Einfluss von Arsenverbindungen auf die Funktion der DNA

Einfluss von Arsenverbindungen auf die

Funktion der DNA-Reparaturproteine

Fpg, XPA und PARP-1

vorgelegt von

Diplom-Lebensmittelchemiker

Ingo Walter aus Überlingen

Von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

Der Technischen Universität Berlin (TU)

Zur Erlangung des akademischen Grades

DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN

- Dr. rer. nat. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. L. W. Kroh

Berichter: Prof. Dr. A. Hartwig

Berichter: Prof. Dr. B. Epe

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 4. Mai 2007

Berlin 2007

D 83

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung............................................................................................ 1

2. Einleitung........................................................................................................... 3

2.1 Thematische Einführung .............................................................................. 3

2.2 Arsen............................................................................................................ 4 2.2.1 Vorkommen und Verwendung .......................................................................................... 5 2.2.2 Toxikokinetik ..................................................................................................................... 6 2.2.3 Toxische Wirkungen ......................................................................................................... 8 2.2.4 Genotoxizität von Arsenverbindungen.............................................................................. 9

2.3 Zinkfingerproteine in der DNA-Reparatur ................................................... 10 2.3.1 Die Basenexzisionsreparatur und das Fpg-Protein........................................................ 11 2.3.2 Die Nukleotidexzisionsreparatur und das XPA-Protein .................................................. 14 2.3.3 Poly(ADP-Ribose)polymerase........................................................................................ 16

3. Fragestellung................................................................................................... 22

4. Material und Methoden ................................................................................... 23

4.1 Zellkultur..................................................................................................... 23 4.1.1 Zellen .............................................................................................................................. 23 4.1.2 Koloniebildungsfähigkeit ................................................................................................. 23

4.2 Inkubationslösungen .................................................................................. 24

4.3 Präparation von PM2-DNA......................................................................... 25 4.3.1 Reaktivierung der Phagen .............................................................................................. 25 4.3.2 Plaque-Test zur Bestimmung des Phagentiters ............................................................. 26 4.3.3 PM2-Präparation............................................................................................................. 26

4.4 DNA-Relaxationstest .................................................................................. 29 4.4.1 Versuchsdurchführung.................................................................................................... 29

4.5 Zinkfreisetzung aus XPAzf ......................................................................... 31 4.5.1 Versuchsdurchführung.................................................................................................... 31

4.6 DNA-Bindungsaktivität von XPA mittels Gelshift ........................................ 32 4.6.1 Versuchsdurchführung.................................................................................................... 33

4.7 Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen .............................................. 34 4.7.1 Versuchsdurchführung.................................................................................................... 34 4.7.2 Auswertung am Fluoreszenzmikroskop.......................................................................... 35

4.8 PARP-1 Proteingehalt ................................................................................ 36 4.8.1 Versuchsdurchführung.................................................................................................... 36

II Inhaltsverzeichnis

4.9 Isolierung von PARP-1 ............................................................................... 38 4.9.1 Infektion der Sf9-Zellen................................................................................................... 38 4.9.2 Aufreinigung rekombinanter PARP-1 ............................................................................. 38

4.10 Poly(ADP-Ribosyl)ierung isolierter PARP-1 ............................................... 40 4.10.1 Versuchsdurchführung.................................................................................................... 40

5. Ergebnisse und Diskussion ........................................................................... 42

5.1 Eingesetzte Arsenverbindungen ................................................................ 42

5.2 Zytotoxizität ................................................................................................ 44

5.3 Einfluss auf die Aktivität von Fpg................................................................ 48

5.4 Einfluss auf XPA......................................................................................... 52

5.5 Einfluss auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung .................................................. 55 5.5.1 Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3-Zellen.................................................................. 55 5.5.2 Einfluss der Arsenverbindungen auf die DNA-Schadensinduktion durch H2O2 und auf

die Genexpression der PARP-1 ..................................................................................... 64 5.5.3 Bestimmung des Proteingehalts von PARP-1................................................................ 67 5.5.4 Poly(ADP-Ribosyl)ierung isolierter PARP-1 ................................................................... 73

6. Zusammenfassende Diskussion und Ausblick ............................................ 78

7. Literatur............................................................................................................ 86

8. Anhang............................................................................................................. 97

8.1 Abkürzungsverzeichnis .............................................................................. 97

8.2 Liste der verwendeten Chemikalien ......................................................... 101

8.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchsmatrialien ........................ 105

8.4 Verwendete Puffer und Lösungen............................................................ 108 8.4.1 Zellkultur ....................................................................................................................... 108 8.4.2 PM2-Isolierung.............................................................................................................. 108 8.4.3 DNA-Relaxationstest .................................................................................................... 110 8.4.4 XPA-Zinkfreisetztung.................................................................................................... 111 8.4.5 XPA-Gelshiftassay........................................................................................................ 111 8.4.6 Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen ................................................................ 112 8.4.7 PARP-1 Proteingehalt................................................................................................... 113 8.4.8 PARP-1 Isolierung ........................................................................................................ 114 8.4.9 Poly(ADP-Ribosyl)ierung isolierter PARP-1 ................................................................. 115

8.5 Vergleich Methyloxoarsin-Diiodomethylarsin............................................ 117

8.6 Qualitätsprüfung der isolierten PM2-DNA ................................................ 119

8.7 Hemmung isolierter PARP-1 durch CuSO4 .............................................. 120

Inhaltsverzeichnis III

Publikationsliste ................................................................................................... 121

Lebenslauf............................................................................................................. 126

Danksagung.......................................................................................................... 127

Zusammenfassung 1

1. Zusammenfassung

In weiten Teilen der Welt sind Millionen von Menschen einer Exposition von Arsen

über das Trinkwasser ausgesetzt. Nach chronischer Arsenexposition kann es neben

anderen Krankheiten zu einer Krebsentstehung in verschiedenen Organen kommen.

Es wird davon ausgegangen, dass vor allem die Induktion von oxidativen DNA-

Schäden und die Hemmung von DNA-Reparaturprozessen eine entscheidende Rolle

in der nach wie vor nicht vollständig verstandenen arseninduzierten Kanzerogenese

spielt. In den letzten Jahren wurden reaktive methylierte Metabolite im menschlichen

Urin nachgewiesen, die ein ähnliches oder sogar höheres genotoxisches Potential

als das anorganische Arsenit besitzen. Da Arsen eine hohe Affinität zu Thiolgruppen

besitzt, stellen so genannte Zinkfingerstrukturen, in denen Zink durch vier Cystein-

und/oder Histidin-Reste komplexiert wird einen potentiellen Angriffspunkt dar. In der

vorliegenden Arbeit werden daher die drei DNA-Zinkfinger-Reparaturproteine

Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fpg), Xeroderma Pigmentosum Protein A

(XPA) und Poly(ADP-Ribose)polymerase-1 (PARP-1) auf ihre Wechselwirkungen mit

Arsenverbindungen untersucht.

In einem ersten Versuch konnte für die bakterielle Fpg gezeigt werden, dass alleine

die methylierten dreiwertigen Arsenverbindungen monomethylarsonige Säure

(MMA(III)) und dimethylarsinige Säure (DMA(III)) in mikromolaren bis millimolaren

Konzentrationen in der Lage sind eine Hemmung hervorzurufen, während Arsenit

und die fünfwertigen Metabolite Monomethylarsonsäure (MMA(V)) und

Dimethylarsinsäure (DMA(V)) keine Reaktion zeigten. Eine Koinkubation mit Zink

konnte die durch DMA(III) induzierte Fpg-Hemmung reduzieren, was einen ersten

Hinweis auf die Beteiligung der Zinkfingerstruktur von Fpg gibt.

Im Falle von menschlichem XPA wurde zunächst untersucht, inwieweit die

Arsenverbindungen in der Lage sind, Zink aus einer synthetischen Zinkfingerdomäne

freizusetzen. Auch hier zeigten ausschließlich die dreiwertigen Verbindungen eine

Zinkfreisetzung, wobei die methylierten Metabolite stärker reagierten als

anorganisches Arsenit. Für DMA(III) konnte zusätzlich gezeigt werden, dass die

Bindung von murinem XPA an DNA in hohen millimolaren Konzentrationen gestört

wird.

Ausgehend von diesen Versuchen mit den isolierten Zinkfingerproteinen Fpg und

XPA, wurde anschließend auch eine Hemmung eines Zinkfingerproteins unter

2 Zusammenfassung

zellulären Bedingungen untersucht. Als ein möglicher erster molekularer Ansatzpunkt

konnte kürzlich die zwei Zinkfingerstrukturen enthaltende PARP-1 identifiziert

werden, die zum Großteil für die Poly(ADP-Ribosyl)ierung von verschiedenen

Zielproteinen und damit für die Regulation wichtiger zellulärer Mechanismen wie der

DNA-Reparatur verantwortlich ist. Der Einfluss von Arsenit und seinen methylierten

Metaboliten auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung wurde in menschlichen HeLa S3 Zellen

mittels immunfluorimetrischer Quantifizierung der Poly(ADP-Ribose) nach vorheriger

Stimulierung durch H2O2 mikroskopisch bestimmt. Arsenit und seine dreiwertigen

methylierten Metabolite reduzieren die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in niedrigen

nanomolaren, nicht zytotoxischen Konzentrationen, während die fünfwertigen

methylierten Metabolite bis zu einer Konzentration von

500 µM keinen Effekt zeigten. Die methylierten Metabolite verursachten die

Hemmung schon in 10-fach tieferen Konzentrationen verglichen mit Arsenit. In

weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass die beobachtete Hemmung weder

auf eine zeitliche Verschiebung des Poly(ADP-Ribose)-Signals, noch auf eine

veränderte Aktivierung der PARP-1 durch H2O2-induzierte Strangbrüche oder eine

veränderte Gen- oder Proteinexpression zurückzuführen ist. Anschließend wurden

Versuche mit isolierter PARP-1 durchgeführt, um zu überprüfen, ob es wirklich zu

direkten Interaktionen der Arsenverbindungen mit dem Protein kommt. Die

festgestellte Hemmung durch die dreiwertigen Arsenverbindungen lag jedoch bei

höheren Konzentrationen als im zellulären System.

Die Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch dreiwertige Arsenverbindungen ist

sowohl im zellulären, wie auch im isolierten System die bisher sensitivste

enzymatische Reaktion, die direkt mit der Reparatur der DNA verbunden ist.

Zusammen mit der Hemmung anderer DNA-Reparatur-Zinkfingerproteine wie XPA

oder möglicherweise menschlichen Homologen von Fpg speziell durch die

dreiwertigen methylierten Arsenmetabolite MMA(III) und DMA(III) könnte sie damit

einen entscheidenden Mechanismus der arseninduzierten Genotoxizität darstellen.

Einleitung 3

2. Einleitung

2.1 Thematische Einführung

Metallionen und Metallverbindungen sind in der Umwelt ubiquitär verbreitet. Viele

von ihnen, wie Zink, Kupfer, Eisen oder Selen spielen als essentielle

Spurenelemente eine wichtige Rolle in biologischen Systemen. Im Gegensatz dazu

konnten für Verbindungen von Arsen, Nickel, Cadmium oder Blei teilweise starke

toxische Effekte, wie eine erhöhte Tumorinzidenz festgestellt werden

(zusammengefasst in Hartwig, 2000). Eines der größten Umweltprobleme auf diesem

Gebiet ist die chronische Belastung von weltweit über 200 Millionen Menschen durch

arsenbelastetes Trinkwasser. Zahlreiche Studien belegen einen Zusammenhang

zwischen dem Arsengehalt im Trinkwasser und dem vermehrten Auftreten von

verschiedenen Krebsarten sowie anderen Krankheiten, wie z.B. der endemischen

blackfoot desease (Yoshida et al., 2004). Aufgrund dieser Studien wurde Arsen

international von der IARC und in Deutschland von der Senatskommission zur

Prüfung gesundheitlicher Arbeitsstoffe der DFG („MAK-Kommision“) als

Humankanzerogen eingestuft (IARC, 1980; DFG, 2004).

Die grundlegenden biochemischen Mechanismen der arseninduzierten

Kanzerogenese sind jedoch nach wie vor nicht vollständig geklärt. Als mögliche

Ursachen werden sowohl direkt genotoxische Effekte, wie die durch reaktive

Sauerstoffspezies (ROS) vermittelte Induktion von DNA-Schäden, aber auch

indirekte Effekte wie ein Einfluss auf die Genexpression oder die Hemmung von

DNA-Reparaturmechanismen diskutiert (Gebel, 2001). Im menschlichen Körper

existieren zur Entfernung endogener und exogener DNA-Schädigung eine Reihe von

Reparaturmechanismen, wie die Basenexzisionsreparatur (BER), die

Nukleotidexzissionsreparatur (NER), die Mismatchreparatur (MMR) oder die

Doppelstrangbruchreparatur. Während die BER für die Reparatur von oxidativen

DNA-Schäden, die NER für großräumige Helixverzerrungen, wie sie durch UVC-Licht

oder Benzo[a]pyren verursacht werden, die MMR für Basenfehlpaarungen aufgrund

von Replikationsfehlern zuständig sind, können Doppelstrangbrüche in der DNA nur

noch durch rekombinatorische Mechanismen oder nichthomologe End-zu-End-

4 Einleitung

Verknüpfung repariert werden (Friedberg et al., 2006). Die Aufrechterhaltung der

DNA-Reparatur ist essentiell für die genomische Stabilität.

Für Arsenit konnte die Hemmung von verschiedenen DNA-Reparatursystemen, wie

die Reparatur oxidativer, UVC- oder Benzo[a]pyren-induzierter DNA-Schäden

gezeigt werden (Hartwig et al., 1997; Gebel, 2001; Schwerdtle et al., 2003a). Als ein

möglicher molekularer Ansatzpunkt sind die an vielen DNA-Reparaturwegen

beteiligten Zinkfingerproteine identifiziert worden, in denen Zink durch 4 Cystein-

und/oder Histidin-Reste komplexiert wird. So konnte gezeigt werden, dass Arsenit die

an der BER beteiligte und hauptsächlich durch das Zinkfingerenzym Poly(ADP-

Ribose)polymarse-1 (PARP-1) katalysierte Poly(ADP-Ribosyl)ierung schon in extrem

niedrigen Konzentrationen hemmt (Hartwig et al., 2003).

