
seus polifenóis têm demonstrado ser um efetivo agente quimiopreventivo
(Cabrera et al., 2003; Gosslau & Chen, 2004). Outras propriedades estão
relacionadas ao aumento da atividade insulínica (Anderson & Polansky, 2002),
capacidades antimicrobiana, imuno-estimulatória e anti-inflamatórias (Saito et al.,
2006), proteção contra doenças cardiovasculares (Sano et al., 2004) e cerebrais
(Suzuki et al., 2004), inibição do crescimento de cáries (Sakanaka et al., 1989),
inibição de alergias (Yeo et al., 1995), redução da pressão arterial sistêmica e
prevenção de gota (An et al., 1996).
Entre os antioxidantes mais ativos e frequentemente encontrados na C.
sinensis são os flavanóis: catequinas (C), epigalocatequina (EGC),
epigalocatequina galato (EGCG), epicatequina (EC), epicatequina galato (ECG),
teaflavinas (FIG. 2); e os flavonóis: miricetina, quercetina e kaempferol (FIG. 3)
(Matsubara & Rodriguez-Amaya, 2006a,b).
28
29
A inibição da oxidação lipídica de seus polifenóis são maiores do que
encontrados em antioxidantes sintéticos, como o BHT (butylated hydroxytoluene),
BHA (butylated hydroxyanisole), TBHQ (tertiary butyl hydroquinone) e
antioxidantes naturais como a vitamina E (Wanasundara & Shahidi, 1998).
Também ha registro de que a epigalocatequina galato (EGCG), um tipo de
catequina encontrado nesse tipo de chá, pode ter efeitos anti-HIV quando
associado na periferia de receptores CD4 (Kawai et al., 2003), e seus
antioxidantes estimulam a termogêneses, promovendo assim a perda de peso
(Dulloo et al., 1999).
Outro benefício do uso dos antioxidantes da C. sinensis, e que
recentemente começou a atenção dos pesquisadores, é seu uso na área
esportiva. Ichinose et al. (2011) verificaram que indivíduos suplementados por 10
semanas, com 572,8 mg de catequinas provenientes do chá verde, associado
com um programa de treinamento de 60 minutos por dia, 3 vezes por semana a
60% do VO2max aumentaram a utilização da gordura corporal durante o exercício.
Arent et al. (2010) relataram que a suplementação de extratos de chá
preto resultou em aumento de desempenho, redução das taxas de dor muscular
de início retardado, diminuição dos marcadores de estresse oxidativo e
recuperação do eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal melhorando a resposta a
crises agudas de exercícios de alta intensidade, indicando que o chá preto possui
aplicação em potencial para a recuperação de exercícios de alta intensidade,
especialmente se estiver usando intervalos anaeróbicos repetidos. Portanto, uma
melhor recuperação pode promover o aumento da frequência e da qualidade do
treinamento, levando a um melhor desempenho.
Todos os tipos de C. sinensis, têm propriedades estimulantes, deste
modo, gestantes ou pessoas que sofrem de ansiedade, insônia ou batimentos
cardíacos irregulares devem limitar o seu consumo diário em 1 ou 2 xícaras,
sendo a última consumida, pelo menos, 3 horas antes de dormir (Ferrara et al.,
2001).
30
3.3.1 Absorção dos antioxidantes
A quantidade de compostos bioativos presentes nos alimentos não
reflete a quantidade absorvida e metabolizada pelo organismo. O entendimento
dos fatores que liberam o composto da matriz do alimento, a extensão da sua
absorção e seu papel no organismo é importante para determinar o mecanismo
de ação e sua influência na promoção e manutenção da saúde humana (Horst &
Lajolo, 2009). Para os polifenóis, somente pelo aumento da capacidade
antioxidante do plasma após o consumo de alimentos ricos nesses compostos é
possível evidenciar a absorção através da barreira intestinal (Scalbert et al.,
2002).
Segundo Ferruzzi (2010), a biodisponibilidade dos compostos fenólicos
pode ser definida como a proporção de constituintes fenólicos e seus metabólitos
(incluindo a fase intestinal e hepática) secretados dentro da circulação disponíveis
para subsequente captação pelo tecido e metabolismo. Já a bioacessibilidade
pode ser definida como a fração de fenólicos transferidos da matriz da bebida
para fase contínua e estar disponível para a captação pela mucosa intestinal.
Para a absorção de compostos fenólicos é necessário que ocorra a:
• Liberação do composto específico da matriz da bebida;
• Solubilização no lúmen intestinal;
• Estabilidade do composto nas condições digestivas;
• Captação pelas células absortivas no intestino delgado;
• Potencial para o metabolismo intracelular;
• Secreção para a corrente sanguínea onde os compostos
fenólicos são distribuídos para os tecidos.
31
O metabolismo dos polifenóis começa no lúmen do intestino delgado e
modificações após a absorção também ocorrem no fígado e em outros órgãos.
Além da absorção pelo intestino delgado, compostos fenólicos podem alcançar o
intestino grosso, sendo metabolizados pela microbiota para fenólicos simples,
ácidos orgânicos e muitos outros produtos que são subsequentemente absorvidos
e distribuídos para os tecidos (Gonthier et al., 2003; Lee et al., 2006; Hsu et al.,
2008).
Os compostos da classe dos flavanóides e dos flavonóides são
submetidos a uma extensa biotransformação incluindo a metilação, sulfatação,
glicuronadação (o ácido glicurônico é ligado via ligação glicosídica com a
substância e o resultante glicuronídeo possui uma maior solubilidade na água
comparada à substância original) e quebra de seus anéis no enterócito, enquanto
a metilação e outros passos também podem acontecer nas células hepáticas (Del
Rio et al., 2010; Khan & Mukhtar, 2007). A recuperação na urina após a ingestão
de quantidades dadas de um polifenol em particular permite a comparação da
biodisponibilidade dos diferentes tipos de moléculas presentes nas dietas,
variando de um composto fenólico para outro (Scalbert et al., 2002).
De um modo geral, nenhum traço de flavonóides pode ser encontrado
no plasma e na urina de humanos. As únicas exceções parecem ser da (-)-EGCG
e traços de (-)-ECG que estão presentes no sistema circulatório sem serem
metabolizados (Stalmach et al., 2009). A presença desses compostos está em
maior concentração em tecidos danificados (dentro de células espumosas
derivados dos macrófagos) do que em tecidos saudáveis por motivos
desconhecidos (Del Rio et al., 2010).
A estrutura dos polifenóis tem um impacto importante na absorção
intestinal. Os parâmetros mais importantes são o peso molecular, a glicosilação e
esterificação. O alto peso molecular das teaflavinas dos chás (M=568) deve
explicar sua baixa recuperação na urina (Déprez, et al., 2001; Donovan et al.,
2002), por exemplo.
A absorção intestinal também é influenciada pela esterificação com
ácido gálico para catequinas. A recuperação de catequinas galato na urina
32
humana após consumo de chá preto foi cerca de 10 vezes menor que a das
catequinas sem galato (Warden et al., 2001).
Muitos dos polifenóis na dieta são rapidamente eliminados na urina e
pela bile após a ingestão. Em humanos, o pico pós-prandial é observado 1-2h
após a ingestão de flavonóides, mas pode ser maior para outros tipos de
polifenóis, pois devem ser antes metabolizados pelas bactérias do intestino para
então serem absorvidas (Scalbert & Williamson, 2000).
Os polifenóis são amplamente metabolizados, tanto nos tecidos, uma
vez que são absorvidos através da barreira intestinal; quanto pela microbiota do
cólon, para a fração não absorvida e a fração re-excretada na bile. Todos os
polifenóis são conjugados para formar Ο-glucuronidos, ésteres de sulfato e O-
metil éter. Esta conjugação ocorre pela primeira vez na barreira intestinal, como
tem sido demonstrado em experimentos nos quais a quercetina foi perfundida no
intestino de ratos vivos (Crespy et al., 1999).
Glucuronidos de quercetina são formados na mucosa intestinal e
secretados tanto para o lúmen intestinal quanto para o lado seroso. Em ratos, o
maior nível de atividade transferase glucuronil foi observado no intestino (Piskula
& Terao, 1998). Estes conjugados, em seguida, chegam ao fígado, onde são
posteriormente metabolizados. Por exemplo, a catequina é extensivamente
metilada no fígado. Quando foi perfundido no intestino de ratos, apenas metade
da catequina presente no plasma mesentérico antes de atingir o fígado foi a forma
metilada (O-metilada), enquanto que 99% da catequina excretada na bile foram
as O-metilados (Donovan et al., 2001).
3.4 Cuidados na produção
A maior industrialização e comercialização de fitoterápicos tornaram
seu uso um problema de Saúde Pública. O aumento da demanda, associado à
falta de fiscalização efetiva que garanta desde a exploração racional dos recursos
naturais empregados como matéria-prima, até a liberação do produto acabado,
contribuem para a disponibilidade e acesso a produtos muitas vezes sem
condições adequadas ao uso, sem garantia da qualidade, segurança e eficiência,
33
fundamentais para a recuperação ou preservação da saúde do consumidor (De
Smet, 2004; Giveon et al., 2004). Além desses fatores, a legislação que instituía
valores aceitáveis para a contaminação por fungos em chás foi revogada e não foi
substituída por nenhuma outra norma.
Na etapa final do processamento das folhas de chá, quando a secagem
é mecânica, com temperatura de aproximadamente 80 °C, pode até reduzir a
carga microbiana, porém não é suficiente pra eliminar endosporos, esporos e
alguns fungos patogênicos. As etapas seguintes à secagem, como na estocagem,
manuseio e embalagem representam um risco para que haja uma
recontaminação. Somando-se a isso, a recomendação pelo uso de água não
fervente, ao contrário da água em ebulição, para o preparo do chá, com o objetivo
de manter o “flavor” o mais intacto possível, faz com que a quantidade de
microrganismos destruídos seja menor (Mishra et al., 2006).
Fatores como poluição na água de irrigação, atmosfera, solo,
condições da coleta, manipulação, secagem e estocagem são importantes a
serem considerados no controle de produtos naturais, por permitirem altos níveis
de contaminação microbiana, por vezes patogênica (Mandeel, 2005). A presença
de fungos potencialmente toxigênicos podem ser encontrados nesses produtos,
indicando um grande potencial para a presença de micotoxinas que podem
causar efeitos agudos e crônicos nos diferentes órgãos e sistemas do corpo
humano (Aquino et al., 2010).
Efuntoye (1999) avaliou a relação entre tempo de estocagem das
plantas, por um período de até três meses e níveis toxigênicos, demonstrando
que, quanto maior o tempo de armazenamento, maior era a produção de toxinas.
Após 90 dias, os níveis toxigênicos apresentaram elevação máxima. Bugno et al.,
(2005) avaliaram 91 amostras de plantas com propriedades fitoterápicas,
compostas por 65 espécies vegetais distintas e considerando as especificações
farmacopéicas para a enumeração de populações microbianas presentes e para
pesquisa de microrganismos específicos, verificaram que 92,3% das drogas
vegetais analisadas estavam em desacordo com um ou mais parâmetros
microbiológicos.
34
Fungos já foram encontrados em todas as etapas na produção de
chás. Estudos realizados em chá preto verificaram a presença de Aspergillus,
Penicillium, Paecilomyces, Cladosporium, Alternaria, Mucor, Fusarium, Rhizopus,
Absidia e Trichoderma. As espécies como Aspergillus, Penicillium, Fusarium e
Alternaria são conhecidas como toxigênicas por produzirem micotoxinas
(Monbaliu et al., 2010).
Rizzo et al. (2004) observaram que 79% de um total de 152 amostras
de plantas medicinais comuns na Argentina estavam contaminadas com
Aspergillus ssp. e em 40 amostras havia a presença de micotoxinas. Hell et al.
(2009) também verificaram a presença dessa espécie de fungo em 72% das suas
amostras que compreendiam de diversos vegetais desidratados vendidos em
mercados de três países da África Ocidental.
3.5 Irradiação
O início da história da irradiação de alimentos surgiu com a própria
história da radiação. Com o descobrimento dos raios-X por Röentgen (Dezembro
de 1895) e a identificação da radioatividade por Becquerel (Fevereiro/Maio 1896),
várias pesquisas surgiram sobre os efeitos biológicos da radiação em organismos
vivos. Rapidamente inventores descobriram aplicações práticas para a radiação.
A principal vantagem na aplicação da radiação ionizante em alimentos observada
era a total ausência do emprego de compostos químicos (Morrissey & Herring,
2002).
Com o desenvolvimento tecnológico durante a segunda guerra
mundial, foram produzidos equipamentos que poderiam ser adaptados e
aumentar a aplicação do processamento por radiação e estudos realizados pelos
Estados Unidos estimularam a realização de experimentos por outros países. Um
dos primeiros usos comerciais da irradiação de alimentos na Europa ocorreu na
Alemanha em 1957, quando produtores de condimentos começaram a melhorar
qualidade higiênica de seus produtos (Diehl, 2002).
No Brasil, a irradiação de alimentos começou a se intensificar no final
da década de 60. Em 1974, o Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares
35
instalou no Centro de Tecnologia das Radiações um acelerador de elétrons de 1,5
MeV para aplicações industriais e em 1975 criou-se um convênio com a
Universidade de São Paulo, para implantação de cursos de pós-graduação no
instituto (IPEN, 2004).
As décadas de 70 e 80 foram mundialmente dedicadas às pesquisas
toxicológicas para comprovar a inocuidade dos alimentos irradiados, uma vez que
esse era o aspecto mais questionado. Os projetos foram desenvolvidos em 24
países sob a coordenação de um Comitê formado pela “International Atomic
Energy Agency” (IAEA/Viena), “Food Agriculture Organization” (FAO/Roma) e
“Organization for Economic Cooperation” (OEC/Paris) e teve como órgão
consultivo a “World Health Organization” (WHO). Após intensivos estudos, que
envolveram, além de testes químicos, experimentos com animais alimentados
com diversos produtos irradiados, o Comitê concluiu, em novembro de 1980, “que
a exposição de qualquer produto alimentício a doses de até 10,0 kGy não
apresenta perigo toxicológico; portanto, testes toxicológicos com alimentos assim
tratados não são mais necessários” (WHO, 1999).
O termo radiação se refere aos processos físicos de emissão e
propagação de energia (CNEN, 2009a), enquanto o termo irradiação é utilizado
para a aplicação desta energia a um determinado material, atingindo objetivos
pré-estabelecidos (CNEN, 2009b). A principal aplicação da radiação de alta
energia é que ela causa ionização no meio que é absorvida, ou seja, é capaz de
remover elétrons de suas órbitas em átomos ou moléculas. Por essa razão é
denominada radiação ionizante (Molins, 2001).
A quantidade de radiação ionizante absorvida é chamada de dose de
radiação absorvida e a unidade utilizada é o Gray (Gy), sendo que 1 Gy é igual à
energia de 1 Joule absorvido por 1 kg de material (Olson, 1998).
De acordo com o Codex General Standard for Irradiated Foods (2003),
para irradiação de alimentos só são permitidos os raios gama, provenientes de
radionuclídeos de 60Co, com energia podendo chegar até 1,33 MeV e 137Cs, com
energia de 0,662 MeV; raios X, com energia máxima de 5 MeV e feixes de
elétrons, que são gerados por aceleradores que podem atingir energia máxima de
36
10MeV. Esses tipos de radiação são permitidos, porque além de produzirem os
efeitos desejados nos alimentos, não induzem a radioatividade nestes ou em
materiais que os acompanham, como por exemplo, as embalagens (Farkas, 2006;
Farkas & Mohácsi-Farkas, 2011).
Estas fontes de radiação não induzem radioatividade mensurável no
alimento porque a energia limiar para a reação (γ,n) está bem acima de 10 MeV
para todos os isótopos presentes no alimento (Findlay et al., 1993; ICGFI, 1995;
Wakeford et al., 1991; Woods & Pikaev, 1994). O processamento de alimentos
por radiação requer uma exposição controlada e cuidadosa frente à radiação
ionizante de energia conhecida. A exposição deve ser adequada para produzir o
resultado desejado (Farkas, 2001).
