Deborah van der Werff Datum: 23-07-08B&M DO cytohistopathologieGabriëlle Pinkse2-1-2008 → 31-6-2008VU medisch centrumStagebegeleider: Wim Vos

0

Inhoudsopgave

1 Inleiding...................................................................................................................................21.1 Longcarcinomen.........................................................................................................31.2 EGFR Protocol............................................................................................................41.3 Immunohistochemie....................................................................................................41.4 Mutatieanalyse............................................................................................................51.5 DISH...........................................................................................................................6

1.5.1 CISH...................................................................................................................71.5.2 Centromeer probe................................................................................................8

1.6 Doel en opzet van het onderzoek................................................................................82 Materiaal en methode.............................................................................................................10

2.1 1 EGFR procedure..........................................................................................................102.2 Immunohistochemie........................................................................................................102.3 Mutatieanalyse................................................................................................................112.4 CISH...............................................................................................................................11

3 Resultaten...............................................................................................................................143.1 Optimalisatie EGFR CISH op paraffinemateriaal....................................................14

3.1.1 Vumc protocol.........................................................................................................143.1.2 Zymed protocol........................................................................................................143.1.3 Zymed en Zytovision vergelijking...........................................................................153.1.4 Zytovision protocol..................................................................................................16

3.2 Optimalisatie EGFR CISH op cytologisch materiaal...............................................173.3 Patiënten materiaal....................................................................................................18

4 Conclusie en discussie...........................................................................................................195 Literatuur verwijzingen..........................................................................................................20Bijlage 1....................................................................................................................................21Bijlage 2....................................................................................................................................22Bijlage 3....................................................................................................................................23Bijlage 4....................................................................................................................................24Bijlage 5....................................................................................................................................25Bijlage 6....................................................................................................................................26Bijlage 7....................................................................................................................................27Bijlage 8....................................................................................................................................28

1

1 Inleiding

Bij recente ontwikkelingen van anti-kanker therapieën worden middelen gebruikt die bij voorkeur specifiek inwerken op kankercellen. Receptor eiwitten zijn daarvoor zeer geschikt, op voorwaarde dat deze specifieke eiwitten aanwezig zijn op de tumorcellen. Een voorbeeld van bij deze therapieën zijn van proteïne kinases, in de meeste gevallen tyrosine kinase. Deze spelen een belangrijke rol in het reguleren van de veel celfuncties, zoals celdeling/celcyclus, celoverleving/celdood (apoptose) en DNA reparatie.Tyrosine kinase remmers zijn kleine moleculen, die ervoor zorgen dat de receptoren geen signalen meer kunnen geven doorgeven aan de aan de cel waardoor de functie van de tyrosine kinase verhinderd word. (1)

Gefitinib/erlotinib is een Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) tyrosine kinase remmer (TKR) die gebruikt wordt bij de behandeling van bepaalde tumoren, waaronder longtumoren. EGFR komt voor in de epitheliale cellen van het lichaam. De EGF receptor behoort tot de tyrosine kinase glycoproteïnes. EGFR bestaat uit een buiten de celgelegen gedeelte (extracellulair) waaraan eiwitten zich kunnen binden, een in het membraan gelegen gedeelte, en een in de cel gelegen gedeelte (intracellulair) dat onder andere bestaat uit tyrosine kinase. EGF en TGFα binden aan het extracellulaire gedeelte van het EGFR waardoor het intracellulaire tyrosine kinase gedeelte gefosforyleerd wordt. Door deze fosforylatie worden er drie pathways geactiveerd, de AKT pathway, de RAS/ERK pathway en de STAT pathway. Deze pathways geven een signaal door aan de kern waarin ze zorgen voor gentranscriptie. De AKT pathway remt de apoptose, de RAS/ERK pathway zorgt voor celdeling en de STAT pathway zorgt voor bloedvatvorming en voor de migratie, adhesie en invasie van cellen in het omliggende weefsel.(2)

Normaal gesproken wordt het EGFR voor een korte tijd geactiveerd, waardoor deze cellen kort tot deling worden aangezet. Hierna worden de receptoren gerecycled of afgebroken.Een verhoogde EGFR activiteit kan verschillende oorzaken hebben.

1. Een verhoogd aantal EGF receptoren op het celoppervlak als gevolg van een verhoogt aantal EGFR genen in het DNA (gen amplificatie).

2. een gestegen aantal EGFR gen transcripties en translaties, waardoor er een overexpressie ontstaat van mRNA, met als gevolg een verhoogt aantal EGF receptoren.

1. wijziging in turnover. Over dit laatste is weinig bekend.

Gefitinib/erlotinib bindt aan het intracellulaire gedeelte van de receptor, waardoor het intracytoplasmatische domein niet meer gefosforyleerd wordt, hierdoor worden geen signalen meer naar het cytoplasma en de kern doorgeven. Daardoor vindt de activatie van de celproliferatie geremd en de apoptose remming niet plaats.Bij patiënten met EGFR amplificatie als het aantal receptoren verhoogd en dit is klinisch geassocieerd met een reactie op de Gefitinib/erlotinib (EGFR TKR) therapie. De respons op

2

Figuur 1: Schematische weergave van de Pathways die EGFR activeert.(3)

deze behandeling komt bij circa 10% van de longcarcinomen, met name adenocarcinomen voor. Vaker is dat bij vrouwen met name van het Oosterse ras, en vrouwen die niet gerookt hebben, Om deze redenen is het belangrijk dat er amplificaties kunnen worden aangetoond.

Figuur 2: Gefitinib/erlotinib zorg ervoor dat de receptoren niet meer gefosforyleerd kunnen worden, hierdoor word geen signaal meer naar het cytoplasma en de kern doorgegeven. Dit zorgt ervoor dat de celproliferatie geremd wordt en dat de apoptose inducerende pathway in gang gezet kan worden. (4)

1.1 Longcarcinomen Longcarcinomen zijn tumoren die ontstaan uit de bedekkende (epitheliale) laag van de longen en bronchiën. Deze worden onderverdeeld in twee hoofdgroepen

Het kleincellig longcarcinoom Het niet-kleincellig longcarcinoom

Ongeveer 20% van de longcarcinomen behoord tot het kleincellige type. Deze worden zo genoemd doordat de cellen zeer klein zijn en weinig cytoplasma bevatten. De groep niet-kleincellige longcarcinoom bestaat uit 3 verschillende typen:

Plaveiselcelcarcinoom (figuur 3A) Adenocarcinoom (figuur 3B) grootcellig carcinoom (figuur 3C)

3

A B C

Figuur 3 A: plaveiselcelcarcinoom 200x B: Adenocarcinoom 200x C: kleincellig carcinoom 200x

Het plaveiselcelcarcinoom is het meest voorkomende type van longcarcinomen. Het plaveiselcelcarcinoom ontwikkelt zich vanuit een morfologisch voorstadium plaveiselcellige metaplasie met dysplasie. Het adenocarcinoom heeft soms een morfologisch voorstadium: atypische adenomateuse hyperplasie. Het adenocarinoom heeft als kenmerk dat het buizen kanvormen en intracytoplasmatische vacuolen. In adenocarcinomen van de long komen EGFR of K-ras mutaties voor in ongeveer 10 en 20-30% van de gevallen.Tumoren waarbij het niet duidelijk is of het een plaveiselcelcarcinoom of een adenocarcinoom is worden ze ingedeeld in de groep grootcellige carcinomen. Hiermee wordt duidelijk gemaakt dat de tumor niet kleincellig is en dus behandeld moet worden als een niet-kleincellig longcarcinoom. De stamcel van de long is niet bekend.