In der vorliegenden Arbeit soll geklärt werden, ob alleine das anorganische Arsenit

oder auch die im menschlichen Körper gebildeten methylierten Metabolite, deren

Bildung lange Zeit als Detoxifizierung angesehen wurde, für die Hemmung von

Zinkfingerproteinen verantwortlich ist. Hierzu wurde die Interaktion der

Arsenverbindungen mit den drei Zinkfingerproteinen Formamidopyrimidin-DNA-

Glycosylase (Fpg), Xeroderma Pigmentosum Protein A (XPA) und Poly(ADP-

Ribose)polymerase-1 (PARP-1) in zellulären und in subzellulären Systemen

untersucht.

2.2 Arsen

Arsen mit der Ordnungszahl 33 steht in der 5. Hauptgruppe des Periodensystems

und besitzt sowohl metallischen als auch nicht-metallischen Charakter und wird

daher als Halbmetall bezeichnet. Elementares Arsen ist in der Natur selten zu finden,

jedoch kommt es in zahlreichen, vor allem sulfidischen und oxidischen Mineralien

(Arsenkiese) in der Erdkruste in den Oxidationsstufen -3, +3 und +5 vor (Hollemann

und Wieberg, 1995). Seine mittlere Konzentration in der Erdkruste wird auf 1-2 mg/kg

geschätzt, wobei es lokal zu extrem hohen Arsenkonzentrationen im Boden kommen

kann (Matschullat, 1999).

Einleitung 5

2.2.1 Vorkommen und Verwendung

Der Name des schon im Altertum in der Heilkunde, später im Mittelalter und der

Renaissance vor allem als Mordgift, verwendeten Arsens leitet sich vom persischen

Namen az-zarnikh (zar = Gold) bzw. vom griechischen Namen arsenikon für das

Mineral Auripigment (As2S3) ab (Hollemann und Wieberg, 1995).

Das im Boden natürlich vorkommende Arsen gelangt durch Verwitterung, Erosion

und Vulkanismus in das Grundwasser und die Luft. In der Luft tritt Arsen vor allem

nach Vulkanausbrüchen, durch Verhüttung von arsenhaltigen Metallerzen sowie

durch Verbrennen von arsenbelasteter Kohle in Form des partikulären Arsentrioxids

(As2O3) auf. Im Trinkwasser dominieren die anorganischen Formen Arsenit und

Arsenat, die in belasteten Gebieten der Erde wie Bangladesch, Indien, Taiwan, Chile,

Argentinien, Mexiko oder in den USA in Konzentationen bis zu 4 mg/l vorkommen

können. Die weltweite Arsenbelastung über das Trinkwasser gehört zu unseren

größten Umweltproblemen. In vielen Teilen der Erde wird der WHO-Grenzwert von

10 µg/l weit überschritten, was alleine in Indien zu 30 Millionen arsenbelasteten

Menschen führt (NRC, 1999; NRC, 2001). Aufgrund einer Konzentration von

anorganischem Arsen von ca. 1,5 µg/l im Meerwasser wird Arsen nach

Metabolisierung auch in Form von organischen Verbindungen als Arsenocholin,

Arsenobetain oder Arsenozucker in marinen Lebewesen wie Algen oder Fischen

gefunden. Durch Verstoffwechselung von anorganischen Arsen durch zahlreiche

Mikroorganismen können zudem methylierte Arsenmetabolite in die Natur

eingebracht werden (NRC, 1999; NRC, 2001; Chou und De Rosa, 2003).

Die „Giftigkeit“ von Arsen wurde in zahlreichen Anwendungen, wie z.B. als

Konservierungs- oder Unkrautvertilgungsmittel, Pestizid (DMA(V), Kakodylsäure)

oder zur Druckimprägnierung von Bauholz in Form von chromiertem Kupferarsenat

(CCA) eingesetzt. Solche Anwendungen sind heute jedoch für viele Bereiche

verboten und rückläufig. In der Industrie wird Arsen mittlerweile vor allem in der

Glasindustrie als Läuterungsmittel, sowie als Legierungsbestandteil in der

Halbleitertechnik als Gallium- oder Indiumarsenit eingesetzt (Chou und De Rosa,

2003). Traditionell wurde Arsen in der Medizin als Fowler’sche Lösung (1%ige

K2AsO3) eingesetzt und findet heute noch Anwendung zur Behandlung der

Schlafkrankheit und von Leukämie (Tallman, 2004).

6 Einleitung

2.2.2 Toxikokinetik

Hauptexpositionsquellen bei oraler Aufnahme sind für Arsenverbindungen das

Trinkwasser und die Nahrung. In Deutschland enthält das Trinkwasser nur geringe

Mengen an Arsen, so dass die Aufnahme über die Nahrung bei beruflich nicht

belasteten Menschen zu über 90% zu der Gesamtarsenexposition beiträgt (ATSDR,

1993). Arsenbelastete Lebensmittel sind vor allem Meeresfische, Krusten- und

Schalentiere oder auch Meeresalgen wie sie z.B. in Sushi verarbeitet werden. Bei

der oralen Aufnahme wird davon ausgegangen dass es zu einer fast vollständigen

Resorption kommt, so dass eine amerikanischen Studie auf eine tägliche

Gesamtarsenaufnahme von 27-92 mg kommt, darunter 4-14 µg anorganisches Arsen

(WHO, 2001).

Neben der oralen Exposition spielt bei der inhalativen Aufnahme von Arsen neben

dem Rauchen vor allem die berufliche Exposition eine wichtige Rolle. So findet man

in der Umgebung von Kohlekraftwerken oder Kupferhütten zwischen 1400 und

160000 ng/m3 Arsen, während in ländlichen Gebieten nur 1-5 ng/m3 nachgewiesen

wurden (LAI, 1993). Die Resorptionsrate der vor allem aus As2O3 bestehenden

Partikel ist schwer zu bestimmen und liegt zwischen 30 und 90% (WHO, 1987).

Arsen wird zunächst im Körper in allen Organen und Geweben verteilt, wobei Leber,

Niere, Milz und Lunge akut hohe Arsenspiegel aufweisen können. Die langfristige

Anreicherung von Arsen erfolgt vor allem im Skelett, den Haaren, den Nägeln und

der Haut. Für eine Abschätzung der chronischen Arsenexposition dient daher oft die

Arsenkonzentration in den Nägeln (WHO, 2001).

Anorganische Arsenverbindungen werden vom Menschen und den meisten

Säugetieren zu methylierten Metaboliten verstoffwechselt. Zunächst erfolgt im

Plasma nahezu quantitativ die schnelle Reduktion von fünfwertigem Arsenat zu

dreiwertigem Arsenit. Arsenit wird anschließend in der Leber zu den fünfwertigen

Hauptmetaboliten Monomethylarsonsäure (MMA(V)) und Dimethylarsinsäure

(DMA(V)) methyliert. Welchen Anteil die reaktiven dreiwertigen Zwischenprodukte

monomethylarsonige Säure (MMA(III)) und dimethylarsinige Säure (DMA(III))

ausmachen ist aufgrund ihrer komplizierten Analytik umstritten (Vahter, 1999). Die

einzelnen enzymatischen und evtl. nicht-enzymatischen Schritte des

Arsenmetabolismus sind nach wie vor nicht vollständig aufgeklärt (Abbildung 1). So

wird diskutiert, ob neben den genannten methylierten Metaboliten weitere GSH-

Einleitung 7

konjugierte (Hayakawa et al., 2005) oder Schwefelarsenmetabolite (Hansen et al.,

2004) entstehen können. Die organischen Arsenverbindungen, wie sie z.B. aus

fischreicher Nahrung stammen, werden im Gegensatz dazu nicht oder nur schwach

umgesetzt (NRC, 1999).

O-

OH

OHO AsV

Arsenat

Arsenat-Reduktase

GSH OH

O-

CH3O AsV

MMA(V)

Reduktase

GSSG

OH

OH

CH3AsIII

MMA(III)

MMA(V)-Methyltransferase

OH

CH3CH3 AsIII

DMA(III)

CH3

CH3

O-

O AsV

DMA(V)

OH

OH-O AsIII

Arsenit

SAHC

Arsenit-Methyltransferase

SAM

GSH

GSSG

SAM

SAHC

Ausscheidung über den Urin

10 - 20%

10 - 20%

? %

60 - 80%? %

O-

OH

OHO AsV

Arsenat

Arsenat-Reduktase

GSH OH

O-

CH3O AsV

MMA(V)

Reduktase

GSSG

OH

OH

CH3AsIII

MMA(III)


OH

CH3CH3 AsIII

DMA(III)

CH3

CH3

O-

O AsV

DMA(V)

OH

OH-O AsIII

Arsenit

SAHC


SAM

GSH

GSSG

SAM

SAHC

Ausscheidung über den Urin

10 - 20%

10 - 20%

? %

60 - 80%? %

O-

OH

OHO AsV

O-

OH

OHO AsV

Arsenat

Arsenat-Reduktase

GSH OH

O-

CH3O AsV

OH

O-

CH3O AsV

MMA(V)

Reduktase

GSSG

OH

OH

CH3AsIII

OH

OH

CH3AsIII

MMA(III)


OH

CH3CH3 AsIII

OH

CH3CH3 AsIII

DMA(III)

CH3

CH3

O-

O AsV CH3

CH3

O-

O AsV

DMA(V)

OH

OH-O AsIII

OH

OH-O AsIII

Arsenit

SAHC


SAM

GSH

GSSG

SAM

SAHC

Ausscheidung über den UrinAusscheidung über den Urin

10 - 20%

10 - 20%

? %

60 - 80%? %

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arsenmetabolismus beim Menschen (Pott et al., 2001) SAM: S-Adenosylmethionin, SAHC: S-Adenosylhomocystein, GSH: Glutathion (red.), GSSG:

Glutathion (ox.)

Die Ausscheidung von Arsen erfolgt in erster Linie über die Niere. Hauptmetabolite

im menschlichen Urin sind Arsenit (10- 20%), MMA(V) (10- 20%) sowie DMA(V) (60-

80%) (Vahter, 1999). Aufgrund kürzlich verbesserter Analyseverfahren konnten

zudem MMA(III) und DMA(III) nachgewiesen werden (Mandal et al., 2001). Die

genaue Speziation und die quantitative Bestimmung sind jedoch noch umstritten.

Fünfwertige Metabolite zeigen eine geringere Reaktivität gegenüber zellulären

Makromolekülen und werden daher schneller ausgeschieden als dreiwertige

Verbindungen (Vahter, 1999).

8 Einleitung

2.2.3 Toxische Wirkungen

Arsen wird aufgrund von Tierversuchen von manchen Autoren als

Ultraspurenelement bezeichnet, obwohl keine physiologischen Daten vom Menschen

vorliegen. Die tägliche Aufnahme an Arsen sollte den Tagesbedarf jedoch bei weitem

decken (Thornton, 1999). Weitaus relevanter sind die toxischen Wirkungen von

Arsen. Nach oraler Aufnahme größerer Mengen von anorganischem Arsen kommt es

zu Wirkungen wie Schädigungen der Schleimhäute im Gastrointestinaltrakt,

Erbrechen und Lähmung der Herz-Kreislauffunktion sowie des peripheren

Nervensystems. Eine hohe Dosis von 1-3 mg/kg Körpergewicht kann binnen 48

Stunden zum Tod im Kreislaufschock führen (Becher und Wahrendorf, 1998).

Die chronische Exposition von Arsen über die Atemluft oder das Trinkwasser geht

neben einer Vielzahl von Krankheiten wie z.B. Hautläsionen (endemische blackfoot

disease in Taiwan) vor allem mit einem erhöhten Krebsrisiko einher. So entsteht

nach inhalativer Aufnahme vor allem Lungenkrebs, während bei oraler Exposition

primär Hautkrebs gebildet wird. Epidemiologische Studien konnten jedoch auch

einen Zusammenhang zwischen einer Arsenbelasung über das Tinkwasser und dem

Entstehen von Lungen-, Nieren-, Blasen und Lebertumoren bereits ab einer

Konzentration von 50 µg/l zeigen (NRC, 1999; NRC, 2001; Yoshida et al., 2004). Für

die Entstehung von Lungenkrebs ergab sich bei chronischer Exposition von nur

1,8 ng/m3, wie sie in der Atemluft in ländlichen Räumen in Deutschland zu finden ist,

schon ein geschätztes Krebsrisiko von 10-5 (Hassauer und Kalberlah, 1999).

Obwohl die Krebsentstehung durch Arsen beim Menschen gut dokumentiert ist und

wichtige Gremien wie die Interational Agency for Reseach on Cancer (IARC),

Weltgesundheitsorganisation (WHO), Environmental Protection Agency (EPA) oder

die MAK Arsen als Humankanzerogen einstufen, dauerte es lange bis ein adäquates

Tiermodell insbesondere für die orale Aufnahme gefunden wurde (IARC, 1980).

Inzwischen ist gut belegt, dass anorganisches Arsen kanzerogene, kokanzerogene

und promovierende Eigenschaften besitzt (Waalkes et al., 2004). DMA(V) konnte als

komplettes Kanzerogen identifiziert werden (Hayashi et al., 1998).

Einleitung 9

2.2.4 Genotoxizität von Arsenverbindungen

Wie auch andere kanzerogene Metalle zeigt anorganisches Arsen kein oder nur ein

schwaches mutagenes Potential in bakteriellen Testsystemen und Säugerzellen. Im

Gegensatz dazu wurden für Arsenit komutagene und klastogene Eigenschaften

nachgewiesen. Zur in vitro Toxizität von Arsenverbindungen liegen umfangreiche

Daten vor. In vielen Studien konnte gezeigt werden, dass die dreiwertigen

Arsenverbindungen ein viel höheres genotoxisches Potential besitzen als die

fünfwertigen Substanzen. So induzieren Arsenit und auch seine dreiwertigen

methylierten Metabolite Chromosonenabberationen, Schwester-Chromatid-

Austausche und Mikrokerne (Gebel, 2001; Kligerman et al., 2003). Als Ursache für

diese Effekte werden unter anderem direkt genotoxische Effekte wie die Induktion

von oxidativen DNA-Schäden verantwortlich gemacht. Arsenit induziert sowohl

reaktive Sauerstoff- als auch Stickstoffspezies (Huang et al., 2004; Shi et al., 2004).

