Journal f. praklt.&mie. Band 326, Heft 1, 1984, S. 171-174 J. A. Barth, Leipzig

Eine schnelle Leu-Enkephalin-Synthese in Losungl)

R. DOLLING, K.-D. KAUFMANN*

Sektion Chemie der Humboldt-Universitlt zu Berlin

A Rapid Leu-Enkephaline Synthesis in Solution Schnelle Peptidsynthesen in Losung ohne die beim klassischen Arbeiten ubliche Isoliernng, Rei-

nigung und Charakterisierung der Zwischenstufen setzen weitgehend nebenreaktionfrei verlaufende und quantitative Kupplungs- und Deblockierungsschritte voraus. Wahrend durch den Einsatz von Boc-aminosaurederivaten hinsichtlich der Deblockierungsreaktion eine problemlose same Abspaltung gewahrleistet werden kann, erfordert ein schneller und quantitativer Verlauf der Kupplungen den tfberschufieinsatz sehr reaktiver, aktivierter Aminosaurederivate. .Beschriebene Schnellsynthesen unter Verwendung von Mischanhydriden [l], Pentafluorphenylestern [a], o-Nitrophenylestern [3], N-Hydroxysuccinimidestern [4], N-Hydroxybenzotriazolestern [5, 61 und Carbodiimiden [7] unter- scheiden sich in der Hohe des eingesetzten Carboxylkomponentenuberschusses und in der Art iind Weise seiner Entfernung nach den Kupplungen, wiihrend die Abspaltung der N”-Boc-gruppe meist iibereinstimmend mit Trifluoressigsaure am zwischengefallten Peptid vorgenommen wird.

Wir fanden, daB Kupplungen dcr Boc-Aminosaureaktivester des N-Hydroxy-5-norbornen-di- carhomaureimids (HONB) [S] besonders schnell und auch weitgehend racemisierungsfrei verlaufen, wenn man sie im Zweiphasensystem aus einem Halogenkohlenwasserstoff und einer Natriumhydro- gencarbonatlosung ausfiihrt.

Fur die Reaktionsbeschleunigung ist offenbar die alkalische Grenzflachenkatalyse bei gleichzeitiger Extraktion des wahrend der Kupplung entstehenden sauren, wasserloslichen HONB verantwortlich. Auf der Grundlage dieser Kupplungsvariante arbeiteten wir ein Schnellsyntheseschema aus, bei dem wir in ahnlicher Weise, wie es von Noz.4~1 beschrieben wurde [7], das wachsende Peptid wahrend der gesamten Synthese in der organischen Phase in Losung halten wollten.

Ein hinreichend hydrophober Aminosaureester, gegebenenfalls auch ein Aminosaureamid, wird in Dichlorethan gelost, rnit 1,2- 2 Aquivalenten des anzukuppelnden Boc-aminosaure-ONB-esters versetzt, mit einer 1 m NaHC0,-Losung iiberschichtet und intensiv geriihrt. Diinnschichtchromato- grafisch 1aBt sich zeigen, daB die meisten Kupplungen innerhalb von 2 Stunden, haufig schon nach einigen Minuten, quantitativ verlaufen sind. Dann hebt man die Hydrogencarbonatlosung ab und wandclt den CarboxylkomponenteniberschuB durch 20-minutiges Ruhren mit einem prim./tert.- Dia- min, beispielsweise N, N-Dimethylaminoethylamin [ 2 ] oder 4Picolylamin [6] in ein mit SBuren aus- waschbares Boc-aminosaureamid um und extrahiert dieses mit einer wassrigen Saure. In der Dichlor- ethanphase kann nun direkt die Deblockierung der Boc-gruppe erfolgen, wenn eine stark acide orga- nische Saure, wie Methansulfonsaure benutzt wird, die bereits in 0,5 m Konzentration die Boc-gruppe in 10 bis 20 Minuten vollstandig abspaltet [9]. Durch Neutralisation rnit einer ausreichenden Menge 1 m NaHC0,-Losung laBt sich das Zweiphasensystem rnit der Aminokomponente in der Dichlorethan- phase fur die folgende Kupplung sofort wieder herstellen.

I ) Nomenklatur und A bkurzungen nach den Regeln der IUPAC-IUB-Commission on Biochemi- cal Nomenclature, J. Biol. Chem. 241, 2491 (1966) und 247, 977 (1972); weitere Abkurzungen: Boc =

tert.-Bntyloxycarbonyl, Bzl = Benzyl, OBzl = Benzylester, ONB = N-Hydroxy-5-norbornen-2,3- dicarbonsaureester

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Voraussetzung fur eine erfolgreiche Anwendung dieses Synthesschemas sind - ein hinreichend hydrophober Charakter der Aminokomponenten, um sie eindeutig in der organi- schen Phase zu halten, - eine ausreichende Loslichkeit der Peptide in Dichlorethan und - ein genugend hydrophiles Verhalten der Boc-aminosaureamide fur die Extraktion mit wlissrigen Sauren.

