Z Lebensm Unters Forsch (1990) 190:414-419 ZeitschriR f~3r

�9 Springer-Verlag 1990

Originalarbeit

Einflufl des Erhitzens auf die Liislichkeit und das Elektrophoreseverhalten von Myoglobin Friedrich Bauer * und Klaus Hofmann

Bundesanstalt ffir Fleischforschung, Institut ffir Chemic und Physik, E.-C. Baumannstrasse 20, D-8650 Kulmbach, Federal Republic of Germany

Eingegangen am 2. Oktober 1989

Influence of heat on the solubility and the electrophoretic behavior of myoglobin

Summary.The heat stability of beef myoglobin was inves- tigated by means of its solubility and intensity of protein bands separated by isoelectric focusing. A method for the sensitive determination of myoglobin in the extracts was developed based on its ability to form a red dye by the oxi- dative coupling of 2,4-dichlorophenol and 4-aminoanti- pyrine in the presence of hydrogen peroxide. By this method, myoglobin could be determined to a concentra- tion of 0.01 mg/mI. For the detection of electro-focused myoglobins, o-dianisidine has proved to be the most sen- sitive compound. The myoglobin content of the extracts, according to the intensity of the myoglobin bands in the electrophoretic gel, decreased with increasing tempera- ture and heating-time. However, the position of the bands was not changed by the heat treatment.

Zusammenfassung. Die Hitzestabflit/it des Myoglobins bei Rindfleisch wurde anhand seiner L6slichkeit und der Intensitfit der Proteinmuster nach isoelektrischer Focu- sierung untersucht. Fiir die empfindliche Bestimmung von Myoglobin in den Extrakten wurde eine photometri- sche Methode entwickelt, die auf einer durch Myoglobin katalysierten oxidativen Kupplung von 2,4-Dichlorphe- nol und 4-Aminoantipyrin in Gegenwart yon Wasser- stoffperoxid beruht, wobei ein roter Farbstoff gebildet wird. Mit dieser Methode konnten noch Myoglobinkon- zentrationen bis 0,01 mg/ml erfal3t werden. Ffir den Nachweis der elektrofocussierten Myoglobine erwies sich o-Dianisidin von den untersuchten Substraten als am empfindlichsten. Die Myoglobingehalte der Extrakte nahmen mit steigender Hitzebelastung des Fleisches ab. Dementsprechend sank auch die Intensit/it der Myoglo- binbanden mit steigender Temperatur und zunehmender

* Gegenwiirtige Adresse: Institut ffir Fleischhygiene, Fleischtech- nologie und Lebensmittelkunde der Veterinfirmedizinischen Uni- versitfit Wien, Linke Bahngasse 11, A-1030 Wien

Offprint requests to: K. Hofmann

Dauer der Erhitzung, ihre Lage im Elektrophoresegel blieb jedoch unver/indert.

Einleitung

Beim Erhitzen von Fleisch entsteht aus dem roten Myo- globin das ffir erhitztes Fleisch typische braune Metmyo- globin. Das Eisen im Porphyrinring liegt in dreiwertiger Form vor, d. h. es wird im Fleisch von seiner urspr/inglich zweiwertigen Form zur dreiwertigen oxidiert [1]. Dariiber hinaus kommt es beim Erhitzen zu einer Proteindenatu- rierung, die zu einer mehr oder weniger starken L6slich- keitsverringerung ffihrt. Bei Myoglobin ist der Grad der Denaturierung unter anderem davon abh/ingig, ob die Erhitzung im Fleisch - d. h. in Gegenwart anderer Prote- ine - oder in einer reinen Myoglobinl6sung stattfindet. W/ihrend die meisten Sarcoptasmaproteine zwischen 40 und 60 ~ denaturieren [2], beginnt bei Myoglobin die Denaturierung erst ab 60 ~ [3, 4]. Diese Tatsache wird auch zur Abtrennung des Grogteils der Sarcoplasmapro- teine fiir die Pr/iparation von Myoglobin genutzt [5], in- dem der wfissrige Fleischextrakt ffinf min auf 55 ~ er- hitzt wird. In einer reinen w/issrigen Myoglobinl6sung ist eine Ver/inderung der Farbe des Myoglobins als Zei- chen der Denaturierung erst bei 75 ~ zu beobachten [6].