A escolha da fonte para a irradiação vai depender do material a ser
irradiado e do objetivo a ser atingido. O uso da radiação proveniente de 60Co
possui grande penetrabilidade e são utilizadas na irradiação de produtos de
grande espessura. Os aceleradores de elétrons possuem a penetração de apenas
alguns milímetros e são usados para a irradiação superficial de alimentos ou para
produtos a granel, de fina espessura (Fanaro et al., 2007a;b). Irradiadores com
fontes de 60Co são os mais utilizados, atualmente, para o processamento de
alimentos (IAEA, 2001).
O tratamento com radiações ionizantes pode ser usado de forma
independente ou combinado às técnicas já existentes, tais como secagem,
fermentação, tratamento químico, tratamento pelo calor, conservação a baixas
temperaturas ou em atmosferas modificadas (Rossi & Jesus, 1994). Uma grande
vantagem do processo de irradiação é que ele permite a diminuição do uso de
produtos químicos, usados como conservantes e antibióticos, em alimentos
(IAEA, 2001).
Essa técnica é recomendada por diversas autoridades de diversos
países, como o “Food and Drug Administration” (FDA), a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA), o Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA) e o “Food and Agriculture Organization” (FAO) e o “World
Health Organization”. Cada país possui uma legislação específica sobre quais
37
alimentos podem ser irradiados e quais são as doses máximas permitidas para
cada um deles.
Nos EUA o processamento de carne suína, bovina e de frango e ovos
com casca podem ser irradiados com doses de até 4,5 kGy e especiarias
desidratadas com doses de até 30,0 kGy (Morehouse, 2002). Na Europa, o
conselho de União Europeia aprova o uso da radiação ionizante apenas para
ervas aromáticas secas, especiarias e temperos vegetais com doses de até 10,0
kGy (EU, 1999), entretanto alguns países membros da União Europeia (Bélgica,
República Checa, França, Itália, Holanda, Polônia e o Reino Unido) possuem
permissões para irradiar, além dos já permitidos, 29 tipos de alimentos ou
ingredientes, entre eles carnes, clara de ovos, frutas, vegetais, cereais e frutos do
mar com doses máximas estabelecidas para cada alimento (EU, 2009).
A legislação brasileira aprova o uso da radiação ionizante por meio da
RDC n° 21/2001, desde que seu uso seja para a finalidade sanitária,
fitossanitárias e/ou tecnológicas e a dose mínima absorvida seja suficiente para
alcançar a finalidade pretendida e a dose máxima seja inferior a dose que
comprometa as propriedades funcionais ou quaisquer atributos do alimento. Uma
das principais observações, e que deve ser sempre ressaltada, é que o processo
de radiação, bem como qualquer outro tratamento aplicado nos alimentos não
deve substituir as boas práticas de fabricação e manuseio (Brasil, 2001a).
A resolução ainda descreve que a embalagem deve ter condições
higiênicas aceitáveis, ser apropriada para o procedimento de irradiação, estar de
acordo com a legislação vigente e aprovada pela autoridade sanitária competente.
Na rotulagem dos alimentos irradiados, além dos dizeres exigidos para os
alimentos em geral e específico do alimento, deve constar no painel principal:
"ALIMENTO TRATADO POR PROCESSO DE IRRADIAÇÃO", com as letras de
tamanho não inferior a um terço (1/3) do da letra de maior tamanho nos dizeres
de rotulagem. Quando um produto irradiado é utilizado como ingrediente em outro
alimento, deve declarar essa circunstância na lista de ingredientes, entre
parênteses, após o nome do mesmo.
38
Existe ainda, um símbolo internacional, a radura, utilizado para
identificar os alimentos que sofreram tratamento por radiação ionizante (FIG. 4).
FIGURA 4 - Símbolo internacional para alimentos irr adiados
Os dados mais recentes sobre a quantidade de alimentos irradiados foi
realizado por Kume et al. (2009) em 2005. A América (Estados Unidos, Canadá e
Brasil) é o segundo continente que mais irradia alimentos no mundo (166.400
toneladas), perdendo apenas para o continente asiático (183.309 toneladas),
entretanto é o que mais utiliza a radiação ionizante em especiarias, frutas, grãos e
hortaliças. O Brasil é o quarto maior irradiador de alimentos (23.000 toneladas),
atrás da China (146.000 toneladas), Estados Unidos (92.000 toneladas) e Ucrânia
(70.000 toneladas). A estimativa foi que 404.804 toneladas de alimentos foram
irradiados no mundo em 2005.
A radiação pode causar uma variedade de efeitos físicos e bioquímicos
nos microrganismos. Uma vez absorvida por um material biológico, a radiação
ionizante pode ter ação direta ou indireta sobre o material que recebeu este
processamento (Hansen & Shaffer, 2001).
Quando a radiação age de forma direta no material biológico, ocorre a
excitação ou ionização de moléculas de ácido nucléico e a partir daí serão
conduzidas mudanças biológicas que podem levar a morte celular (Alcarde et al.,
2003). Considerando que a sensibilidade à radiação de macromoléculas é
aproximadamente proporcional a sua massa molar, Pollard (1966) estimou que
uma dose de 100 Gy danificaria 2,8% do DNA de uma célula bacteriana,
39
enquanto que a mesma dose danificaria 0,14% das enzimas e apenas 0,005%
dos aminoácidos.
O dano correspondente a 2,8% do DNA pode ser letal para uma ampla
fração de organismos vivos, principalmente para organismos complexos. Os
efeitos da quebra do DNA em alimentos são mostrados por diversos autores
(Araújo et al., 2004; Fanaro et al., 2007a,b; Villavicencio et al., 2000). Em
contraste, o dano de 0,14% causado às moléculas das enzimas seria difícil de ser
detectado, mesmo com métodos analíticos sofisticados e uma mudança de
0,005% nos aminoácidos em sistemas biológicos não pode ser detectada. Essas
considerações explicam o porquê uma dada dose pode ter um efeito letal nos
microrganismos em uma amostra de alimento irradiado sem causar muita
alteração na composição química (Aquino, 2003).
O efeito indireto é ocasionado pela interação da radiação com a
molécula de água (radiólise), gerando os chamados radicais livres. Estes irão
interagir com outros constituintes do material biológico tratado com radiação,
podendo trazer sérias consequências (Tritsch, 2000).
3.6 Radiólise da água
Assim como os estudos da irradiação de alimentos, os estudos sobre a
radiólise da água também começaram imediatamente após as descobertas de
Röentgen e Becquerel. Em 1902, Giesel começou os primeiros estudos com a
irradiação de água pura. Entretanto os estudos mais aprofundados só foram
realizados em 1944 por Weiss que assumiu que íons formados inicialmente na
água são transformados em radical (Samuel & Magee, 1953).
A água é o maior constituinte das células. A absorção de radiações
energéticas pela água resulta tanto na excitação, quanto ionização levando a
produção de radicais livres que podem atacar outras moléculas presentes no meio
(Azzam et al., 2012). Sabe-se que boa parte dos danos causados a uma célula
pela radiação ionizante ocorre pela ação indireta da radiação. Isto se deve ao fato
de que a maioria das células vivas apresenta em média 80% de água em sua
composição. Mesmo produtos aparentemente secos contêm água, como farinha
40
de trigo (13%), vegetais desidratados (10%), nozes (5%) entre outros (WHO,
1994).
A radiação ionizante causa a ionização e excitação da água, levando a
formação de produtos radiolíticos como o elétron hidratado ou aquoso (e-aq), água
ionizada (H2O+), radical hidroperoxila (HO2
•), radical hidroxila (•OH), radical
hidrogênio (H•) e peróxido de hidrogênio (H2O2) em um curto período de tempo
(cerca de 10-8s) em sistemas biológicos. Devido suas naturezas instáveis, com
exceção do H2O2, eles desaparecem em menos de 10-3 s (Breen & Murphy, 1995;
Riley, 1994).
Resumidamente, os eventos que acompanham a absorção de fótons
de alta energia ou a passagem rápida de partículas carregadas podem ser
divididos em quatro, onde suas fases são demarcadas pelo o tempo em que
ocorrem (Azzam et al., 2012):
• A primeira fase (10-16 s), ou estágio físico, a deposição de
energia é causada pela radiação incidente e elétrons
secundários são gerados, criando espécies extremamente
instáveis.
• Na segunda fase (10-15 s a 10-12 s), ou estágio físico-químico,
essas espécies geradas passam por uma rápida reorganização.
Esse processo produz produtos radicais e moleculares da
radiólise que são distribuídos em estrutura não homogenia.
Elétrons secundários desaceleram para energias de sub-
excitação e após a termalização, os elétrons tornam-se
hidratados.
• Durante a terceira fase (10-12 s a 10-6 s) as várias espécies
químicas reativas são formadas (H•, •OH, H2, H2O2, H+, OH−,
O2...), difundem e reagem com outras espécies ou com o
ambiente, até todas as reações estejam completas.
41
• Em sistemas fisiológicos, a quarta fase segue o estágio biológico
em que as células respondem ao dano resultante dos produtos
formados nos estágios anteriores. Nessa fase a resposta
biológica pela exposição à radiação é induzida.
Uma parte significante dos danos iniciais causadas nas células pela
irradiação é através dos danos no DNA, onde os produtos da radiólise da água
(principalmente o •OH) possuem um papel importante (Wallace, 1998). Além
disso, alguns produtos da radiólise da água, como o •OH e o HO2•, são
considerados Espécies Reativas do Oxigênio (ERO).
Já foi reportado que em células, a irradiação não somente leva a
geração de ERO derivada da radiólise da água. Esse processamento também
aumenta o nível intracelular de ERO, incluindo o •OH horas depois a exposição à
radiação ionizante. Essas ERO geradas em processos secundários possuem
papéis importantes dentro das células, como a sinalização apoptótica e
instabilidade do DNA (Yamamori et al., 2012).
A radiólise da água resulta em numerosos produtos, onde o radical OH
é o mais reativo. Esse radical retira átomos de hidrogênio do açúcar e das bases
ou adiciona esses átomos nas bases, conduzindo assim, a lesões no DNA. Essas
lesões podem ser através da quebra da fita simples ou da dupla fita, modificações
na desoxirribose e nas bases nitrogenadas, gerando reticulações intracadeia,
entre fitas e “crosslinks” entre DNA-proteína (Spotheim-Maurizot et al., 1996).
Os íons radicais e produtos da radiólise da água já foram identificados
em uma série de trabalhos entre as décadas de 1960 e 1980 e a partir desses
trabalhos, Ershov e Gordeev (2008) descreveram 32 reações químicas entre as
espécies formadas pela radiólise.
As espécies reativas que mais são formadas após a quebra da
molécula da água são o radical hidroxila e o elétron aquoso e ambos são
altamente reativos. O rendimento das espécies reativas é expresso em valor G,
onde G é definido como a transformação química induzida pela energia cedida
para o meio pela radiação (Ferradini & Jay-Gerin, 1999):
42
� =�ú��������é�������������������í��
100����������
Onde os valores de G para os principais produtos da radiólise da água
estão no Quadro1 (Ferradini & Jay-Gerin, 1999):
Quadro 1 – Rendimento das principais espécies reati vas formadas pela radiólise da água
Espécie Rendimento (G)
•OH 2,6 - 2,7
e-aq 2,7 - 2,87
H2O2 0,61 - 0,7
H• 0,55 - 0,61
H2 0,43 - 0,45
A capacidade de um antioxidante em estabilizar um radical livre, ao que
parece, não depende somente do número duplas ligações ou anéis aromáticos
em sua composição. O tipo de radical livre e como os átomos estão dispostos na
molécula antioxidante irão influenciar na capacidade de neutralização. É sabido
que a presença de dupla ligação entre C2 e C3, do gurpo C3-OH e glicosilação
são estruturas-chave que influenciam a capacidade antioxidante de compostos
fenólicos, porém na presença do e-aq, antioxidantes como a quercetina/rutina que
possuem grupos ceto no C4 são mais efetivos (Cai et al., 1999).
43
3.7 Radicais livres
Os estudos sobre radicais iniciaram no fim do século XIX com Fenton
em 1894, passando por Gomberg em 1900 e Haber e Weiss em 1934 e pode ser
definido como uma espécie que perdeu ou ganhou um elétron, ficando com um
elétron desemparelhado (Buechter, 1988; Halliwell & Gutteridge, 1985).
Os radicais livres contém um número ímpar de elétrons. Esse elétron
sozinho confere ao radical livre certo grau de instabilidade em termo de energia e
cinética. Energeticamente, para alcançar a estabilidade, os radicais livres
eliminam esse elétron da sua composição eletrônica. Para isso, o radical pode
perder um elétron, que nesse caso é uma espécie reduzida ou ganhar um elétron,
que nesse caso é um radical oxidado e, dependendo se o composto apresentar o
mesmo radical, ele pode ser tanto oxidado quanto reduzido. Além disso, um
radical pode frequentemente se auto-oxidar, através da reação chamada
dismutação, onde nessa reação, um dos radicais é oxidado enquanto o outro é
reduzido (Valko et al., 2007).
Cineticamente, o fato de o radical livre ter um elétron desemparelhado
na sua última camada favorece consideravelmente seus pareamentos com outras
moléculas durante as colisões biomoleculares. A taxa da reação química,
entretanto, é determinada pela eficiência das colisões, e com o aumento desse
parâmetro no caso dos radicais, as reações são frequentemente mais rápidas
(Pierrefiche & Laborit, 1995).
A presença de um elétron desemparelhado é um fator de instabilidade
que determina as propriedades dos radicais livres. Quando o radical reage com a
molécula vizinha, ela é transformada em um radical livre, que ira procurar um
elétron para se estabilizar. Esse processo vai se perpetuando como uma reação
em cadeia (Pierrefiche & Laborit, 1995).
As ERO são mediadores muito importantes dos danos e da morte
celular. Essas espécies químicas altamente reativas não são importantes
somente no processo do envelhecimento, mas também nos processos que
envolvem diversas doenças como aterosclerose, dano de reperfusão e câncer,
além de serem fundamentais nos danos celulares induzidos por processos
44
inflamatórios crônicos e diversas desordens no sistema nervoso central (Cross,
1987; Halliwell & Gutteridge, 1985; Zwart et al., 1999). Estes radicais
frequentemente atacam as moléculas no organismo, retirando uma molécula de
hidrogênio e quebrando insaturações (Zwart et al., 1999).
A abstração de um ou dois elétrons do oxigênio produz radicais
superóxido e peróxido, respectivamente, amplamente encontrados nos complexo I
e II da cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria e pode ser produzido na
taxa de 1 a 4% de cada molécula de oxigênio usada (Brand et al., 2004). Essa
produção de radicais é particularmente alta quando o terminal de aceitação de
elétrons é limitado (no caso de hipóxia, anóxia ou esquemia), ou quando há
substrato em excesso (Clancy & Birdsall, 2012).
Mudanças atribuídas a reações de radicais livres incluem alterações na
vida útil de moléculas de longa vida, como na transformação do colágeno em N´-
(carboximetil)lisina; danos oxidativos no DNA, onde danos no DNA mitocondrial
são cerca de 16 vezes maior do que no DNA molecular; e na glicação, uma
modificação nas proteínas, resultante de reações entre a glicose e grupos de
aminoácidos das proteínas (Harman, 1992).
A peroxidação lipídica é um fenômeno muito importante, uma vez que
todas as células possuem uma membrana fosfolipídica, e os locais onde os
radicais são geralmente e mais especificamente as espécies reativas do oxigênio
são formadas, tornando a membrana mais suscetível aos ataques dos radicais
livres. Especialmente os ácidos graxos poli-insaturados que são ainda mais
suscetíveis aos radicais livres (Zwart et al., 1999).
A peroxidação pode resultar na geração de radicais lipídicos (L•),
radicais alcoxil (LO•), peróxidos (LOO•) e hidroperóxidos (LOOH•). Uma vez que o
radical lipídico é formado, ele pode propagar uma cadeia de reações que pode
resultar no dano na membrana celular e, além disso, pode interagir com
proteínas, resultando na formação de radicais proteicos e, portanto, afetar o
funcionamento da célula (Burton, 1988).