Diesc Eigenschaften sind durch die Wahl der terminalen und Seitenkettenschutzgruppen in ge- wissen Grenzen beinfluabar, so daO es, gegebenenfalls nach entsprechender Optimierung der Strate- gie, miiglich sein sollte, eine Reihe der bekannten biologisch aktiven Peptide mit Kettenlangen bis zu ca. 10 Aminosaure oder Fragmente grol3erer Peptide in dieser iinBerst rationellen Weise darzu- stellen.

Tabelle 1 Vergleich der Kupplungsgeschwindigkeiten verschiederier Boc-aminosaure-ONB-ester i n Dichlorethan und im Zweiphasensystem aus Dichlorethan/NaHCO,

Aktivester Aminokomponente Losungsm. Zeit") Analytische Daten (I,6 Aquiv.) system (h) F.("C) [a];' (EtOH)

Z-Pro-ONB H-Gly-OBzl la) 02 64- 66 - 54,6 Z-Pro-ONB H-Gly-OBzl za) 091 65-73 -56,G

Z-Ala-ONB H-Leu-OMe 1 0,5 01 -34,4 Z- Ala-ONB H-Leu-OMe 2 0,3 01 -33,2

Z-Pro-ONB H-Leu-OMe 1 1,o 68- 70 -66,6 Z-Pro-ONB H-Leu-OMe 2 0,5 71-72 - 68,6

Z-Val-ONB H-Gly-OBzl 1 5,O 129 - 24,G Z-Val-ONB H-Gly-OBzl 2 2,o 133 - 26,4

") Zeit bis zum quantitativen Umsatz ; Losungsmittelsystem 1 : Dichlorethsn ; Losungsmittel- system 2: Dichlorethan/m NaHCO,

Am Beispiel dos Leu-Enkephaliiis haben wir das Syntheseschema erstmsls erfolgreich angewendet. Dabei wurde der Aufbau der geschiitzten Sequenz Z-Tyr(Bz1)-Gly-Gly-Phe-Leu-OBzl gewlhlt, weil mit der Verwendung von Schutzgruppen des Benzyltyps am Ende der Synthese eine simultane De- blockierung aller geschutzten Funktionen durch schonende Hydrierung erfolgen kann. Die Startami- nokomponente Leucinbenzylester erwies sich erwartungsgemal3 als ausreichend hydrophob und wie die gesamten Peptide der Seyuenz gut in Dichlorethan loslich. Anch die Saureloslichkeit der N-(2- Aminoethy1)morpholinamide der Boc-aminosauren bereit,ete keine Schwieriglreiten. Lediglich der N-terminal eingesetzte Z-Tyr(Bz1)-ONB-ester war nach Uberfiihrung in das N-(2-Aminoethyl) morpholinamid nur schwierig rnit waBrigen Sauren zu extrahieren, so daB Reste dieser Verbindung nach der Isolierung des geschutzten Leu-Enkephalins noch durch Gelfiltration abgetrennt werden muaten. Hier wlre die Verwendung eines anders geschiitzten Tyrosin-ONB-esters und der Einsatz eines hydrophilere Amide liefernden Diamins, wie N-( 2-Aminoetmhyl)piperazin [lo] zu empfehlen. Die Kupplungszeiten betrugen im Maximum fur die Phe/Leu-Kupplung ca. 1 Stunde und lagen bei der Gly/Gly-Kupplung ebenso wie bei der Tyr/Gly-Kupplung Linter 10 Minuten. Ausgehend von b mmol der Startaminosaure in 100 nil Dichloret,han wnrde das geschiitzte Leu-Enkephafin in 75%- iger Ausbeute in 2 Tagen synthetisiert. Nach einer Gelfiltration a11 Sephadex LH 20 in Chloroform/ Methanol erwies es sich diinnschichtchromatografisch in verschiedenen Laufmitteln als vollig ein- heitlich. Die anschlieBende Hydrierung lieferte das freie Leu-Enkephalin in guter ubereinstimrnung mit den Literaturdaten.

Eine schnelle Leu-Enkephalin-Synthese in Losung 1 i 3

Beschreibung der Versuche Die Schmelzpunkte wurden auf dem Mikroheiztisch nach BOETIUS und die optischen Drehwerte

mit dem POLAMAT A des VEB Carl Zeiss Jena bestimmt. Die Aminosaureanalysen wurden an einem Analysator AAA 881 Mikrotechna, Prag, durchgefiihrt.

