Journal f. prakt. Chemie. Band 320, Heft 6, 1978, S. 963-966 J. A. Barth, Leipzig

Boc--OH

Boc

BOc--OH H

Boc

--OH H

Eine vereinfachte Synthese von Methionin- Enkephalin

GUNTEB LOSSE, KLAUS-DIETER WEHRSTEDT Sektion Chemie der Technischen Universitat Dresden

H--0Me

OMe

OMe

OMe

OMe

OMe

A Convenient Synthesis of Methionin-Enkephalin

of the C-terminal aniino acid methylester using Boc-Phe-OH1), Boc-Gly-Gly-OH and Boc-Tyr-OH. A b s t r a c t . An efficient synthesis of methionin-enkephalin has been developed by prolongation

Seit der Entdeckung der endogenen Opitate Leucin-Enkephalin und Methionin- Enkephalin durch HUGHES u. Mitarb. [l, 21 wurden fur diese sowie eine Reihe ihrer Analogen zahlreiche Synthesevorschlage veroffentlicht, die sich in der Lage der Sequenz- schnitte fur die Fragrnente sowie die Auswahl der Schutzgruppen graduell unter- scheiden [3 -121.

Aus der Zielstellung heraus, in N"-Stellung durch bestimnite Bioeffektoren substitu- ierte Enkephaline zu gewinnen, benotigten wir ein Aufbauprinzip, das neben den freien Peptiden auch den Ester moglichst bequem zuganglich macht.

Tyr Gly-Gly Phe Met

Boc

Boc

Schema 1

Wie wir am Beispiel des Methionin-Enkephalins zeigen mochten, ergibt sich ein besondcrs zweckmaBiger Synthescweg, wenn die Sequenz ausgehend vom C-terminalen Methioninmethylester schrittweise durch die vorausgehenden Aminossuren verlangert wird (Schema 1). Tyrosin IaBt sich hierbei in hydroxylfreier Form einsetzen, wenn der Kupplungsschritt in Position 1/2 mit dieser Aminosaure unter Anwendung milder Car- boxylaktivierung e. B. mittels DCC oder verschiedene Aktivester-Varianten ausgefuhrt

1) Nomenklatur und Abkiirzungen nach den Regeln der IUPAC-IUB-Commission on Bichemical Nomenclature: Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 346, 256 (1967), J. Biol. Chem. 247, 977 (1972); weitere Abkurzungen: DCC = Dicyclohesylcarbodiimid, HOBt = 1-Hydroxybenzotriazol, DMP = Dimethylformamid.

61'

964 G. LOSSE, K.-D. WEHRSTEDT

wird. Fur die iibrigen Verlangerungsschritte besteht methodisch weitgeliende Wahl- freiheit, wobei gute Ergehnisse u.a. ebenfalls durch DCC otier besser durch die DCC/ HOBt-Methode erreicht werden. Dieses Aufhauprinzip kann gleichzeitig fiir eine trager- gehundene Synthese der Enkephaline bei niethanolytischer Abspaltung des Penta- peptids von der Matrix ubernommen werden.

Der entsprechend Schenia 1 in einer Gesaintausbeute von 57% bezogen auf Methio- nininethylester rein gewonnene Boc-Methionin-Enkephalin-Methylester (3) liefert nach Verseifung init 0,26 n NaOH und Abspaltung der Boc-Gruppe das authentische freie Peptid. Die Deblockierung allein der N"-Funktion von (3) fiihrt entsprechend Zuni weiter derivatisierhnren Methionin-Enkephalin-Methylester in einer Gesamtausheute von 540&

Beschreihung der Versuche Die I ly /D-Werte wurdcn mit einer Genauigkeit von &0,50" gemessen. Die Diinnschichtchromato-

graphie erfolgte auf Silufol-Plattcn (Kavalier-CSSR). Als Lanfmittelsysteme nurden vermendet: (a) n-Butanol-Eisessig-Wasser 4: 1: 1; (b) n-Propanol-20proz. waBrig. Ammoniak 7 : 3.

N - t e r t . e s t e r 1

B u t y 1 o x y c n r b o n y 1 - g 1 y c y 1 - g I y c y 1 - L - p he n y 1 a la n y I - L - in e t h io n y 1 - m e t h y I -

3,11 g (10,OO mmol) H-Phe-Met-OMe . HCI [13] (F. 120"C, 14k5 == -4,50" c = 0,85, Methanol) werden in 20 ml DMF gelost, mit 1 , l O ml (10,00 mmol) N-Methylmorpholin versetzt, hei -10°C 3,84 g (15,OO mmol) Boc-Gly-Gly-OH [3] (F. 125-127"C), 3,09 g (15,OO mmol) DCC und 2,03 g (l5,OO mmol) HOBt in 20 ml DMF hinzugefugt und 4 Std. bei - lO"C, 4 Std. bei 0°C und 10 Std. bei 20 "C zur Reaktion gebmcht. Drr Dicyclohexylharnstoff wird abgesangt, das Losungsmittel bei 0,l Torr nbgedampft, das resultierende Prodnkt in Essigester aufgenommen, mit Bicarbonatlosung (pH = 8). 6proz. Hydrogensulfatlosung und Wasser gewaschen, iiber MgSO, getrocknet, bei 16 Torr eingeengt und aus Essigcster/Petrolether kristallisiert. Das Produkt, ist chromatographisch einheit- lich. Ausbeiite4,37 g (83,5% d.Th.); F. 100-105°C; = -23,30" (c = 1,00, Methanol); R, = 0,77 (b).