As proteínas constituem uma grande parte de toda a massa orgânica
oxidável nos seres vivos e diversos trabalhos demonstraram que as proteínas são
45
alvos para as ERO. Altos níveis de proteínas com grupos carbonil (como
aminoácidos ácidos) e aminoácidos com grupo amida são utilizados como
marcadores iniciais de danos em sistemas biológicos submetidos ao estresse
oxidativo, mesmo naqueles que se verifica a presença de antioxidantes
endógenos. Elevados níveis de oxidação proteica foi medido em tecidos humanos
envelhecidos (Domazou et al., 2009).
46
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Amostras
Amostras de chá verde foram doadas pelo Herbarium Laboratório
Botânico Ltda. (Colombo/PR) e as amostras de chá preto foram doadas pela Leão
Junior S/A (Fernandes Pinheiro/PR). Todas as amostras foram processadas em
triplicata.
4.2 Atividade de água (Aw)
Foram determinas três Aw para esse trabalho. Uma Aw alta (↑Aw), uma
Aw média (→Aw) e uma Aw baixa (↓Aw). Para a Aw alta, o valor deveria ser maior
que 0,85; que é o valor onde normalmente há crescimento de diversas espécies
de fungos. Para a Aw baixa, o valor deveria estar abaixo de 0,25; que é o valor
onde não há praticamente água livre nos alimentos.
As amostras foram pesadas (o peso variou dependendo do
experimento) e então foram submetidas aos processos de aumento e diminuição
da Aw. As amostras foram pesadas antes para que a quantidade de água ganha
ou perdida não interferisse no peso ao realizar a pesquisa. Os procedimentos
para aumento e diminuição da Aw seguiram-se as seguintes etapas realizadas no
laboratório:
• Para aumentar a Aw, as amostras foram colocadas em placas
de petri sem tampa em um dessecador com água destilada até o
nível do disco de porcelana por 48h a temperatura ambiente
(±25 °C).
47
• Para diminuir a Aw, as amostras foram colocadas em placas de
petri sem tampa em uma estufa a 35 °C/48h.
• As amostras com Aw média tiveram seus valores mantidos
iguais aos dos fornecedores e foram armazenadas em
temperatura ambiente (±25 °C).
Os valores de Aw das amostras foram obtidos utilizando-se
equipamento Aqualab 4TE Duo (Decagon Devices Inc.) e cada placa foi medida
em duplicata. Após esses processos as amostras foram colocadas em sacos de
“stomacher”, fechados e identificados com sua respectiva dose. O período entre a
medição da Aw e o início do processo de irradiação foi menor que 24h.
4.3 Irradiação
As amostras foram irradiadas no Centro de Tecnologia das Radiações
do IPEN, em fonte de 60Co utilizando-se a Gammacell 220 (Nordion Inc., Canadá)
em temperatura ambiente (±25 °C). Inicialmente as doses foram de 0; 2,5; 5,0; 7,5
e 10,0 kGy e após o andamento do trabalho, foram adicionadas as doses de 1,0;
1,5 e 2,0 kGy. A taxa de dose variou de 2,16 a 1,43 kGy/h durante o período e o
dosímetro Harwell Amber 3042 foi utilizado para medir as doses de radiação.
4.4 Microbiologia
No saco de “stomacher”, 10 g de amostra foram misturadas com 90 mL
de água estéril (diluição 10-1) e agitadas por 30 minutos. Alíquotas de 1 mL foram
repassadas em tubos de ensaio com 9 mL de água estéril e realizadas diluições
seriadas até a diluição 10-8. A fração de 0,1 mL foi semeada superficialmente em
placas de petri (em triplicata) contendo ágar Dicloran Glicerol 18% (DG-18) (o pó
para preparo foi da Acumedia, Michigan, EUA e o glicerol da Dinâmica,
Diadema/SP) e incubadas a 25±0,2 °C/5 dias. A contagem foi determinada por
unidades formadoras de colônias por grama da planta de chá (UFC/g) (Pitt et al.,
1983).
48
4.4.1 Contaminação artificial
Devido a baixa contaminação fúngica em ambas as amostras doadas,
elas foram contaminadas com cepas de Aspergillus ssp. e Rhizopus ssp.
fornecidas pelo Laboratório de Fungos Toxigênicos e Micotoxinas do Instituto de
Ciências Biomédicas II da Universidade de São Paulo. Para isso, uma alçada de
cada cepa foi dissolvida em 10 ml de água destilada com uma gota de Tween 20
e então adicionada nas amostras em um saco de polietileno e misturadas
manualmente. Os sacos foram incubados em estufa a 25±0,2 °C/2 semanas e
então repetidos os passos 4.2, 4.3 e 4.4.
4.5 Extração de compostos solúveis
Foi realizada uma infusão com 5 g em 500 mL água destilada fervente
por 10 min. com ligeiras agitações no início, meio e final do período. Em seguida,
a mistura foi filtrada a vácuo em papel filtro e após resfriada em temperatura
ambiente o volume foi ajustado para 500 mL com água destilada. As amostras
foram aliquotadas e armazenadas (-18 °C) para as análises (Matsubara &
Rodriguez-Amaya, 2006a,b). As extrações foram realizadas em triplicata.
4.6 Determinação de compostos fenólicos totais
Os compostos fenólicos totais foram determinados através do reagente
Folin-Ciocalteu. Para isso, em um balão volumétrico de 20 mL, 50 µL dos
extratos, 10 mL de água e 1 mL de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis,
EUA) foram adicionados, misturados e deixado em repouso por 3 min. Então, 8
mL de carbonato de sódio (75 g/L) foram adicionados e o volume final ajustado
para 20 mL com água destilada. Os balões foram imediatamente encubados por
2h/37 °C ao abrigo de luz. A absorbância foi lida em um Espectrofotômetro de UV
visível (UV-1601, Shimadzu), em cubetas de quartzo, no comprimento de onda de
765 nm (Singleton & Rossi Jr, 1965).
Para quantificação dos compostos fenólicos, uma curva de calibração,
utilizando o ácido gálico como padrão, foi realizada com concentrações de 50, 60,
49
70, 80, 90 e 100 µg/mL seguindo o mesmo método. Os resultados estão
expressos em miligrama de Equivalência de Ácido Gálico por 100 mL de extrato
(mgEAG/100 mL).
As análises foram realizadas em triplicata e em ambos os casos, uma
solução branca foi realizada substituindo o extrato/padrão por água destilada.
4.7 Atividade antioxidante
A atividade antioxidante foi medida no Laboratório de Bromatologia da
Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo (FSP/USP) através
do teste de capacidade antioxidante ao radical oxigênio (ORAC) (Ou et al., 2001)
em duplicata.
Resumindo, 50 µL de cada extrato diluído em água destilada (1:500
v/v), 150µL (93,54 nmol/L) de fluoresceína (3’,6’-dihidroxi[isobenzofurano-
1[3H],9’[9H]- xanten]-3-ona, Sigma-Aldrich) foram adicionados na microplaca e
incubado a 37 °C/15 min. ao abrigo da luz. Então, 50 µL (221mM) do gerador de
radicais livres AAPH (2,2′-azobis(2-amidinopropano) dihidroclorida, Sigma-Aldrich)
foi adicionado. A leitura da fluorescência foi lida a 493 nm de excitação e 515 nm
de emissão em um leitor de fluorescência em microplaca Spectramax M5
(Molecular Devices), a cada 1min por 60min, com temperatura controlada (37 °C).
Foi utilizado o Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-ácido
carboxílico, Sigma-Aldrich) como padrão e a solução fosfato como branco. O valor
de ORAC foi avaliado como a área embaixo da curva (AUC) e expresso em mmol
de equivalente de Trolox por 100mL de extrato (mmolET/100 mL) através das
equações:
��� = 1 +�1
�0+�2
�0+�3
�0+�4
�0+⋯
�60
�0
onde: f 0 foi a leitura da fluorescência no tempo 0.
f n foi a leitura da fluorescência no tempo n.
50
$%�� = 20 × �'��çã��������� ×(���������� − ������,��)
(������ã� − ������,��)
onde: 20 foi a concentração do Trolox utilizado como padrão (20 µmol/L).
4.8 Separação, identificação e quantificação de bio compostos
A separação, identificação e quantificação dos biocompostos foram
realizadas no Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo (FCF/USP).
Foi utilizado um Cromatógrafo Líquido Hewlett-Packard Infinity 1120
Series (Palo Alto, EUA) equipado com detector de arranjo de diodos (DAD). A
coluna utilizada foi a Prodigy ODS3 (250 mm x 4,60 mm x 5 µm) (Phenomenex
Ltda, Reino Unido).
A fase móvel para eluição foi constituída por gradiente (Quadro 2)
utilizando os reagentes ácido fórmico 0,5% em água (A) e acetonitrila (B) (ambos
da Merck, Darmstadt, Alemanha). O fluxo foi de 1 mL/min e com temperatura de
25 ºC. O tempo total da corrida foi de 45min. O sistema foi controlado pelo
programa ChemStation.
As amostras foram injetadas em duplicata, em volumes entre 2 e 10 µL.
Os compostos foram identificados através de seu tempo de retenção e da
comparação com o espectro de absorção obtido de padrões.
Os padrões utilizados foram (Sigma-Aldrich): Catequina, Catequina
galato, Epicatequina, Epicatequina galato, Epigalocatequina, Epigalocatequina
galato, Teaflavinas (soma de teaflavina, teaflavina-3 galato, teaflavina-3´ galato e
teaflavina-3,3´ digalato), Quercetina, Miricetina, Kaempferol, Ácido gálico e
Cafeína.
51
Para a quantificação, utilizou-se curva de calibração dos padrões
injetados em triplicata, em cinco concentrações distintas. A quantificação das
catequinas foi realizada no comprimento de onda de 370nm, enquanto que do
ácido gálico e cafeína em 270 nm. Os compostos foram expressos em mg/100 mL
de amostra.
Os cromatogramas das amostras, dos padrões e seus espectros UV
encontram-se anexos.
Quadro 2 - Gradiente de solventes, em porcentagem, para eluição dos compostos fenólicos por HPLC/DAD
Tempo (min) Solução A Solução B
0 90 10
5 90 10
15 80 20
25 75 25
33 65 35
38 50 50
43 10 90
44 10 90
45 10 90
4.9 Análise sensorial
As amostras foram preparadas pela infusão de 10 g em 1L de água
fervente, filtradas em papel filtro e armazenadas em garrafas térmicas de 1L.
O preparo e análise foram realizados no Laboratório de Técnica
Dietética da FSP/USP. O teste foi feito em cabines individuais iluminadas por
lâmpada fluorescente. As amostras foram servidas em copos plásticos
52
transparentes, codificados com três dígitos randômicos, mais um copo com água
para 32 provadores voluntários não treinados para o chá verde e 25 para o chá
preto.
Foi solicitado que o provador analisasse os parâmetros odor, sabor e
aparência e fornecesse apenas uma nota que englobasse essas três qualidades
(características globais)de cada bebida. As amostras foram avaliadas baseadas
em uma escala hedônica de nove pontos (onde 9 significava gostei extremamente
e 1 significava desgostei extremamente).
Esse procedimento foi aprovado pelo comitê de ética da mesma
instituição (FSP/USP) sob o protocolo número 1985.
4.10 Análise estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada aplicando-se a análise
de variância ANOVA e quando foi detectada alguma diferença entre as médias
dos grupos, elas foram comparadas pelo teste de comparação múltipla de Tukey,
ambas com um nível de significância de p≤0,05.
53
5 RESULTADOS
5.1 Aw
Os valores de atividade de água alta, média e baixa dos chás verde e
pretos estão na TAB. 1. Em ambas as plantas, os valores ajustados em cada
parâmetro foram estatisticamente iguais.
TABELA 1- Diferentes valores de atividade de água d os diferentes tipos de chá utilizados
Tipo de chá ↓ Aw → Aw ↑ Aw
Verde 0,170±0,050a 0,651±0,001a 0,931±0,009a
Preto 0,183±0,038a 0,651±0,001a 0,924±0,010a
Valores representam a média±devio padrão. Letras iguais na mesma coluna indica igualdade estatística (p>0,05).
Esses são os valores de Aw medidos antes da irradiação. O valor de
Aw não foi medido após o processamento devido a trabalhos relatarem que a Aw
não se alterar após esse tratamento (Chosdu et al., 1995; Mishra et al., 2006;
Pezzutti et al., 2005).
5.2 Microbiologia
Ao avaliar a contaminação microbiológica das ervas, foi possível
constatar que tanto a planta do chá verde, quanto do chá preto estavam com
baixa contaminação fúngica (TAB. 2 e TAB. 3 respectivamente).
54
TABELA 2 - Contaminação fúngica, em UFC/g, da plant a de chá verde irradiada com diferentes doses de radiação e Aw
Aw Doses (kGy)
0 2,5 5,0 7,5 10,0
↓ Aw 8,33x102a *ND ND ND ND
→ Aw 23,0x102a ND ND ND ND
↑ Aw 103,0x102b ND ND ND ND
Letras diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). *Não detectado (limite de detecção é de 1,0x102 UFC/g).
TABELA 3 - Contaminação fúngica, em UFC/g, da plant a de chá preto irradiada com diferentes doses de radiação e Aw
Aw Doses (kGy)
0 2,5 5,0 7,5 10,0
↓ Aw 7,0x102a *ND ND ND ND
→ Aw 10,3x102a ND ND ND ND
↑ Aw 90,0x102b ND ND ND ND
Letras diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). *Não detectado (limite de detecção é de 1,0x102 UFC/g).
Em ambos os casos, quando a Aw de água foi aumentada, mesmo que
em um período relativamente curto (48h), a contaminação inicial foi maior. Isso
pode ser explicado, pois a Aw de água relativamente baixa (0,65) das plantas
contribuiu para a baixa contaminação e baixo metabolismo celular dos
microrganismos. Independentemente da Aw e da contaminação inicial, a dose de
2,5 kGy foi suficiente para reduzir a contaminação a níveis considerados não
detectáveis.
O Brasil não possui uma legislação em relação à contaminação por
fungos em plantas de chá. A resolução vigente sobre os padrões de
55
contaminação microbiológica de alimentos (RDC 12/2001) apenas inclui valores
para Salmonella sp. e Coliformes (Brasil, 2001b). A Organização Mundial da
Saúde recomenda que plantas que irão ser utilizadas em infusões quentes
tenham uma contaminação fúngica de até 105 UFC/g de planta (WHO, 1998). Os
valores encontrados nesse trabalho estão dentro do recomendado.
Apesar de esse trabalho ter encontrado valores baixos de
contaminação por fungos, diversos autores encontraram níveis altos de
contaminação de fungos em diversos tipos de plantas utilizada em infusões
(Aquino et al., 2010; Araújo & Ohara, 2000; Martins et al., 2001) e mesmo aqueles
em que a contaminação foi baixa, a maioria dos fungos eram produtores de
micotoxinas como os do gênero Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Fusarium
(Bernardi et al., 2005; Bugno et al., 2005; Carvalho et al., 2009; Rocha et al.,
2005).
Devido à baixa contaminação microbiológica das amostras e também
das doses inicialmente escolhidas, não foi possível verificar se a radiólise possui
algum efeito significativo na descontaminação. Portanto, as plantas foram
contaminadas artificialmente e doses intermediárias entre 1,0, 1,5 e 2,0 kGy foram
adicionadas. Os valores da contaminação artificial dos chás irradiados com
diferentes doses e Aw estão na TAB. 4 (chá verde) e TAB. 5 (chá preto), onde foi
possível verificar que quanto maior a Aw, menor foi a dose de radiação
necessária para diminuir a contaminação microbiológica.
56
TABELA 4 – Valores da contaminação artificial por f ungos, em UFC/g, da planta de chá verde irradiada com diferentes doses de radiação e Aw
Aw Doses (kGy)
0 1,0 1,5 2,0 2,5 5,0 7,5 10,0
↓ Aw 1,1x108a 3,3x105a 4,0x104a 2,7x103a 2,7x102 ND ND ND
→ Aw 1,2x108a 5,2x104b 3,7x103b 1,6x102b ND ND ND ND
↑ Aw 1,8x108b 2,0x104b 1,7x102b *ND ND ND ND ND
Letras diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). *Não detectado (limite de detecção é de 1,0x102 UFC/g).