Fur die Diinnschichtchromatografie wurden Kieselgel GO - Fertigplatten der Fa. Merck ver- wendet.

Laufmittelsysteme : CM = Chloroform/Methanol (9: 1) ; CMN = Chloroform/Methanol/lO% Ammoniak (95: 5: 3 ) ; BEM' = Butanol/Eisessig/ Wasser (4: 1: 1); APW = tert.-Amylalkohol/i-Pro- panollWasser (15:4: 1).

Schnellsynthesevorschrift

5 mmol der Aminokomponente und 7,5 mmol eines Boc-aminosaure-ONB-esters, der sich nach dem Carbodiimidverfnhren [D] oder iiber Mischanhydride (analog [ll]) darstellen IaiOt, werden in 100 ml Dichlorethan mit 16 ml einer 1 m NaHC0,-Losung bis zur diinnschichtchromatografisch nachgewiesenen quantit'ativen Kupplung intensiv geriihrt. Dann trennt man die Bicarbonatphase ab, versetzt die organische Phase niit 5 mmol N-(2-Aminoethyl)morpholin (oder eines anderen piim./tert. Diamins) und riihrt 20-30 Minuten. Die Dichlorethanlosung wird ditnach 2 - 3 ma1 rnit 1 m HCI extrahiert, mit 3,23 ml Methansulfonsaure und 2 ml Eisessig versetzt und wieder 20 Minuten geriihrt. Schlielllich wird mit 1 m NaHC0,-Losung neutralisiert und das Zweiphasensystem fur die nachste Kapplung wieder hergestellt.

Synthese des Lou-Enkephalins

1,97 g (6 mmol) H-Leu-OBzl . TosOH wurden in 100 ml Dichlorethan gelost, rnit 1 m Sodalosung geschuttelt und da,nn die organische Phase gemaS dem vorstehend beschriebenen Syntheseschema in der Polge der Sequenz niit jeweils 1,6 Aquivalenten Boc-Phe-ONB, Boc-Gly-ONB und Z-Tyr(Bz1)- ONB ohne Zwischenisolierongen verlhgert. Nach Ablauf der letzten Kupplung wurde der Z-Tyr(Bz1)- QNR-ffberschua in N-(2-Aminoethyl)morpholinamid iiberfiihrt und durch mehrfache Bshand- lung mit 1 n HCI weitgehend extrahiert. Die Dichlorethanlosung wurde neutral gewaschen, eingeengt und das Peptid Z-Tyr(Bzl)-Gly-Gly-Phe-Leu-OBzl rnit Petrolether gefallt. Nach Gelfiltration uber Sephadex LH 20 in Cliloroform/iMethanol betriq die Ausbeute 3,2G g (75% bezogen auf die Startamino- stiure).

I!'. 151-1-53"C; [ x ] f i 8 -17,O" (c = 1, Methanol)

CjOH&T509 (870,O) Ber. C GO,O2 H 6,37 N S,O6 Gef. m,e7 6,29 826

~\iniiioS~i~reilnal~sc (nach Hydrolyse niit' 6 n HCI, 11O"C, 24 Std.): Tyr l,O(l); Gly 2,0(2); Phe l,l(l); Leu 1,1(1)

2,76 g (3,17 mmol) Z-'~yr-(Bzl)-Gly-Gly-Phc-I~cu-OBzl wurden in Met>hanol rnit 10% Pd/Aktiv- kohle 5 Stunden hytlricrt. Nach Einengen der Methanollosung wurde das Leu-Enkephalin rnit Ether/ Petrolether gefallt.

Ausbeute: 1,M ,q (!15% d. "11.); P. 157-159°C; [cx]$?~ -23,O" (c = 1, Dimethylformamid). {Lit. F. 158-160"C); (206°C); [a]:? - 2 3 , P (c =: 1, Dimethylformamid) [la, 1311

DC: R, 0,7G(CM); 0,90(APW)

DC: R, 0,40(CMK); 0,74(BEW) C,,H,,N,O, (.555,6) Ber. C GO$?, H G,71 N 12,60

Gef. GO,O3 G,70 1%,43

Aminosiiureanalyse (nach Totalhydrolyse rnit 6 n HCI/PropionsPure (1 : l), 130 "C, 4 Std.) : Tyr 0,86(1); Gly 1,95(2); Phe l,O(l); Leu 1,0(1)

174 R. DOLLINQ, K.-D. KAUFM-4"

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Bei cler Redaktion eingegangen am 30. MIrz 1983.

A4nsclir. d. Verf.: Dr. R. D~LLING, Dr. sc. K.-D. KAUFMANN, Sektion Chemie der Humboldt-hi- versitiit zu Berlin, DDR-1040 Berlin, Hessische StraIje l / 2