Die relative Stabilitfit der Myoglobine wird zur Tier- artenidentifizierung bei Fleisch mittels immunologischer und elektrophoretischer Methoden genutzt. So konnte Hayden [7] mit Hilfe von Antimyoglobinseren Fleisch yon Rind, Schwein und Pferd auch nach Erhitzung bis 70 ~ unterscheiden. Die Eigenfarbe der Myoglobine er- m6glicht auch eine Identifizierung vieler Tierarten bei Fleisch mit entsprechend hohem Myoglobingehalt an- hand der charakteristischen Myoglobinmuster in Elek- trophoresegelen [8-10]. Durch eine empfindliche Anf/ir- bung der Myoglobinbanden aufgrund ihrer Pseudoper- oxidaseaktivit/it kann die sogenannte Myoglobinmetho- de [10] auch bei hellem und teilweise sogar bei bis 100 ~

415

erh i tz tem Fle i sch angewende t werden [11]. N o c h nicht quan t i t a t i v un te r such t wurde j e d o c h die F rage , inwieweit die H i t z e b e h a n d l u n g des Fle isches EinfluB a u f die Pseu- dope rox idaseak t i v i t~ t und d a m i t a u f die Intensi tf i t de r Anf f i rbung der e lek t rofocuss ie r ten M y o g l o b i n e ausfibt . H ie rzu war es un te r ande rem no twendig , eine empf indl i - che M e t h o d e zur Bes t immung des M y o g l o b i n g e h a l t e s a u f g r u n d seiner Peroxidaseakt iv i t f i t zu entwickeln und verschiedene Subs t r a t e a u f ihre E ignung zur spezifischen Anf f i rbung der M y o g l o b i n b a n d e n zu prfifen.

Material und Methoden

Un tersuchungsmaterial

Rindfieisch von sichtbarem Fett- und Bindegewebe befreien, mit ei- nero Fleischwolf und einem Laborkutter fein zerkleinern.

Probenvorbereitung

methan/L] auf pH 8 einstellen.- Phosphat/Citrat-Puffer pH 5:20,2 g Citronensfiure. H20 + 35,6 g Di-Natriumhydrogenphosphat �9 2H20/L. - Acetatpuffer 1,5 mol, pH 4,7:61,5 g Natriumacetat + 45 g Eisessig/L. - Substratl6sung I: 1 g 2,4-Dichlorphenol und i g 4-Aminoantipyrin/L; Tris/Phosphatpuffer pH 8,0; unmittelbar vor der Reaktion 0,02ml Wasserstoffperoxid (35 Gew.-%)/100 ml zugeben. Substratl6sung II: 3 Teile o-Dianisidin-L6sung (3~33 g/L Ethanol) mit 7 Teilen Phosphat/Citratpuffer mischen und un- mittelbar vor Gebrauch 2 ml Wasserstoffperoxid (35 Gew.-%) je 100ml zusetzen. - Substrate: o-Tolidin-HC1, o-Tolidin, o-Dianisidin, o-Toluidin, Pyrogallol, p-Anisidin, 1,2-Phenylen- diamin, Benzidin- HC1, 3,Y,5,5'-Tetramethylbenzidin, 3-Amino-9- ethylcarbazol.

Extraktion

1 g Probe in 2 ml Extraktionspuffer in einem Zentrifugenglas mit ei- nem Stabhomogenisator (UltraTurrax) feinst verteilen und 3 h in ei- nem Wasserbad bei 37 ~ belassen und zentrifugieren (gm,x minde- �9 stens 1 500). Oberstand filtrieren, bei triiben L6sungen eine Mem- branfiltration (0,2 lim Celluloseacetatfilter) anschliel3en.