Als Folge dessen konnte in zellulären Systemen, wie auch unter isolierten

Bedingungen eine DNA-Schädigung durch verschiedene Arsenverbindungen gezeigt

werden (u.a Mass et al., 2001; Ahmad et al., 2002; Schwerdtle et al., 2003b).

Neben diesen direkten genotoxischen Wirkungen werden eine ganze Reihe von

indirekten Effekten für die Genotoxizität von Arsen verantwortlich gemacht. So wurde

eine Interaktion mit verschiedenen DNA-Reparatursystemen nachgewiesen.

Arsenverbindungen hemmen sowohl die Reparatur von oxidativen DNA-Schäden,

die durch die BER entfernt werden, wie auch die Reparatur von UVC-Schäden und

Benzo[a]pyren-Addukten, für die die NER verantwortlich ist (Hartwig et al., 1997; Bau

et al., 2001; Kitchin, 2001; Schwerdtle et al., 2003a; Huang et al., 2004). Aufgrund

ihrer hohen Affinität insbesondere zu vicinalen Thiolgruppen können vor allem

dreiwertige Arsenverbindungen zu einer Hemmung von einer Vielzahl von Proteinen

führen. Ein potentieller molekularer Angriffspunkt könnten daher so genannte

Zinkfingerstrukturen, wie sie in vielen DNA-Reparaturproteinen vorkommen (siehe

2.3), sein. So konnte gezeigt werden, dass die zelluläre Poly(ADP-Ribosyl)ierung, die

vor allem durch das Zinkfingerprotein PARP-1 katalysiert wird und in der BER eine

wichtige Rolle spielt, schon in extrem niedrigen nanomolaren Arsenit-

Konzentrationen gehemmt wird (Hartwig et al., 2003). Neben der Hemmung

verschiedener DNA-Reparaturwege gelten eine veränderte Genexpression oder eine

10 Einleitung

Beeinflussung der Signaltransduktion als mögliche indirekte genotoxische oder

kanzerogene Faktoren von Arsen (Gebel, 2001; Andrew et al., 2003).

Eine entscheidende Rolle in der arseninduzierten Kanzerogenese spielt zudem die

Metabolisierung. Aufgrund ihrer besseren Ausscheidung wurde die Bildung der

fünfwertigen methylierten Metabolite lange Zeit als Detoxifizierung angesehen. In den

letzten Jahren haben mehrere Studien gezeigt, dass die dreiwertigen metylierten

Metabolite ein ähnliches oder sogar stärkeres genotoxisches Potential als

anorganisches Arsenit haben. So konnte beispielsweise eine stärkere Zytotoxiziät

(Petrick et al., 2000; Styblo et al., 2000), DNA-Schädigung (Schwerdtle et al., 2003b),

Induktion von Apoptose (Chen et al., 2003) oder klastogene Wirkung (Kligerman et

al., 2003) von MMA(III) und DMA(III) im Vergleich zu Arsenit gezeigt werden. Die

methylierten Metabolite oder auch kürzlich beschriebene GSH-Konjugate oder

Schwefelarsenmetabolite können damit einen entscheidenden Beitrag zur

Genotoxizität und in Folge dessen zur kanzerogenen Wirkung von Arsen haben.

2.3 Zinkfingerproteine in der DNA-Reparatur

Zinkfingerproteine spielen als größte Klasse an DNA-bindenden Proteinen (Webster

et al., 2001) eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen der Zelle. Nach

Sequenzierung des menschlichen Genoms, geht man heute davon aus, dass 3%

aller Gene für Zinkfingerproteine kodieren (Maret, 2003). Zinkfingerstrukturen sind in

Proteinen vor allen für Wechselwirkungen mit anderen Molekülen der Zelle, wie DNA

oder RNA aber auch für Protein-Protein Interaktionen verantwortlich und sind daher

an der Regulation von Prozessen wie Transkription, Translation, DNA-Reparatur,

Zellproliferation oder Apoptose beteiligt (Laity et al., 2001; Krishna et al., 2003). Mit

dem Transkriptionsfaktor IIIA (TFIIIA) aus Xenopus leavis wurde 1985 das erste

Zinkfingerprotein identifiziert. Gemeinsames Strukturmerkmal der Zinkfingerproteine

ist ein Zinkion, das durch vier invariante Cystein- und/oder Histidin-Reste komplexiert

wird und so im Protein für die Stabilisierung der Tertiärstruktur sorgt. Im klassischen

Zinkfingermotiv von TFIIIA binden 2 Cysteine und 2 Histidine das zentrale Zinkion. In

den letzten 20 Jahren konnten jedoch weitere Zinkfingertypen wie das Cys4- und das

Cys3His1-Motiv identifiziert werden, die in Proteinen wie dem Östrogen- und

Gukokortidoidrezeptor, Transkriptionsfaktor SP1, breast cancer protein 1 (BRCA-1)

Replikationsprotein A (RPA), Poly(ADP-Ribose)Polymerase-1 (PARP-1),

Einleitung 11

Formamidopyrimidin-DNA-Glycosylase (Fpg) oder Xeroderma Pigmentosum Typ A

Protein (XPA) eine entscheidende Rolle bei der Funktion des Proteins spielen

(Webster et al., 2001; Wilcox et al., 2001). Die Unversehrtheit der Zinkfingerstruktur

ist in diesen Proteinen für ihre Funktion unerlässlich. Störungen im

Redoxgleichgewicht der Zelle oder auch toxische Metallverbindungen können zu

einer Zerstörung der Zinkfingerstruktur und damit zu einem Funktionsverlust des

ganzen Proteins führen. Besonders kritisch ist eine solche Hemmung bei

Zinkfingerproteinen, die an der Reparatur von DNA-Schäden beteiligt sind (Hartwig,

2001). Tabelle 1 gibt einen Überblick über diejenigen Zinkfingerproteine, die an

verschiedenen DNA-Reparaturwegen beteiligt sind und in der vorliegenden Arbeit auf

eine Wechselwirkung mit Arsenverbindungen untersucht wurden.

Tabelle 1: Überblick über die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Zinkfingerproteine

Zinkfingermotiv Anzahl der Zinkfingermotive

DNA-Reparaturweg

Fpg Cys4 1 Basenexzisionsreparatur in E. coli

XPA Cys4 1 Nukleotidexzisionsreparatur

PARP-1 Cys3His1 2 Basenexzisionsreparatur DNA-Einzel- und Doppel-

Strangbruchreparatur

2.3.1 Die Basenexzisionsreparatur und das Fpg-Protein

2.3.1.1 Die Basenexzisionreparatur

Die Basenexzisionsreparatur (BER) ist einer der am häufigsten in der Natur

anzutreffenden DNA-Reparaturwege. Die BER ist unter anderem verantwortlich für

die Reparatur von oxidativ geschädigten Basen, wie sie durch reaktive

Sauerstoffspezies (ROS), die durch entzündliche Prozesse in der Zelle, ionisierende

Strahlung, langwelliges UV-Licht oder bei der Atmungskette in den Mitochondrien

entstehen können, gebildet werden. Das prämutagene 8-Oxoguanin stellt dabei

einen der wichtigsten oxidativen DNA-Schäden dar, da es in Folge einer Replikation

mit Adenin paaren und somit eine Mutation hervorrufen kann. Neben den oxidativen

12 Einleitung

DNA-Schäden werden von der BER auch alkylierte DNA-Basen, Uracil oder AP-

Stellen (Apurin/Apyrimidin-Stellen) erkannt und repariert.

Initiiert wird die BER von einer Klasse von Enzymen, den DNA-Glykosylasen, die

geschädigte DNA-Basen erkennen und diese durch Hydrolyse der N-glykosidischen

Bindung entfernen. Beim Menschen sind bisher 11 verschiedene Glykosylasen

bekannt. Die entstandenen AP-Stellen werden anschließend durch Endonukleasen,

die 5’ von der AP-Stelle das Zuckerphosphatrückgrad einschneiden, sowie von

Desoxyribosephosphordiesterasen, die 3’ das Desoxyribosephosphat entfernen,

weiterprozessiert, so dass eine Lücke von einem Nukleotid in der DNA entsteht.

Manche DNA-Glykosylasen vereinigen zudem ihre Glykosylase- mit einer

Endonuklease- oder 3’-Lyase-Aktivität. Durch Einfügen eines Nukleotids durch

Polymerase ß wird die Lücke geschlossen. Im Falle der sogenannten short patch

BER erfolgt anschließend das Zusammenspiel von Ligase III, XRCC1, Polymerase ß

und PARP-1 um die Ligation zu katalysieren und die Reparatur zu vollenden. Bei der

long-patch BER hingegen werden durch die Polymerasen δ oder ε sowie PCNA und

RFC bis zu 10 weitere Nukleotide eingeführt. Im Zusammenspiel von Flap-

Endonukleose-1 (FEN-1) und PCNA wird das überhängige Deoxyribosephosphat

entfernt und die Reparatur durch Ligation mittels Ligase I, die mit PCNA und

Polymerase ß interagiert, beendet. Auch PARP-1 ist bei letzten Schritt der long-patch

BER am Aufbau des Proteinkomplexes beteiligt. (zusammengefasst in Friedberg et

al., 2006)

2.3.1.2 Die Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase

Die Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fpg oder MutM) spielt eine wichtige

Rolle in der Reparatur oxidativer DNA-Schäden in E. coli. Das Enzym, das

ursprünglich als FaPy-DNA-Glykosylase identifiziert wurde, erkennt neben

ringoffenen Purin-Basen (FaPy) hauptsächlich 8-Oxopurine wie das prämutagene

8-Oxoguanin, welches beim Menschen durch die strukturell völlig verschiedene

8-OxoGuanin-DNA-Glykosylase (OGG1) erkannt wird (Friedberg et al., 2006).

8-Oxoguanin wird von Fpg vor allem in Paarung mit Cytosin oder Thymin repariert.

Die nach einer Replikation entstehende Paarung mit Adenin wird 200-fach schlechter

erkannt und in E. coli durch eine weitere Glykosylase (MutY) identifiziert (Tchou et

al., 1994). Neben seiner DNA-Glykosylase-Aktivität besitzt Fpg eine 3’-AP-Lyase-

Einleitung 13

sowie eine 5’-Desoxyribosephosphordiesterase-Aktivität, die über eine

ß,δ- Elimination eine Lücke von einem Nukleotid in der DNA erzeugen (Boiteux,

1993; Bhagwat und Gerlt, 1996).

Das Fpg-Protein ist ein relativ kleines Enzym mit einem Molekulargewicht von

30,2 kDa und besteht aus 269 Aminosäuren. Die starke Bindung an Duplex-DNA

wird durch zwei DNA-Bindungsmotive bewerkstelligt. Im N-terminalen Bereich ist ein

helix-two-turn-helix-Motiv und im C-terminalen ein Zinkfingermotiv zu finden

(Abbildung 2), in dem Zink durch vier Cystein-Reste (Cys244, Cys247, Cys264,

Cys267) komplexiert wird (Boiteux, 1993; Buchko et al., 2000). Die Bindung an die

DNA ist eng verknüpft mit der enzymatischen Funktion des Proteins. So hemmen

Punktmutationen eines der Cysteine des Zinkfingers die Funktion von Fpg,

wohingegen Mutationen von Cystein-Resten außerhalb des Zinkfingers keinen

Einfluss haben (O'Connor et al., 1993; Tchou et al., 1993). Cabrera et al. (1988)

konnten zudem zeigen, dass eine Inaktivierung von Fpg zu einer erhöhten Menge an

durch G → T Transversionen verursachten Mutationen führt.

(NH2) C CE•P

R

V

T

•

••

••

••••

•

••

•

•C

C

G•T•P•I•V•A

Q

R

QA

HK

•C

Y•F•T•A•R

K•

Q•C

(COOH)

Zn

147 195

244

247

267

264

(NH2) C CE•P

R

V

T

•

••

••

••••

•

••

•

•C

C


Q

R

QA

HK

•C

Y•F•T•A•R

K•

Q•C

(COOH)

Zn

147 195

244

247

267

264

(NH2) C CE•P

R

V

T

•

••

••

••••

•

••

•

•C

C


Q

R

QA

HK

•C

Y•F•T•A•R

K•

Q•C

(COOH)

Zn

147 195

244

247

267

264

Abbildung 2: Struktur des Zinkfingers von Fpg (modifiziert nach Boiteux, 1993)

14 Einleitung

2.3.2 Die Nukleotidexzisionsreparatur und das XPA-Protein

2.3.2.1 Die Nukleotidexzisionsreparatur

Im Gegensatz zu den oxidativen, kleinräumigen DNA-Schäden, die durch die BER

repariert werden, erkennt die Nukleotidexzisionsreparatur (NER) vor allem

großräumige DNA-Schäden, wie UV-induzierte 6-4-Photoprodukte und

Cyclobutandimere (CPD) sowie Addukte von z.B. Aflatoxin oder Benzo[a]pyren, die

zu Verzerrungen der DNA-Helix führen. Für das Funktionieren der NER ist ein

koordiniertes Zusammenspiel von mindestens 30 verschiedenen Proteinen

erforderlich. Gendefekte in einem der zentralen NER-Proteine führen zu einer

extremen Lichtempfindlichkeit und oft zum Entstehen von Hautkrebs bei betroffenen

Patienten. Diese Erbkrankheit wird Xeroderma Pigmentosum genannt und kann in

acht Komplementationsgruppen (XPA bis XPG und XPV) unterteilt werden, die auf

Funktionsstörungen von zentralen NER-Proteinen zurückzuführen sind.