C,,HwN,O,S (524,F") Ber. C 55,OO H 6,92 N 10,70 Gef. C 55,12 H 7,Ol N 10,68

G l y c y l - g l y c y l - L - p h e n y l a l a n y l - L - m e t h i o n y l - m e t h y l e s t e r - h y d r o c h l o r i ~ '3

4.00 g (7,63 mmol) 1 werden in 40 ml 4n HCI/Dioxan 30 Min. bei 20°C stehen gelassen, das Losungsmittel abgezogen und das Produkt aus Methanol/Ether kristallisiert. Ausbeute 3,41 g (97% d.Th.); F. 183-187°C; la1$ = -18,OO" (c = 1,00, Methanol); R, = 0,33 (a).

Cl9H2,N4O,S. HCI (460,97) Ber. C 49,50 H 6 3 4 N 12,15 Gef. C 49,25 H 6,33 N 12,03

N - t e r t. B 11 t y 1 o x y c a r b o n y 1 - L - t y r o s y I - g 1 y c y I - g I y c y 1 - L - p h e n y I a I n n y I - L - m e t h i o n y I - m e t h y l e s t e r 3

3 2 3 g (7,OO mmol) 2 werden in 20 ml DMF gelost, mit 0,77 ml (7,OO mmol) N-Methylmorpholin versetzt. bei -15°C 2,81 g (10,OO mmol) Boc-Tyr-OH [14] (14i5 = +4,50" c = 2,00, Essigslure), 2,OG g (10,OO nimol) DCC und 1,35 g (10,OO mmol) HOBt in 20 ml I)MF zugegeben und 4 Std. bei -16" C, G Std. bei 0" C undl5 Std. bei 20" C zur Reaktion gebracht. I)er Dicyclohexylharnstoff wird abgesaugt, das Losungsmit.tel bei 0,l Torr abgezogen, in Essigaster aufgenommen, mehrmals mit, Bicarbonatlosung (pH = 8). 6 proz. Hydrogensulfatlosung und Wasser gewaschen und iiber MgSO, getrocknet. Die Essigesterlosung wird bei 15 Torr eingeengt und das Produkt aus Essigester/Petrol-

Eine vereinfachte Synthese yon Menthionin-Enkephalin 965

ether kristallisiert. Das Produkt ist chromatographisch cinheitlich. Ausbeute 3,76 g (780,; d.Th.); F. 112--114°C; \N\$ = -8,8U" (c = 0,85, Methanol); RF = 0,80 (a); Aminosanreanalysr Tyr 1,10 (1,00), Gly 1,80 (2,00), Phe 1,07 (1,00), Met 1 , O O (1,OO).

C,3H45N,0gS (687,79) Ber. C 67,G2 H G,GO N 10,18 Gef. C 57,38 H 6,70 N 9,92

L - T y r o s y 1 - g 1 y c y I - g 1 y c y 1 -L - p h e n y 1 a 1 a n y 1 - L - m e t h i o n y 1 - m e t h y 1 e s t e r - h y d r o c h lo r i d 4 1,72 g (2,50 mmol) 3 werden mit 16 ml 4n HCl/Dioxan 30 Min. bei 20°C behandelt, das Losungs-

mittel abgezogen und aus Methanol/Ether kristallisiert. Ausbeute 1,50 g (96% d.Th.); F. 143-145 "C; la- Ig = +12,40" (c = 0,90, Methanol); RF = 0,45 (a).

C2bH37N507S . HCI (62414) Ber. C 63,88 H 6,14 N 11,22 Gef. C 53,72 H G,12 N 11,OO

N - t e r t . Butyloxycarbonyl-~-tyrosyl-glycyl-glycyl-~-phenylalanyl-~-methionin 5

1,72 g (2,50 mmol) 3 werden in 20 ml 0,2d n NaOH in Dioxan/Wasser (6: 1) 1 Std. bei 20 "C ver- seift. Dann wird das Dioxan bei 15 Torr abgezogen, rnit Wasser aufgenommen und mit Essigester extrahiert. Die waRrige Phase wird mit 5proz. Hydrogensulfatlosung angesauert und das Produkt durch Extraktion in Essigester iiberfuhrt. Die Essigesterphase wird neutral gewaschen, iiber MgSO, getrocknet und bei 15 Torr eingeengt. Das Produkt kristallisiert aus Essigester/Petrolether. Aus- beute 1,24g (74% d.Th.); F. 150-152OC (Zers.), Lit. 149-151°C (Zers.) [ll]; 1x12 = +18,70" (c = 0,80, Methanol); R, = 0,44 (b), Lit. RF = 0,52-0,57 (Essigestcr-Pyridin-Eisessig-Warner 60:20:6:11) [ll].

