Einfluss der Temperatur auf die Vitalität von Mikroorganismentechnikinitiative-nwt.de/wp-content/uploads/2014/12/V11... · Schülerseiten Einfluss der Temperatur auf die Vitalität

Schülerseiten

Einfluss der Temperatur auf die Vitalität von

Mikroorganismen

Thema: Mikroorganismen, Wärme

26.11.2014 V11-Tempertureinfluss_lebend_tot_ToTest Seite 1

V11

1. Einleitung

Mikroorganismen spielen in unserem Leben eine wichtige Rolle. So sind

Mikroorganismen mitverantwortlich für die Mineralisierung von organischem

Material und somit für den natürlichen Stoffkreislauf.

Beim Menschen können sie auch für Krankheiten verantwortlich sein, (z.B.

wird Scharlach durch Bakterien verursacht). Weiterhin können sie

Lebensmittel verderben (z.B. Schimmelpilze).

Sie können jedoch auch gezielt eingesetzt werden, um bestimmte Stoffe

herzustellen. So wird z.B. Alkohol durch Hefen produziert, Joghurt mit Hilfe

von Bakterien hergestellt oder das Antibiotikum Penicillin durch einen Pilz.

Bei diesen technischen Prozessen spielt deshalb das gezielte Handling von

Mikroorganismen eine wesentliche Rolle.

2. Grundlagen

Für ein gezieltes mikrobiologisches Arbeiten oder bei der Konservierung von

Lebensmitteln ist die Abtötung von Mikroorganismen ein zentrales Thema.

Hierbei geht es darum, die Mikroorganismen einerseits unschädlich zu

machen, gleichzeitig sollen jedoch die im Produkt enthaltenen Wertstoffe

(z.B. Vitamine) möglichst erhalten bleiben. In diesem Versuch soll untersucht

werden, welchen Einfluss eine Wärmebehandlung auf die Vitalität von

Mikroorganismen hat.

Als Mikroorganismus wird hierbei die Hefe Saccheromyces cerevisiae

eingesetzt, die allen als Backhefe bekannt ist. Weiterhin ist diese Hefe auch

für die alkoholische Gärung (Wein-/Bierherstellung) von Bedeutung.

In diesem Versuch soll über eine Färbung mit einem bestimmten Farbstoff,

eine sogenannte Lebend-Tot-Färbung, der Vitalitätszustand der Zellen in

Anbhängigkeit von der Temperatru durchgeführt werden. Für solche

Färbungen kommen verschiedene Farbstoffe zum Einsatz.

Info:

Saccheromyces cerevisiae:

Backhefe, Bierhefe

Info:

Vitalität = Lebenskraft

Schülerseiten

Einfluss der Temperatur auf die Vitalität von Mikroorganismen


Methylenblau:

Methylenblau wird von den Enzymen der Hefezellen in farbloses Leukoform

umgewandelt. D. h. Zellen, bei denen die Enzyme noch funktionieren,

erscheinen im Mikroskop farblos, Zellen bei denen die Enzyme nicht

funktionieren, erscheinen im Mikroskop violett [1].

Abb. 1: Mit Methylenblau angefärbte Hefezellen nach der Erhitzung. In den hellen Zellen wurde der Farbstoff durch Enzyme abgebaut. Diese Zellen werden als lebend gewertet. Bei den dunkel gefärbten Zellen konnte der Farbstoff nicht abgebaut werden, diese werden als tot gewertet.

Eosin /Trypanblau:

Die Farbstoffe Eosin oder Trypanblau können die Zellwand intakter Zellen

nicht durchdringen. Der Farbstoff kann somit nur in Zellen eindringen, deren

Zellwand nicht mehr intakt ist. Diese erscheinen im Mikroskop blau-violett,

die intakten Zellen sind farblos.

Zellzahlbestimmung mittels Zählkammer

Über eine Zellzahlbestimmung mittels Zählkammer kann die Anzahl der Zellen in

einem Medium bestimmt werden.

Eine Zählkammer ist ein (dickerer) Objektträger mit 3 quer verlaufenden Stegen

(2 schmale an den Seiten und ein dickerer in der Mitte). Die beiden äußeren

Stege sind genau 0,1 mm höher als die Oberfläche des Mittelstreifens. In die

Oberfläche des etwas breiteren Mittelstreifens sind zwei kreuzförmige Netze

lebend

tot

Kurz gesagt:

Die Zellen werden gefärbt

und dann in eine Zählkam-

mer eingebracht. In der

Zählkammer befindet sich

ein bestimmtes Volumen.