Die NER kann in die globale genomische Reparatur (GGR), die Schäden aus dem

gesamten Genom entfernt, sowie die transkriptionsgekoppelte Reparatur (TCR), die

nur Schäden im transkribierten Strang aktiver Gene repariert, unterteilt werden. Die

beiden Reparaturwege unterscheiden sich nur im ersten Schritt der

Schadenserkennung. Bei der TCR erfolgt die Erkennung der Helixverzerrung der

DNA durch die RNA Polymerase II. Es kommt zu einem Stopp der Transkription, zu

einer Konformationsänderung der DNA und zur Anlagerung der NER-Proteine. In der

GGR wird ein Proteinkomplex bestehend aus XPC und hHR23B für den ersten

Schritt verantwortlich gemacht (Sugasawa et al., 1998). Vor allem bei der Erkennung

von CPDs scheint ein weiteres Protein, das damage DNA binding protein (DDB) die

Bindung von XPC-hHR23B zu vermitteln. Nach der Bindung von XPC-hHR23B

kommt es zu einer sequenziellen Anlagerung und Ablösung von weiteren NER-

Faktoren (Volker et al., 2001). An XPC-hHR23B bindet als nächstes der

Transkriptionsfaktor TFIIH, der aus 10 Untereinheiten besteht und als wichtige

Proteine die beiden Helikasen XPB und XPD enthält. Nach der lokalen Entwindung

der DNA kommt es zur Anlagerung der 3’-Nuklease XPG, von XPA, RPA und als

letztes von der 5’-Nuklease ERCC1-XPF, während XPC-hHR23B den so genannten

Präinzisionskomplex verlässt. Durch die Nukleasen XPG und ERCC1-XPF kommt es

nun zur Exzision eines 24 bis 30 Nukleotiden langen Oligonukleotids. Es wird

Einleitung 15

anschließend ein zweiter Multienzymkomplex, bestehend aus den Polymerasen δ

und ε, sowie PCNA, RPA und RFC ausgebildet, der die DNA-Neusynthese in der

entstandenen Lücke katalysiert. Der Reparaturprozess wird durch Ligation mittels

Ligase I abgeschlossen (Friedberg, 2001).

2.3.2.2 Das Xeroderma Pigmentosum Protein A

Mutationen des für das NER-Protein Xeroderma Pigmentosum Protein A (XPA)

kodierenden Gens führen zu einer sehr schwerwiegenden Form von Xeroderma

Pigmentosum mit verbundener Lichtempfindlichkeit und dem Entstehen von

Hautkrebs (in Sonnenlicht 1000-fach erhöht). Das Ausschalten von XPA führt zu

einer Absenkung der NER auf weniger als 2% (Vogelstein et al., 2002).

Lange Zeit wurde XPA für den ersten Schritt der NER-Schadenserkennung

verantwortlich gemacht. Sugasawa et al. (1998) konnten jedoch zeigen, dass zuerst

XPC-hHR23B an den Schaden bindet. Man geht heute davon aus, dass XPA eine

wichtige Rolle bei dem Aufbau des Präinzisionskomplexes der NER spielt und nach

Ablösen von XPC-hHR23B die Schadenserkennung verifiziert. Es konnte gezeigt

werden, dass XPA unabhängig von XPC an eine Vielzahl von DNA-Schäden wie

UVC- und cis-Platin-Addukte (Jones und Wood, 1993; Asahina et al., 1994) oder

Benzo[a]pyren- und Aflatoxinaddukte (zusammengefasst in Cleaver und States,

1997) bindet. Für XPA konnte neben der Bindung an geschädigte und ungeschädigte

DNA eine Interaktion mit verschiedenen Faktoren der NER nachgewiesen werden.

So bindet XPA an TFIIH sowie RPA und ist für die Aktivität der 5’-Nuklease ERCC1-

XPF unerlässlich, während die 3’-Nuklease XPG unabhängig von XPA funktioniert

(Sugasawa et al., 1998; Volker et al., 2001).

Das 36 kDa große und 273 Aminosäuren lange XPA besitzt wie auch Fpg eine

Zinkfingerdomäne, in der Zink durch vier Cysteine (Cys105, Cys108, Cys126 und

Cys129) komplexiert wird (Abbildung 3) (Buchko et al., 1998). Im Gegensatz zu Fpg

bindet der Zinkfinger nicht direkt an die DNA. Für die DNA-Bindung ist vielmehr die

loopreiche Domäne von XPA verantwortlich, deren Tertiärstruktur durch die

Wechselwirkungen mit der Zinkfingerstruktur aufrecht erhalten wird. Der Zinkfinger

wird darüber hinaus für die Wechselwirkung mit der 70 kDa Untereinheit von RPA

verantwortlich gemacht (Ikegami et al., 1998; Morikawa und Shirakawa, 2000). Durch

16 Einleitung

Substitution eines der Zink-bindenden Cysteine kommt es zu einem Funktionsverlust

von XPA und einer fast vollständigen Hemmung der NER (Miyamoto et al., 1992).

Abbildung 3: Links: Minimale Bindungsdomäne (MBD) (98-210) von XPA. Rechts: Zinkfingerdomöne (XPAzf), die zur Zinkfreisetztung in dieser Arbeit eingesetzt wurde (101-137) (Ikegami et al., 1998; Bal et al., 2003)

2.3.3 Poly(ADP-Ribose)polymerase

Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung ist eine posttranslationale Modifikation von Proteinen,

die erstmals in den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts Jahren beschrieben wurde

(Chambon et al., 1963). Sie wird durch eine Familie von Enzymen, den Poly(ADP-

Ribose)polymerasen (PARP) katalysiert. Nach heutigem Kenntnisstand besteht die

sogenannte PARP-Superfamilie aus 17 Mitgliedern, die nach Datenbankrecherche

alle die gleiche minimale katalytische Domäne aufweisen (Ame et al., 2004;

Schreiber et al., 2006). Durch die Poly(ADP-Ribosyl)ierung von Proteinen werden

negative Ladungen in das Molekül eingeführt, die in der Regel zu einem

Aktivitätsverlust der Enzyme führen. Zudem kann es zu sterischen Hemmungen von

Proteinen aufgrund der langen Addukte kommen. Auf diese Weise regulieren

Poly(ADP-Ribose)polymerasen eine Vielzahl von biochemischen Prozessen in der

Zelle, wie z.B. DNA-Reparatur, DNA-Replikation oder Apoptose. Zuletzt wurde PARP

in Zusammenhang mit dem Alterungsprozess gebracht (Bürkle et al., 2005b). Den

größten Anteil an der Poly(ADP-Ribosyl)ierung hat mit etwa 90% das nukleäre

Protein PARP-1. Das Enzym wird mit ca. 200.000 Molekülen pro HeLa- Zelle

Einleitung 17

kontinuierlich stark exprimiert und kann in pflanzlichen wie auch tierischen

Lebewesen, nicht jedoch in Hefen, hochkonserviert nachgewiesen werden

(zusammengefasst in Diefenbach und Bürkle, 2005).

2.3.3.1 Struktur der PARP-1

Das 113 kDa große und 1014 Aminosäuren lange PARP-1 Molekül kann in 3

Domänen unterteilt werden (Abbildung 4). In der 46 kDa großen N-terminalen DNA-

bindenden Domäne finden sich 2 Zinkfingermotive, in denen Zink durch 3 Cystein-

und einen Histidin-Rest komplexiert wird (Cys21, Cys24, His53, Cys56 sowie

Cys125, Cys129, His159, Cys162) (Ikejima et al., 1990). Im Vergleich zu anderen

Zinkfingerproteinen besitzt PARP-1 mit 28 bzw. 30 Aminosäuren sehr große

Zinkfinger, wie sie nur noch in Ligase III gefunden werden. Die beiden

Zinkfingerstrukturen sind für die katalytische Aktivierbarkeit von PARP-1 durch DNA-

Strangbrüche essentiell, wobei Zinkfinger 1 sowohl an Doppel- als auch an

Einzelstrangbrüche bindet, während Zinkfinger 2 nur mit Einzelstrangbrüchen

interagiert. Zudem sind die Zinkfinger an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt.

Wie Trucco et al. (1996) zeigen, sind jedoch nicht nur intakte Zinkfingermotive,

sondern auch andere Stukturen der N-terminalen Domäne für die Aktivierung der

katalytischen Aktivität verantwortlich (Trucco et al., 1996). Neben den beiden

Zinkfingern kann PARP-1 auch über eine helix-turn-helix-Domäne an die DNA

binden, in der sich neben einem Kernerkennungssignal (NLS) auch eine Schnittstelle

für die apoptotischen Enzyme Caspase 3 und 7 (siehe 2.3.3.4) befindet.

Die zentrale 22 kDa große Domäne der PARP-1 ist die basische

Automodifikationsdomäne. PARP-1 poly(ADP-ribosyl)iert sich hier vor allem an

Glutamatresten selbst. Zusätzlich befindet sich in dieser Domäne ein BRCT

Bindungsmotiv, das für Protein-Protein-Wechselwirkungen z.B. mit XRCC1

verantwortlich gemacht wird (siehe 2.3.3.3).

In der dritten C-terminalen katalytischen Domäne wird die eigentliche PARP-

Reaktion katalysiert. Durch Spaltung des Cofaktors NAD+ entsteht Nicotinamid und

ADP-Ribose, die dann zu Polymeren aufgebaut wird. Die minimale katalytische

Domäne lässt sich hochkonserviert in der cDNA von allen 17 Mitgliedern der PARP-

Familie wieder finden (zusammengefasst in D'Amours et al., 1999; Schreiber et al.,

2006).

18 Einleitung

N C

Katalytische Domäne

minimale katalytischeDomäne

524 1014

ß-NAD+Nicotinamid

ADPr

ZF1 ZF2 HTH

DNA Bindungsdomäne1

Automodifikations-domäne

372

NLS

Caspase-3/-7Schnittstelle

N CN C

Katalytische Domäne

minimale katalytischeDomäne

524 1014

ß-NAD+Nicotinamid

ADPr

ZF1 ZF2 HTH

DNA Bindungsdomäne1

Automodifikations-domäne

372

NLS

Caspase-3/-7Schnittstelle

Abbildung 4: Molekulare Struktur der PARP-1 (modifiziert nach D'Amours et al., 1999) ZF: Zinkfinger, HTH: Helix-turn-helix-Motif, NLS: Kernerkennungssequenz, ADPr: ADP-Ribose,

ß-NAD+: Nicotinamidadenindinukleotid

2.3.3.2 Metabolismus von Poly(ADP-Ribose)

PARP-1 bindet in dimerer Form (Pion et al., 2005) als eines der ersten Moleküle der

Zelle an einen DNA-Strangbruch und stabilisiert die charkteristische V-Form der

DNA. Durch die Bindung an die DNA wird PARP-1 bis zu 500fach aktiviert und

beginnt nun Zielmoleküle wie p53, NF-κB, Histone, DNA-Ligasen, DNA-

Topoisomerasen, DNA-Polymerasen und vor allem sich selbst zu poly(ADP-

ribosyl)ieren. Die Polymerisationsreaktion lässt sich in 3 Teilabschnitte unterteilen.

Durch die Veresterung der ersten ADP-Ribose-Einheit mit einem Aspartat- oder

Glutamat-Rest des Zielmoleküls wird die Reaktion initiiert. In der Elongationsphase

werden nun bis zu 200 weitere ADP-Ribose-Einheiten α-1’’-2’ glycosidisch verknüpft.

Alle ca. 40 Einheiten kann eine ADP-Ribose-Einheit α-1’’’-2’ glycosidisch angehängt

werden, so dass es zu einer Verzweigung des Polymers kommt. Durch die starken

negativen Ladungen des Polymers in Folge der Modifikation dissoziiert PARP-1 von

der DNA ab und inaktiviert sich so selbst. Poly(ADP-Ribose) hat nur eine kurze

Halbwertszeit von ca. 1 min und wird schnell von der Poly(ADP-

Ribose)glykohydrolase (PARG) abgebaut. PARG besitzt sowohl eine Endo- als auch

eine Exoglykosylase-Aktivität. Die Abspaltung der letzten ADP-Ribose-Einheit vom

Protein wird von der ADP-Ribose-Protein-Lyase katalysiert (Abbildung 5)

(zusammengefasst in Diefenbach und Bürkle, 2005).