1.2 EGFR ProtocolIn het VUmc is bij de pathologie een procedure gestart voor EGFR bepalingen op long adenocarcinomen waarmee kan worden bepaald of patiënten een EGFR amplificatie hebben waardoor ze behandeld kunnen worden met Gefitinib/erlotinib. Deze bepalingen worden gedaan bij patiënten die voldoen aan de volgende criteria:

Een vrouwelijke patiënt die nooit heeft gerookt heeft waarbij voor het eerst een longcarcinoom is geconstateerd

Een patiënt die een recidief heeft van een adenocarcinoom na eerste lijns behandeling.

Hierbij worden er een aantal testen gedaan op paraffinecoupes.1. EGFR eiwit expressie. hierbij wordt gekeken naar het patroon: membraneus en/of

cytoplasmatisch en mate van eiwitexpressie.2. Een EGFR en K-ras mutatieanalyse. Hierbij wordt gekeken naar de aanwezigheid van

mutaties in het bij voorkeur tumorDNA.3. Een EGFR genkopie bepaling. Hiermee wordt het aantal EGFR genkopieën per tumor

cel geteld. 4. TTF1 expressie. Deze kleuring kleurt de kernen van longadenocarcinomen vaak sterk

positief aan. 5. ALK-1 expressie. Indien de ALK-1 aankleurt is het al zeker dat het geen EGFR

mutatie is en zou het kunnen gaan om een zeldzame translocatie.Het plan is om dit ook te gaan doen op cytologisch materiaal. Het verkrijgen van cytologisch materiaal is minder ingrijpend dan het nemen van een biopt. Dit komt doordat de patient niet geopereerd hoeft te worden om weefsel te verkrijgen, maar wordt geprikt in de tumor en de cellen opgezogen.

1.3 ImmunohistochemieAls onderdeel van de immunohistologische kleuringen van het EGFR protocol worden de TTF-1(Thyroid transcription factor-1), EGFR en ALK-1 (anaplastic lymphoma kinase-1) gedaan.Het TTF-1 eiwit komt voor inde kern en wordt gebruikt om normaal schildklierweefsel aan te kleuren, maar waarvan is gebleken dat het ook longtumoren aankleurt (figuur 4). De TTF-1 is in het EGFR protocol opgenomen omdat men wilde kijken naar de relatie met EGFR mutatie en amplificatie.

4

Figuur 4 TTF-1 kleuring

Het EGFR eiwit komt voor in het membraan van de cel en kleurt het intrinsieke gedeelte van het EGF receptor aan. Bij de aanwezigheid van grote hoeveelheden receptoren komen deze ook in het cytoplasma voor en wordt ook het cytoplasma aangekleurd. De EGFR kleuring zorgt voor het zichtbaar maken van de receptoren, maar laat niet zien of het een EGFR gen mutatie is of een andere mutatie in een ander gen. De coupes worden beoordeeld met behulp van een scoringsschema. Deze gaat van 0, negatief, tot 3+, sterk positief. Hierbij wordt gekeken naar de cytoplasmatische aankleuring en de membraan aankleuring (figuur 5)

Het ALK-1 eiwit komt voor in de kern en het cytoplasma en (figuur 6) wordt normaal gebruikt om een translocatie aan te tonen in grootcellige anaplastische lymfomen om er zo achter te komen welk type lymfoom het is. Uit recent onderzoek is gebleken dat een ALK translocatie ook kan voorkomen in longcarcinomen.

1.4 MutatieanalyseEen ander onderdeel van het EGFR protocol is de mutatieanalyse. Met behulp van een mutatieanalyse kunnen eventuele mutaties in het DNA worden opgespoord. Bij de EGFR mutatieanalyse worden zowel een analyse gedaan op het EGFR gen als op het K-ras gen. Als een mutatie op het K-ras gen aanwezig is, bestaat de kans dat Gefitinib/erlotinib therapie zelfs ongunstiger kan uitpakken dan de gewone chemotherapie. Voor mutaties in het EGFR gen wordt een mutatieanalyse gedaan op exon19, exon20 en exon21 en voor mutaties op het K-ras gen op exon1, al deze bevinden zich op chromosoom 7. De meest voorkomende EGFR mutaties zitten in exon19 (45%) en exon21 (40-45%), een klein gedeelte van de mutaties zitten op exon18 (5%) en exon20 (5%). Voor een volledig overzicht ziet figuur 7. Niet alle mutaties die voorkomen reageren op de Gefitinib/erlotinib therapie. De meeste mutaties die niet reageren op de Gefitinib/erlotinib therapie zitten op exon20, om deze rede is de exon20

5

Figuur 6. ALK-1 aankleuring op dunne darm weefsel(4)

Figuur 5 EGFR immunohistochemische scoring . a) score 0 b) score 1+ c) score 2+ d) score 3+

wel opgenomen in het protocol en exon18 niet. Als uit verdere testen blijkt dat een EGFR mutatie aanwezig zou moeten zijn wordt alsnog een exon18 mutatieanalyse aangevraagd.

Figuur 7 schematisch weergave van de verschillende EGFR mutaties in niet kleincellige longtumoren en hun gevoeligheid voor Gefitinib/erlotinib therapie. (1)

1.5 DISH

In Situ Hybridisatie (ISH) is een techniek waarbij je specifieke sequenties DNA(DISH) of mRNA (RISH) met behoud van morfologie kan zichtbaar maken. RISH wordt meestal toegepast voor de detectie van virussen indien RNA meer voorkomt dan DNA (bijv. het veel voorkomende EBER bij EBV geïnfecteerde cellen) of voor de lokalisatie van het mRNA van interesse in de cellen. DISH daarentegen wordt gebruikt om grove fouten, zoals translocaties, deleties en amplificaties van complete genen, in het DNA op te sporen. Dit wordt gedaan met behulp van probes. Probes bestaan uit kleine specifieke stukjes dubbelstrengs DNA die dezelfde nucleotidevolgorde (sequentie) hebben als het te detecteren stukje DNA. Deze probes zijn voorzien van een label om hybridisaties zichtbaar te maken. De label kan direct door fluorescentie (FISH) of indirect door een enzymatische reactie (CISH) zichtbaar worden gemaakt. Er zijn verschillende typen probes die ieder hun eigen hybridisatie- eigenschappen hebben, die gebaseerd zijn op de sterkte van de binding van de probe aan het DNA. Probes die sterk binden moeten stringenter gewassen worden na incubatie met probe. Stringent wassen wordt gedaan in een zoutoplossing bij een hoge temperatuur. Bij de zoutconcentratie geldt de regel hoe lager de zoutconcentratie hoe stringenter het wast, en bij de temperatuur geld de regel hoe hoger de wastemperatuur hoe stringenter. Een DISH kan worden gedaan op formaline gefixeerd, in paraffine ingebed weefsel waarvan coupes van 5μm dik zijn gesneden, ook kan het toegepast worden op cytologisch materiaal.