Homogenisiertes Fleisch vakuumverpacken, im Vakuumbeutel gleiehm~il3ig verteilen; dabei an die R~inder der Vakuumbeutel auf einer ebenen Unterlage als ,,Abstandshalter" zwei 3 mm dieke Glas- platten und auf die Vakuumbeutel eine stabile Kunststoffplatte le- gen; diese gegen das Fleischhomogenat driicken, bis die Fleisch- schicht die Dicke der Glasplatten angenommen hat. Die Fleischpro- ben im Wasserbad bei der gewiinschten Temperatur erhitzen. Die Beutel rasch abkiihlen und nochmals mit Hilfe eines Universalzer- kleinerers (Moulinette von Moulinex) homogenisieren; den ausge- tretenen Fleischsaft beim Homogenisieren wieder beigeben.

Erhitzungsbedingungen

Gelbereitung

Gelzusammensetzung (T=5%, C=3%, Dimension 265x125 x 0.5 mm); 10 ml Gelpuffer, 3,4 ml Acrylamid/Bis-L6sung, 6,6 ml

Wasser und 101al TEMED mischen und entgasen; vor dem Gelgiegen 20 gl Ammoniumpersulfatl6sung zusetzen; Gel mittels Capillar- oder Kassettentechnik gieBen. Das fertige Gel mindestens 2 x 30 min in dest. Wasser waschen und dann mindestens 30 min mit der Additivl6sung behandeln. Geloberfl~iche kurz mit Wasser abspfilen, anhaftende /ibersch/issige F1/issigkeit mit einem Filter- papier entfernen. Trocknen der Gele bei Raumtemperatur.

30, 60, 120, 240 min auf 65, 70, 75, 80 und 100 ~ Rehydration der Gele

Gerdte

Horizontalelektrophoresekammer; Netzgedit, leistungsstabilisiert; Kryostat; Polymerisationskassette; Filtrationsger/it ffir die Mem- branfiltration; 0,2 p.m Cellutoseacetatfilter (Sartorius); Spektral- photometer.

Reagentien

Extraktionspuffer: 1 Teil Gelpuffer und 9 Teile dest. Wasser. - Gel- puffer: 90,82 g Tris und 120 ml I mol Salzs~ure auf 1 L auffiillen, pH 8,9. - Aerylamid/Bis-L6sung: 29,2 g Acrylamid + 0,8 g N,N'- Methylenbisacrylamid/100 ml, Gemisch fiber einem Mischbettio- nenaustauscher (Amberlite MB-1) im Kiihlschrank 'aufbewahren (max. 2 Wochen haltbar). - Ammoniumpersulfatl6sung: 0,5 g Am- moniumpersulfat + 1 ml Wasser (1 Woche im Kfihlschrank halt- bar). - N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED). - Tr/iger- folien ffir Polyacrylamidgele (Gel-Fix von Serva, Heidelberg). - Re- pel-Silane (LKB). - Additivl6sung: 30 g Sorbit + 20 g Polyvinyl- pyrrolidon (MW ca. 10000)/L Wasser. - Rehydrationsl6sung: 1,2 ml Trfigerampholyte (40%) (Ampholine oder Servalyte) + 14,8 ml Glycerin-L6sung [100 ml Glycerin (87%)/L Wasser; ausrei- chend ffir ein Gel 125 x 265 x 0,5 crn]. - AnodenlSsung: 3,32 g As- paragins~iure + 3,68 g Glutamins~iure/L Wasser. - Kathodenl6- sung: 120 ml Ethylendiamin + 4,36 g Arginin (freie Base) + 3,64 g Lysin (freie Base)/L Wasser. - Tris/Phosphatpuffer pH 8:0,1 mol Phosphatl6sung (13,8 g Natrium-dihydrogenphosphat. H20/L) mit einer 0,1 mol Tris-L6sung [12,1 g Tris(hydroxymethyl)-amino-

Getrocknete Gele mit einer Deckfolie auf eine Glasplatte aufrollen, Gelkassette zusammenbauen (Kassettentechnik) und Rehydrati- onsl6sung zugeben, Rehydrationszeit 2-3 h.