TABELA 5 – Valores da contaminação artificial por f ungos, em UFC/g, da planta de chá preto irradiada com diferentes doses de radiação e Aw
Aw Doses (kGy)
0 1,0 1,5 2,0 2,5 5,0 7,5 10,0
↓ Aw 3,7x107a 7,7x105a 2,0x104a 2,4x103a 3,7x102 ND ND ND
→ Aw 1,2x108b 6,2x104b 1,6x103b 9,3x102b ND ND ND ND
↑ Aw 1,4x108b 6,1x104b 8,3x102c *ND ND ND ND ND
Letras diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). *Não detectado (limite de detecção é de 1,0x102 UFC/g).
Em relação ao chá verde, com o aumento da Aw, maior foi a presença
de fungos em comparação a Aw média e baixa, entretanto, a radiação foi mais
eficaz em diminuir a carga microbiana. Com 1,0 kGy os valores de contaminação
ficaram iguais para as atividades média e alta e a dose de 2,0 kGy foi suficiente
para reduzir ao nível não detectado, enquanto para Aw média a dose foi de 2,5
kGy e para a baixa Aw foi o dobro.
O mesmo aconteceu ao chá preto, onde a contaminação inicial na Aw
baixa foi cerca de 10 vezes menor comparada com as outras Aw, entretanto com
57
1,0 kGy a contaminação foi mais que 10 vezes maior comparada com as outras
Aw e a dose para diminuir completamente a carga microbiana também foi o dobro
quando comparada com a Aw média e maior ainda quando comparada com a de
Aw alta.
A dose de 5,0 kGy, que foi a dose mínima para que não apresentasse
crescimento de fungos nos chás com Aw baixa, está de acordo com a literatura.
Katusin-Razem et al. (2001) relataram que a faixa de dose entre 5,0 a 8,0 kGy é
suficiente para descontaminar diversos materiais vegetais secos (Aw não foi
medida) com uma contaminação fúngica maior que 104 UFC/g.
Mishra et al. (2006) verificaram que a dose mínima de 5,0 kGy foi
necessária para eliminar o crescimento de fungos, principalmente do gênero
Aspergillus em C. sinensis com a Aw por volta de 0,39 e contaminação inicial na
faixa de 104 UFC/g e mesmo armazenando em uma umidade de 99,9% não
apresentou crescimento no período de 11 dias.
Aquino et al. (2010) observaram que C. sinensis com Aw de 0,58
irradiadas com 5,0 kGy tiveram a carga fúngica diminuída a níveis não detectados
em 17 de 20 amostras e em apenas uma amostra daquelas onde houve o
crescimento ainda estava contaminada com 5x102 UFC/g após 30 dias. Os
autores recomendam então a dose de 10,0 kGy onde não houve crescimento em
nenhuma amostra após o tempo de armazenamento.
Thomas et al. (2008) descreveram que dois tipos de chá preto irradiado
com 7,0 kGy tiveram seus níveis de contaminação diminuídos ao nível não
detectado, porém nenhuma dose mais baixa foi utilizada e a Aw não foi medida.
O fato de o chá irradiado com alta Aw necessitar de uma dose menor
para reduzir a contaminação não está somente pelo efeito da radiólise. Segundo a
curva de crescimento microbiano, há quatro fases que caracterizam as fases de
crescimento. A fase Lag (não há variação do número de células), fase Log
(crescimento exponencial), fase estacionária (diminuição da velocidade de
crescimento) e a fase de morte celular. Como a Aw normalmente em chá é baixa,
a maioria dos microrganismos está ou em latência ou com baixa velocidade em
seu metabolismo ou encontram-se na forma de esporos. Com o aumento da Aw,
58
as células microbianas aumentaram seus metabolismos, entrando na fase Log e
nessa fase, devido à alta velocidade de reprodução e metabolismo, essas células
são mais sensíveis à radiação (Tortora et al., 2002). A sinergia desse fenômeno
com a radiólise faz com que a dose de radiação seja menor para diminuir a
contaminação microbiológica em plantas de chá com alta Aw.
5.3 Fenólicos totais
A quantificação dos compostos fenólicos totais foi realizada através da
expressão da curva de calibração, utilizando o ácido gálico como padrão (FIG. 5).
FIGURA 5 – Curva de calibração utilizada para quant ificação de fenólicos totais nos chás verde e preto irradiados com difere ntes doses e atividade de água, utilizando ácido gálico como p adrão
Diferente da contaminação microbiológica, a análise de fenólicos totais
no chá verde demonstra o efeito da radiólise nesses compostos, uma vez que a
planta irradiada com baixa Aw não apresenta diferença estatística entre as
diferentes doses de radiação (TAB. 6), assim como a planta irradiada com a Aw
média, onde apenas na dose de 5,0 kGy foi diferente das demais doses.
y = 0,0093x + 0,0168R² = 0,9974
0,4000
0,5000
0,6000
0,7000
0,8000
0,9000
1,0000
40 50 60 70 80 90 100 110
Abs
orbâ
ncia
(AU
)
Concentração ( µµµµg/ml)
59
Entretanto, quando a planta é irradiada com alta Aw as diferenças observadas
entre as doses são maiores.
TABELA 6 - Quantidade de fenólicos totais, em mgEAG /100 mL de chá verde, de C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água
Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw
0 93,7±7,8aA 90,6±1,2aA 89,5±0,5aA
1,0 97,2±0,5aA 92,5±0,2aB 91,9±0,5bB
1,5 95,9±0,8aA 94,3±2,9abA 88,2±0,3aB
2,0 98,4±0,6aA 96,1±2,1abA 83,4±0,1cB
2,5 95,7±0,2aA 91,7±1,1aB 80,7±1,7dC
5,0 99,7±1,7aA 98,9±4,5bA 83,4±1,3cB
7,5 100,3±1,3aA 96,4±1,9abB 84,8±0,2cC
10,0 99,9±1,9aA 93,3±4,0abB 89,8±0,2aB
Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna significa diferença
estatística (p≤0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha significa diferença
estatística (p≤0,05).
A planta do chá verde irradiada com alta Aw demonstrou a menor
quantidade de fenólicos detectados nesse trabalho. Até mesmo na dose de 1,0
kGy, que foi a dose em que se detectou a maior quantidade de fenólicos totais, foi
menor que a quantidade detectada na planta com baixa e média Aw, exceto nas
doses controle. Comparando com as outras doses, a radiação diminuiu a
quantidade de fenólicos nas doses de 2,0, 2,5, 5,0 e 7,5 kGy, porém não houve
diferença entre a dose controle e a dose de 10,0 kGy. No caso da Aw média, a
60
diferença apresentada com 5,0 kGy não foi negativa, uma vez que essa dose
aumentou a quantidade de fenólicos detectados.
Ao comparar as diferentes Aw na mesma dose de radiação, apenas a
dose controle mostrou ser igual nas três Aw e nas outras doses o comportamento
variou. Nas doses de 2,5 e 7,5 kGy a quantidade de fenólicos detectados foram
diferentes, sendo a quantidade maior na planta irradiada com baixa Aw, com
destaque para a dose de 7,5 kGy onde foi detectado a maior quantidade de
fenólicos e a planta com alta Aw apresentou os menores valores, onde a maior
diferença entre elas foi na dose de 5,0 kGy (16,3 mg).
Nas doses de 1,0 e 10,0 kGy as plantas com alta e média Aw tiveram
uma quantidade de fenólicos totais detectados menor daquela que foi irradiados
com baixa Aw e nas doses de 1,5, 2,0 e 5,0 kGy a quantidade de fenólicos foi
menor na amostra com baixa Aw em relação as amostras com alta e média Aw.
Em relação às doses identificadas na microbiologia a dose de 2,0 kGy
que foi a dose em que na planta irradiada com alta Aw diminuiu a contaminação a
níveis não detectáveis a quantidade de fenólicos foi menor que na dose de 2,5
kGy da planta com média Aw e bem menor que na dose de 5,0 kGy na planta
irradiada com baixa Aw, mostrando que os radicais formados pela quebra da água
interagem tanto com os microrganismos quanto em compostos fenólicos.
A análise do chá preto mostrou um comportamento diferente da planta
quando irradiada com a mesma Aw comparada com o chá verde (TAB. 7). Isso
pode ser explicado pelo próprio processamento que o chá é submetido,
transformando-o de chá verde para preto através da oxidação enzimática pela
indústria produtora de chá. O mesmo efeito foi observado ao analisar o perfil de
compostos voláteis (Fanaro, 2009). Como no chá verde, maiores quantidades de
fenólicos foram encontrados nas amostras com baixa Aw.
61
TABELA 7 - Quantidade de fenólicos totais, em mgEAG /100 mL de chá preto, de C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água
Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw
0 84,5±1,0aA 84,9±0,4acA 85,2±0,1abA
1,0 96,7±7,7bcA 91,6±0,3bA 88,6±0,9bcA
1,5 94,9±0,6bcA 87,3±1,0acB 85,6±1,6abB
2,0 101,0±0,2cA 93,0±1,5bB 84,0±2,9aC
2,5 96,8±3,9bcA 87,7±1,7acB 85,4±0,3abB
5,0 93,4±1,1bA 92,0±0,3bA 91,6±1,4cA
7,5 95,1±0,1bcA 90,6±0,8bcB 88,2±0,1bcC
10,0 89,9±0,5abA 86,4±2,3acB 87,4±1,8bB
Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna significa diferença
estatística (p≤0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha significa diferença
estatística (p≤0,05).
Com baixa Aw, conforme a dose de radiação é aumentada até a 2,0
kGy, maior é a quantidade de fenólicos detectados, porém com doses maiores, as
quantidades são estatisticamente iguais às doses menores que 2,0 kGy, com
exceção da dose de 10,0 kGy em que a quantidade foi estatisticamente igual a
amostra controle.
Conforme houve o aumento da Aw, menor foi a influência da radiação
na quantidade de fenólicos em relação ao chá com baixa Aw. Enquanto nessa
última amostra a diferença entre a menor e maior quantidade foi de 16,45 mg (0 e
2,0 kGy), nas a mostras com Aw média a diferença foi de 8,09 mg (0 e 2,0 kGy) e
na de Aw alta foi de 7,62 mg (2,0 e 5,0 kGy).
62
Analisando as amostras com a mesma dose, mas diferentes Aw, foi
possível constatar um maior número de doses em que a quantidade de fenólicos
não variou entre as três Aw. Nas doses de 0, 1,0 e 5,0 kGy a quantidade de
fenólicos foi estatisticamente igual nas três Aw e ao contrário do chá verde, as
plantas irradiadas com Aw média e alta tiveram uma quantidade mais parecida,
pois nas doses de 1,5, 2,5 e 10,0 kGy a quantidade de fenólicos foi
estatisticamente igual nessas condições. Em nenhuma dose os valores entre as
amostras com Aw baixa e média foram iguais.
Em relação às doses identificadas na microbiologia para diminuir a
contaminação a níveis não detectáveis, nas amostras com média e alta Aw (2,5
kGy e 2,0 kGy respectivamente) as quantidades de fenólicos foram
estatisticamente iguais ao seus respectivos controle. A amostra com baixa Aw
apesar de necessitar uma dose maior para a diminuição da contaminação (5,0
kGy) aumentou a quantidade de fenólicos totais detectados em comparação ao
seu controle.
Independente da dose de radiação e da atividade de água, os valores
encontrados para o chá verde e para o chá preto estão de acordo com a literatura.
Rusak et al. (2008) quantificaram os fenólicos totais em dois tipos de chá verde e
a quantidade variou entre 700 a 1.100 mgEAG/g. Komes et al. (2010) verificaram
que a quantidade de fenólicos em 11 amostras de chá verde variou de 88 a 256,6
mgEAG/100 mL.
Costa et al. (2012) observaram uma quantidade menor de fenólicos em
suas três amostras de chá verde, quantidades essas que variaram de 13,5 a 29,1
mgEAG/100mL. Essas quantidades foram menores devido ao pouco tempo que
os autores utilizaram para extração (5 minutos). Oh et al. (2013) constataram uma
quantidade de 82,21 mgEAG/g para o chá verde e 82,86 mgEAG/g para o chá
preto.
Atoui et al. (2005) detectaram uma quantidade superior a deste
trabalho com um total de 506,66mgEAG/100ml para o chá verde e 352
mgEAG/100mL para o chá preto, porém a quantidade da planta tanto de chá
63
verde quanto de chá preto utilizada para a extração foi 25% maior a utilizada
nesse trabalho.
A quantificação de 8 tipos de chá preto de três países diferentes
realizado por Ramalho et al. (2013) variou de 50,3 a 274,0 mgEAG/g. Turkmen et
al. (2006) observaram uma quantidade menor de fenólicos (30,5 mgEAG/g) em
sua amostra de chá preto e a quantidade de erva utilizada na extração foi o dobro
do que a utilizada nesse trabalho.
Mishra et al. (2006) verificaram que em chá verde irradiado com uma
Aw de 0,38 a quantidade de fenólicos variou de 89,4 a 92,7 mgEAG/g entre as
doses de 0 e 10,0 kGy respectivamente, sendo que essa diferença não foi
estatística. Furgeri et al. (2009) trabalhando com erva mate (Ilex paraguariensis)
observaram um efeito parecido a esse trabalho onde algumas doses aumentaram
e outras diminuíram a quantidade de fenólicos detectadas, sendo que a dose de
3,0 kGy e 7,0 kGy foram as doses em que se mais detectou fenólicos e a dose de
10,0 kGy foi estatisticamente igual a amostra controle.
Nagy et al. (2011) constataram que a irradiação com 10,0 kGy não
alterou a quantidade de fenólicos em sálvia (Folium salviae officinalis), tomilho
(Folium thymi) e orégano (Folium origani cretici) desidratados. Almeida (2012)
observou o mesmo efeito em açafrão (Curcuma longa L.), gengibre (Zingiber
officinale Roscoe) e zedoária (Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe) e, com
exceção do açafrão, as doses de 15,0 e 20,0 kGy aumentaram a quantidade de
fenólicos detectados.
Diferenças encontradas nesse trabalho com outros da literatura podem
ser explicadas uma vez que muitos dos compostos em plantas vaiam de acordo
com tipo de extrato, idade, região de cultivo e características genéticas da planta
(Cardozo Jr. et al, 2007; Dartora et al., 2011), além do tipo e tempo de extração
(Ramalho et al., 2013).
Tanto no chá verde, quanto no chá preto houve uma variação da
quantidade de fenólicos quantificados nas diversas doses de radiação e não foi
possível relacionar esse ganho ou perda diretamente com a dose de radiação em
64
que isso ocorreu. Esse efeito também é observado em trabalhos na literatura que
utilizaram outras plantas submetidas a diferentes doses de radiação.
Essa variação tanto para mais quanto para menos ao que tudo indica é
independente da dose de radiação utilizada, pois não é possível relacionar a
quantidade de fenólicos em uma determinada dose de radiação e verificar que em
doses maiores ou menores a quantidade irá aumentar ou diminuir. Além disso, os
valores encontrados, mesmo que apresentam diferenças estatísticas, são
próximos. A literatura é escassa em explicar o porquê desse fenômeno ocorrer.
5.4 Atividade antioxidante
Os resultados encontrados no chá verde em relação aos fenólicos
totais onde foi observado que quanto maior a Aw, menor a quantidade desses
compostos encontrados aparentemente não interferiram na capacidade
antioxidante dessa bebida analisada pelo método ORAC (TAB. 8).
Foi possível verificar que nas doses de 1,5 e 2,0 kGy quanto maior a
Aw menor foi a capacidade antioxidante. Nenhuma explicação foi encontrada
explicando o porquê isso ocorreu, mas provavelmente a radiólise não foi o que
causou esse efeito, uma vez que nas doses mais altas esse fenômeno não foi
observado. É possível constatar que nem a quantidade de água nem a radiação
com dose de até 10,0 kGy interferem na capacidade antioxidante do chá verde.
65
TABELA 8 - Valores de ORAC, em mmolET/100 mL de chá verde, de C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de águ a
Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw
0 21,0±2,3aA 21,3±2,1abcdeA 21,1±2,1aA
1,0 22,6±0,88aA 22,4±0,9adeA 21,0±3,6aA
1,5 22,5±1,1aA 18,8±0,9bcdB 19,4±1,8aB
2,0 22,0±1,7aA 18,3±1,2bcB 19,3±0,9aB
2,5 21,4±2,9aA 21,7±1,9adeA 21,7±2,3aA
5,0 21,3±2,8aA 22,5±1,3adeA 21,0±2,3aA
7,5 22,5±0,9aA 20,4±1,3abcdeA 20,1±3,4aA
10,0 22,0±1,4aA 20,8±0,6abcdeA 21,0±3,0aA
Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna significa diferença
estatística (p≤0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha significa diferença
estatística (p≤0,05).
