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Eine RNA-Menagerie: miRNAs und anderekodierende und nichtkodierende RNAs
Peter N. Robinson
Institut für medizinische GenetikCharité Universitätsmedizin Berlin
13. Januar 2015
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 1 / 69
Outline
1 Eine RNA-Menagerie
2 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA
3 RNA-Struktur
4 RNA: Sekundärstruktur
5 miRNAs
6 Bioinformatik der miRNAs
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 2 / 69
Eine RNA-Menagerie
mRNA
tRNA
rRNA
snRNA
snoRNA
miRNA
XIST-RNA
piRNA
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 3 / 69
RNA vs. DNA (1): 1 vs 2 Stränge
DNA: I.d.R. doppelsträngig
RNA: I.d.R. einzelsträngig, oftSekundärstrukturen durchintramolekulareWasserstoffbrücken
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 4 / 69
Bildquelle: Wikipedia
RNA vs. DNA (2): Länge
DNA: Millionen vonBasenpaaren
RNA: ∼20 bis mehreretausend Nukleotide
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 5 / 69
Bildquelle: Wikipedia
RNA vs. DNA (3): Biochemie
Adenosinmonophosphat (Wikipedia)
RNA: Ribose
Desoxyadenosinmonophosphat (Wikipedia)
DNA: 2-Desoxyribose
Die zusätzliche 2-Hydroxylgruppe macht die RNA weniger stabil als dieDNA, da sie leichter hydrolysiert werden kann
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 6 / 69
RNA vs. DNA (4): Biochemie
Uridinmonophosphat (Wikipedia)
RNA: Uracil
Desoxythymidinmonophosphat (Wikipedia)
DNA: Thymin
In der RNA ist nicht Thymin (T) sondern Uracil (U) zu Adenin (A)komplementär
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 7 / 69
RNA vs. DNA (5): Biologische Rollen
DNAI Trägerin der Erbinformation.
RNA
Im Gegensatz zur DNA spieltdie Struktur der RNA beideren Funktion einewesentliche Rolle
3D-Struktur aus mehrerenkürzeren Helices, ähnlich wieProteine
Katalyse wie bei Enzyme
Zahlreiche unterschiedlicheFunktionen . . .
Wikipedia
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 8 / 69
Outline
1 Eine RNA-Menagerie
2 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA
3 RNA-Struktur
4 RNA: Sekundärstruktur
5 miRNAs
6 Bioinformatik der miRNAs
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 9 / 69
Eine RNA-MenagerieZahlreiche Klassen von RNAEs folgt zunächst ein Überblick über mRNA,tRNA,rRNA,snRNA,die Sie bereits kennen (sollten)
Abb. 9.4 Die Klassen der menschlichen RNA-Gene. Die beste Abschätzung (Mitte 2003) ergibt insgesamt 3000 menschliche RNA-Gene, die sich in verschiedene Klassen einteilen lassen. Aus technischen Gründen (siehe Text) ver-zichtete man für die Erstellung der menschlichen Rohsequenz auf die rRNA-Gencluster, sodass die hier angegebenen Zahlen anhand anderer Daten bestimmt wurden. Da sich RNA-Gene nur schwer identifizieren lassen (Abschnitt 8.3.5), sind die geschätzten Zahlen für einige kleine RNAs (beispielsweise miRNAs) möglicherweise deutlich zu niedrig. Die vorhergesagte Zahl von Antisense-RNA-Genen beruht auf Daten aus Collins et al. (2003) und wird von entsprechenden Untersuchungen bei der Maus gestützt (FANTOM Consortium and RIKEN Genome Exploration Research Group Pha-se I & II Team, 2002).
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mRNA
Wikipedia commons
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 11 / 69
mRNA: Spleißen
mRNA-Spleißen
Struktur einer reifen mRNA
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Wikipedia commons
tRNA
∼ 85 Nukleotide lang
Struktur etwa wie derBuchstabe ”L”
Drei-Nukleotid Anticodon aufder Spitze des L bindet ankomplementäres Codon inmRNA
Der ”Fuß” des L bindet an eineder 20 Aminosäuren
Anticodonarm: blau, Anticodon: schwarz (Wikipedia commons)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 13 / 69
rRNA
ribosomale RNA
zusammen mit denribosomalen Proteinen amAufbau und derenzymatischen Aktivität desRibosoms und damit an derProteinsynthese beteiligt.