Elektrophoresebedingungen

Elektrodendistanz ca. 10 cm; Vorelektrophorese; anfangs 40 V/cm bei konstanter Leistung, Ende bei Erreichen von 80 V/cm; Proben- auftrag (10 ~tl) mittels Siliconapplikatorstreifen mit sehlitzf6rmigen Offnungen ca. 2-3 cm vonder Anode; danach bei 40 V/cm elektro- phorieren, bis die Proteine ins Gel eingewandert sind (sichtbar am Myoglobin); Focussierung bei einer konstanten Leistung yon 20 W und einer Maximalspannung yon 1 700 V; Ende der Elektrophorese bei Positionsgleichheit anodisch und kathodiseh aufgetragener Myoglobine; Kiihlbadtemperatur ca. 10 ~

Pseudoperoxidasefdrbung

Gele unmittelbar naeh der Elektrophorese in der Substrat16sung II inkubieren (maximal 15 min), in der Konservierungsl6sung ca. 30 min ~iquilibrieren und lufttrocknen.

Bestimmung der Empfindlichkeit der Substrate

5 Ixl einer L6sung von Pferdemyoglobin (Konzentrationen 1, 0,1, 0,01 g/L) punktf6rmig auf ein getrocknetes 150 ~tm diekes Poly-

41.6

acrylamidgel auf Tr/igerfolie auftragen, trocknen lassen und Peroxi- dasereaktion analog der Pseudoperoxidasef/irbung durchf/ihren (Substrate und L6sungsmittel siehe Tab. 2).

M y og lob inbestimmung

250 gl Extrakt in einer Einwegkfivette mit 2,5 ml Substratl6sung I mischen und nach genau 10 min die Extinktion bei 510 nm ablesen. Als Vergleichsl6sung eine Mischung aus 250 I~1 Wasser und 2,5 ml Substratl6sung I verwenden; eine Eichkurve mit Pferdemyoglobin als Standard im Konzentrationsbereich zwischen 0,1 und 0,01 mg/ ml aufstellen. Konzentrierte Extrakte entsprechend verdfinnen oder ein geringeres Volumen zum Test einsetzen und den Rest auf 250 gl mit Wasser ergfinzen.

Ergebnisse und Diskuss ion

Einflufi der Erhitzung auf die L&fichkeit des Myoglob&s

Die herk6mmlichen Methoden ffir die Bestimmung von Myoglobin in Fleisch dienen hauptsfichlich zur Feststel- lung des Gesamtmyoglobingehaltes und zur Ermittlung des Anteiles an Oxy- und Metmyoglobin [12, 13] bei ro- hem Fleisch. Das Prinzip dieser Methoden beruht auf der Messung der Eigenfarbe des Myoglobins bei bestimmten Wellenlfingen. F/ir eine Bestimmung des geringen, nicht denaturierten Anteiles an Myoglobin bei erhitztem Fleisch ist aber die Empfindlichkeit nicht ausreichend.

Um die Abhfingigkeit des Myoglobingehaltes in Ex- trakten yon der Dauer und der Temperatur der Erhitzung zu ermitteln, wurde eine Methode zur Bestimmung gerin- ger Myoglobinkonzentrationen auf der Basis der Pseudo- peroxidaseaktivitfit des Myoglobins entwickelt. Das Prinzip dieser Methode beruht auf der durch Myoglobin katalysierten oxidativen Kupplung von 4-Aminoantipy- rin und 2,4-Dichlorphenol in Gegenwart von Wasser- stoffperoxid [14]. Dabei bildet sich der rote FarbstoffAn- tipyrylchinonimin. Die Eichkurve verl~iuft im Bereich der Myoglobinkonzentration von 0,1 und 0,01 mg/ml linear; der Korrelationskoeffizient betrfigt 0,9995.