Em relação ao chá preto, assim como na análise de fenólicos totais que
mostraram uma menor interferência da radiólise quando comparada com o chá
verde, o mesmo comportamento pode ser observado na capacidade antioxidante
dessa bebida, onde não foi encontrada nenhuma diferença estatística entre as
diferentes variáveis utilizadas (TAB. 9).
66
TABELA 9 - Valores de ORAC, em mmolET/100 mL de chá preto, de C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de águ a
Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw
0 16,4±1,4aA 16,5±1,1aA 16,8±1,6aA
1,0 18,4±1,7aA 16,9±1,2aA 19,2±3,9aA
1,5 18,9±1,3aA 18,2±1,4aA 19,8±4,9aA
2,0 18,0±1,9aA 14,4±0,9aA 17,3±2,7aA
2,5 17,4±2,1aA 17,3±1,6aA 17,9±2,4aA
5,0 17,0±0,7aA 18,5±3,7aA 15,7±0,9aA
7,5 18,2±2,3Aa 15,7±4,6aA 15,3±0,9aA
10,0 18,1±1,1aA 16,4±4,3aA 16,4±1,3aA
Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas iguais na mesma coluna significa igualdade
estatística (p>0,05). Letras maiúsculas iguais na mesma linha significa igualdade
estatística (p>0,05).
Comparado com o chá verde a capacidade antioxidante do chá preto é
menor. Isso é devido ao processamento que esse chá é submetido. Carloni et al.
(2012) utilizando a mesma planta para fazer chá branco, verde e preto
encontraram no chá verde uma maior capacidade antioxidante do que no chá
preto.
Rusak et al. (2008) verificou que em suas amostras de chá verde a
capacidade antioxidante foi menor do que encontrado nesse trabalho (variou de
34 a 1.090 µmolET/100 mL), assim como Kodama et al., (2010) em suas nove
amostras de chá verde (600 a 2.550 µmolET/100mL). Essas diferenças
encontradas entre esse trabalho e a literatura já foram explicadas no item 5.3.
Kumar et al. (2010) trabalhando com diversos fitoterápicos verificou
que a radiação não diminuiu a atividade antioxidante em doses de 10,0 kGy
67
através do método DPPH (1,1-difenil-2-picril-hidrazil). Mishra et al. (2006)
verificaram também por DPPH que a atividade antioxidante de C. sinensis não se
alterou nas diversas doses de radiação utilizada, onde a dose máxima foi de 10,0
kGy.
5.5 Identificação e quantificação dos biocompostos
Devido aos resultados encontrados nas etapas da microbiologia e
fenólicos totais, a identificação e quantificação dos flavonóides tanto no chá
verde, quanto no chá preto, foram realizadas somente nas doses de 5,0 kGy, que
foi a dose mínima para garantir a segurança microbiológica nesse trabalho e na
dose de 10,0 kGy, que é a dose recomendada por diversos órgãos em diversos
países para o processamento desse tipo de planta (os cromatogramas estão
anexos).
Igualmente aos resultados encontrados nos fenólicos totais, a radiólise
mostrou ter certa influência na quantidade dos principais flavonóides do chá
verde. Na maioria dos compostos identificados, a planta quando irradiada com Aw
baixa apresentou uma quantidade maior da maioria das catequinas identificadas
comparado com as plantas irradiadas com Aw mais alta (TAB. 10).
O aumento da quantidade do ácido gálico pode representar a
degradação de compostos galatos. Foi possível verificar que, na Aw alta conforme
houve o aumento da radiação, maior foi a presença desse composto, apesar
desta diferença não ser significativa, entretanto a diferença foi significativa na
dose de 10,0 kGy, onde quanto maior a Aw, maior foi a quantidade de ácido
gálico identificado.
68
TABELA 10 - Quantidade de flavonóides e cafeína, em mg/100 mL de chá verde, identificados em C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água
Compostos Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw
Ácido Gálico
0 3,41±0,18aA 3,42±0,05aA 3,44±0,37aA
5,0 3,41±0,09aA 3,60±0,18aA 3,65±0,51aA
10,0 3,30±0,09aA 3,45±0,05aB 3,77±0,22aC
EC
0 11,8±0,1aA 11,9±0,1aA 11,8±0,1aA
5,0 12,1±0,2bA 11,5±0,1bB 11,5±0,1bB
10,0 12,1±0,3bA 11,7±0,3abB 11,4±0,1bB
ECG
0 18,4±0,1aA 18,3±0,1aA 18,4±0,3aA
5,0 19,0±0,1bA 18,3±0,1aB 18,3±0,2aB
10,0 18,5±0,5aA 17,9±0,8aA 17,9±0,1bA
EGC
0 62,9±1,0aA 62,2±0,6aA 62,7±0,7aA
5,0 61,8±0,7aA 60,2±0,3bB 60,5±1,2bB
10,0 61,6±0,8aA 60,7±0,9bA 58,9±0,7cB
EGCG
0 43,1±0,9aA 42,5±0,1aA 42,8±0,6aA
5,0 43,0±0,7aA 41,6±0,6aB 42,8±0,6aA
10,0 42,5±1,4aA 42,5±1,5aA 42,0±0,3bA
Cafeína
0 38,5±0,9aA 37,8±0,2aA 38,5±0,5aA
5,0 39,3±0,9aA 37,6±0,9aA 38,4±1,5aA
10,0 38,4±0,9aA 37,4±0,8aA 37,2±0,4aA
Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha significa diferença estatística (p≤0,05).
69
Com relação ao composto epicatequina a planta do chá verde quando
irradiada com 5,0 kGy com Aw acima de 0,6 tem a quantidade desse composto
diminuída, enquanto ao ser irradiada com Aw baixa, sua quantidade aumenta.
Além disso, quando irradiada com Aw alta, conforme houve o aumento da dose,
menor foi a quantidade de EC detectada. Um efeito similar também foi verificado
na epigalocatequina.
Para a epicatequina galato, com uma Aw baixa, a dose de 5, 0kGy
aumentou a quantidade desse composto, enquanto nas Aw mais altas não houve
diferença, tendo sua quantidade diminuída apenas quando irradiada com 10,0
kGy. A epigalocatequina galato apresentou a diminuição da sua quantidade
quando irradiada com 5,0 kGy com uma Aw média e também quando aplicado
10,0 kGy com Aw alta.
A cafeína mostrou ser estável, não sofrendo influência tanto do efeito
direto, quanto do efeito indireto da radiação nas diferentes doses de radiação e
atividades de água utilizadas. A literatura ainda relata a presença de outros tipos
de catequinas e de alguns flavonóis nessa bebida, entretanto os compostos
catequina, catequina galato, quercetina, miricetina e kaempferol não foram
identificados.
Apesar de a radiação causar a diminuição nos principais compostos do
chá verde, principalmente quando irradiados com alta Aw, essa redução, mesmo
que estatística, pode ser considerada insignificante, uma vez que a maior
diferença encontrada foi no composto EGC irradiado com Aw alta entre a dose
controle e 10,0 kGy (diferença de 3,8 mg/100 mL) e a menor diferença estatística
foi no composto EC (0,3 mg/100 mL). Além disso, os dados sobre a capacidade
antioxidante mostraram que não houve diminuição da capacidade antioxidante
nos diferentes tratamentos utilizados.
A análise do chá preto mostrou que nem a radiólise, nem o efeito direto
da radiação mostraram ter influência no conjunto de teaflavinas, pois não houve
diferença estatística nas diferentes doses de radiação e Aw utilizadas (TAB. 11).
70
TABELA 11- Quantidade de teaflavinas totais e cafeí na, em mg/100 mL de chá preto, identificados em C. sinensis irradiada com diferentes doses e atividades de água
Compostos Doses (kGy) ↓ Aw → Aw ↑ Aw
Ácido Gálico
0 6,87±0,17aA 6,84±0,14aA 6,85±0,13aA
5,0 6,91±0,20aA 7,06±0,10bA 6,87±0,10aA
10,0 6,94±0,21aA 6,91±0,07aA 7,03±0,28aA
Teaflavinas*
0 1,04±0,12aA 1,06±0,06aA 1,05±0,06aA
5,0 1,03±0,12aA 1,09±0,06aA 1,13±0,07aA
10,0 1,12±0,14aA 1,08±0,06aA 1,17±0,08aA
Cafeína
0 44,6±0,9aA 44,4±0,9aA 44,7±1,7aA
5,0 45,4±0,6aA 45,2±0,6aA 44,9±0,8aA
10,0 47,2±0,4bA 47,3±0,3bA 48,3±3,4bA
*Corresponde a soma da quantidade de teaflavina, teaflavina-3 galato, teaflavina-3´ galato e teaflavina-3,3´ digalato.
Valores representam a média±devio padrão. Letras minúsculas diferentes na mesma coluna significa diferença estatística (p≤0,05). Letras maiúsculas diferentes na mesma linha significa diferença estatística (p≤0,05).
Ao contrário dos resultados encontrados no chá verde, no chá preto, a
quantidade de ácido gálico identificado não variou entre as diferentes doses de
radiação, com exceção na dose de 5,0 kGy com Aw média, porém com 10,0 kGy,
a quantidade foi estatisticamente igual a amostra controle.
Com um comportamento também diferente ao encontrado no chá
verde, a dose de 10,0 kGy aumentou a quantidade de cafeína identificada no chá
preto e esse aumento foi independente da atividade de água. Além disso, a
quantidade foi maior comparada com o chá verde.
71
Isso se deve ao fato de a cafeína ser armazenada dentro do vacúolo da
planta na forma de complexos com ácidos clorogênicos (Baumann & Rohing,
1989; Waldhauser & Baumann, 1996). Para se fabricar o chá preto, as folhas de
C. sinensis são esmagadas e trituradas, com o objetivo de quebrar o vacúolo da
célula para liberar a polifenoloxidase (Matsubara & Rodriguez-Amaya, 2006a,b) e
com isso há também uma liberação da cafeína. Ao irradiar esse tipo de chá, as
estruturas dos vacúolos que não foram quebradas no processo de fabricação do
chá preto, foram quebradas pela dose de 10kGy, aumentando assim a quantidade
de cafeína extraída pela infusão.
As quantidades de catequinas e cafeína identificadas no chá verde
foram maiores do que relatados por Reto et al. (2007), que quantificaram nove
tipos de chá verde de Portugal e El-Shahawi et al. (2012) em suas 29 amostras
provenientes de um mercado da Arábia Saudita.
Em quatro amostras de chá verde da China, Wu et al. (2012)
identificaram uma maior quantidade de EGCG, uma quantidade menor de EGC e
EC e uma quantidade similar de ECG que neste trabalho. Matsubara e Rodrigues-
Amaya (2006) verificaram quantidades semelhantes desses compostos em dois
tipos de chá verde adquiridos em Campinas-SP.
Nesse mesmo trabalho, os autores verificaram que a quantidade de
teaflavinas foi maior comparado a este trabalho, assim como os trabalhos de
realizados por Wang et al., (2010) e Lee et al. (2004). Entretanto, Lee e Ong
(2000) encontraram em chás preto de Singapura valores de teaflavinas
semelhantes.
Apesar da quantidade de flavonóides encontrado no chá verde variar
dependendo da dose de radiação e Aw, isso não significa que ingerindo o chá
com alta Aw, que possuiu uma quantidade menor de catequinas, trará menos
benefícios para a saúde de um indivíduo. Outros fatores como a absorção,
metabolização e excreção influenciam na ingestão dessa bebida.
Estudos com ratos indicaram que a EGCG é principalmente excretada
através da bile, enquanto a EGC e a EC são excretadas através da urina e bile,
indicando que as catequinas são rapidamente e extensivamente metabolizadas.
72
Enquanto a EGCG não foi detectada na urina, 90% do total de EC e EGC foram
excretadas na urina por 8 horas e nenhum composto foi detectado no organismo
após 24 horas (Yang et al., 1998).
Higdon e Frei (2003) compararam a farmacocinética de doses
equimolares de EGC, ECG e EGCG puras em 10 voluntários saudáveis. Os picos
médios de concentração no plasma depois de uma dose única de 1,5 mmol foram
de 5µmol/L para EGC, 3,1 µmol/L para ECG e 1,3 µmol/L para EGCG. A EGC e a
EGCG plasmática voltaram para o valor base, mas o valor plasmático de ECG
permaneceu elevado depois de 24h.
Portanto, a manutenção da alta concentração plasmática das
catequinas requer a ingestão repetida desses flavonóides ao longo do tempo e
não somente do consumo de chás com alta concentração de catequinas, como
tem sido observado em voluntários consumindo chá a cada 2h (Scalbert et al.,
2002).
5.6 Análise sensorial
Devido à série de resultados encontrados nesse trabalho, onde a
radiação e radiólise até causaram variações em alguns parâmetros analisados,
porém essas diferenças, mesmo que estatísticas, podem ser consideradas
insignificantes, pois variaram muito pouco. Por isso, a análise sensorial foi
realizada apenas nas doses de 5,0 kGy e 10,0 kGy com a Aw média.
Os resultados fornecidos pela a análise sensorial são de extrema
importância para determinar se processos utilizados nos alimentos, como a
irradiação, vão interferir nas características como odor, sabor, cor e textura do
alimento. Uma vez que esses parâmetros mudam, o produto pode não ser mais
aceito pelo consumidor devido a essas mudanças. Um procedimento que é muito
eficiente em diminuir a carga microbiana ou aumentar a vida útil de um alimento,
porém se não há a aceitação pelo consumidor, esse processo não deve ser
aplicado. É baseado na aceitação do alimento pelo consumidor que a legislação
da irradiação de alimentos no Brasil (RDC n° 12/2001) se basea.
73
A TAB. 12 mostra que não houve diferença estatística entre as doses
para os dois tipos de chá. A nota baixa se deve ao fato dessas bebidas serem um
pouco amargas e como os chás foram servidos sem açúcar ou qualquer outro
melhorador de sabor, os voluntários levaram esse parâmetro em consideração ao
fornecer suas notas.
TABELA 12 – Valores das características globais (od or, aparência e sabor) de chá verde e preto irradiados com diferentes dose s de radiação
Tipo de Chá Doses (kGy)
0 5 10
Verde 5,8±2,0a 5,9±1,8a 5,2±2,1a
Preto 3,0±1,9a 3,3±2,1a 3,0±1,8a
Valores representam a média±devio padrão. Letras iguais na mesma linha indica igualdade
estatística (p>0,05).
Mishra et al., (2006) encontraram os mesmos resultados que este
trabalho em chás de C. sinensis irradiados com até 10,0 kGy. Fanaro et al. (2012)
observaram que apesar de a radiação com 5,0 kGy interferir no perfil de
compostos voláteis em chá oolong (C. sinensis), não foi encontrado nenhuma
diferença nas característica sensoriais por voluntários em doses de até 20,0 kGy.
Furgeri et al. (2007) trabalhando com erva mate (Ilex paraguariensis)
irradiada, demonstraram que não houve diferença estatística entre as amostras
irradiadas com até 10,0 kGy e a não irradiada. Salum et al. (2007), verificaram
que os provadores não souberam a diferença entre as amostras de canela e noz
moscada irradiadas e não irradiadas.
Rodrigues et al. (2012) observaram que biscoitos feitos com farinha de
linhaça irradiada com doses de até 1,5 kGy tiveram a mesma aceitação que os
biscoitos com farinha não irradiada. Os biscoitos possuíam uma Aw de 0,38.
74
Khattak et al. (2009) trabalhando com rizomas de lótus frescas constataram que a
radiação com doses de até 6,0 kGy não interferem nas características sensoriais,
preservando essas características até o tempo de estocagem de 12 dias a 4 ºC.
Wen et al. (2006) verificaram que a provadores não diferenciaram goji (Lycium
chinense Mill) desidratados irradiados com doses de até 14,0 kGy da fruta não
irradiada.