6

1.5.1 CISH Om het aantal genkopieën per cel te bepaling is een EGFR DNA In Situ Hybridisatie nodig Binnen de EGFR procedure wordt gebruik gemaakt van chromogene ISH (CISH). Dit omdat CISH een aantal voordelen heeft ten opzichte van FISH. Het belangrijkste voordeel is dat de coupes te archiveren zijn, dit omdat het signaal niet uitdooft na verloop van tijd, waardoor later nog terug kan worden gekeken naar de coupe. Een ander voordeel is dat de morfologie van de cellen kan worden beoordeeld onder een normale lichtmicroscoop. Een ander voordeel is dat er geen autofluorecentie kan optreden die het signaal kan verstoren. Het laatste voordeel is dat CISH gevoeliger is dan FICH, dit omdat er bij de CISH versterkingsstappen zijn waardoor het signaal sterker zichtbaar kan worden gemaakt. De EGFR CISH probe bestaat uit kleine stukjes specifiek Digoxigenin gelabeld DNA waaruit alle repeterende sequenties zijn gehaald. De repeterende sequenties zijn eruit gehaald om aspecifieke hybridisatie op andere chromosomen/genen te voorkomen. CISH probes binden sterker aan homologe DNA sequenties dan conventionele DNA probes.Bij de beoordeling wordt er gekeken naar het aantal stippen (hybridisaties) per kern, zie figuur 8. Deze worden onderverdeeld in: Normaal 1-2 stippenPolysomie 3-5 stippenLichte amplificatie 6-10 stippenAmplificatie >10 stippen of clusters

Hierbij worden normaal en polysomie niet beschouwd als amplificatie.De resultaten van de CISH worden vergeleken met de immunohistochemische kleuringen en de mutatieanalyse. Aan de hand hiervan zal worden besloten of de patiënten met Gefitinib/erlotinib behandeld TKR gaan worden.

7

Figuur 8. Beoordeling EGFR CISH. A. geen amplificatie B. polysomie C. lichte amplificatie D. Amplificatie/clustervorming

1.5.2 Centromeer probe

Centromeer probes zijn probes die gericht zijn tegen het centromeer regio. Met behulp van deze probes kan worden uitgevonden hoeveel kopieën van een chromosoom aanwezig zijn.Deze probes binden minder sterk aan het DNA dan een CISH probe. Dit komt doordat dit gedeelte van het chromosoom voornamelijk bestaat uit repeterende gedeeltes. Deze bevatten veel A-T verbindingen(GGAAT, AATGN), deze zijn minder sterk dan de G-C bindingen. Hierdoor kunnen deze er eerder afspoelen. Hierdoor was je deze probes minder stringent dan een normale CISH probe. Met behulp van een centromeer probe kan zichtbaar gemaakt worden hoeveel chromosomen in de cel aanwezig zijn.

1.6 Doel en opzet van het onderzoek

Momenteel wordt een CISH voorschrift gebruikt voor formaline gefixeerd en paraffine ingebed patiënten materiaal, dat nog niet optimaal is voor al het materiaal. Regelmatig is de morfologie te slecht geworden om nog te beoordelen en de signalen zijn zwak of niet zichtbaar of bevat teveel aspecifieke achtergrond.

Het is belangrijk om het CISH protocol te optimaliseren zodat aan de hand hiervan kan worden besloten om de therapie te starten of aan te passen. Bij dit optimaliseren wordt gebruik gemaakt van: een long adenocarcinoom als doeltumor met een open chromatine patroon, een long plaveiselcelcarcinoom als doeltumor met een dicht chromatinepatroon en een tonsil als milde fixatie en een dicht chromatinepatroon. Het chomatinepatoon is belangrijk omdat het bepaald hoe toegankelijk het DNA is voor de probe. Hoe dichter het chomatinepatroon hoe minder toegankelijk het DNA wordt voor de probe. De tonsil wordt meergenomen als voorbeeld van een biopt die milder gefixeerd worden dan grotere stukken weefsel. Voor het optimaliseren worden verschillende manieren van voorbehandelen getest, hierbij wordt gevarieerd met de manier van koken en gebruik van digestiemiddel. Bij de beoordeling wordt gekeken welke methode het beste signaal geeft en waarbij de morfologie ook nog goed te beoordelen is. Verder wordt ook gevarieerd in detectiemethode om zo te kijken welke het sterkste signaal geeft zonder teveel achtergrondkleuring. Als het protocol voor paraffinecoupes optimaal is zal de EGFR CISH worden uitgevoerd op de te onderzoeken patiëntengroep.

De resultaten van de CISH zullen worden vergeleken met de resultaten van de EGFR eiwit kleuring en de mutatieanalyse met behulp van een zelf ontworpen database. Hierbij is gekozen voor een Access database, omdat hierbij geen dubbele records kunnen voorkomen en dat het hierbij gemakkelijker is om gegevens in te voeren en later te analyseren.

Tevens zal worden getest of EGFR CISH kan worden gedaan op cytologisch materiaal. Als testmateriaal wordt gebruik gemaakt van een A431 cellijn. De A431 cellijn is een humane plaveiselcelcarcinoom van de huid. De A431 cellijn heeft een EGFR mutatie die voor een amplificatie zorgt en is hierdoor een goede positieve controle. Het gebruik van cytologisch materiaal heeft al voordeel dat het nemen van puncties minder belastend is voor de patiënt dan het nemen van biopten. Verder wordt onderzocht of de EGFR immunokleuring van het protocol werkt op cytologisch materiaal. De mutatieanalyse zal niet optimaal werken op cytologisch materiaal doordat je niet kunt bepalen welke cellen je wilt gebruiken, maar de volledige suspensie moet gebruiken waar ook normale cellen in voorkomen. Hierdoor zal in veel gevallen het percentage tumorcellen laag zijn (< 50%)

8

2 Materiaal en methode.

2.1 1 EGFR procedureDe EGFR procedure wordt door de patholoog aangevraagd waarna deze wordt gestart.Als de procedure is gestart worden een reeks van coupes gesneden van verschillende diktes en geplakt op glaasjes. Voor en na het snijden van de reeks worden coupes opgevangen voor een standaard HE kleuring. De patholoog bepaald welke gedeelte van het weefsel gebruikt moet worden voor de mutatieanalyse en bepaald het percentage tumorcellen. De twee HE coupes worden gebruikt om te kunnen kijken waar de tumor zit in de coupe en of in beide nog tumorcellen zitten. Dit is belangrijk omdat het anders mogelijk is dat de uitslagen vals negatief zijn en de patholoog bepaald de locatie in de coupe voor mutatie analyse. Voor de reeks bestaat uit de volgende coupes:

Eerst worden 4 coupes van 3μm gesneden die gebruikt worden voor de TTF-1, EGFR en ALK-1 kleuringen. Bij deze dikte wordt voorkomen dat de coupes uit meerdere cellagen bestaan waardoor het signaal of achtergrond te sterk of onduidelijk wordt om te bepalen welke cel aankleurt.