Somit kann die ermittelte

Zellzahl immer auf ein be-

stimmtes Volumen bezogen

werden und man kann eine

Konzentrationsangabe ma-

chen.

Schülerseiten



von Linien eingeätzt, die als Flächenorientierung bei der Zählung verwendet

werden.

die den Grundriss der Kammern bilden. Zu beiden Seiten des Mittelstreifens,

jeweils auf der anderen Seite der tiefen Rinnen, befindet sich ein etwas

schmalerer Steg. Die Oberflächen dieser beiden äußeren Stege sind ebenfalls

plangeschliffen und liegen 0,1 mm höher als die Oberfläche des Mittelstreifens.

Abb. 2: Thoma-Zählkammer: In der Mitte der etwas tiefer gelegene Steg mit den Liniennetzen zum Zählen (die Liniennetze sind in der Aufnahme nicht sichtbar). Rechts und links davon die etwas höher gelegenen Stege.

Durch Auflegen eines dicken, plangeschliffenen Deckglases auf diese beiden

höheren Stege entsteht ein Zwischenraum definierter Größe (Grundfläche x

Höhe), in welche die Probe eingefüllt wird. Die auf einer bestimmten Fläche des

Netzes liegenden Zellen werden ausgezählt.

Sie können somit auf das Volumen der Zählkammern bezogen werden, womit

die Angabe einer Zellkonzentration möglich wird. Die Zellkonzentration wird

nach folgender Formel berechnet:

Die Angaben zur Fläche und Kammertiefe findest du auf der Zählkammer [2].

Info:

Eine Konzentration muss in

diesem Versuch nicht

ermittelt werden, da nur

das Verhältnis lebender

Zellen im Vergleich zu der

Gesamtzellzahl berechnet

wird.

Schülerseiten



3. Versuchsdurchführung

3.1 Versuchsvariante 1

Lebend-/Tot-Färbung

Material:

Zellsuspension (z.B. Hefen im Apfelsaft)

Objektträger, Deckgläschen

0,1 %-ihr Methylenblaulösung (in H2O)

Pasteurpipette oder Pipette (1 ml)

Reagenzglas oder Reaktionsgefäß

Aufgabenstellung:

Führe eine Lebend-/Tot-Färbung der Mikroorganismen durch und betrachte diese unter dem Mikroskop.

Versuchsdurchführung:

Mische die Zellsuspension mit der gleichen Menge 0,1%igen Methylenblaulösung.

Beobachtung:

Betrachte die gefärbten Zellen nach einer Einwirkzeit von 5 min unter dem Mikroskop

Aufgabe:

a) Notiere die Beobachtung in Deinem Heft. b) Warum sind die lebenden Zellen farblos und die toten blau?

Vorsicht:

Methylenblauflecken las-

sen sich nur schlecht ent-

fernen.

Schülerseiten



3.2 Versuchsvariante 2

Teilversuch 1

Bestimmung des Zusammenhangs zwischen Zeiteinstellung und Temperatur in

der Mikrowelle

Material

Mikrowelle

Stoppuhr

Thermometer (Temperatur sollte sehr schnell ablesbar sein)

1 Schüssel mit Eiswasser

7x Erlenmeyerkolben (250 ml)

Aufgabe

Bestimme, wie lange du einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml Flüssigkeit in die

Mikrowelle stellen musst, um bestimmte Temperaturen zu erreichen.

Versuchsdurchführung

Erlenmeyerkolben mit 100 ml Leitungswasser (Raumtemperatur) füllen

Die Mikrowelle auf volle Leistung stellen

Bei der Mikrowelle eine längere Zeit einstellen, die exakte Zeit wird

mittels Stoppuhr und durch das Öffnen der Mikrowellentür vorgegeben

Die Temperatur des Wassers in Abhängigkeit von verschiedenen Zeiten

ermitteln

Aufgaben und Messwerte:

a) Dokumentiere die ermittelten Werte in einer Tabelle in deinem Heft.

b) Erstelle eine Graphik, in der der Zusammenhang veranschaulicht wird.

c) Wie lange muss jeweils erwärmt werden, um Temperaturen in der

Größenordnung von 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C und 80°C zu

erhalten?

Achtung:

Der Temperaturbereich

zwischen Raumtemperatur

und 80°C sollte abgedeckt

sein.

Achtung:

Da es in der Mikrowelle

punktuelle Temperaturun-

terschiede gibt (so ge-

nannte Hot Spots) muss

der Erlenmeyerkolben im-

mer auf dieselbe Stelle

platziert werden (Markie-

rung vornehmen).