75
6 CONCLUSÃO
A irradiação com 5,0 kGy garante um controle microbiológico em chá
verde e chá preto quando irradiados com diferentes atividades de água sem
interferir na quantidade de fenólicos totais, na quantidade de diversos flavonóides
e na atividade antioxidante em ambos os chás.
76
7 TRABALHOS FUTUROS
• Verificar a influência da alta Aw na atividade enzimática nos
chás armazenados por 1 ano.
• Verificar a formação de produtos radiolíticos únicos nas
diferentes doses de radiação e Aw.
77
ANEXOS
78
FIGURA 6 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw baixa
79
FIGURA 7 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw média
80
FIGURA 8 - Cromatogramas do chá verde irradiado com Aw alta
FIGURA 9 - Cromatogramas do chá verde irradiado com diferentes doses de radiação e Aw
81
82
FIGURA 10 - Cromatogramas do chá preto irradiado co m Aw baixa
83
FIGURA 11 - Cromatogramas do chá preto irradiado co m Aw média
84
FIGURA 12 - Cromatogramas do chá preto irradiado co m Aw alta
FIGURA 13 - Cromatogramas do chá verde irradiado co m diferentes doses de radiação e Aw
85
86
FIGURA 14 - Cromatograma e espectros de abosrção U. V. dos padrões: (1) Epigalocatequina; (2) Epicatequina; (3) Epicate quina galato
1
2
3
1 2
3
87
FIGURA 15 - Cromatograma e espectros de abosrção U. V. dos padrões: (1) Catequina; (2) Epicagalotequina galato; (3) Cat equina galato
1
1
2
2
3
3
88
FIGURA 16 - Cromatograma e espectros de abosrção U. V. do mix de padrões de Teaflavina
3
3
2
1
Catequina
2 1
89
FIGURA 17 - Cromatograma e espectros de abosrção U. V. dos padrões: (1) Cafeína; (2) Miricetina; (3) Kaempferol
3
2 1
2
1
90
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. ABDULLAH, N.; NAWAWI, A.; OTHMAN, I. Fungal spoilage of starch-based foods in relation to its water activity (Aw). J. Stored Prod. Res. , v. 36, p. 47-54, 2000.
2. ABELLANA, M.; BENEDI, J.; SANCHOS, V.; RAMOS, A.J. Water Activity and temperature effects on germination of Eurotium amstelodami, E. chevalieri e E. herbariorum isolates from bakery protucts. J. Appl. Microbiol. , v. 87, p. 371-380, 1999.
3. ABU-IRMAILEH, B.E.; AFIFI, F.U. Herbal medicine in Jordan with special emphasis on commonly used herbs. J. Ethnopharmacol. , v. 89, p. 193-197, 2003.
4. ALCARDE, A.R.; WALDER, J.M.M.; HORII, J. Fermentation of irradiated sugarcane must. Sci. Agric. , v. 60, p. 677-681, 2003.
5. ALMEIDA, M.C. Efeitos do processamento por radiação em espécies da família zingiberaceae: açafrão ( Curcuma longa L.), gengibre (Zingiber officinale Roscoe) e zedoária ( Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe) . 2012. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo.
6. AMAROWICZ, R.; PEGG, R.B.; RAHIMI-MOGHADDAM, P.; BARL, B.; WEIL, J.A. Free-radical scavenging capacity and antioxidant activity of selected plant species from the Canadian prairies. Food Chem. , v. 84, p. 551-562, 2004.
7. AMERICAN DIETETIC ASSOCIATION. Position of the American Dietetic Association: Functional Foods. J. Am. Diet. Assoc. , v. 109, p. 735-746, 2009.
8. AN, B.J.; BAE, N.J.; CHOI, C. Inhibitory effect of flavan-3-olsisolated from oolong tea on xanthine oxidase. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. , v. 28, p. 1084-1088, 1996.
9. ANDERSON, R.A.; POLANSKY, M.M. Tea enhances insulin activity. J. Agric. Food Chem. , v. 50, p. 7182-7186, 2002.
91
10. ANJO, D.F.C. Alimentos funcionais em angiologia e cirurgia vascular. J. Vasc. Bras. , v. 3, p. 145-54, 2004.
11. AQUINO, S. Efeitos da radiação gama no crescimento de Aspergillus flavus produtor de aflatoxinas e no emprego da técnica da reação em cadeia de polimerase (PCR) em amostras de grãos de milho inoculadas artificialmente . 2003. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo.
12. AQUINO, S.; GONÇALEZ, E.; ROSSI, M.H.; NOGUEIRA, J.H.C.; REIS, T.A.; CORREA, B. Evaluation of fungal burden and aflatoxin presence in packed medicinal plants treated by gamma radiation. J. Food Protec. , v. 73, p. 932-937, 2010.
13. ARAÚJO, A.L.D.; OHARA, M.T. Qualidade microbiológica de drogas vegetais comercializadas em feira de São Paulo e de infusos derivados. Rev. Bras. Cienc. Farmac. , v. 36, p. 129-137, 2000.
14. ARAÚJO, M.M.; MARIN-HUACHACA, N.S.; MANCINI-FILHO, J.; DELINCÉE, H.; VILLAVICENCIO, A.L.C.H. Identification of irradiated refrigerated pork with the DNA comet assay. Radiat. Phys. Chem. , v. 71, p. 183-185, 2004.
15. ARENT, S.M.; SENSO, M.; GOLEM, D.L.; MCKEEVER, K.H. The effects of theaflavin-enriched black tea extract on muscle soreness, oxidative stress, inflammation, and endocrine responses to acute anaerobic interval training: a randomized, double-blind, crossover study. J. Int. Soc. Sports Nutr. , v. 7, p. 1-10, 2010.
16. ATOUI, A. K.; MANSOURI, A.; BOSKOU, G.; KEFALAS, P. Tea and herbal infusions: their antioxidant activity and phenolic profile. Food Chem. , v. 89, p. 27-36, 2005.
17. AZZAM, E.I.; JAY-GERIN, J.P.; PAIN, D.; Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Lett. , v. 327, p. 48-60, 2012.
18. BALENTINE, D.A.; WISEMAN, S.A.; BOUWENS, L.C.M. The chemistry of tea flavonoids. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. , v. 37, p. 693-704, 1997.
19. BAUMANN, T.W.; ROHING, L. Formation and intracellular accumulation of caffeine and chlorogenic acid in suspension cultures of Coffea arabica. Phytochemistry , v. 28, p. 2667-2669, 1989.
20. BECKER, E.M.; NISSEN, L.R.; SKIBSTED, L.H. Antioxidant evaluation protocols: food quality or health effects. Eur. Food Res. Technol. , v. 219, p. 561-571, 2004.
92
21. BENT, S.; KO, R. Commonly used herbal medicines in the United States: a review. Am. J. Med. , v. 116, p. 478-485, 2004.
22. BERNARDI, E.; CALDEIRA, M.F.; NASCIMENTO, J.S. Identificação de fungos filamentosos em erva-mate (Ilex paraguariensis st. Hil.). Arq Inst Biol. , v. 72, p. 489-493, 2005.
23. BHATTACHARYYA, N.; SETH, S.; TUDU, B.; TAMULY, P.; JANA, A.; GHOSH, D.; BANDYOPADHYAY, R.; BHUYAND, M.; SABHAPANDIT, S. Detection of optimum fermentation time for black tea manufacturing using electronic nose. Sensor Actuat. B , v. 122, p. 627-634, 2007.
24. BIANCHI, M.L.P.; ANTUNES, L.M.G. Radicais livres e os principais antioxidantes da dieta. Rev. Nutr. , v. 12, p. 123-130, 1999.
25. BONE, D.P. Water activity – its chemistry and applications. Food Prod. Devel. , v. 8, p. 81, 1969.
26. BORGES, V.C. Alimentos funcionais: prebióticos, probióticos, fitoquímicos e simbióticos. In: WAITZBERG, D.L. Nutrição enteral e parenteral na prática clínica . São Paulo: Atheneu, 2001.
27. BRAND, M.D.; AFFOURTIT, C.; ESTEVES, T.C.; GREEN, K.; LAMBERT, A.J.; MIWA, S., PAKAY, J.L.; PARKER, N. Mitochondrial superoxide: production, biological effects, and activation of uncoupling proteins. Free Radic. Biol. Med. , v. 37, p. 755-767, 2004.
28. BRASIL. Diretrizes básicas para análise e comprovação de propriedades funcionais e ou de saúde alegadas em r otulagem de alimentos . Resolução n°18, Agencia Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, 1999a.
29. BRASIL. Regulamento de procedimentos para registro de alime nto com alegação de propriedades funcionais e ou de saú de em sua rotulagem . Resolução n° 19, Agencia Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, 1999b.
30. BRASIL. Inclusão do uso das espécies vegetais e parte(s) de espécies vegetais para o preparo de chás . Resolução de Diretoria Colegiada - RDC n° 219, Agencia Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, 2006.
31. BRASIL. Nota técnica do comitê nacional de plantas medicina is e fitoterápicos a respeito do que foi veiculado sobre plantas medicinais e fitoterápicos na imprensa televisiva e escrita no último mês . Anvisa, 2010.
93
32. BRASIL. Regulamento técnico de espécies vegetais para o pre paro de chás . Resolução de Diretoria Colegiada - RDC n° 267, Agencia Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, 2005.
33. BRASIL. Regulamento técnico para irradiação de alimentos . Resolução de Diretoria Colegiada – RDC n° 21, Agencia Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, 2001a.
34. BRASIL. Regulamento técnico sobre padrões microbiológicos p ara alimentos . Resolução de Diretoria Colegiada - RDC n° 12, Agencia Nacional de Vigilância Sanitária - ANVISA, 2001b.
35. BREEN, A.P.; MURPHY, J.A. Reactions of oxyl radicals with DNA. Free Radic. Biol. Med. , v. 18, p. 1033-1077, 1995.
36. BUECHTER, D.D. Free radicals and oxygen toxicity. Pharm. Res. , v. 5, p. 253-260, 1988.
37. BUGNO, A.; BUZZO, A.A.; NAKAMURA, C.T.; PEREIRA, T.C.; MATOS, D.; PINTO, T.J.A. Avaliação da contaminação microbiana em drogas vegetais. Rev. Bras. Ciênc. Farm. , v. 41, p. 491-497, 2005.
38. BURTON, K.P. Evidence of direct toxic effects of the myocardium. Free Radic. Biol. Med. , v. 4, p.15-24, 1988.
39. CABRERA, C.; GIMENEZ, R.; LÓPEZ, M.C. Determination of tea components with antioxidant activity. J. Agric. Food Chem. , v. 51, p. 4.427-4.435, 2003.
40. CAI, Z.; LI, X.; KATSUMURA, Y. Interaction of hydrated electron with dietary flavonoids and phenolic acids: rate constants and transient spectra studied by pulse radiolysis. Free Radic. Biol. Med. , v. 27, p. 822-829, 1999.
41. CALIXTO, J.B. Twenty-five years of research on medicinal plants in Latin America. A personal view. J. Ethnopharmacol. , v. 100, p. 131-134, 2005.
42. CARDOZO JR., E.L.; FERRARESE-FILHO, O.; CARDOZO FILHO, L.; FERRARESE, M.L.L.; DONADUZZI, C.M.; STURION, J.A. Methylxanthines and phenolic compounds in mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) progenies grown in Brazil. J. Food Comp. Anal ., v. 20, p. 553-558, 2007.
43. CARLONI, P.; TIANO, L.; PADELLA, L.; BACCHETTI, T.; CUSTOMU, C.; KAY, A.; DAMIANI, E. Antioxidant activity of white, green and black tea obtained from the same tea cultivar. Food Res.Int. , In Press, DOI. 10.1016/j.foodres.2012.07.057, 2012.
94
44. CARVALHO, S.; STUART, R.M.; PIMENTEL, I.C.; DALZOTO, P.R.; GABARDO, J.; ZAWADNEAK, M.A.C. Contaminação fúngica em chás de camomila, erva-doce e erva-mate. Rev. Inst. Adolfo Lutz , v. 68, p. 91-5, 2009.
45. CHMIELEWSKI, A.G.; HAJI-SAEID, M. Radiation technologies: past, present and future. Radiat. Phys. Chem. , v. 71, p. 17-21, 2004.
46. CHOSDU, R.; ERIZAL; IRIAWAN, T.; HILMY, N. The effect of gamma irradiation on curcumin component of Curcuma domestica. Radiat. Phys. Chem. , v. 46, p. 663-667, 1995.
47. CHU, Y. H.; CHANG, C. L.; HSU, H. F. Flavonoid content of several vegetables and their antioxidant activity. J. Agric. Food Chem. , v. 80, p. 561-566, 2000.
48. CLANCY, D.; BIRDSALL, J. Flies, worms and the Free Radical Theory of ageing. Ageing Res. Rev. , v. 12, p. 404-412, 2013.
49. CNEN – Comissão Nacional de Energia Nuclear. Aplicações da energia nuclear . Disponível em: < http://www.cnen.gov.br/ensino/apostilas/aplica.pdf>. Acesso em: 15 jan. 2009b.
50. CNEN – Comissão Nacional de Energia Nuclear. Radiações ionizantes e a vida . Disponível em: <http://www.cnen.gov.br/ensino/apostilas/rad_ion.pdf>. Acesso em: 15 jan. 2009a.
51. CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION. Codex general standard for irradiated foods. Codex Stan 106-1983 . Rev. 1-2003, 2003.
52. COSTA, A.S.G.; NUNES, M.A.; ALMEIDA, I.M.C.; CARVALHO, M.R.; BARROSO, M.F.; ALVES, R.C.; OLIVEIRA, M.B.P.P. Teas, dietary supplements and fruit juices: A comparative study regarding antioxidant activity and bioactive compounds. Food Sci. Technol. , v. 49, p. 324-328, 2012.
53. COULTATE, T.P. Food – The chemistry of its components. Series of the Royal Society of Chemistry Paperbacks, 3.ed. London: Royal Society of Chemistry, 1996.
54. CRESPY, V.; MORAND, C.; MANACH, C.; BESSON, C.; DEMIGNE, C.; REMESY, C. Part of quercetin absorbed in the small intestine is conjugated and further secreted in the intestinal lumen. Am. J. Physiol. , v. 277, p. G120-G126, 1999.
95
55. CROSS, C. Oxygen radicals and human disease. Ann. Intern. Med. , v. 107, p. 526-545, 1987.
56. DARTORA, N.; SOUZA, L.M.; SANTANA-FILHO, A.P.; IACOMINI, M.; VALDUGA, A.T.; GORIN P.A.J.; SASSAKI, G.L. UPLC-PDA-MS evaluation of bioactive compounds from leaves of Ilex paraguariensis with different growth conditions, treatments and ageing. Food Chem ., v. 129, p. 1453-1461, 2011.
57. DE SMET, P.A.G.M. Health risks of herbal remedies: an update. Clin. Pharmacol. Therm. , v. 76, p. 1-17, 2004.
58. DEL RIO, D.; COSTA, L.G.; LEAN, M.E.J.; CROZIER, A. Polyphenols and health: What compounds are involved?. Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis. , v. 20, p. 1-6, 2010.
59. DELINCÉE, H.; POOL-ZOBEL, B. L. Genotoxic properties of 2-dodecylcyclobutanone, A compound formed on irradiation of food containing fat. Radiat. Phys. Chem. , v. 52, p. 39-42, 1998.
60. DÉPREZ, S.; MILA, I.; HUNEAU, J. F.; TOMÉ, D.; SCALBERT, A. Transport of proanthocyanidin dimer, trimer and polymer across monolayers of human intestinal epithelial Caco-2 cells. Antioxid. Redox Signal. , v. 3, p. 957-967, 2001.
61. DIEHL, J.F. Food irradiation - past, present and future. Radiat. Phys. Chem. , v. 63, p. 211-215, 2002.
62. DIEHL, J.F. Safety of irradiated foods . New York: Marcel Deckker, 1995.
63. DOMAZOU, A.S.; KOPPENOL, W.H.; GEBICKI, J.M. Efficient repair of protein radicals by ascorbate. Free Radic. Biol. Med. , v. 46, p.1049-1057, 2009.
64. DONOVAN, J. L.; CRESPY, V.; MANACH, C.; MORAND, C.; BESSON ,C.; SCALBERT, A.; RÉMÉSY, C. Catechin is metabolized by both the small intestine and the liver in rats. J. Nutr. , v. 131, p. 1753-1757, 2001.