Hierna worden 4 coupes van 10μm gesneden die gebruikt worden voor DNA extractie ten behoeve van de EGFR en K-ras mutatieanalyse. Coupes van 10μm bestaan uit ongeveer 2 cellagen, hierdoor zitten in 1 coupe meer tumorcellen en is de opbrengst per coupe hoger. Dikkere coupes zijn niet mogelijk doordat de coupes dan tijdens het snijden gaan brokkelen.

Waarna nog 6 coupes van 5μm gesneden worden. Coupes van 5μm bestaan uit ongeveer 1 cellaag. Dit zorgt ervoor dat de cellen in de coupes bijna de gehele kern bevatten en voorkomt het dat een te groot gedeelte van het DNA mist waardoor deze vals negatief kan worden voor de DNA In Situ Hybridisatie.

2.2 ImmunohistochemieBij de immunohistochemie worden de TTF-1, EGFR, ALK-1 kleuring uitgevoerd. Hierbij wordt gebruik gemaakt van het PowerVision-HRP Detection System van Immunologic. PowerVision is een tweestaps detectiemethode waarmee antigenen in paraffinecoupes van weefsels zichtbaar gemaakt kunnen worden. Eerst worden de coupes gedeparaffineerd via alcohol naar water, endogene peroxidase geremd en voorbehandeld om de antigenen beter bereikbaar te maken voor het antilichaam. Nu wordt het weefsel geïncubeerd met het specifiek primaire antilichaam (TTF-1, EGFR of ALK-1). Na spoelen wordt het weefsel geïncubeerd met Post-antibody blocking, dit is een antilichaam dat bind aan het primaire antilichaam als een tussenstap. Waarna het wordt geïncubeerd met PowerVision-HRP complex. Dit zijn dextraansulfaatmoleculen met daaraan gekoppelde antilichamen en peroxidase. Deze dextraan tussen stap geeft een veelvoudige versterking van het signaal. De dextraansulfaatmoleculen binden aan de Post-antibody blocking antilichamen. De visualisatie vindt plaats door

9

Figuur 9. schematische weergave van dePowerVision Detection System.

toevoeging van substraat/chromogeen-oplossing (DAB). (figuur 9) Voor het volledige protocol zie bijlage 1.

Deze immunologisch kleuringen alleen geven niet aan of er een EGFR mutatie met amplificatie heeft, maar heeft een ondersteunende rol. Om deze rede worden er nog andere testen gedaan zoals de EGFR en K-ras mutatieanalyse.

2.3 MutatieanalyseMet behulp van een mutatieanalyse kunnen eventuele mutaties in het DNA worden opgespoord. Bij de EGFR mutatieanalyse worden zowel een analyse gedaan op het EGFR gen als op het K-ras gen.De mutatieanalyse wordt uitgevoerd op paraffine gefixeerd materiaal waarvan coupes van 10μm worden gesneden. Aan de hand van de HE- kleuring en/of het aanvraagformulier wordt bepaald welk gedeelte van de coupe wordt gebruikt voor de mutatieanalyse. Dit gedeelte wordt verwijderd en gebruikt voor de mutatieanalyse. De eerste stap van de procedure is het behandelen van het weefsel met een mix van Proteïnase K, TrisHCl en SDS. Deze stap verwijdert de DNases uit het weefsel. Na deze stap wordt door verhitting het paraffine uit het weefsel verwijderd en de cellen in suspensie gebracht. Deze suspensie wordt gelyseerd met lysisbuffer zodat de cellen kapot gaan en het DNA vrijkomt. Daarna wordt een genestelde PCR gedaan die bestaat uit twee PCR reacties. De eerste wordt gedaan met primers die zich buiten het doel DNA bevinden. De tweede wordt gedaan met primers die specifiek het doel DNA vermeerderd (figuur 10). Hierdoor wordt het monster zeer zuiver. Dit wordt afzonderlijk gedaan voor alle exonen.Hierop volgt een PCR sequence-reactie. Deze maakt het mogelijk om de specifieke aminozuur volgorde in de exonen zichtbaar te maken. Door deze te vergelijken met de aminozuur volgorde van het wildtype EGFR gen kunnen mutaties worden vastgesteld. Van veel mutaties is bekend welk effect de Gefitinib/erlotinib therapie op de tumor kan hebben. Waardoor men eenvoudiger kan besluiten of de therapie gestart kan worden. Hoe hoger de percentage tumorcellen in de begincoupe hoe groter de kans is dat een eventuele mutatie wordt gevonden. Als het percentage lager dan 50% is, is de kans groter dat mutaties niet worden gevonden. Als dit het geval is moeten de mutaties met behulp van andere technieken worden gedetecteerd. Zoals in de VUmc met behulp van CISH. De mutatieanalyse op cytologisch materiaal gebeurt bijna op dezelfde manier. Alleen kunnen hierbij niet de tumorcellen worden geselecteerd van de rest van de cellen.

2.4 CISHBinnen de EGFR procedure wordt gebruik gemaakt van de CISH.De EGFR CISH probe bestaat uit kleine stukjes specifiek Digoxigenin gelabeld DNA waaruit alle repeterende sequenties zijn gehaald. De repeterende sequenties zijn eruit gehaald om aspecifieke hybridisatie te voorkomen.

10

Figuur 10 schematisch weergave van de genesteldePCR-reactie.

Bij de CISH moeten de paraffine coupes eerst gedeparaffineerd worden, waarna zowel de paraffine coupes als de cytologische preparaten worden gekookt (b.v. >95°C bij paraffinecoupes in kookbuffer) en gedigesteerd met een mild digestiemiddel om zo het DNA toegankelijk te maken. Tijdens het hybridiseren zal de gelabelde EGFR-CISH-probe zich binden aan gedeelte van DNA dat complementair is aan het DNA van de probe. Hierna wordt de aspecifieke gebonden probe weggespoeld door het weefsel stringent te wassen. Vervolgens wordt het weefsel geïncubeerd met muis-anti-digoxigenin of muis-anti-biotin dat bind aan het label, waarna het geïncubeerd wordt door anti-muis-HRP- polymeer (polymeer met daaraan peroxidase) welke zich bindt aan het muis-anti-digoxigenin. Waarna het ontwikkeld wordt met DAB chromogeen, licht tegengekleurd met Haematoxyline en afgedekt (figuur 11) Hierna worden de coupes beoordeeld met behulp van een lichtmicroscoop. Bij de beoordeling wordt er gekeken naar het aantal stippen (hybridisaties) per kern. Bij normale cellen worden 1-2 stippen per cel gevonden, bij tumorcellen met een verhoogd aantal chromosomen (polysomie) worden er 3-5 stippen per cel gevonden. In beide gevallen wordt er geen amplificatie gevonden. Bij lichte amplificatie worden er 6-10 stippen per cel gevonden en bij amplificatie worden er meer dan 10 stippen of grote genclusters gevonden per cel. Bij beide is er amplificatie. Het resultaat wordt vergeleken met de immunohistochemische kleuringen en de mutatieanalyse, aan de hand hiervan wordt beoordeeld welke mensen worden behandeld met Gefitinib/erlotinib en welke niet.