Schülerseiten



Teilversuch 2

Erhitzen von Hefezellsuspensionen

Material

Mikrowelle

Stoppuhr

Thermometer (Temperatur sollte sehr schnell ablesbar sein)

1 Schüssel mit Eiswasser

7x Erlenmeyerkolben (250 ml)

2x Erlenmeyerkolben 1 l

2 l A-Saft

2 Päckchen Backhefe

Aufgabe:

Erhitze verschiedene Hefezellsuspensionen auf ca. 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C,

70°C und 80°C


1 Päckchen Backhefe und 500 ml Apfelsaft werden über Nacht

vorkultiviert (bei Raumtemperatur). Der Kolben sollte dabei ein Volumen

von mindestens 1 l fassen, damit die Sauerstoffversorgung der Hefe

gewährleistet ist. Wenn alle o.g. Temperaturen untersucht werden, muss

dieser Ansatz doppelt gemacht werden, da für jede Temperatur 100 ml

benötigt werden.

Am Versuchstag werden in die 7 Erlenmeyerkolben je 100 ml der Hefe-

/Apfelsaftsuspension gegeben.

Einen Kolben nicht erhitzen, die anderen Kolben für die oben ermittelten

Zeiten auf ca. 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C und 80°C in der

Mikrowelle erhitzen, danach sofort die Temperatur messen und die

Kolben in Eiswasser auf Raumtemperatur abkühlen.


a) Notiere die ermittelten Temperaturen in deinem Heft.

Achtung:

Da es in der Mikrowelle

punktuelle Temperaturun-

terschiede gibt (so ge-

nannte Hot Spots) muss

der Erlenmeyerkolben im-

mer auf dieselbe Stelle

platziert werden (Markie-

rung vornehmen).

Achtung:

Die Hefesuspension muss

am Tag zuvor angesetzt

werden.

Achtung:

Vergiss nicht, die Kolben

entsprechend zu beschrif-

ten.

Schülerseiten



Teilversuch 3

Bestimmung des Anteils vitaler /lebender Zellen

Material

Hefezählkammer (z.B. Thomazählkammer oder Neubauer improved) mit Deckgläschen

0,1 %-ige Methylenblaulösung

Reagenz- oder Zentrifugenröhrchen

Pasteurpipetten oder Pipetten

Aufgabe

Ermittle den Anteil vitaler Zellen in Abhängigkeit von der Erhitzungstemperatur.


Probenvorbereitung

1 ml Hefesuspension und 1 ml Methylenblaulösung in ein Röhrchen

pipettieren.

Probe gut schütteln (falls vorhanden Vortexer verwenden)

Probe 5 min stehen lassen

Mikroskopische Auswertung

Deckglas auf Zählkammer legen

Die Außenstege mit destilliertem Wasser befeuchten und das Deckglas mit

sanftem Druck von vorn auf die Zählkammer schieben.

Probe gut mischen und mit einer Pipette einen Tropfen entnehmen. Den

Tropfen vorsichtig an die Stelle zwischen Deckglas und Kammerboden bringen.

Abb. 3: Befüllen der Thoma-Zählkammer

Sind Luftblasen sichtbar oder ist die Flüssigkeit über die Ränder in die Rinnen

übergequollen, so muss die Kammer gereinigt und nochmals befüllt werden.

VORSICHT!:

Das Deckgläschen ist leicht

zerbrechlich.

Info:

Durch die Kpillarwirkung

füllt sich der Spalt

zwischen Deckglas und

Kammerboden

Schülerseiten



Die Zellen werden unter dem Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung gezählt.

Dabei wird die Kultursuspension so verdünnt, dass man in einen zählbaren

Bereich kommt. Die verdünnte Kultursuspension wird dabei auf einen speziellen

Objektträger, die Zählkammer pipettiert.

Auszählen:

Das Liniennetz der Thomazählkammern hat 25 Großquadrate. Ausgezählt werden

die 5 diagonal verlaufenden (s. Abb.).

Die Großquadrate sind ferner in 16 Kleinquadrate unterteilt. Hier werden alle Zellen

innerhalb des definierten Messbereiches gezählt.

Mitgezählt werden die an 2 (!) Kanten aufliegenden Zellen (schwarz). Die an den

anderen beiden Kanten aufliegenden Zellen werden nicht gezählt.

Der Zählvorgang erfolgt in der Reihenfolge, wie durch die Pfeile angegeben.