60S Untereinheit (28S,6,8S,5S rRNA) und 40SUntereinheit (18S rRNA)
5’ Domäne der kleinen rRNA (Wikipedia commons)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 14 / 69
snRNA
small nuclear RNA
Immer mit spezifischenProtein assoziiert: smallnuclear ribonucleoproteins(snRNP)
Spleißen
Regulation vonTranskriptionsfaktoren (7SKRNA)
Aufrechterhaltung derTelomere
Das Spleißosom
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 15 / 69
Outline
1 Eine RNA-Menagerie
2 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA
3 RNA-Struktur
4 RNA: Sekundärstruktur
5 miRNAs
6 Bioinformatik der miRNAs
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 16 / 69
Ebenen der RNA-Struktur
Primärstruktur: Die NukleotidsequenzI z.B. die Sequenz CUCUCGGUAAGCUUAGGUACCA
Sekundärstruktur: Paare von Nukleotiden, welche eineWasserstoffbrückenbildung miteinander eingehen
Hairpin- und Stemloop-Strukturen, Helixstrukturen sowohlEinzelstrang- als Doppelstrangbereiche.
Tertiärstruktur (3D)
Quartärstruktur (Beziehung zu anderenRNAs/Proteinen im Komplex)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 17 / 69
RNA-Sekundärstruktur
G–C: drei Wasserstoffbrücken
A–U: zwei Wasserstoffbrücken
G–U: Eine Wasserstoffbrücke(”wobble pair”→Wackelpaar)
Wikipedia
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 18 / 69
RNA-Sekundärstruktur
RNA-Sekundärstruktur:häufige Motive wie Hairpin,Helix, stem loop, bulge loop,interior loop, multiple loop
RNA-Strukturbestimmungexperimentell schwierig, daherein wichtiges Thema für dieBioinformatik
Hairpin loop (Haarnadel)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 19 / 69
Strukturvorhersage durch Maximierung vonBasenpaarungen
Minimieren der freien EnergieWasserstoffbrücken sind eine Schlüsselkomponente derRNA-StabilitätViele Algorithmen versuchen daher, die Anzahl derWasserstoffbrücken zu maximieren
S. cerevisiae tRNA-PHE: Energien alternativer Strukturen (Wikipedia)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 20 / 69
Strukturvorhersage durch Maximierung vonBasenpaarungen
Primary Proximity ConstraintBilden Nukleotide i und j eine Wasserstoffbrücke, dann |i− j|> 3
Diese Bedingung ergibt sich aus der Tatsache, dass eine RNA-Kettenicht ausreichend flexibel ist, damit sich eine Wasserstoffbrückezwischen eng benachbarten Nukleotiden bilden könnte.
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 21 / 69
Strukturvorhersage durch Maximierung vonBasenpaarungen
Nesting ConstraintSind (i, j) und (p,q) zwei Wasserstoffbrücken (Paare von Nukleotiden),wobei i < p < j , dann gilt q < j
Diese ”Schachtelungsbedingung” verbietet überkreuzteWasserstoffbrücken, erlaubt dagegen geschachtelteWasserstoffbrücken. Überkreuzte Wasserstoffbrücken, so genanntePseudoknoten, kommen relativ selten vor. Algorithmen, welchePseudoknoten zulassen, sind wesentlich weniger effizient als solche,die sie verbieten.
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 22 / 69
Strukturvorhersage durch Maximierung vonBasenpaarungen
Beispiel: UUGACAUCG
Ziel:die Sekundärstruktur mit der maximalen Anzahl anBasenpaaren finden, wobei zwischen zwei paarenden Basenmindestens eine Ungepaarte stehen soll
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 23 / 69
RNA-Struktur: Klammern und PunkteWir können die RNA-Struktur als Strings mit balanziertenKlammern und Punkten mit der entsprechenden Schachtelebene(nesting level) darstellen
UUGACAUCG UUGACAUCG(..)(...) (.(....))011001110 011222210
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 24 / 69
RNA-Struktur: Klammern und PunkteDie Sekundärstruktur kann von der Sequenz undKlammerndarstellung ermittelt werdenBeispiel
GGAAAAACC((.....))