Bij de optimalisatie wordt begonnen met het huidige protocol van het VU medisch Centrum (VUmc), zie bijlage 1. Het protocol wordt getest op 3 soorten weefsel. Twee typen longcarcinomen, een adenocarcinoom voor licht gefixeerd materiaal met open chromatine patroon en een plaveiselcelcarcinoom voor sterk gefixeerd materiaal met gesloten chromatine patroon, en een tonsil voor licht gefixeerd materiaal met een gesloten chomatinepatroon. Van elk weefsel wordt het representatieve gedeelte uitgekozen, uit de coupe gesneden en alle drie op een objectglaasje geplakt zodat ze alle drie onder een dekglaasje van 24x40 mm passen. Eerst wordt de testcoupe gekleurd met behulp van het VUmc protocol. In het VUmc protocol wordt gebruik gemaakt van de Zymed® probe. Aan de hand van de resultaten van deze kleuring wordt besloten welke variaties gedaan worden. Mocht blijken dat het VU protocol niet optimaliseren is zal worden overgegaan op het protocol van Zymed® (bijlage 2). Ook kan het zijn dat de probe van een andere firma uitgetest zal worden (bijlage 3).De verschillende variaties die per onderdeel getest kunnen worden zijn te zien in tabel 1.

Tabel 1: lijst van mogelijke variaties in het EGFR CISH paraffine protocolKook-vloeistof

Kook-methode

Digestiemiddel Digestie-tijd

Denatureren Probe wassen detectie Detectie methode

Tris/EDTA pH9

Magnetron Pepsine 0,01 /0,05 /0,1% bij 37ºC

0, 2, 5, 10, 20, 30, 40 minuten

10min. 80ºC Zymed probe

75-80ºC 5 min

Sigma Muis-anti-digoxigenin

PV+

Zymed kook-buffer

Waterbad Zymed digestie-middel KT of 37ºC

5min. 95ºC Zytovision probe

70 ºC5 min

Zymed Muis-anti-digoxigenin

EV

Zytovision kook-buffer

bekerglas Zytovision digestie-middel KT of 37ºC

Zytovision Muis-anti-digoxigenin

11

Figuur 11. schematische weergave van de EGFR CISH detectie

Tevens wordt onderzocht of het mogelijk is om de EGFR procedure uit te voeren op cytologisch materiaal. Hiervoor worden cytologische preparaten gemaakt volgen drie verschillende methodes, de TTF-1 methode (bijlage 4), Pelillycet (bijlage 5) en de ThinPrep methode (bijlage 6). Als materiaal voor de testen wordt de cellijn A431 gebruikt waarvan bekend is dat deze een EGFR mutatie en amplificatie bevat. De variaties die gestest kunnen worden zijn te zien in tabel 2. Ook worden A431 cellen doorgevoerd en ingebed om de positieve controle te dienen.

Tabel 2: lijst van mogelijke variaties in het EGFR CISH cytologie protocolkookvloeistof Kookmethode Digestiemiddel digestietijd Probe detectieZymed kookvloeistof

Niet koken Zymed digestie-middel KT of 37ºC

0, 2, 5, 10 min Zymed probe Sigma Muis-anti-digoxigenin

Zytovision kookvloeistof

Waterbad Zytovision digestie-middel KT of 37ºC

Zytovision probe

Zymed Muis-anti-digoxigenin

2xSSC bekerglas Zytovision Muis-anti-digoxigenin

Het geoptimaliseerde EGFR CISH protocol wordt dan gebruikt om de EGFR CISH bepaling die nog open staan van het EGFR protocol uit te voeren. Deze worden beoordeeld op de morfologie, aankleuring en op de aanwezigheid van genamplificaties om zo de kwaliteit van de hybridisaties te bepalen. De gegevens worden ook gebruikt om de effectiviteit van het geoptimaliseerde protocol is. De resultaten worden vergeleken met de andere testen van het EGFR protocol. Hiervoor wordt een Access database gemaakt om alle gegevens te verzamelen. De database gaat bestaan uit verschillende tabellen die onderling verbonden worden. De tabellen worden onderverdeeld in verschillende onderdelen, een hoofdtabel met de basis gegevens, een tabel met de immunohistochemische gegevens, een met de mutatieanalyse gegevens en een tabel met de EGFR CISH gegevens (figuur 12).

12Figuur 12 Schematische weergave relaties in Access database

Hoofdtabel

3 Resultaten

3.1Optimalisatie EGFR CISH op paraffinemateriaalIn tabel 3 wordt aangegeven wat de verschillende symbolen betekenen die worden gebuikt in de tabellen 4 t/m 9.

Tabel 3. Betekenis van symbolen bij beoordelingen.Teken Signaal Morfologie Achtergrond - Geen Slecht Afwezig+- Zwak/ redelijk Redelijk Aanwezig+ Goed Goed ++ Zeer goed

3.1.1 Vumc protocol Het Vumc protocol, figuur 13 A, B en C, blijft bij alle geteste omstandigheden slechte signalen geven, alleen de tonsil geeft signaal bij de verschillende variaties. Dit signaal is alleen niet homogeen over de coupe verdeeld. De adenocarcinoom en de plaveiselcel-carcinoom gaven geen signaal. Bij een langere digestietijd wordt de morfologie slechter waardoor de signalen niet meer te beoordelen zijn. Een ander groot probleem is dat bij de adenocarcinoom altijd achtergrond is, ook in de negatieve controle. Incubatie met Normaal geit serum (NGS) verlaagd de achtergrond niet (tabel 4). Doordat het VUmc protocol altijd achtergrond en weinig specifieke signalen geeft is het geen ideaal protocol voor longweefsel. Daarom is het Zymed protocol ook uitgetest.

Tabel 4. resultaten van de geteste variaties bij het VUmc protocol. varianten tonsil adenocarcinoom plaveiselcelcarcinoom

signaal morf achter signaal morf achter signaal morf achterStandaard =0,1% pepsine 37° hete plaat

- + + +- + + +- + +

0,01% pepsine 37° waterbad - +- + - +- + - +- -0,1% pepsine 37° waterbad - +- + - +- + - +- -7,5 min. Digestie 80° denaturatie +- + - - + + - + -15 min. Digestie 80° denaturatie +- + - - + + - + -30 min. Digestie 80° denaturatie +- - - - - + - - -7,5 min. Digestie 95° denaturatie + /+- + - - + + - + -15 min. Digestie 95° denaturatie +/+- + - - + + - + -30 min. Digestie 95° denaturatie +/+- - - - - + - - -Zymed voorbeh. NGS remming +- + - +- + + - + -