Aufgaben:

a) Notiere die ermittelten Zellzahlen (lebend und tot in deinem Heft)

b) Berechne den prozentualen Anteil der lebenden Zellen an der

Gesamtzellzahl

c) Erstelle ein Diagramm, in dem der Anteil der lebenden Zellen über

der Erhitzungstemperatur aufgetragen wird.

d) Erläutere dieses Diagramm.

e) Warum sind auch bei der nichterhitzten Probe tote Zellen

vorhanden?

f) In der Umwelt kommen Hefezellen überall vor. Auch auf Äpfeln sind

sie natürlicherweise vorhanden. Wie würdest Du Deinen Apfelsaft

behandeln, damit er nicht zu gären anfängt?

Abb. 4: Ausschnit eines Großquadrates mit 16 Kleinquadraten

Abb. 5 Thoma- oder Neubauer improved-Zählkammer mit 25 Großquadraten. Ausgezählt werden die 5 diagonal verlaufenden Großquadrate

Schülerseiten



4. Weiterführende Literatur:

[1] Praktikum Mikro- und Zellbiologie im Modul Biobasics BPT1, 4. Auflage, 2010, Hochschule Furtwangen: Hochsieder, G.; Lachner, K.; Paatsch, T.; Salat, U.; Seidinger, H.; Kunzelmann, H.

[2] LO - Laboroptik Ltd, Information über Zählkammern

http://www.zaehlkammer.de/pdf/info_zaehlkammern.pdf

Lehrerseiten Prozesshilfsmittel


5. Kurzbeschreibung

In diesem Versuch wird der Einfluss der Temperatur auf die Vitalität der

Hefezellen untersucht. Hierzu werden die Zellen unterschiedlich stark erhitzt,

anschließend eine Vitalitätsfärbung durchgeführt und mikroskopisch ausgewertet.

Zur Quantifizierung wird mit einer Zählkammer gearbeitet.

6. Lernziel

- Grundlagen Konservierung

- Erhitzung

- Arbeiten mit Mikroorganismen

- Mikroskopie

7. Versuchsdauer

Kalibrierung der Mikrowelle 1 Unterrichtsstunde

Lebend- /Tot Färbung: 1 Doppelstunde



8. Beispiellösungen

Versuchsvariante 1

Lebend-/Tot-Färbung

Aufgabe:

c) Notiere die Beobachtung in Deinem Heft. Ein Teil der Hefezellen ist blau gefärbt, ein Teil ungefärbt.

d) Warum sind die lebenden Zellen farblos und die toten blau? In den lebenden Zellen wird der Farbstoff Metyhlenblau umgebaut zu Leukoform, welche farblos ist.

Versuchsvariante 2

Teilversuch 1

Bestimmung des Zusammenhangs zwischen Zeiteinstellung und Temperatur in

der Mikrowelle


Die Kalibrierung muss für jede Mikrowelle individuell durchgeführt

werden.

a) Dokumentiere die ermittelten Werte in einer Tabelle in deinem Heft.

b) Erstelle eine Graphik, in der der Zusammenhang veranschaulicht wird.

20

30

40

50

60

70

80

90

0 50 100 150

Temperatur [°C]

Zeit Mikrowelle [s]



c) Wie lange muss jeweils erwärmt werden, um Temperaturen in der

Größenordnung von 20°C, 30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C und 80°C zu

erhalten?

Zei t [s]

Temp. [°C]

10 30

30 46,9

40 53,3

50 60,1

60 66

70 72,4

80 76,4

90 79,1

100 81,5

Teilversuch 2

Erhitzen von Hefezellsuspensionen

a) Notiere die ermittelten Temperaturen in deinem Heft.

Die ermittelten Temperaturen sollten größenordnungsmäßig den Werten der ermittelten Kalibrierkurve entsprechen.

Teilversuch 3

Bestimmung des Anteils vitaler /lebender Zellen

a) Notiere die ermittelten Zellzahlen (lebend und tot in deinem Heft)

Temperatur [C°]

Zellen insgesamt

lebende Zellen

Anteil lebender Zellen

[%]

20 144 102 71%

30 144 102 71%

40 113 72 64%

50 74 29 39%

60 59 16 27%

70 42 3 7%

80 48 1 2%

b) Berechne den prozentualen Anteil der lebenden Zellen an der

Gesamtzellzahl



c) Erstelle ein Diagramm, in dem der Anteil der lebenden Zellen über

der Erhitzungstemperatur aufgetragen wird.

d) Erläutere dieses Diagramm.

Mit zunehmender Erhitzungstemperatur nimmt der Anteil der

lebenden Zellen ab.

g) Warum sind auch bei der nichterhitzten Probe tote Zellen

vorhanden?