65. DONOVAN, J.L.; MANACH, C.; RIOS, L.; MORAND, C.; SCALBERT, A.; RÉMÉSY, C. Procyanidins are not bioavailable in rats fed a single meal containing a grape seed extract or the procyanidin dimer B3. Br. J. Nutr. , v. 87, p. 299-306, 2002.
66. DREOSTI, I.E.; WARGOVICH, M.J.; YANG, C.S. Inhibition of carcinogenesis by tea: the evidence from experimental studies. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. , v. 37, p. 761-770, 1997.
96
67. DUFRESNE, C.J.; FARNWORTH, E.R. A review of latest research findings on the health promotion properties of tea. J. Nutr. Biochem. , v. 12, p. 404-421, 2001.
68. DULLOO, A.G.; DURET, C.; ROHRER, D.; GIRARDIER, L.; MENSI, N.; FATHI, M.; CHANTRE, P.; VANDERMANDER, J. Efficacy of a green tea extract rich in catechin polyphenols and caffeine in increasing 24-h energy expenditure and fat oxidation in humans. Am. J. Clin. Nutr. , v. 70, p. 1040-1045, 1999.
69. EFUNTOYE, M.O. Fungi associated with herbal drug plants during storage. Mycophat. , v.136, p. 115-118, 1999.
70. EL-SHAHAWI, M.S.; HAMZA, A.; BAHAFFI, S.O.; AL-SIBAAI, A.A.; ABDULJABBAR, T.N. Analysis of some selected catechins and caffeine in green tea by high performance liquid chromatography. Food Chem. , v.134, p. 2268-2275, 2012.
71. ERSHOV, B.G., GORDEEV, A.V. A model for radiolysis of water and aqueous solutions of H2, H2O2 and O2. Radiat. Phys. Chem. , v. 77, p. 928-935, 2008.
72. EUROPEAN UNION. Directive 1999/3/EC of the European Parliament and of the Council of 22 February 1999 on the establishment of a Community list of foods and food ingredients treated with ionising radiation. Directive 1999/3/EC. Official Journal of the European Union, 1999.
73. EUROPEAN UNION. List of Member States’ authorisations of food and food ingredients which may be treated with ionising radiation. Directive 2009/C . Official Journal of the European Union, 2009.
74. FANARO, G. B. Efeito da radiação ionizante na formação de volát eis em chás da planta Camellia sinensis (L). 2009. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo.
75. FANARO, G.B.; ARAÚJO, M.M.; THOMAZ, F.S.; DUARTE, R.C.; VILLAVICENCIO, A.L.C.H. Comparison of treatment in soybean grains between 60Co and e-beams applications. In: International Nuclear Atlantic conference (INAC) - VIII ENAN, 2007. Proceedings… Santos, SP. Associação Brasileira de Energia Nuclear (ABEN), 2007a.
76. FANARO, G.B.; DUARTE, R.C.; SANTILLO, A.G.; PINTO E SILVA, M.E.M.; PURGATTO, E.; VILLAVICENCIO, A.L.C.H. Evaluation of γ-radiation on oolong tea odor volatiles. Radiat. Phys. Chem. , v. 81, p. 1152-1156, 2012.
97
77. FANARO, G.B.; SALUM D.C.; NUNES, T.C.F; FURGERI, C.; RELA, P.; VILLAVICENCIO, A.L.C.H. Advances between e-beams and 60Co applications in soybean grains. In: Eight International Topical Meeting on Nuclear Applications and Utilization of Accelerators (AccApp´07), Pocatello, Estados Unidos da América. Proceedings of International Topical Meeting on Nuclear Applications and Utilization of Accelerators , p. 1022-1025, 2007b.
78. FARKAS, J. Irradiation for better foods. Tren. Food Scien. Technol. , v. 17, p. 148-152, 2006.
79. FARKAS, J. Physical methods of food preservation . 2. ed., Washington: ASM, p. 567–591, 2001.
80. FARKAS, J., MOHÁCSI-FARKAS, C. History and future of food irradiation. Tren. Food Scien. Technol. , v. 22, p. 121-126, 2011.
81. FERRADINI C.; JAY-GERIN, J.P. La radiolyse de l’eau et des solutions aqueuses: historique et actualité. Can. J. Chem. , v. 77, p. 1542-1575, 1999.
82. FERRARA, L.; MONTESANO, D.; SENATORE, A. The distribution of minerals and flavonoids in the tea plant (Camellia sinensis). Il Farmaco , v. 56, p. 397-401, 2001.
83. FERRUZZI, M.G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiol. Behav. , v. 100, p. 33-41, 2010.
84. FINDLAY, D.J.S.; PARSON, T.V.; SENÉ, M.R. Irradiation of food and the induction of radioactivity. Radiat. Phys. Chem. , v. 42, p. 417-420, 1993.
85. FURGERI, C..; NUNES, T.C.F.; FANARO, G.B.; SOUZA, M.F.F.; BASTOS, D.H.M.; VILLAVICENCIO, A.L.C.H. Evaluation of phenolic compounds in maté (Ilex paraguariensis) processed by gamma radiation. Radiat. Phys. Chem. , v. 78, p. 639-641, 2009.
86. FURGERI, C.; SABUNDJIAN, I.T.; SILVA, P.V.; SALUM, D.C.; BASTOS, D.H.M.; VILLAVICENCIO, A.L.C.H. Evaluation of sensorial analysis in maté (Ilex paraguariensis) processed by gamma radiation. In: International Nuclear Atlantic conference (INAC) - VIII ENAN, 2007. Proceedings… Santos, SP. Associação Brasileira de Energia Nuclear (ABEN), 2007.
87. GIVEON, S.M.; LIBERMAN, N.; KLANG, S.; KAHAN, E. Are people who use “natural drugs” aware of their potentially harmful side effects and reporting to family physician? Patient Educ. Couns. , v. 53, p. 5-11, 2004.
98
88. GOCK, M.A.; HOCKING, A.D.; PITT, J.I.; POULOS, P.G. Influence of temperature, water activity and pH on growth of some xerophilic fungi. Int. J. Food Microbiol. , v. 81, p. 11-19, 2003.
89. GONTHIER, M.P.; VERNY, M.A.; BESSON, C.; RÉMÉSY, C.; SCALBERT, A. Chlorogenic acid bioavailability largely depends on its metabolism by the gut microflora in rats. J. Nutr. , v. 133, p. 1853-1859, 2003.
90. GOSSLAU, A.; CHEN, K.Y.; Nutraceuticals, Apoptosis, and Disease Prevention, Nutrition , v. 20, p. 95-101, 2004.
91. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J.M.C. The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases. Mol. Aspects Med. , v. 8, p. 189-193. 1985.
92. HANSEN, J.M.; SHAFFER, H.L. Sterilization and preservation by radiation sterilization. In: Block, S.S. Disinfection sterilization and preservation . 5 ed. Philadelphia: Lippincott Willians & Wilkins, p. 729-746, 2001.
93. HARMAN, D.; Birdsall, J. Free radical theory of aging. Mut. Res. , v. 275, p. 257-266, 1992.
94. HAYES, D.J.; MURANO, E.A.; MURANO, P.S.; OLSON, D.G.; SAPP, S.G. Food Irradiation : A Sourcebook. 1 ed. [S.I]: Ames, 1995.
95. HELL, K.; GNONLONFIN, B.G.J.; KODJOGBE, G.; LAMBONI, Y.; ABDOURHAMANE, I.K. Mycoflora and occurrence of aflatoxin in dried vegetables in Benin, Mali and Togo, West Africa. Int. J. Food Microbiol. , v. 135, p. 99-104, 2009.
96. HIGDON, J.V., FREI, B. Tea catechins and polyphenols: health effects, metabolism, and antioxidant functions. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. , v. 43, p. 89-143, 2003.
97. HO, C.T.; RAFI, M.M.; GHAI,G. Substâncias bioativas: Nutracêuticas e tóxicas. In: DAMODARAN, S.; PARKIN, K.L.; FENNEMA, O.R. Química de alimentos de Fennema . 4 ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.
98. HOCKING, A.D.; PITT, J.I. Media and methods for detection and enumeration of microorganism with consideration of water activity requirements. In: Rockland, L.D.; Beuchat, L.R. (Eds.). Water Activity: Teory and applications to food . Marcel Dekker: Nova York, 1987.
99. HORST, M.A.; LAJOLO, F.M. Biodisponibilidade de compostos bioativos de alimentos. In: COZZOLINO, S.M.F. Biodisponibilidade de nutrientes . 3 ed. Barueri: Manole, 2009.
99
100. HSU, H.Y.; TSANG, S.F.; LIN, K.W.; YANG, S.C.; LIN, C.N. Cell death induced by flavonoid glycosides with and without copper. Food Chem. Toxicol. , v. 46, p. 2394-2401, 2008.
101. IAEA. International Atomic Energy Agency - Food irradiation with emphasis on process control and acceptance in Asia. IAEA TEC.DOC-871 , 2001.
102. ICGFI. The development of X-ray machines for food irradiation. Vienna, Austria, 1995.
103. ICHINOSE, T.; NOMURA, S.; SOMEYA. Y.; AKIMOTO, S.; TACHIYASHIKI, K.; IMAIZUMI, K. Effect of endurance training supplemented with green tea extract on substrate metabolism during exercise in humans. Scand. J. Med. Sci. Sports , v. 21, p. 598-605, 2011.
104. IPEN. Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares. Sobre o IPEN – Histórico, principais convênios e eventos técnicos. Disponível em: <http://www.ipen.br/ipen_p/sobre-ipen/historico/historico-principais-convenios.html>. Acesso em 20 ago. 2004.
105. KARMAS, E. Techniques for measurement of moisture content of foods. Food Techn. , v. 34, n. 4, p. 52-59, 1980.
106. KATUSIN-RAZEM, B.; NOVAK, B. RAZEM, D. Microbiological decontamination of botanical raw materials and corresponding pharmaceutical products by irradiation. Radiat. Phys. Chem. , v. 62, p. 261-275, 2001.
107. KAWAI, K.; TSUNO, N.H.; KITAYAMA, J.; OKAJI, Y.; YAZAWA, K.; ASAKAGE, M.; HORI, N.; WATANABE, T.; TAKAHASHI, K.; NAGAWA, H. Epigallocatechin gallate, the main component of tea polyphenol, binds to CD4 and inter-feres with gp120 binding. J. Allergy Clin. Immunol. , v. 112, p. 951-957, 2003.
108. KHAN, N.; MUKHTAR, H. Tea polyphenols for health promotion. Life Sci. , v. 81, p. 519-533, 2007.
109. KHATTAK, K.F.; SIMPSON, T.J.; IHASNULLAH. Effect of gamma irradiation on the microbial load, nutrient composition and free radical scavenging activity of Nelumbo nucifera rhizome. Radiat. Phys. Chem. , v. 78, p. 206-212, 2009.
110. KODAMA, D.H.; GONÇALVES, A.E.S.S.; LAJOLO, F.M.; GENOVESE, M.I. Flavonoids, total phenolics and antioxidant capacity: comparison between commercial green tea preparations. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 30, p. 1077-1082, 2010.
100
111. KOMES, D.; HOR ŽIĆ, D.; BELŠČAK, A.; GANIĆ, K.K.; VULIĆ, I. Green tea preparation and its influence on the content of bioactive compounds. Food Res. Int. , v. 43, p. 167-176, 2010.
112. KOO, S.I.; NOH, S.K. Green tea as inhibitor of the intestinal absorption of lipids: potential mechanism for its lipid-lowering effect. J. Nutr. Biochem. , v. 18, p. 179-183, 2007.
113. KUMAR, S.; GAUTAM, S.; POWAR, S.; SHARMA, A. Microbial decontamination of medicinally important herbals using gamma radiation and their biochemical characterization. Food Chem. , v. 119, p. 328-335, 2010.
114. KUME, T.; FURUTA, M.; TODORIKI, S.; UENOYAMA, N.; KOBAYASHI, Y. Status of food irradiation in the world. Radiat. Phys. Chem. , v. 78, p. 222-226, 2009.
115. LAROCHE, C.; FINE, F.; GERVAIS, P. Water activity affects heat resistance of microorganisms in food powders. Int. J. Food Microbiol. , v. 97, p. 307-315, 2005.
116. LEE, B.L; ONG, C.N. Comparative analysis of tea catechins and theaflavins by high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A , v. 881, p. 439-447, 2000.
117. LEE, H.C.; JENNER, A.M.; LOW, C.S.; LEE, Y.K. Effect of tea phenolics and their aromatic fecal bacterial metabolites on intestinal microbiota. Res. Microbiol. , v. 157, p. 876-84, 2006.
118. LEE, M.J.; LAMBERT, J.D.; PRABHU, S.; MENG, X.; LU, H.; MALIAKAL, P.; HO, C.T.; YANG, C.S. Delivery of tea polyphenols to the oral cavity by green tea leaves and black tea extract. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. , v. 13, p. 132-137, 2004.
119. LEUNG, H. K. Structure and properties of water. Cereal Foods World , v. 26, n. 7, p. 350-352, 1981.
120. LIYANA-PATHIRANA, C. M.; SHAHIDI, F. Antioxidant properties of commercial soft and hard winter wheats (Triticum aestivum L.) and their milling fractions. J. Sci. Food Agric. , v. 86, n. 3, p. 477-485, 2006.
121. LUXIMON-RAMMA, A.; BAHORUN, T.; CROZIER, A. Antioxidant actions and phenolic and vitamin C contents of common Mauritian exotic fruits. J. Sci. Food Agric. , v. 83, p. 496-502, 2003.
122. MALTINI, E.; TORREGGIANI, D.; VENIR, E.; BERTOLO, G. Water activity and the preservation of plant foods. Food Chem. , v. 82, p. 79-86, 2003.
101
123. MANDEEL, Q.A. Fungal contamination of some imported spices. Mycopathology , v. 159, p. 291-298, 2005.
124. MARTINS, H.M.; MARTINS, M.L.; DIAS, M.I.; BERNARDO, F. Evaluation of microbiological quality of medicinal plants used in natural infusions. Int. J. Food Microb. , v. 68, p. 149-151, 2001.
125. MASEFIELD, J. Reflections on the evolution and current status of the radiation industry. Radiat. Phys. Chem. , v. 71, p. 9-16, 2004.
126. MATSUBARA, S.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Conteúdo de miricetina, quercetina e kaempferol em chás comercializados no Brasil. Ciênc. Tecnol. Aliment. , v. 26, n. 2, p. 380-385, 2006a.
127. MATSUBARA, S.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Teores de catequinas e teaflavinas em chás comercializados no Brasil. Ciênc. Tecnol. Aliment. , v. 26, n. 2, p. 401-407, 2006b.
128. MISHRA, B.B.; GAUTAM, S.; SHARMA, A. Microbial decontamination of tea (Camellia sinensis) by gamma radiation. J. Food Sci. , v. 71, p. M151-M156, 2006.
129. MOLINS, R.A. (ed). Food irradiation: principles and applications . New York: Wiley-Interscience, 2001. 469 p.
130. MONBALIU, S.; WU, A.; ZHANG, D.; PETEGHEM, C.P.; SAEGER, S.D.Multimycotoxin UPLC-MS/MS for tea, herbal infusions and the erived drinkable products. J. Agric. Food Chem. , v. 58, p. 12664-12671, 2010.
131. MONK, J. D.; BEUCHAT, L. R.; DOYLE, M. P. Irradiation inactivation of food-borne microrganisms. J. Food Protec. , v. 58, p. 197-208, 1995.
132. MOREHOUSE, K.M. Food irradiation-US regulatory considerations. Radiat. Phys. Chem. , v. 63, p. 281-284, 2002.
133. MOREHOUSE, M. Food irradiation: the treatment of foods with ionizing radiation. Food Test. Anal. , v. 4, 1998.
134. MORRISSEY, R.F.; HERRING, C.M. Radiation sterilization: past, present and future. Radiat. Phys. Chem. , v. 63, p. 217-221, 2002.
135. MUKHTAR, H.; AHMAD, N., Cancer chemoprevention: future holds in multiple agents. Toxicol. App. Pharm. , v. 158, p. 207-210, 1999.