Einleitung 19

Abbildung 5: M

etabolismus der Poly(A

DP-R

ibose) (modifiziert nach D

iefenbach und Bürkle, 2005)

NA

D+: N

icotinamidadenindinukleotid, P

AR

P-1: P

oly(ADP

-Ribose)polym

erase-1, PA

RG

: Poly(AD

P-R

ibose)glykohydrolase

20 Einleitung

2.3.3.3 PARP und DNA-Reparatur

Bisher konnte nur für zwei Mitglieder der PARP-Superfamilie, PARP-1 und PARP-2,

eine Aktivierung durch DNA-Strangbrüche gezeigt werden, die auf eine Rolle beider

Enzyme in der DNA-Einzelstrangbruchreparatur und in der BER (siehe 2.3.1.1)

schließen lässt. Knock-out Versuche bei Mäusen offenbarten, dass sowohl der

PARP-1 als auch der PARP-2 knock-out zu schweren Defekten in der BER und zu

einer Hypersensitivität gegenüber ionisierender Strahlung und alkylierenden

Agentien führt. PARP-1-PARP-2-doppel-knock-out Mäuse sind darüber hinaus nicht

lebensfähig (Menissier de Murcia et al., 2003). Auch in Zellkultursystemen mit

ausgeschalteter PARP-1-Aktivität konnten ähnliche Ergebnisse erhalten werden

(Küpper et al., 1995). Zudem konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Menge an

PARP-1 in der Zelle zu einer erhöhten genomischen Stabilität beiträgt (Meyer et al.,

2000). Obwohl die molekularen Mechanismen der Rolle von PARP in der BER noch

nicht vollständig geklärt sind, existiert eine Reihe von Erklärungsmodellen. Als eines

der wichtigsten Akzeptorproteine von PARP-1 gelten die Histone. Ihre lokale

Poly(ADP-Ribosyl)ierung in der Nähe des DNA-Strangbruchs bewirkt eine Relaxation

des Chromatins und ermöglicht damit einen besseren Zugang von anderen DNA-

Reparaturfaktoren an den Schaden (Bürkle et al., 2005a). Neben der Modifikation

von Histonen konnte auch die Poly(ADP-Ribosyl)ierung von wichtigen BER-

Proteinen wie XRCC1, Ligase III oder Polymerase ß nachgewiesen werden. Über die

Poly(ADP-Ribosyl)ierung könnte demnach die Aktivität dieser Proteine reguliert

werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass PARP-1 und PARP-2 direkt mit

BER Enzymen über Protein-Protein- oder aber über Wechselwirkungen der Proteine

mit dem Poly(ADP-Ribose)-Polymeren interagieren. PARP-1 könnte also dafür

verantwortlich sein, diese Proteine nach einem DNA-Strangbruch, wie er auch als

Zwischenprodukt bei der BER gebildet wird, vor allem für die long-patch BER zu

rekrutieren. Hier bildet sich ein Komplex bestehend aus DNA-Ligase III, Polymerase

ß, XRCC1, FEN-1 und PARP-1, die zusammen den letzten Schritt der BER

katalysieren (zusammengefasst in Bouchard et al., 2003; Malanga und Althaus,

2005). Allison et al. (2003) dagegen schlagen vor, dass nicht eine Interaktion mit

PARP-1 selbst, sondern Wechselwirkungen mit poly(ADP-ribosyl)ierten Proteinen die

entscheidende Rolle in der BER spielen (Allinson et al., 2003). Aus dem Abbau von

Poly(ADP-Ribose) könnte zudem an der geschädigten Stelle lokal ATP gebildet

Einleitung 21

werden, das dann z.B. für den Ligationsschritt der BER verwendet werden könnte

(Oei und Ziegler, 2000).

Neben ihrer bedeutsamen Rolle in der BER, konnte für PARP-1 auch eine Interaktion

mit p53 (zusammengefasst in Malanga und Althaus, 2005), mit der DNA-

Doppelstrangbruchreparatur (Süsse et al., 2004) oder auch der Reparatur von UV-

induzierten-Schäden (Flohr et al., 2003) gezeigt werden.

2.3.3.4 PARP und Apoptose

Unter der Apoptose versteht man den programmierten Zelltod, der unter

Enegieaufwand für das gezielte Absterben von stark geschädigten Zellen

verantwortlich ist. Während der Apoptose werden über eine Caspasekaskade

degradative Enzyme wie Endonukleasen oder Proteasen aktiviert, die DNA und

Proteine abbauen und damit zum programmierten Zelltod beitragen. Die Caspasen 3

und 7 sind in der Lage PARP-1 zu spalten und damit zu inaktivieren. Die Bildung des

typischen apoptoischen 85 kDa-Fragments der PARP-1 gilt als ein früher Nachweis

von Apoptose (Diefenbach und Bürkle, 2005).

Neben der Spaltung von PARP-1 kann es aufgrund starker DNA-Schädigung in den

frühren Phasen der Apoptose zu einem massiven Anstieg der Poly(ADP-

Ribosyl)ierung kommen. Diese Überaktivierung von PARP-1 führt zu einer

Depletierung von NAD+ und zu einer Translokation des Apoptose induzierenden

Faktors (AIF) aus den Mitochondrien in den Zellkern. Dieser Reaktionsweg stellt eine

PARP-1-abhängige, aber p53-unabhängige Form der Apoptose dar (Ame et al.,

2004).

22 Fragestellung

3. Fragestellung

Aufgrund epidemiologischer Studien wurde Arsen als Humankanzerogen eingestuft,

obwohl die grundlegenden molekularen Mechanismen der arseninduzierten

Kanzerogenese nach wie vor ungeklärt sind. Neben direkt genotoxischen Effekten,

wie der Induktion von DNA-Schäden, verursacht Arsen vor allem indirekte

genotoxische Effekte wie die Hemmung von DNA-Reparaturprozessen. Aufgrund

seiner hohen Affinität zu Thiolgruppen sind Zinkfingerstrukturen, wie sie auch in

DNA-Reparaturproteinen vorkommen, ein möglicher molekularer Ansatzpunkt für

eine Enzymhemung.

Anorganisches Arsen wird im menschlichen Körper zu methylierten Metaboliten

umgesetzt. Als Zwischenprodukte entstehen dabei die hochreaktiven dreiwertigen

methylierten Metabolite MMA(III) und DMA(III). Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zu

klären inwieweit die methylierten Metabolite von anorganischem Arsen zur indirekten

Genotoxizität beitragen. Für die Untersuchungen wurden drei Zinkfingerproteine

ausgewählt, die an verschiedenen DNA-Reparaturprozessen beteiligt sind. Die

bakterielle Fpg ist an der Reparatur oxidativer DNA-Schäden in E. coli beteiligt. Hier

soll zudem geklärt werden, inwieweit eine Koinkubation mit Zink eine möglicherweise

auftretende Hemmung durch Arsen aufheben kann, um so Rückschlüsse auf eine

Beteiligung der Zinkfingerstruktur zu erhalten. Im Falle des zweiten

Zinkfingerproteins XPA, das an der menschlichen NER beteiligt ist, soll untersucht

werden, ob Arsenverbindungen Zink aus der zinkbindenden Domäne (XPAzf)

freisetzen können und ob in Folge dessen die Bindung an die DNA nicht mehr

möglich ist. Mit der Untersuchung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 wird

geklärt, ob Arsenverbindungen in der Lage sind, auch im zellulären System eine

Reaktion zu hemmen, die zu ca. 90% von dem Zinkfingerenzym PARP-1 katalysiert

wird. Weitere Untersuchungen zur PARP-1 sollen zeigen, worauf eine mögliche

Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung zurückzuführen ist. So wird mittels Western

Blot-Analyse die Proteinmenge der PARP-1 nach Arseninkubation bestimmt. Mit

diesem Versuch ist es zudem möglich, die Induktion von Apoptose über die

Entstehung eines typischen apoptotischen Fragments der PARP-1 nachzuweisen.

Abschließend soll auch für isolierte PARP-1 untersucht werden, ob speziell die

dreiwertigen Verbindungen in der Lage sind das Enzym zu hemmen.

Material und Methoden 23

4. Material und Methoden

Eine Auflistung von allen eingesetzten Chemikalien und Lösungen, deren

Konzentrationen sowie eine Liste der verwendeten Geräte ist im Anhang zu finden.

Anorganisches Arsen ist als humanes Kanzerogen eingestuft. Die folgenden

Chemikalien sind gefährlich und sollten mit äußerster Sorgfalt gehandhabt werden:

Natriumarsenit, Monomethyloxoarsin, Diiodomethylarsin, Iododimethylarsin,

Monomethylarsinsäure und Dimethylarsinsäure.

4.1 Zellkultur

Medien, Puffer, Lösungen und alle verwendeten Verbrauchsmaterialien für die

Zellkultur wurden sterilfiltriert oder autoklaviert bzw. hitzesterilisiert.

4.1.1 Zellen

In der vorliegenden Arbeit wurde die humane, reparaturkompetente Zelllinie HeLa S3

(Zervixkarzinomzellen) verwendet. Zur Lagerung wurden die Zellen in einem

Einfriermedium bestehend aus 90% FKS (fötales Kälberserum) und 10% DMSO bei

-196°C in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Die Zellen wurden in F12-Medium,

versetzt mit 10% FKS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin bei

37°C, 5% CO2-Atmosphäre und 100% Luftfeuchtigkeit kultiviert. HeLa S3-Zellen

wachsen als Monolayer mit einer Generationszeit von etwa 24 Stunden. Die Zellen

wurden bei Erreichen einer Konfluenz von ca. 70% abtrypsieniert, in neue

Zellkulturschalen ausgestreut und mit frischen Medium versetzt. Für die Versuche

wurden die Zellen maximal 25 Passagen lange kultiviert, bis eine neue Charge

aufgetaut wurde.

4.1.2 Koloniebildungsfähigkeit

Zur Ermittlung der Zytotoxizität der Arsenverbindungen wurde die

Koloniebildungsfähigkeit bestimmt. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde hierfür die

Zellzahl bestimmt und eine definierte Zahl von Zellen weitergesetzt und ohne

Substanzinkubation mehrere Tage weiterkultiviert. Anhand der Anzahl an gebildeten

24 Material und Methoden

Kolonien kann man, im Vergleich zu unbehandelten Zellen, Rückschlüsse auf

Langzeitschäden und die Wirkung auf die Reproduktionsfähigkeit des getesteten

Agens ziehen.

Um die Koloniebildungsfähigkeit zu ermitteln, wurden jeweils 1x106 Zellen in eine

Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Kulturmedium ausgestreut und nach einem

Teilungszyklus von ca. 24 Stunden mit der zu untersuchenden Substanz für 18

Stunden inkubiert, indem die entsprechende Menge einer Stammlösung direkt in das

Zellkulturmedium pipettiert wurde. Nach Ende der Inkubationszeit wurde das Medium

abgesaugt und die Schalen wurden mit 5 ml frischem Medium gewaschen. Die Zellen

wurden abtrypsiniert, die Zellzahl mit einem automatischen Zellzählgerät (Casy)

gemessen und jeweils genau 300 Zellen in eine Zellkulturschale (60 x 15 mm) mit 5

ml frischem Medium überführt. Nach etwa einer Woche im Brutschrank hatten sich

Kolonien gebildet, die mit dem bloßen Auge sichtbar waren. Das Medium wurde

abgenommen, die Zellen mit PBS gewaschen und mit 2-3 ml vergälltem Ethanol

fixiert. Die Kolonien wurden mit Giemsa-Farbstoff gefärbt und ausgezählt.

4.2 Inkubationslösungen

Alle Inkubationslösungen wurden frisch am Versuchstag unmittelbar vor dem

Versuch in bidestilliertem Wasser angesetzt, um vor allem bei den dreiwertigen

methylierten Arsenverbindungen einer Oxidation vorzubeugen. Arsenit und die

beiden fünfwertigen Metabolite Monomethylarsonsäure und Dimethylarsinsäure

(Cacodylsäure) sind mit Reinheiten von >99,0%, 96,0% bzw. 98,8% kommerziell zu

erweben (siehe Anhang). Die Reinsubstanzen der dreiwertigen methylierten

Arsenverbindungen (Monomethyloxoarsin, Diiodomethylarsin und Iododimethylarsin)

wurden aliquotiert und bei -80°C gelagert. Diese Substanzen sind kommerziell nicht

erhältlich und wurden uns mit einer Reinheit von 99,0% freundlicherweise von Prof.

W. R. Cullen (University of British Columbia, Vancouver, Kanada) zur Verfügung

gestellt.


4.3 Präparation von PM2-DNA

Für die Untersuchung des Einflusses von Arsen auf die Aktivität des bakterielllen

Fpg-Proteins wird die DNA des Bakteriophagen PM2 als Substrat verwendet. Die

zirkulare, etwa 10.000 Basenpaare (bp) lange doppelstängige DNA, kommt in drei

verschiedenen Formen vor. In vivo liegt zu über 95% die überspriralisierte

(supercoiled) Form vor, die durch einen Einzelstrangbruch in eine relaxierte,

ringoffene (open circular) Form übergeht. Kommt es sogar zu einem

Doppelstrangbruch, liegt lineare DNA vor (Epe et al., 1993). Für den DNA-

Relaxationstest (Kapitel 4.4) ist es wichtig, dass die DNA möglichst wenige

Strangbrüche und oxidativen Schäden aufweist und dadurch der Anteil an ringoffener

und linearer Form auf ein Minimum reduziert wird.

Der Bakteriophage PM2 befällt das Meeresbakterium Alteromonas espeijana,

vermehrt sich in den Bakterienzellen und lysiert diese. Für die Präparation werden

die Phagen in den Wirtszellen vermehrt und nach der erfolgten Lyse aufkonzentriert

und gereinigt. Zum Schluss wird die DNA mittels Phenol-Chloroform-Extraktion

isoliert. Die Herstellung von PM2-DNA wurde mit einigen Modifikationen wie von

(Salditt et al., 1972) beschrieben durchgeführt. Das Wirtsbakterium Alteromonas

sowie die PM2-Phagen wurden uns von Prof. Bernd Epe (Mainz) zur Verfügung

gestellt.

4.3.1 Reaktivierung der Phagen

100 ml Nährmedium wurden mit einer Spatelspitze der bei -80°C gelagerten

Alteromonas-Kultur beimpft und bis zu einer OD600 nm= 0,4 (optische Dichte) auf

einem Schüttler bei Raumtemperatur (Optimum 28°C) angezogen. Bei Erreichen

einer OD von 0,4, die photometrisch kontrolliert wurde, wurde 1 ml Alteromonas-

Phagen-Lösung (gelagert bei -80°C) zugesetzt. Vor Eintritt der Lyse sollte die

Alteromonassuspension eine OD von 1 erreichen, die nach erfolgter Lyse der

Bakterien bis auf ca. 0,1 abfällt. Um Zelltrümmer und nicht lysierte Zellen zu

entfernen, wurde der Extrakt 40 min bei 10.000 g und 4°C zentrifugiert. Das

Phagenlysat im Überstand wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei 4°C gelagert. Pro

Woche kommt es zu einem Verlust von ca. 30% der Phagenaktivität.


4.3.2 Plaque-Test zur Bestimmung des Phagentiters

Mit dem Plaque-Test lässt sich die Konzentration der reaktivierten Phagen

bestimmen, die für die Beimpfung der Hauptkultur wichtig ist. Hierfür wurde am

Vorabend eine Alteromonas-Übernachtkultur (ca. 10 Stunden) angesetzt. Am Testtag

wurden bei Erreichen einer OD von ca. 0,8 100 µl Übernachtkultur und 100 µl

Phagenlysat der Verdünnungsstufen 1:106 – 1:1012 30 min bei Raumtemperatur

inkubiert. 100 µl des Gemisches wurden mit 2 ml flüssigem, 46-48°C warmem Top-

Agar auf mit Bottom-Agar ausgegossenen Platten ausplattiert und über Nacht bei

Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag konnten die Plaques ausgezählt und

die Konzentration der aktiven Phagen wurde als plaque forming units (PFU)

berechnet.