C,,H4,N50gS (673,76) Ber. C 57,04 H 6,43 N 10,39 Gef. C 57,28 H 6,66 N 10,17

L-Tyrosyl-glycyl-glycyl-L-phenylalanyl-L-methionin G

1,%0 g (1,78 mmol) 5 werden in 10 ml HCI/Dioxan 30 Min. bei 20°C von der Boc-Gruppe befreit, das Losungsmittel abgezogen, das Produkt in Wasser gelost, uber Kieselgel GO (Fa. Merck) filtriert, in 20 ml Wasser aufgenonimen und GO Min. mit 2 g Wofatit AD 41 (OH-Form) geriihrt. Nach Abfil- trieren des Austauschers nnd Abziehen des Wassers bei 0,l Torr wird aus Methanol/Ether kristalli- siert. Ausbeute 0,63 g (62% d.Th.); F. 200°C (Zers.), Lit. 195°C (Zers.) [3]; 1.1: = +31,50° (c = 1,00, Methanol), Lit. = + 31,20° (c = 1,00, Methanol) [R]; RF = 0,41 (a), Lit. RF = 0,42 (n-Bntanol-Eisessig-~'asser 3: 1 : 1) [4].

Litcraturverzeichnis [I] J. HCGHES, T. SMITH, B. MORGAN U. L. FoTaERaILL,Life Sci. 16, 1753 (1975). [2] J. HTTCHES, T. W. SBIlTH, H. It'. KOSTERLITZ, L. A. P'OTHERGILL, B. A. MORGAN U. H. R. MOR-

[3] E. PIETRZIK, H. KaLBACHER u. W. VOELTER, Liebigs Ann. Chem. 1977, 609. [4] W. VORLTER, C. BU~vEarcrr, H. HORN, H. KALBACHER u. E. PIETRZIK, Angew. Chem. 8s. 3.32

151 R. VOELTER, H. HORN, H. KALBACHER 11. E. PIETRZIK, Chem. Ztg. 101, 194 (1977). [6] N. S. A G . ~ W A L , V. J. HRVBY, R. KATZ, W. KLEE u. PI. NIRENBERO, Biochem. Biophys. Etes.

RIS, Nature (London) 558, 577 (1975).

(1 9 76).

Conirnun. 7G, 129 (1977).

R. FERTEL, C,. G. BERNTSON 11. C. A. SANDMAN, Biocheni. Biophys. Res. Commun. 73,632 (1976).

(1977), C.A. $7, 68667~ (1977).

[7] D. H. C O Y , A. J. KASTIN, A. V. SCHALLY, 0. M O R I N , N. G. CARON, P. LABRIE, J . 51. N:ALKER,

p] L). A. JONES. J. A. QCIILATTER, R.A. MICULEC, J. A. REUTERU. R. H. MAZUR, u.s.Pat. 4 ~ 2 8 3 1 9

96G G. LOSSE, K.-D. WEIIRSTEDT

[9] S. BAJUSZ, A. Z. RONAI, J. I. SZEKELY, L. GRAF, Z. DUNAI-KOVACS ti. I. BERZETEI, FEBS Lett. 7G, 91 (1977).

[lo] SU-SbN IT'ANG, B. F. GISIN, D. P. WINTER, R. &IbKOFSKE, J. 1). KULESHA, c. TZOUGRIKI U. J. bfEIENIfOFER, J. Org. Chem. 42, 1286 (1977).

[ l l ] L. GRAT, A. 2. RONAI, S. B.LTUSZ, G. CSEII 11. J. I. SZEKELY, FEBS Lett. 64, 181 (1976). [I21 J. HUGIIES u. L. 8. FOTHERGILL, U.S.P. Appl. GGGG47 (197G), C.A. SG, 1359:I:Ic (1977). [13] C. SCHATTENKERK, I. VOSKUYC-HOLTKAMP 11. R. BOKHORST, Rer. Trav. Chini. Pays-Bas 92, 92

[14] G. 11'. ANUERSON u. A. C. MCCREGOR. J . Am. Chem. SOC. 79, 6180 (1957). (1073).

Bei der Rednktion eingegnngen a m 23. November 1977 bzw. 20. Marz 1978.

Anschr. d. Verf.: Prof. Dr. habil. G. LOSSE und Dipl.-Chem. KL.-D. WEHRSTEUT, Sektion Chemie der Technischen Universitit Dresden, DDR-8027 Dresden, Mommsenstr. 13