Auch Hefezellen werden nicht unendlich alt. In einer Kultur sind stets

Zellen in verschiedenen Stadien vorhanden, Zellen die sich vermehren

und Zellen die abgestorben sin.

e) In der Umwelt kommen Hefezellen überall vor. Auch auf Äpfeln sind

sie natürlicherweise vorhanden. Wie würdest Du Deinen Apfelsaft

behandeln, damit er nicht zu gären anfängt?

Erhitzen, auf mindestens 80°C

9. Anmerkungen für projektorientiertes / forschendes Arbeiten

Der Zusammenhang zwischen Temperatur und Zeit in der

Mikrowelle kann auch sehr frei formuliert werden, so dass Schüler

der Schüler sich seine Vorgehensweise selbst überlegen muss.

Dier Erhitzung kann auch auf andere Art (z.B. in Reagenzröhrchen in

einem Wasserbad) realisiert werden. Die Vorgehensweise wurde

hier so gewählt, weil die Prozedur dann vergleichbar mit dem

Versuch „Einfluss der Temperatur auf die Aktivität von

Mikroorganismen ist, und die Ergebnisse verglichen werden

können.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

20 30 40 50 60 70 80

Erhitzungstemperatur [°C]

Anteil lebender Zellen



Zur Vereinfachung könnten auch normale Objektträger eingesetzt

werden, und die Zellen in einigen mikroskopischen Gesichtsfeldern

ausgezählt werden.

Der Versuch kann insgesamt arbeitsteilig durchgeführt werden. (z.B.

jede Gruppe eine andere Temperatur)

Es könnte auch so umgesetzt werden, dass jede Schülergruppe

einen anderen Versuch zum Thema durchführt (eine Gruppe wertet

über die Lebend- / Tot-Färbung aus, eine Gruppe untersucht die

Aktiviät der Mirkoorganismen über die Gasbildung (Versuch:

Einfluss der Temperatur auf die Aktivität von Mikroorganismen)

Eine Gruppe streicht Platten aus (Versuch geplant).

Oder alternativ: Eine Gruppe untersucht jeweils:

den Einfluss der Temperatur auf Mikroorganismen

den Einfluss der Temperatur auf Enzyme (Versuch zum Einfluss der Temperatur auf Polyphenoloxidasen (sind für die enzymatische Bräunung des Apfels zuständig) ist geplant.

Dem Einfluss der Temperatur auf Vitamine (Versuch zu Vit. C ist geplant)

10. FAQ / Tips & Tricks

Eine Hefesuspension muss bereits am Tag zuvor angesetzt werden!

Alternativ zu Methylenblau können auch die Farbstoffe Eosin oder Trypanblau

eingesetzt werden.

10. Anmerkungen

In Zusammenhang mit diesem Versuch gibt es weiter die Versuche: Einfluss der

Temperatur auf die Aktivität von Mikroorganismen (als Maß für die Aktivität wird

die Gasbildung von Hefen gemessen) und Einfluss der Temperatur auf das

Wachstum der Zellen (hier werden die Proben auf Nährmedien ausplattiert).

Dieser Versuch soll eine Vorbereitung auf den Gesamtzusammenhang des

Einsatzes unterschiedlicher Erhitzungsverfahren (Pasteurisation, UHT-Erhitzung,

Sterilisation,…) sein. Es sind weitere Versuche geplant, die den Einfluss der

Hitzeeinwirkung auf weitere Produktinhaltsstoffe, z.B. Vitamine oder Enzyme

zeigen. Die übergeordnete Fragestellung ist; Wie kann ich Mikroorganismen

ausreichend inaktivieren und dabei andere Produktinhaltsstoffe schonen?

Achtung!:

Hefesuspension am Tag

vorher ansetzen!!!



11. Bezugsquellen

Apfelsaft und Backhefe könne im Supermarkt bezogen werden.

Thoma- oder Neubauer Zählkammer: im Laborbedarf erhältlich. Es sind spezielle,

dafür vorgesehene Deckgläschen erforderlich.

Preis:

Zählkammer ca. 30,00 €

10 Deckgläschen: ca. 16,00 €

10. Versuchslegende

Herausgeber: Technikinitiative NwT

Hochschule Furtwangen | Furtwangen University

Jakob-Kienzle-Str. 17

78054 Villingen-Schwenningen

http://technikinitiative-nwt.de/

[email protected]

Autor: Dipl.-Ing. (FH) Ursula Eschenhagen

Erstellt: Juni 2012

In Zusammenarbeit mit: Severin Gylstorff

http://technikinitiative-nwt.de/

mailto:[email protected]

Documents

Einfluss der Temperatur auf die Vitalität von Mikroorganismentechnikinitiative-nwt.de/wp-content/uploads/2014/12/V11... · Schülerseiten Einfluss der Temperatur auf die Vitalität