4.3.3 PM2-Präparation

1.Tag:

Acht 2L-Schikanekolben mit je 1 l Medium wurden mit je 40 ml Alteromonas-

Übernachtkultur (siehe 4.3.2) und auf einem Taumler gut geschüttelt, so dass eine

gute Sättigung der Kultur mit Sauerstoff erreicht wurde. Nach ca. 2 Stunden und dem

Erreichen einer OD von 0,7 wurden pro Liter Bakerienmedium 1x1010 Phagen

zugegeben und der Anstieg der OD am Photometer stündlich kontrolliert. Nach

Erreichen eines Maximums von über 1,0 und vollständiger Lyse (OD ca. 0,1) wurden

die Lysate in zwei 5L-Erlenmeyerkolben verteilt und 43 g pro Liter Lysat

Polyethylenglycol 6000 (PEG) eingerührt. Nachdem sich das PEG gelöst hat wurde

2,36 g pro Liter Lysat Natriumdextransulfat zugegeben. Sobald die Lösungen

homogen waren wurden die Kolben in 45°-Position für ca. 36 Stunden bei 4°C

gelagert.

2. Tag:

Alle folgenden Schritte wurden auf Eis durchgeführt und die Zentrifugationen

erfolgten bei 4°C. In den Kolben hatten sich Sedimente abgesetzt. Der Überstand

wurde fast vollständig mit einer Pumpe abgesaugt, die Sedimente resuspendiert und

auf 40 ml-Zentrifugenröhrchen verteilt. Nach der Zentrifugation (25 min, 10.000 g)

befanden sich die Phagen im Sediment. Die Oberphase wurde vorsichtig abpipettiert,

die Pellets in einem Becherglas gewogen, mit der doppelten Menge NTC-Puffer


(1M NaCl, 9,7 mM CaCl2, 10,15 mM Tris/HCl) resuspendiert und 20 min bei 18.000 g

zentrifugiert. Der Überstand wurde abdekantiert, die Pellets in ein Pottergefäß

überführt und mit 3 ml/l Kulturlösung NTC-Puffer in einem Homogenisator nach

Potter homogenisiert (12 x bei 1.500 rpm). Nach einer weiteren Zentrifugation bei

12.000 g und 20 min befanden sich die PM2-Phagen im Überstand. Dieser wurde

daraufhin in ein Becherglas überführt und das Pellet mit 1,5 ml/l Kulturlösung NTC-

Puffer erneut extrahiert und abzentrifugiert. Die gewonnen Überstände wurden

vereinigt und 3 Stunden bei 30.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgezogen

und verworfen und die im Pellet befindlichen Phagen mit 2-3 ml

Flüssigkeitsüberstand über Nacht bei 4°C gelagert.

3.Tag:

Die Pellets wurden erneut in 27 ml NTC Puffer resuspendiert und noch einmal nach

Potter homogenisiert. Die Lösung wurde in einen Erlenmeyerkolben überführt und

pro ml Lösung 0,39 g CsCl eingewogen um eine Dichte von genau 1,27-1,29 g/ml

einzustellen. Die Lösung wurde anschließend 10 min bei 5.000 rpm abzentrifugiert

um Proteinreste zu entfernen. Nach erneuter Kontrolle der Dichte wurde die Lösung

in Ultrazentrifugen-Röhrchen überführt und für mindestens 12 Stunden über Nacht

bei 30.000 g zentrifugiert.

4.Tag:

Durch die Ultrazentrifugation wurden die Phagen im CsCl-Gradienten

aufkonzentriert, die als trübe Bande im oberen Drittel des Röhrchens gefunden

werden konnten. Die Bande wurde nun vorsichtig von oben mit einer

abgeschnittenen Pipettenspitzte abgenommen und in sterilen 2ml-Reaktionsgefäßen

aufgefangen; ihr Volumen betrug ca. 3 ml.

Anschließend wurde die Phagenlösung über eine sorfältig mit BE1-Puffer

vorgespülte Sepharosesäule (10 cm Länge, Duchmesser 2,5 cm, Material Sepharose

2B, Amersham) vom CsCl gereinigt. Das Eluat wurde in Fraktionen aufgefangen und

die Fraktionen am Biophotometer vermessen. Fraktionen mit einem 260/280 nm

Verhältnis von 1,35 – 1,43 wurden vereinigt (ca. 30 ml). Die Isolierung der DNA aus

den Phagen erfolgte mittels Phenol-Chloroform-Extraktion. In einem ersten Schritt

wurde dazu das gleiche Volumen an Phenol (Roti-Phenol, pH 7) mit 1% SDS zum

Aufspalten der Phagen und 0,1% Hydroxychinolin zum Schutz vor oxidativen

Schäden, zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur über Kopf

geschüttelt anschließend 5 min bei 10.000 g zentrifugiert und der Überstand


nochmals mit Phenol ohne SDS extrahiert. Zur Entfernung des Phenols wurde der

klare Überstand mit Chloroform ausgeschüttelt und erneut 5 min bei 10.000 g

zentrifugiert. Die DNA aus dem Überstand wurde mit dem 2,5-fachen Volumen

EtOH/125 mM Natriumacetat ausgefällt. Die DNA fiel nach ca. 1 h bei

Raumtemperatur aus. Falls dies nicht der Fall ist, kann das Gemisch über Nacht bei -

20°C gelagert werden. Die 10 min bei 10.000 g abzentrifugierte DNA wurde mit

eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen, erneut abzentrifugiert und in 1 ml BE1-

Puffer gelöst.

Die Konzentration der DNA wurde photometrisch am Biophotometer (1 OD260 nm =

50 µg DNA/ml) durchgeführt. Abschließend wurde das Verhältnis von

überspiralisierter zu ringoffener Form im Agarosegel (siehe 4.4) bestimmt, das

höchstens bei 20% ringoffener Form liegen sollte. Die gereinigte PM2-DNA wurde

aliquotiert und in BE1-Puffer bei -20°C gelagert.


4.4 DNA-Relaxationstest

Die Enzymaktivität des Fpg-Proteins wird anhand seiner Eigenschaft gemessen, in

oxidativ geschädigter PM2-DNA einen Einzelstrangbruch zu erzeugen. Durch den

Thiazinfarbstoff Methylenblau in Kombination mit sichtbarem Licht wird

Singulettsauerstoff erzeugt, der in isolierter PM2-DNA neben wenigen Strangbrüchen

fast ausschließlich Fpg-sensitive Stellen und darunter überwiegend 8-Oxoguanin

erzeugt (Floyd et al., 1989). Die Endonuklease Fpg ist in der Lage, in einer so

geschädigten DNA einzuschneiden. Die überspiralisierte PM2-DNA wird dadurch in

die realxierte, ringoffene Form überführt. Beide DNA-Formen können mittels einer

Agarose Gelelektophorese voneinander getrennt und nach Anfärbung mit

Ethidiumbromid am Geldokumentationsgerät quantifiziert werden. Aus dem

Verhältnis der beiden Banden lässt sich abschließend die DNA-Strangbruchrate und

die Fpg-Aktivität berechnen (Müller et al., 1990).

4.4.1 Versuchsdurchführung

PM2-DNA (20 µg/ml) wurde in einem 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst,

der zur Erzielung der geeigneten Ionenstärke zusätzlich 100 mM NaCl enthält. Die

Schadensinduktion erfolgte in einem abgedunkelten Raum mit Hilfe des Photo-

sensibilisators Methylenblau (10 µg/ml) und sichtbarem Licht (60 W, 50 cm

Entfernung = 5,25 J/m2/s). Nach der Schädigung wurde die DNA nach Zugabe eines

ethanolischen Fällungsreagenz (5% 2,5 M Natriumacetat, 95% Ethanol) 30 min bei

4°C im Dunkeln ausgefällt. Die 5 min bei 7000 g abzentrifugierte DNA wurde

vollständig vom Überstand abgetrennt. Noch vorhandene Reste des Überstandes

wurden sorgfältig mit einem Papiertuch entfernt. Anschließend wurde das erhaltene

DNA- Pellet in Enzympuffer (20 µg/ml) resuspendiert.

Parallel zur DNA-Schädigung wurde frisch bereitete Fpg-Lösung (1,3 µg/ml)

zusammen mit der zu untersuchenden Arsenverbindung in einem 100 µl-Ansatz für

30 min bei 37°C inkubiert (Vorinkubation). Es wurde für jede Konzentration der

Arsen- bzw. Zink-Verbindung oder Kombination jeweils ein Ansatz mit Fpg und ohne

Fpg mitgeführt, um zu unterscheiden, welche Strangbrüche durch die Fpg und

welche durch die Arsen-Verbindung selbst erzeugt wurden.


10 µl der oxidativ geschädigten DNA bzw. ungeschädigte Kontroll-DNA (300

ng/Ansatz) wurden zusammen mit 30 µl Vorinkubationslösung 30 min bei 37°C

inkubiert, so dass sich eine Fpg-Endkonzentration von 1 µg/ml ergibt

(Hauptinkubation). Während dieser Zeit detektierte die Fpg die zuvor erzeugten

oxidativen Basenschäden und setzte Einzelstrangbrüche. Die Reaktion wurde mit

7 µl Stoppreagenz beendet und die Proben auf ein 1%iges Agarose-Gel aufgetragen.

Nach 2,5 h bei 90 V waren die DNA-Formen von einander getrennt und das Gel

wurde für 30 min mit Ethidiumbromid (1,25 µg/ml) gefärbt. Abschließend wurde das

Gel für 10 min in Wasser entfärbt, und mit Hilfe eines HEROLAB Gel-

Dokumentationsgerätes und eines computergestützten Auswertungsprogramms

(Easy Win 32) wurden die Banden der beiden DNA-Formen bei einer Wellenlänge

von 254 nm densitometrisch detektiert. Aus dem Verhältnis der beiden Banden lies

sich eine Poisson-Verteilung der Strangbrüche nach Müller berechnen. Der

Korrekturfaktor von 1,4 gleicht die geringere Fluoreszenz der überspiralisierten

gegenüber der ringoffenen Form aus (Müller et al., 1990).

N = -ln[(1,4 x I)/(1,4 x I + II)]

N = Strangbruchrate/ PM2- Molekül

I = % der überspiralisierten Form

II = % der ringoffenen Form

Die Fpg-Enzymaktivität wurde berechnet als % der Enzymaktivität bezogen auf die

Kontrolle ohne Substanzzusatz, die gleich 100% gesetzt wurde. Aus der

Enzymaktivität lies sich eine eventuell vorhandene Reparaturhemmung des Fpg-

Proteins durch die eingesetzte Verbindung ableiten.


4.5 Zinkfreisetzung aus XPAzf

Die Reaktivität von Zink-gebundenen Cysteinen, wie sie in Zinkfingerstrukturen von

z.B. XPA vorkommen, gegenüber Metallverbindungen lässt sich durch die Messung

des freigesetzten Zinks ermitteln. Freie Zinkionen werden von dem Metallindikator 4-

2-Pyridylazoresorcinol mit hoher Aktivität gebunden. Der Indikator verändert sein

Absorptionsmaximum und der Zink-Farbstoff-Komplex kann bei 492 nm

photometrisch bestimmt werden (Abb. 6) (McCall und Fierke, 2000; Maret, 2002).

NN

N OH

ON

NN

O

OH

Zn2+

NN

N OH

ON

NN

O

OH

Zn2+

Abbildung 6: Komplex zwischen 4-2-Pyridylazoresorcinol und Zink (McCall und Fierke, 2000)

Für die Zinkfreisetzungsversuche wird ein kommerziell synthetisiertes Peptid

verwendet, das die Zinkfingerstruktur von humanem XPA repräsentiert (XPAzf) (101-

137). Es besitzt folgende Aminosäuresequenz, wobei das N-terminale Ende

acetyliert und das C-terminale Ende amidiert wurde, um zusätzliche

Metallbindungsstellen zu blockieren:

AcDYVICEECGKEFMDSYLMNHFDLPTCDNCRDADDKHKam


XPAzf mit einer Molmasse von ca. 6800 g/mol wurde als erstes mit Zink abgesättigt,

um die Zinkfingerstruktur zu erzeugen. Dafür wurde eine 100 µM ZnCl2-Lösung in 20

mM Hepes/NaOH-Puffer hergestellt und pro 0,28 mg XPAzf 420 µl dieser Zink-

Lösung zugegeben. Ein Aliquot dieser XPAzf-Stammlösung wurde nun mit 4-2-

Pyridylazoresorcinol versetzt und optisch mit Vergleichslösungen verglichen, die 0, 2,


3 bzw. 4 µM Zink enthielten. Es wurde nun in kleinen Schritten so lange ZnCl2-

Lösung (100 µM) zugegeben bis ein Überschuss von Zink vorlag.

Für die Zinkfreisetzung wurde ein Mastermix hergestellt. Pro Probe wurden 53,1 µl

Hepes-Puffer sowie 13,4 µl XPAzf-Stammlösung vorgelegt und dann 0,672 µl der

Arsenverbindung zugegeben. Als Positivkontrolle wurde bei jedem Versuch 10 mM

H2O2 mitgeführt, das eine 100%ige Zinkfreisetzung bewirkt. Alle Inkubationslösungen

wurden in den Deckel des Reaktionsgefäßes pipettiert und dann gemeinsam

herunterzentrifugiert, um einen gleichzeitigen Beginn aller Reaktionen zu

gewährleisten. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei 37°C wurden 2,8 µl 4-2-

Pyridylazoresorcinol zugegeben. Aus einer Probe wurden 3 x 20 µl Lösung in eine

384-Loch-Mikrotiterplatte pipettiert und die Platte am Mikrotiterplattenlesegerät

(Tecan) bei 492 nm vermessen. Alle Werte wurden auf die Kontrolle mit 10 mM H2O2

bezogen, die definitionsgemäß 100% Zinkfreisetzung darstellt.