Zur Ermittlung der Streuung der Methode wurden Proben, die jeweils 60 min lang bei 75 ~ erhitzt wurden, in folgender Weise analysiert: (A) 10 Myoglobinbestim- mungen im Extrakt einer Probe, (B) Myoglobinbestim- mung in Extrakten aus 10 verschiedenen Teilen einer Pro- be und (C) Myoglobinbestimmung in den Extrakten aus 10 verschiedenen, getrennt voneinander erhitzten Pro- ben. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen (Tabelle 1)

Tabelle 1. Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Myoglobinbe- stimmung, in erhitzten Proben (Erlfiuterungen s. Text)

.~ X m i n X m a x S W c

(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (%)

Versuch A 0,133 0,119 0,140 _+0,0057 +4,3 Versuch B 0,136 0,130 0,147 • 0,0060 ___4,4 Versuch C 0,128 0,115 0,140 + 0,0064 +5,0

2 = Mittelwert; xmi. = Minimalwert; Xm,x = Maximalwert; s = Stan- dardabweichung; V~ = Variationskoeffizient

zeigen, dab die Extraktion und Erhitzung sehr gleichm/i- Big erfolgte und nur einen geringen Anteil an der Streu- ung des Analysenergebnisses hat.

In den Abb. 1 und 2 ist der EinfluB der Erhitzungszeit von Fleisch bei verschiedenen Temperaturen auf die L6s- lichkeit des Myoglobins und die Abh~ingigkeit der Myo- globingehalte der Extrakte yon den Erhitzungstempera- turen dargestellt. Der Myoglobingehalt in den Extrakten

mg Myoglobin/ml 2

1.5

0.~

0 < v r , I

30 60 90 120 150 180 210 240

Erhitzungsdauer in min Abb. l. EinfluB der Erhitzungszeit auf die L6slichkeit von Myoglo- bin bei verschiedenen Temperaturen. o 65 ~ [] 70 ~ zx 75 ~

80~ ~ IO0~

mg Myoglobin/ml

1

Z

0.5 ~

0 ~ i , , ,

65 70 75 80 85 90 95 100

Temperatur ~ Abb. 2. EinfluB der Temperatur auf die L6slichkeit von Myoglobin bei verschiedenen Erhitzungszeiten. o 30 min; [] 60 rain; zx 120 rain; x 240 min

417

nimmt mit zunehmender Erhitzungszeit und steigender Temperatur ab. Der Grad der Denaturierung des Myo- globins ist zwischen 65 und 75 ~ am gr6Bten. Bei 100 ~ liegen die Myoglobingehalte nur mehr zwischen 1-4% der bei 65 ~ ermittelten Werte. Diese Ergebnisse zeigen, dab die Denaturierung des Myoglobins in Fleisch bis 75 ~ bei normalen pH-Werten (pH 5,5) weitgehend ab- geschlossen ist. Im Gegensatz dazu tritt in wfissrigen Myoglobinl6sungen bei gleichem pH-Wert eine deutliche Denaturierung erst ab 75 ~ ein [3, 6]. Die Ursache der Verringerung der Hitzestabilit/it liegt in der Gegenwart anderer Proteine, wie z.B. in Modellmischungen aus Myoglobin und Rinderserumalbumin nachgewiesen wer- den konnte [4].

Untersuchung yon Substraten fiir den Myoglobinnachweis im Elektrophoresegel

Zur Erprobung verschiedener Substrate ffir den Nach- weis von Myoglobin wurden in erster Linie solche ausge- w/ihlt, die bereits in der Literatur fiir den Peroxidase- und H/imoglobinnachweis als besonders empfindlich be- schrieben wurden [15-17]. Da auch Arbeitsvorschriften ffir die Impr/ignierung yon Filterpapier zum Nachweis von Peroxidasen mittels der Abklatschtechnik angegeben sind [16, 17], muBte oft auch die L6sungsmittelzusam- mensetzung ge/indert werden, um einen direkten Nach-