Output of sir_graph (®)
by D. Stewart and M. Zuker
dG = 1.20 [initially 1.20] test
G G
A
A
A
A
A
CC
5’
3’
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 25 / 69
Übung für zu Hause
die DNA-Sequenz für das menschliche Mitochondriongenomaufrufen (Accessionnummer: 17981852)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=17981852
in der FEATURES-Liste nach dem Gen für tRNA-Phe suchen(Position 579–649), die Sequenz für dieses Gen im neuen Fensteraufrufen
Display auf FASTA einstellen, die FASTA-formatierte Sequenzkopieren
Die Sequenz mit dem mfold-Programm analysieren
http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/rna-form1.cgi
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 26 / 69
Übung für zu HauseOutput of sir_graph (®)
by D. Stewart and M. Zuker
dG = -10.44 [initially -11.40] tRNA-Phe
G
U
U
U
A
U
GU
A
GCUU
ACCU
C
CU C A
A A G C
AA
U A C AC
UG
AA
A AU
GU
UU
AG
A
C
GG
G CU
C
AC
AUC
A
CC
CC
A
U
A
A
A
C
A
5’
3’
10
20
30
40
50
60
70
GUUUAUGUAGCUUACCUCCUCAAAGCAAUACACUGAAAAUGUUUAGACGGGCUCACAUCACCCCAUAAACA(((((((..((((.........))))......(((((....)))))..(((.........)))))))))).
Wieviele Strukturen werden vorhergesagt? Worin unterscheidensie sich?
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 27 / 69
Outline
1 Eine RNA-Menagerie
2 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA
3 RNA-Struktur
4 RNA: Sekundärstruktur
5 miRNAs
6 Bioinformatik der miRNAs
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 28 / 69
Bioinformatik der RNA-Faltung
Zahlreiche Algorithmen
Dynamic programming
Freie Energie
Hier stellen wir einen vereinfachten DP-Algorithmus vor
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 29 / 69
Bioinformatik der RNA-FaltungDominiert wird eine RNA Struktur von den Basenpaaren die sichzwischen komplementären Basen bilden.Die meisten dieser Basenpaarungen sind Watson-CrickBasenpaare.“Palindrome” häufig
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 30 / 69
Bioinformatik der RNA-Faltung
Eine vereinfachte Version des Zuker-Algorithmus versucht, dieAnzahl der gepaarten Basen zu maximieren
Unser Score: +1 für Basenpaar, 0 für alles Andere
Wir betrachten eine RNA-Sequenz 1,2, . . . ,n
S(i, j) Max. Score für die Subsequenz i, i +1, . . . , j .
S(i, j) kann rekursiv berechnet werden (Dynamic programming)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 31 / 69
RNA-Faltung: DP (1)
Falls i, j ein WC-Baasenpaar sind
S1(i, j) = 1+S(i +1, j−1)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 32 / 69
RNA-Faltung: DP (2)
Falls i ungepaart bleibt
S2(i, j) = S(i +1, j)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 33 / 69
RNA-Faltung: DP (3)
Falls j ungepaart bleibt
S3(i, j) = S(i, j−1)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 34 / 69
RNA-Faltung: DP (4)
Falls i, j jeweils mit anderen Nukleotiden gepaartsind, handelt es sich um eine Bifurkation, dieStruktur S(i, j) besteht dann aus den Strukturenfür zwei Subsequenzen i, . . . ,k und k +1, . . . , j :
S4(i, j) = maxi<k<j
S(i,k)+S(k +1, j)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 35 / 69
RNA-Faltung: Dynamic programming
Falls i und j also ein Basenpaar bilden, wird dem Score ein Punkthinzugefügt, ganz egal was die Struktur der Subsequenzi +1, . . . , j−1 ist
Daher müssen wir den Score für S(i +1, j−1) nicht neuberechnen
Ähnliche Argumente gelten für die anderen drei Möglichkeiten
Der optimale Score S(i, j) ist daher lediglich das Maximum dervier Optionen
S(i, j) = max
1+S(i +1, j−1)
S(i +1, j)
S(i, j−1)
maxi<k<j S(i,k)+S(k +1, j)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 36 / 69
RNA-Faltung: Dynamic programmingUm einen effizienten Algorithmus zu konstruieren, müssen wirimmer die Werte für S(i +1, j−1),S(i +1, j),S(i, j−1), sowieS(i,k)+S(k +1, j) für k = i, . . . , j zur Hand haben, wenn wirS(i, j) berechnen wollen.Dies heißt Dynamic programmingWir tragen die Scores S(i, j) in eine trianguläre Matrix ein.Subsequenzen der Länge 0 bzw. 1 haben keine Basenpaare,daher S(i, i) = S(i, i−1) = 0
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 37 / 69
RNA-Faltung: Dynamic programming
Wir arbeiten uns nun bis zur rechten oberen Ecke
Die rechten oberen Ecke enthält S(1,n), den Score für die ganzeSequenz 1, . . . ,n.