4.6 DNA-Bindungsaktivität von XPA mittels Gelshift

Mit Hilfe eines so genannten Gelshift-Assays ist es möglich die DNA-

Bindungsfähigkeit des XPA-Proteins nach Inkubation mit Arsen zu bestimmen. Man

macht sich hierbei die Eigenschaft zu nutzte, dass in einem nativen Polyacrylamidgel

ein Komplex aus einem Oligonukleotid und XPA langsamer wandert als freies

Oligonukleotid. Für die Experimente werden rekombinantes Maus-XPA und ein 70 bp

langes Oligonukleotid verwendet, das jeweils 5’ mit einem Digoxigeninderivat

endmarkiert war und folgende Sequenz besitzt (Blessing et al., 2004):

5’-ATA TGT GCA CAT GGC GCA CGT ATG TAT CTA TAG TCT

3’-TAT ACA CGT GTA CCG CGT GCA TAC ATA GAT ATC AGA

GCC ATC ACG CCA GTC AAT CGC TGT GGT ATA TGC A-3’

CGG TAG TGC GGT CAG TTA GCG ACA CCA TAT ACG T-5’



Die beiden einzelsträngigen Oligonukleotide wuden zuerst getrennt von einander für

5 min und anschließend vereinigt für weitere 5 min bei 80°C aufgeschmolzen. Um ein

Annealing der beiden Stränge zu gewährleisten, wurden sie langsam bei

Raumtemperatur im Dunkeln ca. 15 min abgekühlt. Im Anschluss daran wurde der

Doppelstrang auf Eis mit einer Dosis von 18 KJ/m2 bei 254 nm (UVC) bestrahlt.

Durch die gewählte Sequenz werden hier vor allem 6-4-Photoprodukte induziert, an

die XPA bevorzugt bindet.

Pro Ansatz wurde nun 4 µl Gelshiftpuffer, 4,5 µl (Ansätze mit Arsen) bzw. 5,5 µl

(Ansätze ohne Arsen) bidestilliertes Wasser und 2 µl XPA (500 ng) vorgelegt. Als

nächstes wurde 1 µl Arsenlösung in den Deckel des Reaktionsgefäßes pipettiert, die

Lösung herunterzentrifugiert und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurden 2 µl Oligonukleotid (120 fmol/l) zupipettiert und die Proben

gemeinsam herunterzentrifugiert, damit die Bindung der Oligonukleotide an XPA

gleichzeitig startet. Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur im

Dunkeln wurde jeder Probe 1,5 µl Ladepuffer (ohne Farbstoffe) zugesetzt. Die

Proben wurden mittels eines 5%igem nativem Polyacrylamidgel bei 90 V innerhalb

von ca. 75 min aufgetrennt. Zur Markierung der Lauffront wurden zusätzlich die

äußeren beiden Geltaschen mit Farbstoffen beladen.

Zur Vorbereitung des Semidry-Southern-Blots wurden zuerst eine Nylonmembran

(Hybond N+, Amersham) sowie 6 Blotpapiere (3MM-Whatman) einige Minuten in

0,5fachem TBE-Puffer äquilibriert. Zum Transfer der Oligonukleotide auf die

Membran wurde ein Stapel bestehend aus drei Blotpapieren, der Membran, dem Gel

und wiederum 3 Blotpapieren gebildet. Es ist darauf zu achten, dass sich keine

Luftblasen zwischen den einzelnen Schichten bilden. Zum Blotten der

Oligonukleotide wurde für 30 min eine Spannung von 20 V an die Apparatur angelegt

und die Oligonukleotide abschließend für 1,5 h bei 100°C im Trockenschrank fixiert.

Die Membran wurde für eine Minute in Maleinsäurepuffer und für 30 min in

Blockierlösung getaucht. Anschließend wurde die Membran mit einem Anti-

Digoxigenin-Antikörper, der mit Peroxidase gekoppelt war, in Blockierlösung 1:1000

verdünnt, in eine Folie eingeschweißt und 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln

inkubiert. Die Membran wurde für 15 min in Waschpuffer und weitere

15 min in Maleinsäurepuffer gewaschen. Für die Detektion wurde die Membran für


eine Minute mit 750 µl einer 1:1-Mischung der ECL-Lösungen inkubiert. Die

Detektionslösungen wurden von der Membran gestrichen und im Dunkeln ein

Autoradiographie-Film aufgelegt. Bei der Reaktion der Peroxidase mit ihrem Substrat

wird Licht emittiert, das den Fotofilm schwärzt (Chemilumineszenz). Zur Entwicklung

des Films wurde dieser nacheinander in Entwickler, Wasser, Fixierer und nochmals

in Wasser getaucht und getrocknet.

4.7 Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen

Der Nachweis der Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 basiert auf einer in situ

immunflourimetrischen Detektion durch den primären monoklonalen Anti-PAR-

Antikörper 10H (Kawamitsu et al., 1984). Die Quantifizierung erfolgt am

Fluoreszenzmikroskop über die Detektion eines fluoreszenzmarkierten sekundären

Antikörpers. Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung wird durch eine DNA-Strangbruchinduktion

mittels H2O2 aktiviert, so dass vorwiegend die an der DNA-Reparatur beteiligten

PARP-1 und PARP-2 für die Reaktion verantwortlich sind (Küpper et al., 1990; Burkle

et al., 1993; Hartwig et al., 2003). Der primäre Antikörper wurde uns

freundlicherweise von Prof. Alexander Bürkle (Universität Konstanz) zur Verfügung

gestellt.


200.000 HeLa S3 Zellen wurden in Zellkulturschalen (40 x 10 mm) ausgestreut und

für ca. 2 Tage auf in den Schalen liegenden Deckgläschen (15 mm Durchmeser)

wachsen gelassen. Für die Versuche müssen die Zellen etwa halbkonfluent sein.

Dies wurde am Mikroskop überprüft wurde. Die Inkubation mit den

Arsenverbindungen erfolgte ca. 24 h nach dem Ausstreuen für weitere 18 h. Nach

Ende der Inkubationszeit wurden die Deckgläschen für 5 min bei 37°C mit 100 µM

H2O2 zur Induktion von DNA-Strangbrüchen inkubiert.

Anschließend wurden die Deckgläschen mit einer gebogenen Pinzette aus den

Schalen entfernt, kurz in eiskaltem PBS gewaschen und für mindestens 10 min in

eiskalter 10%iger (w/v) Trichloressigsäure fixiert. Anschließend wurden die

Deckgläschen für 5 min in auf -20°C vorgekühltem 70%igem Ethanol gewaschen,

gefolgt von zwei weiteren Waschschritten in 90% und 100% Ethanol. Die


Deckgläschen wurden auf Blotpapier gelegt und im Dunkeln an der Luft getrocknet.

Auf diese Weise fixiert sind die Präparate einige Tage lagerstabil.

Die Deckgläschen wurden zur Detektion mit den Antikörpern zuerst kurz in PBS

angefeuchtet und mit jeweils 50 µl der Antikörperlösung inkubiert (10H, 1:300

verdünnt in Blockierlösung, 5 µg/ml). Die Inkubation erfolgte in einer feuchten

Kammer im Dunkeln 30 min bei 37°C. Anschließend wurde überschüssige

Antikörperlösung 4 x 5 min mit PBS abgewaschen, wobei die Deckgläschen mit

einem starken Strahl aus der Spritzflasche abgespült wurden. Der sekundäre FITC-

gekoppelte Antikörper (1:50 in Blockierreagenz) wurde analog zum primären

Antikörper inkubiert. Hier ist darauf zu achten, dass bei gedämpftem Licht gearbeitet

wird, um ein Ausbleichen des Fluoreszenzfarbstoffs zu vermeiden. Nach weiteren

Waschschritten (s.o.) wurden die Deckgläschen mit der Oberseite nach unten auf mit

einem Tropfen Vectashield (Eindeckmedium mit DAPI) vorbereiteten Objekträgern

luftblasenfrei gelegt. DAPI bindet an DNA und färbt so die Zellkerne an. Vectashield-

Eindeckmedium bewahrt die Fluoreszenz des Objekts für mehrere Tage.

4.7.2 Auswertung am Fluoreszenzmikroskop

Die Auswertung erfolgte an einem Fluoreszenzmikroskop der Firma Nikon (Eclipse

E400). Dazu wurden mit einer SPOT RT (real time) Kamera (Visitron Systems,

Puchheim) sowohl für den DAPI- als auch für den FITC-Kanal pro Objektträger

mindestens 5 Bilder von verschiedenen Stellen in der Mitte des Objekts

aufgenommen. Über den DAPI-Kanal wurden nun mindestens 50 Zellen pro

Objektträger ausgewählt, die Regionen auf den jeweiligen FITC-Kanal übertragen

und die Fluoreszenzintensität mittels eines computergestützten

Auswertungsprogramms (MetaView, Version 4.1.5, Visitron Systems, Puchheim)

quantifiziert. Für die Auswertung wurden nur intakte Zellen ausgewählt, da z.B.

Zellen, die sich in der Mitose oder Apoptose befinden, ein unspezifisch hohes

Fluoreszenzsignal zeigen.


4.8 PARP-1 Proteingehalt

Zur Bestimmung des PARP-1 Proteingehalts nach Inkubation mit den

Arsenverbindungen werden zunächst die Proteine aus den Zellen isoliert. Die

Proteinextrakte werden anschließend denaturiert und über ein 10%iges

Polyacrylamidgel aufgetrennt. Nach dem Transfer der Proteine auf eine PVDF-

Membran (Western Blot) kann PARP-1 durch Inkubation mit dem primären

Antikörper CII-10 und einem sekundären Peroxidase-gekoppelten Antikörper über

Chemilumineszenz detektiert werden. CII-10 erkennt neben der 116 kDa großen

vollständigen PARP-1 auch das apoptosetypische 85 kDa Fragment.


In eine Zellkulturschale (60 x 15 mm) wurden 400.000 HeLa S3-Zellen ausgestreut

und für ca. 24 Stunden anwachsen gelassen. Die Arsenverbindungen wurden für 18

Stunden direkt in das Kulturmedium inkubiert. Alle folgenden Schritte bis zur

Denaturierung der Proteine wurden auf Eis durchgeführt um eine zu starke

Automodifizierung der PARP-1 zu verhindern. Das gebrauchte Kulturmedium wurde

nach Ablauf der Inkubationszeit in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben, die Zellen

mit Trypsin inkubiert und mit dem gebrauchten Medium von der Schale abgelöst.

Dies ist wichtig, da auf diese Weise auch sich vom Boden der Zellkulturschale schon

abgelöste Zellen, zur Ermittlung des apoptotischen Fragments der PARP-1 miterfasst

werden. Die Zellen wurden 5 min bei 1000 g und 4°C abzentrifugiert und das Medium

abgesaugt. Das Zellpellet wurde mit eiskaltem PBS resuspendiert und die Zellzahl

am automatischen Zellzählgerät (CASY) bestimmt. Die Zellen wurden ein weiteres

Mal 5 min bei 1000 g bei 4°C abzentrifugiert und der Überstand vollständig

abgesaugt. Das Zellpellet wurde anschließend in 50 µl Proteaseinhibitorlösung

resuspendiert und in ein Mikroreaktionsgefäß überführt. Sofort wurden 100 µl 95°C

heißer 1,5x Probenpuffer zugegeben und die Proteine 5 min bei 95°C denaturiert.

Der noch heiße und sehr viskose Zellextrakt wurde nun mehrfach mit einer Pipette

auf- und abgezogen um die DNA zu scheren und so eine pipettierbare Lösung zu

erhalten. Die Proteinextrakte können sofort auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen

oder bei -20°C gelagert werden.


Die Extrakte (100.000 Zellen pro Bahn) wurden zusammen mit einem

Molekulargewichtsmarker (Peqgold, Peqlab) und isolierter PARP-1 (50 ng, Isolierung

siehe 4.9) auf ein denaturierendes SDS-PAGE Gel aufgetragen. Zur Detektion der

116 kDa- und 85 kDa-Banden wurde ein 10%iges Trenngel und ein 3%iges

Sammelgel verwendet. Die Elekrophorese erfolgte bei 80 V im Sammelgel und zur

Trennung der Proteine bei 100 V im Trenngel. Nach Beendigung der Elektrophorese

wurde das Gel für 20 min in eiskaltem Transferpuffer und eine PVDF-Membran

(Hybond P, GE Healthcare) zunächst 10 sec in Methanol, 5 min in Wasser und

abschießend 10 min in eiskaltem Transferpuffer äquilibriert. Der Aufbau des

Blotstapels erfolgte wie in 4.6.1 beschrieben. Der Transfer der Proteine wurde in der

Semidry-Blot-Apparatur bei 0,8 A/cm2 für eine Stunde durchgeführt.

Die Membran wurde nach Ende des Transfers kurz in PBS SDS-frei gewaschen und

zur Absättigung von unspezifischen Bindungsstellen für eine Stunde in

Magermilchpulver (5% in PBS-T) geschwenkt. Anschließend wurde die Membran

über Nacht bei 4°C mit dem primären Antikörper (CII-10, Alexis, 1:2.500 verdünnt in

Blockierlösung) in Folie eingeschweißt inkubiert. Am nächsten Tag wurde die

Membran 3 x 10 min in PBS-T gewaschen und für eine weitere Stunde mit dem

sekundären Peroxidase-gekoppelten Antikörper (Anti-Maus, Santa Cruz, 1:2.500

verdünnt in Blockierlösung) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wurde

wiederum 3 x 10 in PBS-T gewaschen, kurz in PBS getaucht und mit ca. 800 µl einer

1:1-Mischung von ECL-Advance Lösungen (Amersham) für 5 min inkubiert. Die

Signale wurden über ein Chemilumineszenz-Geldokumentationsgerät (LAS 3000,

Fuji) aufgenommen und die Banden über eine computergestützte

Auswertungssoftware (AIDA, Raytest) quantifiziert.