Tabelle 2. Empf indl ichkei t verschiedener Subs t ra te ffir die Sicht- b a r m a c h u n g von H~imoprote inen in Polyacrylamidgelen. F~irbung: + = intensiv, _ = schwach, - = keine F g r b u n g

Subs t ra t Subst ra t - L6- Myoglob in - konzen- sungs- konzen t r a t i onen t ra t ion mittel % 1 g /L 0,1 g /L 0,01 g /L

o-Dianis id in 0,1 A + + _+ o-Dianis id in ges. A + + _+ o-Tol idin �9 HC1 1 D + § - o-Tol idin �9 HC1 0,3 D § § + o -To l id in ' HC1 0,1 D + + _ o -Tol id in . HC1 0,1 C _+ - - Benzidin �9 HC1 0,1 D + -t- - o-Tol idin 0,1 A + + - Pyrogal lol 0,1 a A § -- -- p -Anis id in 0,1 ~ A + - - 1 ,2-Phenylen- 0,1" A + -t- -

d iamin o-Tolu id in 1 C + + - o -Dianis id in 0,1 B § _+ - o-Tol idin 0,1 B + - - 3,3 ' ,5,5 '-Tetra- 0,1 a A § § +

methy l - benzidin

3-Amino-9-ethyl- 0,1 a A + -I- - carbazol

A: 3 Teile E thanol + 7 Teile Phospha t /Ci t ra t -Puf fe r p H 5. B: 7 Teile E thano l + 2 Teile 1,5 tool Ace ta tpuf fe r p H 4,7 + 2 Teile Wasser . C: Phospha t /C i t r a t -Pu f f e r p H 5. D: Wasser . Z u je 100 ml dieser Subs t r a t l 6 sungen 2 ml Wasse r s to f fpe rox id (35 Gew. -%) zugeben a Nich t vollst/ indig gel6st

weis im Polyacrylamidgel zu erm6glichen. Die Ergebnisse der halbquantitativen Ermittlung der Nachweisgrenzen sind in Tabelle 2 dargestellt. Am gfinstigsten erwies sich o-Dianisidin in einer Konzentration von 0,1% in der an- gegebenen Ethanol/Puffer-Mischung als L6sungsmittel. Die Verwendung einer ges/ittigten o-Dianisidin-L6sung brachte keine Empfindlichkeitsteigerung. o-Tolidin. HC1 in Wasser w/ire zwar hinsichtlich der Empfindlichkeit als Substrat geeignet, bei der F/irbung im Elektrophoresegel kommt es aber zu einer Substratpr/icipitation im basi- schen pH-Bereich des Gels, die nur schwer auszuwaschen ist und die Handhabung der F/irbung erschwert. AuBer- dem sind die Randzonen der Banden nicht scharf abge- grenzt, o-Tolidin. HC1 in einem Citrat/Phosphat-Puffer, Benzidin. HC1 in Wasser und o-Tolidin, Pyrogallol, p- Anisidin sowie 1,2-Phenylendiamin eignen sich ebenso- wenig ffir einen empfindlichen Nachweis von Myoglobi- nen wie das von Kinzkofer u. Radola [17] empfohlene o- Toluidin zur direkten Sichtbarmachung von Peroxidasen in ultradfinnen Polyacrylamidgelen. Bei Verwendung des Substratpuffers nach Owen [15] wurde bei o-Dianisidin und o-Tolidin nut eine um eine Zehnerpotenz geringere Empfindlichkeit erreicht. Ein Nachteil dieser Substrate liegt in ihrer Toxizit/it (Carcinogenit/it). Das von Allen [18] vorgeschlagene 3-Amino-9-Ethylcarbazol ist ffir den Myoglobinnachweis bei erhitztem Fleisch zu wenig emp- findlich. 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin, das schon als nicht-carcinogenes Substrat zur Bestimmung von Peroxi- dasen [19] und H/imoglobin [20] eingesetzt wurde, ist ffir diese Zwecke nicht geeignet, weil der gebildete Farbstoff im Gel keinen unl6slichen Komplex bildet und teilweise schon w/ihrend der F/irbung wieder ausgewaschen wird. Voraussetzung ffir ein geeignetes Substrat ist neben einer m6glichst hohen Empfindlichkeit die Bildung eines un- 16slichen Farbstoffs, der bei der Trocknung und der La-