102
136. NAGY, T.O.; SOLAR, S.; SONTAG, G.; KOENIG, J. Identification of phenolic components in dried spices and influence of irradiation. Food Chem. , v. 128, p. 530-534, 2011.
137. NIJVELDT, R.J.; van NOOD, E.; van HOORN, D.E.C..; BOELENS, P.G.; van NORREN, K.; van LEEUWEN, P.A.M. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications. Am. J. Clin. Nutr. , v. 74, p. 418-425, 2001.
138. OH, J.; JO, H.; CHO, A.R.; KIM, S.J.; JAEJOON HAN, J. Antioxidant and antimicrobial activities of various leafy herbal teas. Food Control , v. 31, p. 403-409, 2013.
139. OLSON, D.G. Irradiation of food. Food Technol. , v. 52, p. 56-62, 1998.
140. OTA, N.; SOGA, S.; MURASE, T.; SHIMOTOYODOME, A.; HASE, T. Consumption of coffee polyphenols increases fat utilization in humans. J. Health Sci. , v. 56, n. 6, p. 745-751, 2010.
141. OU, B.; HAMPSCH-WOODILL, M.; PRIOR, R. Development and validation of an improved oxygen radical absorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent. J. Agric. Food Chem. , v. 49, p. 4619-4626, 2001.
142. OWUOR, P.O.; OBANDA, M.; NYIRENDA, H.E.; MANDALA, W.L. Influence of region of production on clonal black tea chemical characteristics. Food Chem. , v. 108, p. 263-271, 2008.
143. PACKER L. Oxidants, antioxidants, nutrients and the athlete. J. Sports Sci. , v. 15, p. 353-63, 1997.
144. PEZZUTTI, A.; MATZKIN, M.R.; CROCI C.A. Gamma irradiation improved the quality of onion flakes used by argentine consumers. J. Food Process. Pres. , v. 29, p. 120-131, 2005.
145. PIERREFICHE, G.; LABORIT, H. Oxygen free radicals, melatonin, and aging. Exp. Gerontol. , v. 30, p. 213-227, 1995.
146. PISKULA, M.K.; TERAO, J. Accumulation of (–)-epicatechin metabolites in rat plasma after oral administration and distribution of conjugation enzymes in rat tissues J. Nutr. , v. 128, p. 1172-117, 1998.
147. PITT, J. I.; HOCKING, A. D.; GLENN, D. R. An improved medium for the detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. J. Appl. Bacteriol. , v. 54, p. 109-114, 1983.
103
148. POLLARD, E.C. Phenomenology of radiation effects on microorganisms. In: SPRINGER-VELAG (ed.). Encyclopedia of medical radiology . New york, 1966, v.2, p. 1-34.
149. POLLONIO, M.A.R. Alimentos funcionais: as recentes tendências e os envolvidos no consumo. Hig. Aliment. , v. 14, p. 26-31, 2000.
150. PRADO, C.C.; ALENCAR, R.G.; PAULA, J.R.; BARA, M.T.F. Avaliação do teor de polifenóis da Camellia sinensis (chá verde). Rev. Eletr. Farm. , v. 2, p. 164-167, 2005.
151. RAMALHO, S.A.; NIGAM, N.; OLIVEIRA, G.B.; OLIVEIRA, P.A.; SILVA, T.O.M.; SANTOS, A.G.P.; NARAIN, N. Effect of infusion time on phenolic compounds and caffeine content in black tea. Food Res. Int. , v. 51, p. 155-161, 2013.
152. RATES, S.M.K. Plants as source of drugs. Toxicon , v. 39, p. 603-613, 2001.
153. REID, D. S.; FENNEMA, O. R. Água e Gelo. In: DAMODARAN, S.; PARKIN, K. L.; FENNEMA, O. R. Química de alimentos de Fennema . 4 ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.
154. RETO, M.; FIGUEIRA, M.F.; FILIPE, H.M.; ALMEIDA, C.M.M. Chemical composition of green tea (Camellia sinensis) infusions commercialized in Portugal. Plant Foods Hum. Nutr. , v. 62, p. 139-144, 2007.
155. RILEY, P.A. Free radicals in biology: oxidative stress and the effects of ionizing radiation. Int. J. Radiat. Biol. , v. 65, p. 27-33, 1994.
156. RIZZO, I.; VEDOYA,G.; MAURUTTO, S.; HAIDUKOWSKI, M.; VARSAVSKY, E. Assessment of toxigenic fungi on Argentinean medicinal herbs. Microbiol. Res. , v. 159, p. 113-120, 2004.
157. ROCHA, L.O.; SOARES, M.M.S.R.; CORRÊA, C.L. Análise da contaminação fúngica em amostras de Cassia acutifolia (sene) e Peumus boldus (Molina) Lyons (boldo-do-chile) comercializados na cidade de Campinas, Brasil. Rev. Bras. Cien. Farmac. , v. 40, p. 521-527, 2004.
158. RODRIGUES, F.T.; FANARO, G.B.; DUARTE, R.C.; KOIKE, A.C.; VILLAVICENCIO, A.L.C. H. A sensory evaluation of irradiated cookies made from flaxseed meal. Radiat. Phys. Chem. , v. 81, p. 1157-1159, 2012.
159. ROSSI, A.M.; JESUS, E.F. A radiação que conserva. Ciênc. Hoje , v. 17, p. 24-29, 1994.
104
160. RUSAK, G.; KOMES, D.; LIKIĆ, S.; HOR ŽIC, D.; KOVAČ, M. Phenolic content and antioxidative capacity of green and white tea extracts depending on extraction conditions and the solvent used. Food Chem. , v. 110, p. 852-858, 2008.
161. SAITO, S.T.; WELZEL, A.; SUYENAGA, E.S., BUENO, F. A method for fast determination of epigallocatechin gallate (EGCG), epicatechin (EC), catechin (C) and caffeine (CAF) in green tea using HPLC. Ciênc. Tecnol. Aliment. , v. 26, p. 394-400, 2006.
162. SAKANAKA, S.; KIM, M.J.; YAMAMOTO, T. Antibacterial substances in Japanese green tea extract against Streptococcus mutans, a carciogenic bacterium. Agric. Biol. Chem. , v. 53, p. 2307-2311, 1989.
163. SALUM, D.C.; SABUNDJIAN, I.T.; SILVA, P.V.; FURGERI, C.; PURGATTO, E.; VILLAVICENCIO, A.L.C.H. Sensorial effects of gamma radiation processing in cinnamon (Laurus cinnamomum) and nut meg (Myristica fragans). In: International Nuclear Atlantic conference (INAC) - VIII ENAN, 2007. Proceedings… Santos, SP. Associação Brasileira de Energia Nuclear (ABEN), 2007.
164. SAMUEL, A.H.; MAGEE, J.L. Theory of radiation chemistry. II. Track effects in radiolysis of water. J. Chem. Phys. , v. 21, p. 1080-1087, 1953.
165. SANO, J.; INAMI S.; SEIMIYA, K., OHBA, T; SAKAI, S.; TAKANO, T.; MIZUNO, K. Effects of green tea intake on the development of coronary artery disease. Cir. J. , v. 68, p.665-670, 2004.
166. SANTANA-RIOS, G.; ORNER, G.A.; AMANTANA, A.; PROVOST, C.; WU, S.Y.; DASHWOOD, R.H. Potent antimutagenic activity of white tea in comparison with green tea in the Salmonella assay. Mutat. Res. , v. 495, p. 61-74, 2001a.
167. SANTANA-RIOS, G.; ORNER, G.A.; XU, M.; IZQUIERDO-PULIDO, M.; DASHWOOD, R.H. Inhibition by white tea of 2-amino-1-methyl-6- phenylimidazo[4,5-b]pyridine-induced colonic aberrant crypts in the F344 rat. Nutr. Cancer. , v. 41, n. 1 e 2, p. 98-103, 2001b.
168. SATO, T.; MYATA, G. The nutraceutical benefit, Part I: Green tea. Nutrition , v. 16, p. 315-317, 2000.
169. SCALBERT, A.; MORAND, C.; MANACH, C.; RÉMÉSY, C. Absorption and metabolism of polyphenols in the gut and impact on health. Biomed. Pharmacother. , v. 56, p. 276-282, 2002.
170. SCALBERT, A.; WILLIAMSON, G. Dietary intake and bioavailability of polyphenols. J. Nutr. , v. 130, p. 2073S-2085S, 2000.
105
171. SEN, C. K.; ATALAY, M.; HÄNNINEN O. Exercise-induced oxidative stress: glutathione supplementation and deficiency. J. Appl. Physiol. , v. 77, p. 2177-2187, 1994.
172. SHARANGI, A.B. Medicinal and therapeutic potentialities of tea (Camellia sinensis L.) - A review. Food Res. Int. , v. 42, p. 529-535, 2009.
173. SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E.P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia, da planta ao medicamento . 5.ed., Porto Alegre/Florianópolis: Editora da UFRGS/ Editora da UFSC, 2003.
174. SINGLETON, V.L.; ROSSI JR, J.A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Vitic. , v. 16, p. 144-158, 1965.
175. SPOTHEIM-MAURIZOT, M.; SAVOYE, C.; SABATTIER, R.; CHARLIER, M. Comparative study of DNA radiolysis by fast neutrons and γ-rays. Bull Cancer/Radiother. , v. 83, p. 27s-31s, 1996.
176. STALMACH, A.; TROUFFLARD, S.; SERAFINI, M.; CROZIER, A. Absorption, metabolism and excretion of Choladi green tea flavan-3-ols by humans. Mol. Nutr. Food Res. , v. 53, p. S44-S53, 2009.
177. SUZUKI, M.; TABUCHI, M.; IKEDA, M.; UMEGAKI, K.; TOMITA, T. Protective effects of green tea catechins on cerebral ischemic damage. Med. Sci. Monit. , v. 10, p. 166-74, 2004.
178. THOMAS, J.; SENTHILKUMAR, R.S.; KUMAR, R.R.; MANDAL, A.K.A.; MURALEEDHARAN, N. Induction of γ irradiation for decontamination and to increase the storage stability of black teas. Food Chem. , v. 106, p. 180-184, 2008.
179. TIJBURG, L.B.M.; MATTERN, T.; FOLTS, J.D. WEISGERBER, U.M.;Katan, M.B.Tea flavonoids and cardiovascular diseases: a review. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. , v. 37 p. 771-785, 1997.
180. TOIT, R.; VOLSTEEDT, Y.; APOSTOLIDES, Z. Compa-rison of the antioxidant content of fruits, vegetables and teas measured as vitamin C equivalents. Toxicology , v. 166, p. 63-69, 2001.
181. TORTORA, G.J.; FUNKE, B.R.; CASE, C.L. Microbiologia . 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2002.
182. TRITSCH, G. L. Food iradiation. Nutrition , v.16, nº 7/8, p. 698-701, 2000.
106
183. TURKMEN, N.; SARI, F.; VELIOGLU, Y.S. Effects of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate tea polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin–Ciocalteu methods. Food Chem. , v. 99, p. 835-841, 2006.
184. VALKO, M.; LEIBFRITZ, D.; MONCOL, J.; CRONIN, M.T.D.; MAZUR, M.; TELSER, J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. , v. 39, p. 44-84, 2007.
185. VILLAVICENCIO, A.L.C.H.; FANARO, G.B.; ARAÚJO, M.M.; AQUINO, S.; SILVA, P.V.; MANCINI-FILHO, J. Detection of Phakopsora pachyrhizi by polymerase chain reaction (PCR) and use of germination test and DNA comet assay after e-beam processing in soybean. Radiat. Phys. Chem. , v. 76, p. 1878-1881, 2007.
186. VILLAVICENCIO, A.L.C.H.; MANCINI-FILHO, J.; DELINCÉE, H. Application of a rapid screening method to detect irradiated meat in Brazil. Radiat. Phys. Chem. , v. 57, p. 295-298, 2000.
187. WAKEFORD, C.A.; BLACKBURN, R.; SWALLOW, A.J. Induction and detection of radioactivity in foodstuffs irradiated with 10MeV electrons and X-rays. Radiat. Phys. Chem. , v. 38, p. 29-38, 1991.
188. WALDHAUSER, S.S.M; BAUMANN, T.W. Compartmentation of caffeine and related purine alkaloids depends exclusively on the physical chemistry of their vacuolar complex formation with chlorogenic acids. Phytochemistry , v. 42, p. 985- 996, 1996.
189. WALLACE, S.S. Enzymatic processing of radiation-induced free radical damage in DNA. Radiat. Res. , v. 150, p. S60-S79, 1998.
190. WANASUNDARA, U.N.; SHAHIDI, F. Antioxidative and prooxidant activity of green tea extract in marine oils. Food Chem. , v. 63, p. 335-342, 1998.
191. WANG, Y.; YANG, X.; LI, K.; LI, C.; LI, L.; LI, J.; HUANG, H.; HE, Y.; YE, C.; SONG, X. Simultaneous determination of theanine, gallic acid, purine alkaloids, catechins, and theaflavins in black tea using HPLC. Int. J. Food Sci. Technol. , v. 45, p. 1263-1269, 2010.
192. WARDEN, B.A.; SMITH, L.S.; BEECHER, G.R.; BALENTINE, D.A.; CLEVIDENCE, B.A. Catechins are bioavailable in men and women drinking black tea throughout the day. J. Nutr. , v. 131, p. 1731-1737, 2001.
193. WEISBURGUER, J.H. Tea and health: a historical perspective. Cancer Lett. , v. 114, p. 315-317, 1997.
107
194. WEN, H.W.; CHUNG, H.P.; CHOU, F.I.; LINC, I.H.; HSIEH, P.C. Effect of gamma irradiation on microbial decontamination, and chemical and sensory characteristic of lycium fruit. Radiat. Phys. Chem. , v. 75, p. 596-603, 2006.
195. WHO – WORLD HEALTH ORGANIZATION. High-dose irradiation: wholesomeness of food irradiated with doses above 1 0 kGy . Techinical Report Series 890, Geneva, 1999.
196. WHO – WORLD HEALTH ORGANIZATION. Quality control methods for medicinal plant materials . World Health Organization: Geneva, 1998. 122p.
197. WHO – WORLD HEALTH ORGANIZATION. Safety and nutritional adequacy of irradiated food . Geneva, 1994.
198. WOODS, R.J.; PIKAEV, A.K. Applied Radiation Chemistry : Radiation Processing. New York, USA, 1994.
199. WU, C.; XU, H.; HÉRITIER, J.; ANDLAUER, W. Determination of catechins and flavonol glycosides in Chinese tea varieties. Food Chem. , v. 132, p. 144-149, 2012.
200. YAMAGUCHI, K.; SHIBAMOTO, T. Volatile Constituents of Green Tea, Gyokuro (Camellia sinensis L. var Yabukita). J. Agric. Food Chem. , v. 29, p. 366-370, 1981.
201. YAMAMORI, T.; YASUI, H.; YAMAZUMI, M.; WADA, Y.; NAKAMURA, Y., NAKAMURA, H.; INANAMI, O. Ionizing radiation induces mitochondrial reactive oxygen species production accompanied by upregulation of mitochondrial electron transport chain function and mitochondrial content under control of the cell cycle checkpoint. Free Radic. Biol. Med. , v. 53, p. 260-270, 2012.
202. YANG, C. S; CHUNG, J. Y.; YANG, G.; CHHABRA, S. K.; LEE, M. J. Tea and tea polyphenols in cancer prevention. J. Nutr. , v. 130, p. 472S-478S, 2000.
203. YANG, C.S., CHEN, L., LEE, M.J., BALENTINE, D., KUO, M., SCHANTZ, S.P. Blood and urine levels of tea catechins after ingestion of different amounts of green tea by human volunteers. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. , v. 7, p. 351-354, 1998.
204. YEO, S.G.; AHN, C.W.; LEE, Y.W.; LEE, T.G.; PARK, Y.H.; KIM, S.B. Antioxidative effect of tea extracts from green tea, oolong tea and black tea. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. , v. 24, p. 229-304, 1995.
108
205. ZWART, L.L.; MEERMAN, J.H.N.; COMMANDEUR, .J.M.; VERMEULEN, N.P.E. Biomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans. Free Radic. Biol. Med. , v. 26, p. 202-226, 1999.