3.1.2 Zymed protocol Het Zymed protocol gaf betere resultaten. De tonsil is onder alle omstandigheden te hybridiseren. De adenocarcinoom kan gehybridiseerd worden als de coupe werd gekookt in een bekerglas in plaats van een waterbad. De plaveiselcelcarcinoom is zeer moeilijk te hybridiseren, alleen bij de verlaging van de temperatuur bij het stringent wassen kan een zwak signaal gedetecteerd worden. Ondanks het minder stringent wassen zijn geen kruishybridiaties ontstaan. Het gebruik van de PV+ voor de detectie versterkt het signaal niet, maar zorgt alleen voor het ontstaan van achtergrond. Het meest optimale Zymed protocol, figuur 13 D, E en F, is het koken in een bekerglas waarna het 10 tot 15 minuten gedigesteerd wordt en de coupe stringent gewassen wordt bij 70°C (tabel 5). Om de rede te achterhalen van de moeizame hybridisatie wordt het protocol ook uitgetest met behulp van de chromosoom 1 probe

13

Tabel 5 resultaten van de geteste variaties bij het Zymed protocol varianten tonsil adenocarcinoom plaveiselcelcarcinoom

signaal morf achter Signaal morf achter signaal morf achter5min digestie + + - - + - - + -

10 min digestie + + - - + - - + -10 min digestie sigma anti digoxgenin + + - - + - - + -10 min digestie pv+ + + - - + - - + -15 min digestie pv+ + + - - + - - + -Bekerglas 10 min. digestie + + - + + - - + -Bekerglas 10 min digestie pv+ + + + - + + - + +Bekerglas 20 min digestie +- + - +- + - - + -10 min digestie stringent wassen 70° + + - + + - +- + -15 min digestie stringent wassen 70° + + - + + - +- + -

De chromosoom 1 probe geeft goede tot sterke signalen bij alle variaties, waarbij alleen achtergrond ontstaat bij het gebruik van PV+. Hieruit kan worden vastgesteld dat de voorbehandeling optimaal is.(Tabel 6)

Tabel 6 resultaten van de geteste variaties bij het Zymed protocol en de chromosoom 1 probevarianten tonsil adenocarcinoom plaveiselcelcarcinoom

signaal morf achter Signaal morf achter signaal morf achter5 min 0,01% pepsine ++ + - ++ + - ++ + -

5 min 0,1%pepsine ++ + - ++ + - ++ + -10 min Zymed ++ + - ++ + - ++ + -7,5 min digestie 0,05 pepsine + + - + + - + + -15 min digestie 0,05% pepsine + + - + + - + + -10 min Zymed pv+ + + - + + + + + +

Uit de resultaten van tabel 4 en 5 blijkt dat het weefsel wel hybridiseerbaar is en denken we dat de EGFR CISH probe van Zymed niet goed is. Daarom hebben we 10 testcoupes opgestuurd naar Zymed voor consult en zijn we de EGFR CISH probe gaan testen wan een andere firma (Zytovision).

3.1.3 Zymed en Zytovision vergelijking.In tabel 7 zijn de resultaten te zien van de Zymed en Zytovision vergelijkende testen. Hierbij zijn de probes en voorbehandeling verwisseld tussen de firma’s. Hieruit kan worden afgelezen dat de Zytovision probe het beste signaal geeft, ook op de plaveiselcelcarcinoom, en dat de Zymed probe suboptimaal is. Hierdoor zijn we verder gegaan met Zytovision protocol.

Tabel 7 resultaten van de Zytovision en Zymed protocol vergelijkingvarianten tonsil adenocarcinoom plaveiselcelcarcinoom

signaal morf achter Signaal morf achter signaal morf achterZymed detectie – Zymed probe + + - +- + - +- + -

Zymed detectie – Zytovision probe ++ + = ++ + - + + -Zytovision detectie –Zymed probe + + - - + - - + -Zytovision detectie – Zytovision probe

++ + - ++ + - + + -

14

3.1.4 Zytovision protocolIn tabel 8 is te zien dat het Zytovision protocol het beste werkt door het koken in een waterbad en de digestietijd 10 minuten is, figuur 13 G, H en I. Deze zal worden gebruikt bij de bepalingen op patiëntmateriaal. Bij 5 minuten digestie is het signaal bij de plaveisel-celcarcinoom minder sterk. Het koken in een bekerglas zorgt ervoor dat de morfologie van de adenocarcinoom minder wordt. Om de digestietijd bij biopten vast te stellen is er een random biopt genomen en 5 en 10 minuten gedigesteerd (tabel 9). Hieruit blijkt dat het signaal bij beide sterk is, maar dat bij langere digestie de morfologie duidelijk minder word. Biopten worden om deze rede 5 minuten gedigesteerd bij de bepalingen op patiëntmateriaal.

Tabel 8 resultaten van de geteste variaties bij het Zytovision protocolvarianten tonsil adenocarcinoom plaveiselcelcarcinoom

signaal morf achter Signaal morf achter signaal morf achter5 min digestie ++ + - +- + - +- + -

10 min digestie ++ + - ++ + - + + -Bekerglas 5 min digestie ++ + - ++ +- - +- + -Bekerglas 10 min digestie ++ + - ++ +- - + + -

Tabel 9 resultaten van de geteste variaties bij het Zymed protocol op bioptentonsil

signaal morf achter5 min digestie ++ + -10 min digestie ++ +- -

Figuur 13. Uitlagen EGFR CISH optimalisatie VUmc protocol: A. adenocarcinoom B. plaveiselcelcarcinoom C. tonsil. Optimaal Zymed protocol D. adenocarcinoom E. plaveiselcelcarcinoom F tonsil. Optimaal Zytovision protocol G. adenocarcinoom H. plaveiselcelcarcinoom I. tonsil

15

3.2Optimalisatie EGFR CISH op cytologisch materiaal

In tabel 10 is te zien dat de peliLyset en de Thinprep een geen tot zwak signaal geven met enige achtergrond. Door de slecht resultaten zijn we hiermee niet verder gegaan.

Tabel 10 uitslagen peliLyset en Thinprep

Digestie peliLyset signaal morfologie achtergrond1 uur 2x SSC 37°C 2 min digestie zwak goed licht2 min digestie kt Geen Goed lichtDigestie Thinprep1 uur 2x SSC 37°C 2 min digestie Redelijk Redelijk Licht2 min digestie kt Redelijk goed licht

De TTF-1 gefixeerde preparaten zijn goed te hybridiseren als deze 1 dag zijn gefixeerd. Bij 2 dagen fixatie is al te zien dat deze duidelijk minder goed te hybridiseren zijn, zie tabel 11.

Tabel 11. resultaten ttf1 1dag gefixeerd

Digestie 1 dag fixatie signaal morfologie achtergrond0 min kt Geen Goed Geen1 min kt Goed Goed Licht2 min kt Goed Redelijk Licht Digestie 2 dagen fixatie0 min kt Geen Goed Geen1 min kt Zwak Goed Licht 2 min kt Zwak Redelijk Licht

Hierna zijn de 4 dagen gefixeerde preparaten getest, deze gaven bij geen van de geteste condities een signaal, zie tabel 12. Doordat we geen preparaten meer hebben zijn we doorgegaan met de 3 dagen gefixeerde preparaten

digestie signaal morfologie achtergrond2 min kt Geen Goed Geen2 min 37°C Geen Goed Licht10 min kt Geen Redelijk Licht

Tabel 12 resultaten 4 dagen gefixeerd

De 3 dagen gefixeerde preparaten gaven bij alle digestietijden een signaal, zie tabel 13. Hieruit is op te maken dat de preparaten langer gedigesteerd moeten worden hoe langer ze gefixeerd zijn.