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 38 / 69
RNA-Faltung: Dynamic programming
Traceback: Wir verfolgen den besten Pfad zurück, um eineoptimale Lösung zu finden.
Die Matrix braucht O(N2) Platz, aber die inner Schleife(potentielle Bifurkation) braucht O(N3) Zeit.
Eddy SR (2004) How do RNA folding algorithms work? Nature Biotech. 22:1457-1458
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 39 / 69
RNA-Faltung: Dynamic programmingRealistischere Algorithmen betrachten Stems,Haarnadelstrukturen, Bulges, innere Schleifen, auchPseudoknoten
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 40 / 69
Outline
1 Eine RNA-Menagerie
2 mRNA, tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA
3 RNA-Struktur
4 RNA: Sekundärstruktur
5 miRNAs
6 Bioinformatik der miRNAs
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 41 / 69
miRNAs
Wir werden uns in der verbleibenden Zeit mit micro-RNAs(miRNAs) beschäftigen
miRNAs sind 1993 in C. elegans entdeckt worden
Die große Bedeutung von miRNAs in einer Reihe von biologischenProzessen auch bei Säugern ist wohl seit Anfang desJahrtausends nach und nach klar geworden, zahlreiche Aspektedes miRNA-Metabolismus sind noch nicht geklärt
Wichtiges Thema für die Bioinformatik: Beitrag der miRNAs zurGenregulation verstehen
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 42 / 69
miRNAs
Sehr kurze RNA-Moleküle (∼ 22 nt)
Antisense-Regulatoren anderer Gene
miRNAs entstehen aus Vorstufen mit ∼ 70 nt, welche eineumgekehrt komplimentäre enthalten, die die Bildung einerHaarnadelstruktur ermöglicht
Mindestens tausend miRNAs beim Menschen
eine miRNA reguliert i.d.R. bis zu ein paar hundertproteinkodierende Gene
Grundsätzlich eine negative Regulation
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 43 / 69
Biogenese der miRNAs (1)
miRNA-Vorstufen (pri-miRNAs,primary microRNAs) werden alsunabhängige miRNA-Genetranskribiert oder stellen in anderenFällen Abschnitte von Intronsproteinkodierender Gene dar
eine pri-miRNA kann Sequenzenmehrerer miRNAs enthalten
pri-miRNAs falten alsHaarnadelstrukturen mit imperfekterBasenpaarung
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 44 / 69
Biogenese der miRNAs (2)
pri-miRNAs werden dann durch dieEndonuclease Drosha verarbeitet∗
Das Ergebnis sind ∼ 70 ntHaarnadeln namens prä-miRNAs
*) Drosha bindet an das Produkt des DiGeorge syndrome critical region Gens 8 (DGCR8)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 45 / 69
Biogenese der miRNAs (3)
In einigen Fällen entstammen diePrä-miRNA-Sequenzenherausgespleißten Introns†
Mirtrons benötigen daherDrosha-DGCR8 nicht
†) Mirtrons kommen bei Caenorhabditis elegans, D. melanogaster und Säugetieren vor.
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 46 / 69
Biogenese der miRNAs (4)
prä-miRNAs werden durch Exportin-5ins Zytoplasma transportiert
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 47 / 69
Biogenese der miRNAs (5)
Im Zytoplasma werden dieprä-miRNAs durch Dicer∗ gespalten
Das Ergebnis ist ein ∼ 20 bpmiRNA-Duplex
*) Dicer bildet einen Komplex mit TAR RNA binding protein (TRBP).