Peakfl&che [mm 2] 140

120

100

80

60

40

20

O< 0 0.5 1 1.5 2

mg Myoglobin/ml

Abb. 3. Abhfingigkei t der Earbintensi t f i t der mi t o-Dianisidi:n ange- Nrb t en M y o g l o b i n b a n d e n yon der Konzen t ra t ion ; dens i tometr i - sche Auswer tung bei 525 n m

418

Abb. 4. Pherogramm elektrofocussierter Myoglobine von unterschiedlich erhitztem Rindfleisch; Erhitzungszeiten je Temperatur yon links nach rechts: 30, 60, 120 und 240 min. #) Zusatz von Kaliumhexacyanoferrat (III) zum Extrakt der 30 rain bei 65 ~ (links) und der 30 min bei 70 ~ (rechts) erhitzten Fleischproben. Pseudoperoxidasef/irbung mittels H20 z und o-Dianisidin

gerung der Gele weder an Intensit/it verliert noch seine Farbe/indert. Die mit o-Dianisidin gef/irbten Myoglo- binbanden wurden in einem Konzentrationsbereich von 0-2 mg/ml densitometrisch ausgewertet. Dabei zeigte sich, dal3 die F/irbung der Myoglobine mit diesem Sub- strat nur bis etwa 0,2 mg/ml dem Lambert-Beer'schen Gesetz entspricht (Abb. 3).

Einflufl der Erhitzung auf die elektrophoretischen Eigenschaften des Myoglobins

Bei der isoelektrischen Focussierung der Myoglobine aus erhitztem Fleisch zeigt sich, dal3 die Intensit/it der Ban- den mit zunehmender Dauer der Erhitzung bei gleicher Temperatur bzw. mit zunehmender Temperatur bei glei- cher Erhitzungsdauer abnimmt (Abb. 4). Die Lage der Banden im Gel bleibt dabei allerdings unverindert (die- set Befund ist ffir die Beurteilung der Myoglobinrnuster im Rahmen der Tierartenidentifizierung von grundlegen- der Bedeutung[). Bei 2 bis 4stiindiger Erhitzung der Fleischhomogenate im siedenden Wasserbad war keine F/irbung der Myoglobinbanden mehr erkennbar. Zu ei- ner Verringerung der Bandenzahl kommt es dadurch, da l die bei schwaeher Hitzebelastung noch erkennbaren Myoglobine bei st/irkerer Erhitzung nicht mehr siehtbar gemacht werden k6nnen. Die sehr schwachen Banden der Proben, die auf 100 ~ erhitzt wurden, werden nach ge- eigneter Konzentrierung der Extrakte wieder deutlich sichtbar. Geeignete Konzentrierungsmethoden sind da- bei die Ultrafiltration und die Adsorption an Hydroxyla- patit. Bis zu einer 30miniitigen Erhitzung der Fleischpro- ben auf 70 ~ k6nnen die elektrofocussierten Myoglobi- ne noch an ihrer Eigenfarbe im Gel erkannt werden. Die- se Ergebnisse zeigen, dab auch beim Erhitzen tiber 65 ~ kein Verlust der elektrophoretischen Mobilit/it eintritt, wie von Roberts u. Lawrie [21] zur Erkl/irung des Fehlens von Myoglobinbanden in ihren Untersuchungen ange- nommen wurde. Das Auftreten mehrerer Myoglobinban- den ist, wie schon an anderer Stele beschrieben [22-24], mit Ladungsisomeren zu erkl/iren. Da das Eisen im er- hitzten Myoglobin ausschliel31ich in der dreiwertigen Form vorliegt [1], ist auch ein Zusatz von Kaliumhexacya-