Tabel 13 resultaten 3 dagen gefixeerd

Digestie signaal morfologie achtergrond10 min kt Redelijk Goed Geen10 min 37°C Sterk Goed Licht20 min kt Sterk Redelijk Licht

De EGFR immunokleuring is ook uitgetest op cytologisch materiaal. Deze was gefixeerd op de TTF1 methode en geïncubeerd op dezelfde methode als de paraffine coupes en zichtbaar gemaakt met CEA. Deze was sterk positief.

16

3.3 Patiënten materiaalBij de beoordeling van het patiënt materiaal hebben we 51 cases getest. 10 van de beoordeelde patiënten,5.1%, waren positief voor de EGFR mutatieanalyse en/of EGFR CISH. Vier hiervan waren positief voor zowel de EGFR mutatieanalyse als de EGFR CISH, deze waren altijd TTF1 positief en hadden indien getest een positieve EGFR immunokleuring. Dit is in overeenstemming met de verwachtingen. Vijf patiënten hadden een positieve mutatieanalyse, maar een negatieve CISH. In 1 geval had deze helemaal geen signaal, dus zou positief kunnen zijn. 3 van deze 5 patiënten had een positieve TTF1, 1 een negatieve en was deze bij 1 niet getest. De EGFR immunokleuring was in alle gevallen positief, behalve bij 1 die niet getest was. Deze uitkomsten zijn grotendeels in overeenstemming met verwachtingen, behalve bij 1 patiënt die negatief is voor de TTF1 kleuring.Twee patiënten hadden een negatieve mutatieanalyse, maar een positieve CISH. Deze waren negatief voor de TTF1 kleuring en 1 ervan was positief bij de EGFR immunokleuring, de ander was negatief. Dit is dus niet in overeenstemming met de verwachtingen.9 patiënten hadden een K-ras mutatie, geen van deze had een EGFR mutatie wat in overeenstemming is met de verwachtingen.Verder waren er 9 patiënten, 4,59% , die geen signaal kregen bij de EGFR CISH. Hiervan is dus niet bekent of deze een mutatie kunnen bevatten. Voor een volledig overzicht zie bijlage 8

Tabel 7. Samenvatting van de resultaten van de EGFR CISH bepaling tezamen met de andere gegevens van het EGFR protocol. Type tumor Adeno-

carcinoomPlaveiselcel-carcinoom

Kleincellig carcinoom

Grootcellig carcinoom

Totaal N= 33 5 2 11TTF1 pos N= 25 - 1 5EGFR imh 1+ 6 - 1 4

2+ 7 2 - 13+ 8 1 - 3

mutatieanalyse EGFR exon19 5 - - -EGFR exon20 1 - - -EGFR exon21 1 - - 1K-ras exon1 8 - - 1

EGFR CISH Cluster/ amplificatie 3 - - 2Lichte amplificatie 1 1 - -polysomy 3 1 - 5normaal 13 2 2 2Geen signaal 5 1 - 2

17

4 Conclusie en discussieUit deze optimalisatie is gebleken dat de EGFR probe van Zymed niet optimaal is om het EGFR gen in het DNA aan te kleuren is hierdoor beter niet als standaard gebruikt dient te worden. De EGFR probe van Zymed is naar grote waarschijnlijkheid niet goed gelabeld waardoor deze zeer weinig label bevat en dus weinig aankleuring geeft. De firma heeft recent te kennen gegeven dat de probe inderdaad suboptimaal is. De Zytovision probe daarentegen kleurt goed aan in de meeste omstandigheden. De optimale digestietijd is voor weefsels 10 minuten en voor biopten 5 minuten. Uit het kleuren van aanvragen is gebleken dat enkele weefsels moeilijk aan te kleuren zijn dit kan komen doordat deze te lang gefixeerd zijn waardoor de probe niet meer bij het DNA kan komen. Dit kon worden opmerken bij de EGFR CISH op cytologie. De 1 en 2 dagen ttf1 fixeren waren nog goed zichtbaar te maken met hooguit 5 min digesteren en bij 3 dagen bij 20 minuten. De 4 dagen moesten waarschijnlijk nog langer digesteren. Hieruit kan worden vastgesteld dat hoe langer het gefixeerd is hoe moeilijker het is om het DNA toegankelijker te maken. Doordat de EGFR immunokleuring nu ook op cytologisch materiaal kan, is het mogelijk om de EGFR procedure ook uit te voeren op cytologisch materiaal. In de toekomst zou het mogelijk zijn om te testen of de slechte EGFR CISH resultaten bij sommige patiënten komt doordat deze een langere tijd gefixeerd hebben. Ook zou kunnen worden getest of deze nummers Met behulp van de FISH kan worden gedaan omdat deze moleculen kleiner zijn en makkelijker de cel binnen kunnen dringen. Ook kan worden gekeken of de EGFR CISH op peliLyset en Thinprep gefixeerde cellen ook geoptimaliseerd kan worden.

18

5. Literatuur verwijzingen

1. Sreenath V. Sharma*, Daphne W. Bell*‡, Jeffrey Settleman* and Daniel A. Haber*, Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer, Nature reviews. 2007 3:

Blz. 169-181 2. Kris Novak, PhD, Conference Report – Protein Kinase Inhibitors in Cancer Treatment:

Mixing and Matching?, MedGenMed. 2004; 6(2): 253. http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:EGFR_signaling_pathway.png4. http://www.arraybiopharma.com/_documents/Publication/PubAttachment127.pdf

19

Bijlage 1 EGFR CISH Methode VUmc A-specifieke achtergrond in de kern ontstaat bij overdigestie.Powervision Plus i.p.v. Envision: sterkere achtergrond

Stap Voorbewerking Tijd 1. Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken bij 60C2. Coupes deparaffineren 2x 10 min3. Spoel met alcohol absoluut 2x 10 min4. Spoel met Leidingwater5. Kook met 1 mM EDTA /TRIS pH9 in een magnetron 10 min6. Laat de coupes afkoelen en was daarna de coupes met leidingwater 2x 3 min7. Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met 0,1%

pepsine/0,2N HCl bij 37C op een stoof van 37°C, 100µl/coupe onder dekglaasjes en afgedekt door kap

5 min

8. Was de coupes met leidingwater 3x 2 min9. Dehydreer de coupes met Alc. 70% -85% -95% -100%10. Droog de coupes aan de lucht

Denatureren en hybridiseren11. Breng een druppel probe op een dekglaasje en dek de coupe af

Sluit de randen af met rubbercement 10µl voor een glaasje van 22x22mm 15µl voor een glaasje van 24x32mm

12. Denatureer bij 80C op een hete plaat, afgedekt met een kap 10 min13. Plaats de coupes in een vochtige bak bij 37C 16-24 uur

Stringent wassen14. Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een

cuvet met 0,5xSSC bij kamertemperatuur15. Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80C in waterbad