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 48 / 69
Biogenese der miRNAs (6)
Nach der Verarbeitung durch Dicerwerden die miRNAs eingefügt ineinen Ribonukeloproteinkomplexnamens miRNA-induzierteSilencing-Komplex (miRISCs)
Der Aufbau des miRISC ist an dieprä-miRNA-Verarbeitung gekoppelt
Ein Strang des Duplex bildet die reifemiRNA, der andere wird abgebaut
Die wichtigsten Proteinbestandteiledes miRISC sind Proteine derArgonaut-Familie
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 49 / 69
Biogenese der miRNAs (7)
Zusammengefasst...
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 50 / 69
Wie steuern miRNAs die Genexpression?
miRNAs steuern die Expression von jeweils bis zu einigen hundertGenen posttranskriptionell
Verminderung der mRNA-Stabilität
Verminderung der mRNA-Translation
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 51 / 69
Wie steuern miRNAs die Genexpression?
Basenpaarung an die 3’-UTR der Ziel-mRNAs
Perfekte Basenpaarung in der Saatregion (Nukleotide 2–8 dermiRNA)
Die Saatregion initiiert die miRNA-mRNA-Assoziation
Fehlpaarung in der mittleren Region
(Imperfekte) Basenpaarung in der 3’-Region der miRNA
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 52 / 69
Wie steuern miRNAs die Genexpression?
miRNA-Bindungsstellen sind in der 3’-UTR der Ziel-mRNAgelegen
Mehrfache Bindungsstellen sind in der Regel für eine wirksameRepression der Genexpression benötigt
Synergistische Wirkung insbesondere von Bindungsstellen, dienah beieinander gelegen sind (10–40 nt)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 53 / 69
Wie steuern miRNAs die Genexpression?
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 54 / 69
Filipowicz W et al. (2008) Nat Rev Genet. 9:102–14.
miRNAs vs. Transkriptionsfaktoren
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 55 / 69
Chen K, Rajewsky N. (2007) Nat Rev Genet. 8:93–103.
miRNA-Funktionen
miRNA-Gene stellen ca. 1–2% aller Gene bei Eukaryonten dar. DieFunktionen der meisten miRNAs sind noch unbekannt.
Regulatoren des zeitlichen Ablaufs der Entwicklung derLarvenstadien (lin-4, lin-7, C. elegans)
Links-rechts-Asymmetrie der Chemorezeptorexpression (lsy-6, C.elegans)
Apoptose, Fettstoffwechsel (miR-14, D. melanogaster )
Hämatopoietische Differenzierung (miR-181a, Maus)
Spaltung von Hox-B8-Transkripten (miR-196, Maus)
Rolle bei Krebs, neurologischen Krankheiten,. . .,?
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 56 / 69
miRNA vs. siRNA
(A) dsRNA von Transposons, (B) Viren (C) miRNAs werden vonDicer prozessiert
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 57 / 69
miRNA vs. siRNA
siRNA/miRNA bilden den RNA-induzierten Silencing-Komplex(RISC)
Ist die Bindung an die Ziel-mRNA (nahezu) perfekt, wird dieZiel-mRNA gespalten (eher der Fall bei siRNA)
Ist die Bindung nicht perfekt, wird die mRNA destabilisiert bzw. dieTranslation gehemmt (eher der Fall bei miRNA)
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 58 / 69
piRNAs
Piwi-Unterfamilie derArgonautenproteine
Ziel: Transposons,Retroelemente
Spaltung der Ziel-mRNAerzeugt eine neue piRNA
Rolle vor allem imKeimgewebe, um neueInsertionen von Transposonszu verhindern
Chapman, Carrington, Nature Genetics Reviews 2007
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 59 / 69
zum Schluss
Email: [email protected]
weiterführende LiteraturChen K, Rajewsky N (2007) The evolution of gene regulation by transcription factors andmicroRNAs. Nat Rev Genet. 8:93-103
Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N. (2008) Mechanisms of post-transcriptionalregulation by microRNAs: are the answers in sight?Nat Rev Genet. 9:102-14.
Peter N. Robinson (Charité) RNA 13. Januar 2015 60 / 69