noferrat (III) zur vollstindigen Oxidation nicht notwen- dig. Die Bandenmuster eines unbehandelten und eines mit Kaliumhexacyanoferrat (III) behandelten Extrakts sind identisch (Abb. 4). Da die Abhingigkeit der Anf/ir- bung der Myoglobine von der Konzentration nut in ei- nem geringen Bereich linear ist (Abb. 3), wurde eine Be- stimmung der prozentualen Verteilung der Myoglobini- someren nicht durchgefiihrt. Im Hinblick auf die Tierar- tenidentifizierung bei erhitztem Fleisch ist hervorzuhe- ben, dab aufgrund der Stabilit/it der Myoglobine der Nachweis einer Spezies bei m/il3ig (bis 100 ~ erhitztem Material anhand unerhitzter Referenzproben m6glich ist.

Schlufifolgerung

Die L6slichkeit der Myoglobine nimmt mit zunehmender Temperatur und steigender Erhitzungsdauer ab. Auf der Peroxidaseaktivit/it des Myoglobins basiert eine Metho- de zur Myoglobinanalyse, mit deren Hilfe noch 0,01 rag/ ml Myoglobin bestimmt werden k6nnen. Die elektrofo- cussierten Myoglobine aus erhitztem Fleisch k6nnen auf- grund ihrer Peroxidaseaktivit/it spezifisch sichtbar ge- macht werden, wobei sich o-Dianisidin als das empfind- lichste Substrat erwies. Die Intensit/it der Myoglobinban- den nimmt mit zunehmender Hitzebelastung ab, ihre La- ge im Elektrophoresegel/indert sich dabei nicht.

Danksagung. Der Erstautor dankt dem Fond zur F6rderung der wissenschaftlichen Forschung, Wien (Osterreich), fiir die Gew/ih- rung eines Erwin-Schr6dinger-Auslandsstipendiums.

Literatur

1. Tappel AL (1957) Food Res 22:404 2. Hamm R (1966) In: Briskey EJ, Cassens RG, Trautman JC

(eds) Physiology and biochemistry of muscle as food. University of Wisconsin Press, Madison, Wisconsin, p 363

3. Bernofsky C, Fox JB, Schweigert BS (1959) Food Res 24:339 4. Ledward DA (1971) J Food Sci 36:883

5. Snyder HE, Ayres JC (1961) J Food Sci 26:469 6. Satterlee LD, Zachariah NY (1972) J Food Sci 37:909 7. Hayden AR (1979) J Food Sci 44:494 8. H6yem T, Thorson B (1970) J Agric Food Chem 18:737 9. Sinclair AJ, Slattery MJ (1982) Aust Vet J 58:79

10. Hofmann K, Bliichel E (1986) Fleischwirtschaft 66:916 11. Bauer F, Hofmann K (1987) Fleischwirtschaft 67:861 12. Broumand l-I, Ball CO, Stier EF (1958) Food Technol 12:65 13. Zuk~tl E, Hamm R (1968) Fleischwirtschaft 48:185 14. Barham D, Trinder P (1972) Analyst 97:142 15. Owen JA, Silberman HJ, Got C (1958) Nature 182:1373

41q

16. Delincee H, Radola BJ (1972) Anal Biochem 48:536 17. Kinzkofer A, Radola BJ (1983) Electrophoresis 4:408 18. Allen RC, Saravis CA, Maurer HR (1984) Gel Electrophoresis

and Isoelectric Focusing of Proteins. de Gruyter, Berlin, p 235 19. Andrews PC, Krinsky NI (1982) Anal Biochem 127:346 20. Liem HH, Cardenas F, Tavassoli M, Poh-Fitzpatri~ MB, Mul-

ler-Eberhard U (1979) Anal Biochem 98:388 21. Roberts PCB, Lawrie RA (1974) J Food Technol 9:345 22. Quinn JR, Pearson AM, Brunner JR (1964) J Food Sci 29:422 23. Quinn JR (1973) J Food Sci 38:289 24. Satterlee LD, Snyder HE (1969) J Chromatogr 41:417