Verhoog voor elke coupe meer de temperatuur met 1C tot 80°C5 min

16. Was de coupes met PBS/ 0,05% Tween 20 bij kamer temperatuur 3x 2 minDetectie

17. Rem endogene peroxidase met 3%H2O2/PBS 10 min18. Spoel de coupes goed met PBS 10 min19. Incubeer met Muis anti-Digoxin (Sigma) 1:100 **) 60 min20. Was met PBS/ 0,05% Tween 20 2x 3 min21. Incubeer met EnvisionHRP Dako 30 min22. Was met PBS/ 0,05% Tween 20 2x 3 min23. DAB Envision 10 min24. Spoel met leidingwater25. Kleur tegen met Haematoxylin 30 sec26. Spoel met leidingwater27. Dehydreer in oplopende alcohol reeks 28. Xyleen29. Afdekken

20

Bijlage 2 Zymed EGFR CISH protocolTabel 3

Stap Voorbewerking Tijd1 Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken op hete plaat bij

65°C

2 Coupes deparaffineren met xyleen 2x 10 min3 Spoelen met alcohol absoluut 2x 10 min4 Spoel in leidingwater5 Kook met voorbehandings-vloeistof in een waterbad bij ten minste 95°C 15 min6 Was de coupes in leidingwater 2x 3min

7 *) Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met digestiemiddel bij KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes

10 min

*)8 Was de coupes met leidingwater 3x 2min9 Dehydreer met alcohol absoluut10 Droog de coupes aan de lucht

Denatureren en hybridiseren11 Breng een druppel EGFR CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af.

10μl voor een glaasje van 22x22mm15μl voor een glaasje van 24x32mm Sluit de randen af met rubbercement

12 Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min13 Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24 uur

Stringent wassen14 Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een cuvet

met 0,5xSSC bij kamertemperatuur

15 Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C

5 min

16 Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2minDetectie

17 Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min18 Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min19 Incubeer met caseïne blocking oplossing bij KT 10 min20 Afgieten van caseïne blocking oplossing21 Incubeer met muis-anti-digoxigenin bij KT 30 min22 Was met PBS/tween 2x 3min23 Incubeer met anti-muis-HRP polymeer bij KT 30 min24 Was met PBS/tween 2x3min25 Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min26 Spoel met leidingwater 2min27 Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec28 Spoel met leidingwater29 Dehydreer met alcohol absoluut30 Xyleen31 Afdekken

21

Bijlage 3 Zytovision EGFR CISH protocol

Stap Voorbewerking Tijd32 Coupes plakken op Superfrost glaasjes en 2-4 uur bakken op hete plaat bij

65°C

33 Coupes deparaffineren met xyleen 2x 10 min34 Spoelen met alcohol absoluut 2x 10 min35 Spoel in leidingwater36 Kook met voorbehandings-vloeistof in een waterbad bij ten minste 95°C 15 min37 Was de coupes in leidingwater 2x 3min

38 *) Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met digestiemiddel bij KT, 100μl/coupe onder dekglaasjes

10 min

*)39 Was de coupes met leidingwater 3x 2min40 Dehydreer met alcohol absoluut41 Droog de coupes aan de lucht

Denatureren en hybridiseren42 Breng een druppel CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af.

10μl voor een glaasje van 22x22mm15μl voor een glaasje van 24x32mm Sluit de randen af met rubbercement

43 Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min44 Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24 uur

Stringent wassen45 Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een cuvet

met 0,5xSSC bij kamertemperatuur

46 Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C

5 min

47 Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2minDetectie

48 Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min49 Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min50 Incubeer met caseïne blocking oplossing bij KT 10 min51 Afgieten van caseïne blocking oplossing52 Incubeer met muis-anti-digoxigenin bij KT 30 min53 Was met PBS/tween 2x 3min54 Incubeer met anti-muis-HRP polymeer bij KT 30 min55 Was met PBS/tween 2x3min56 Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min57 Spoel met leidingwater 2min58 Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec59 Spoel met leidingwater60 Dehydreer met alcohol absoluut61 Xyleen62 Afdekken

*) Standaard is 10 minuten, Biopten 5 minuten

22

Bijlage 4 TTF-1 methode

Verdun de celsuspentie tot de gewenste verdunning neem hiervan 100 μl celsuspentie en maak er een cytospin van laat maximaal 5 minuten drogen aan de lucht zet ze in de formaline 4% en laat ze 1 tot max. 4 dagen fixeren in de koelkast vries de coupes hierna in voor langer gebruik

23

Bijlage 5 PeliLyset methode

neem 100 μl celsuspentie en pipetteer deze in een falcon buis zet deze buis in het pelilyset apparaat. in het apparaat worden er 3 vloeistoffen bij gespoten tot een volume van 1 ml

- cellysis-oplossing- celmach-oplossing- celfixatie-oplossing

neem van deze oplossing 100 μl en maar hier een cytospin van.

24

Bijlage 6 Thinprep methode

pippetteer de celsuspentie in de PreservCyt fixatievloeistof -zet de vloeistof in het Thinprep apparaat -maak gebruik van Thinprep glaasje het apparaat maak er preparaten van -laat drogen aan lucht vries in voor later gebruik

25

Bijlage 7 EGFR CISH cytologisch materiaal

Stap Voorbewerking Tijd1. Maak cytospins volgens de TTF1 procedure(zie BIJLAGE:IMHCYT00005/BL02) 2x 10 min2. Kook met 2XSSC in een waterbad bij 37°C 1 uur3. Was de coupes in leidingwater 2x 3min4. Laat de coupes zoveel mogelijk droogvallen en digesteer met middel bij KT,

100μl/coupe onder dekglaasjes 2 min

5. Was de coupes met leidingwater 3x 2min6. Dehydreer met alcohol absoluut7. Droog de coupes aan de lucht8. Denatureren en hybridiseren9. Breng een druppel CISH probe op een dekglaasje en dek de coupe af. Sluit de

randen af met rubbercement10μl voor een glaasje van 22x22mm

10. Denatureer bij 95°C op een hete plaat, afgedekt met een kap 5 min11. Plaats de coupes in een stoof bij 37°C 16-24 uur12. Stringent wassen13. Verwijder de cement en de afdekglaasjes en verzamel de coupes in een cuvet

met 0,5xSSC bij kamertemperatuur

14. Was de coupes in 0,5xSSC in een cuvet bij 75-80°C in een waterbad. Verhoog met elke coupe de temperatuur met 1°C tot 80°C

5 min

15. Was de coupes met PBS/tween bij kamertemperatuur 3x 2min16. Detectie17. Rem met endogene peroxidase met 3%H2O2/Methanol 10 min18. Spoel de coupes met PBS/tween 3x 2min19. Incubeer met blocking oplossing bij KT 10 min20. Afgieten van blocking oplossing21. Incubeer met species-anti-label bij KT 30 min22. Was met PBS/tween 2x 3min23. Incubeer met anti-label-HRP polymeer bij KT 30 min24. Was met PBS/tween 2x3min25. Incubeer met DAB oplossing bij KT 30 min26. Spoel met leidingwater 2min27. Kleur tegen met Heamatoxyline 5-10 sec28. Spoel met leidingwater29. Dehydreer met alcohol absoluut30. xyleen31. Afdekken

26

Bijlage 8 Volledig overzicht EGFR procedure patiënten.

27