Die Membran wurde für mindestens eine Stunde in PBS gewaschen, mit primärem

Anti-Aktin-Antikörper (Kaninchen) für eine weitere Stunde inkubiert und wie oben

beschrieben gewaschen. Nach der Inkubation mit sekundärem Anti-Kaninchen-

Antikörper (HRP-markiert) und Waschschritten (s.o.) wurde Aktin als Ladekontrolle

wie oben beschrieben mittels Chemilumineszenzdetektionsgerät nachgewiesen.


4.9 Isolierung von PARP-1

Humane PARP-1 wird aus mit rekombinanten Bacculoviren infizierten Insektenzellen

(Sf9) isoliert. Mit Hilfe eines Baculo-Gold-Kits wurde ein rekombinanter Bacculovirus-

PARP-1-Klon erzeugt, der Sf9-Zellen infiziert, welche dadurch zu über 50% humane

PARP-1 exprimieren. Bei der Aufreinigung der Zellextrakte macht man sich zu Nutze,

dass PARP-1 aufgrund seiner hohen Affinität zur DNA an eine mit doppelsträngiger

DNA modifizierten Cellulosesäule bindet. Die Arbeiten wurden mit Unterstützung der

Arbeitsgruppe von Prof. Bürkle an der Universität Konstanz modifiziert nach der

Methode von (Beneke et al., 2000) durchgeführt. Recombinante Bacculovieren sowie

Sf9-Zellen wurden dort freundlicherweise zur Verfügung gestellt.

4.9.1 Infektion der Sf9-Zellen

2 x 107 Sf9 Zellen wurden in Zellkulturschalen ausgesät und nach 15minütigem

Anheften mit einer moi ≥ 3 (Verhältnis Viruszahl zu Zellzahl) infiziert. Die Schalen

wurden über 1 Stunde alle 20 min kurz geschwenkt, nachfolgend die Zellen

abgespült in 200 ml Aliquots, in 500 ml Erlenmeyerkolben überführt, mit 0,2%

Pluronsäure F-68 versetzt und 45 h in einem 26°C Schüttelwasserbad (90 rpm, 2 cm

Auslenkung) inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 10 min bei Raumtemperatur

und 140 g zentrifugiert und das Zellsediment bei -70°C eingefroren (Miranda et al.,

1997).

4.9.2 Aufreinigung rekombinanter PARP-1

108 Zellen wurden in 7,5 ml Puffer A resuspendiert und Tween 20, Nonidet P-40

sowie NaCl zugegeben, so dass jeweils eine Enkonzentration von 0,2% bzw. 0,5 M

(NaCl) erreicht wurde. Diese Lösung wurde 20 min bei 4°C auf einem

Überkopfmischer inkubiert und nachfolgend 20 min bei 20.000 g und 4°C

zentrifugiert. Die DNA im Überstand wurde durch Zugabe von Protaminsulfat mit

einer Endkonzentration von 1 mg/ml ausgefällt und durch Zentrifugation wie oben

sedimentiert. Anschließend wurde eine fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung der

Proteine durchgeführt in Schritten von 30%iger (NH4)2SO4-Sättigung und 70%iger

(NH4)2SO4-Sättigung, wobei das Ammoniumsulfat jeweils langsam zugegeben


wurde. Nach einer Zentrifugation für 20 min bei 20.000 g und 4°C wurde im ersten

Schritt der Überstand weiterverwendet, im zweiten Schritt das Sediment, welches in

3 ml Puffer B resuspendiert wurde. Diese Lösung wurde nur kurzfristig bei 4°C

gelagert und anschließend zur einer Gelfiltration eingesetzt (Giner et al., 1992).

1 g Sephadex G100-50 superfine (Sigma) wurde mit 20 ml Puffer C versetzt und

30 min bei Raumtemperatur zur Quellung belassen. Eine 60 ml Säule wurde mit

Glaswatte gestopft und mit der Sephadex-Suspension beschickt. Nach Abtropfen der

Flüssigkeit bei 4°C wurde die Säule mit 3 ml Puffer B-Resuspendat beladen. Der

Durchfluss wurde verworfen und anschließend 30 ml Puffer D auf die Säule

gegeben. Die Eluat-ml 2-23 wurden aufgefangen und nachfolgend auf eine

dsDNA(Doppelstrang)-Cellulose-Säule gegeben.

0,3 g dsDNA-Cellulose wurden in 15 ml Puffer BII inklusive 0,1 M KCL

aufgenommen. Die Suspension wurde 30 min bei Raumtemperatur unter Schütteln

inkubiert und anschließend 5 min bei RT und 1100 g zentrifugiert. Das Sediment

wurde mit 7 ml Puffer BII aufgenommen, für weitere 30 min unter Schütteln inkubiert

und das Säulenmaterial nochmals wie oben beschrieben abzentrifugiert. Das

Sediment wurde wiederum in 6 ml BII-Puffer resuspendiert und auf eine dsDNA-

Cellulose-Säule in 10 ml Polyprep-Säulen gegeben, so dass sich nach dem

Abtropfen des Puffers ein Säulenvolumen von 2 ml ergab. Die weiteren

Arbeitsschritte wurden alle bei 4°C durchgeführt.

Je 4 ml des Sephadex-Eluats wurden auf die dsDNA-Säule gegeben und nach

Durchfluss die Säule mit 10 ml Puffer D gespült. Danach wurde die Säule mit 2 ml

Puffer D/0,28 M KCl beladen und anschließend mit 500 µl Puffer D/2,8 M KCl

gewaschen. Nach dieser Präelution wurde die an der DNA gebundene PARP-1 mit

1,5 ml Puffer D/2,8 M KCl von der Säule eluiert und sofort mit 20% Glycerin versetzt

(Kofler et al., 1993).

Die PARP-1 Proben wurden bei 4°C in Kollodium-Hülsen über Nacht gegen

PBS/20% Glycerin dialysiert. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte

abschließend durch die Messung der Extinktion bei 235 und 280 nm. Die Differenz

dieser beiden Werte dividiert durch den Faktor 2,51 ergab dabei die Konzentration in

mg/ml. Als Vergleich und Kontrolle dienten entsprechende Lösungen von BSA in

PBS/20% Glycerin (Whitaker und Granum, 1980).


4.10 Poly(ADP-Ribosyl)ierung isolierter PARP-1

Isolierte PARP-1 modifiziert sich selbst und zugesetzte Histone, wenn sie durch ein

kurzes Oligonukleotid aktiviert wird. Nach Abstoppen der Reaktion kann das

Gemisch mit Hilfe einer Slot-Blot-Apparatur auf eine Membran aufgesaugt werden.

Die poly(ADP-ribosyl)ierten Proteine werden nachfolgend mit dem gegen Poly(ADP-

Ribose) gerichteten Antikörper 10H und einem sekundären Peroxidase-gekoppelten

Antikörper mittels Chemilumineszenz detektiert.


27 µl isolierte PARP-1 (0,5 µg/ml) wurden in Reaktionsgefäße vorgelegt und 3 µl

Arsenlösung in den Deckel pipettiert. Nachdem die Proben gemeinsam

herunterzentrifugiert wurden, wurde die PARP-1 30 min bei 37°C vorinkubiert. In der

Zwischenzeit wurde ein Mastermix bereitet, bestehend (pro Probe) aus 10 µl

Reaktionspuffer (10x), 20 µl Histone Typ IIa (0,1 mg/ml), 5 µl Oligonukleotid (8mer,

GGAATTCC, 1mg/ml), 5 µl DTT (20 mM), 10 µl ß-NAD+ (2mM) und 45 µl H2O.

Histone, DTT und ß-NAD+ wurden frisch angesetzt. Aus dem Vorinkubationsansatz

wurden 3 x 5 µl in den Deckel eines mit Mastermix vorgelegten Reaktionsgefäßes

pipettiert, so dass eine Dreifachbestimmung entsteht. Es wurde wiederum

gemeinsam herunterzentrifugiert und die PARP-1-Reaktion für 10 min bei 37°C

ablaufen gelassen. Die Reaktion wird durch Zugabe von 200 µl eiskaltem PARP

Inhibitor 3-Aminobenzamid (12,5 mM) gestoppt. Die Proben wurden nach ca. 20 min

auf Eis mit einer Slot-Blot-Apparatur (Roth) auf eine Membran (Hybond N+,

Amersham) aufgesaugt. Mit Hilfe einer Multisteppipette wurden anschließend 150 µl

eiskalte 10%ige TCA/2%ige Na4P2O7 in jedes Loch pipettiert und mit 200 µl 70%igem

Ethanol überschichtet. Die Mischung wurde bis zur Trockne abgesaugt und die

Membran für eine Stunde im Trockenschrank bei 90°C fixiert. Die Membran wurde im

Anschluss eine Stunde mit Blockierlösung (5% Magermilchpulver in PBS-T)

abgesättigt und eine weitere Stunde mit primärem Antikörper (10 H, 1:300 verdünnt

in Blockierlösung) gegen Poly(ADP-Ribose) bei Raumtemperatur inkubiert.

Anschließend wurde die Membran 4 x 5 min mit PBS-T gewaschen und für eine

Stunde mit einem sekundären Peroxidase-gekoppelten Antikörper (Anti-Maus, Santa

Cruz) bei Raumtemperatur behandelt. Nach weiteren vier fünfminütigen


Waschschritten mit PBS-T wurde die Membran kurz in PBS getaucht und wie unter

4.8.1 beschrieben mit ECL detektiert.

42 Ergebnisse und Diskussion

5. Ergebnisse und Diskussion

Im folgenden Abschnitt der Arbeit werden die Effekte von Arsenit und seinen

methylierten Metaboliten auf die Zinkfingerproteine Fpg, XPA und PARP-1

nacheinander beschrieben. Zunächst wird jedoch auf die eingesetzten

Arsenverbindungen und deren zytotoxische Wirkungen auf HeLa S3 Zellen

eingegangen.

5.1 Eingesetzte Arsenverbindungen

Für die Untersuchungen wurden neben anorganischem Arsenit die fünfwertigen

Metabolite MMA(V) und DMA(V) (Kakodylsäure) eingesetzt. Die beiden fünfwertigen

Metabolite sind im Gegensatz zu den dreiwertigen Metaboliten kommerziell

erhältlich. Zur Untersuchung der dreiwertigen Metabolite wurden Methyloxoarsin,

Diiodomethylarsin und Iododimethylarsin eingesetzt. Für die beiden

monomethylierten Verbindungen konnte von Petrick et al. (2001) gezeigt werden,

dass sie in wässriger Lösung MMA(III) (CH3AsIII(OH)2) bilden (Petrick et al., 2001).

Man geht davon aus, dass aus Iododimethylarsin unter ähnlichen Bedingungen

DMA(III) ((CH3)2AsIIIOH) entsteht (Mass et al., 2001). Um auszuschließen, dass

mögliche Effekte auf das Iod in den Verbindungen zurückzuführen sind, wurden für

Monomethyloxoarsin und Diiodomethylarsin vergleichende Untersuchungen zum

Einfluss auf Fpg und zur Zinkfreisetztung aus XPAzf durchgeführt. Es konnte hierbei

kein Unterschied zwischen der iodhaltigen und der nicht-iodhaltigen Verbindung

festgestellt werden (Daten siehe Anhang). Zudem konnte in unserer Arbeitsgruppe

gezeigt werden, dass auch im zellulären System bezogen auf die Zytotoxizität sowie

auf die Benzo[a]pyrendiolepoxid-induzierte DNA-Adduktbildung und Reparatur in

A549 Zellen kein Unterschied zwischen den beiden Verbindungen zu sehen ist

(Schwerdtle et al., 2003a). Für die weiteren Versuche zur Poly(ADP-Ribosyl)ierung

wurde auf vergleichende Untersuchungen verzichtet und nur Methyloxoarsin

eingesetzt. Alle in der Arbeit dargestellten Ergebnisse beziehen sich daher auf

Methyloxoarsin, das im Weiteren mit MMA(III) abgekürzt wird. Man kann zudem

davon ausgehen, dass auch im Falle der dimethylierten Verbindung

Ergebnisse und Diskussion 43

Iododimethylarsin, die als DMA(III) bezeichet wird, Iod keine Effekte auf die

untersuchten Parameter ausübt.


5.2 Zytotoxizität

Für die Untersuchungen im zellulären System wurde die humane

Zervixkarzinomzelllinie HeLa S3 eingesetzt, die nur eine geringe

Methylierungskapazität für Arsenverbindungen besitzt (Peel et al., 1991). Die

Ergebnisse für die Zytotoxizität und die Poly(ADP-Ribosyl)ierung sowie der PARP-1

Proteingehalt können daher für die einzelnen Arsenverbindungen unabhängig

voneinander betrachtet werden. Die verschiedenen Arsenverbindungen wurden bei

allen Zellkultur-Versuchen 18 Stunden inkubiert, da für Arsenit in dieser Zeit eine

maximale intrazelluläre Konzentration erreicht wird (Hartwig et al., 1997).

Zur Ermittlung der Zytotoxizität von Arsenit, MMA(III), DMA(III), MMA(V) und DMA(V)

wurde sowohl ihr Einfluss auf die Zellzahl wie auch auf die Koloniebildungsfähigkeit

untersucht. Bezogen auf beide Parameter zeigten die dreiwertigen Verbindungen um

ein Vielfaches höhere Effekte als die fünfwertigen Metabolite. Die beiden

dreiwertigen Metabolite waren zudem stärker zytotoxisch als anorganisches Arsenit.

So reduzierten MMA(III) und DMA(III) bei einer Konzentration von 5 µM die Zellzahl

auf 33% bzw. 34%, während Arsenit bei der gleichen Konzentration nur eine

Reduzierung auf 43% bewirkt. Die fünfwertigen Metabolite MMA(V) und DMA(V)

zeigten erst in 100fach höherer Konzentration von 500 µM einen Effekt auf die

Zellzahl mit 69% bzw. 45% verbliebenen Zellen (Abbildung 7).

Im Vergleich zu den Effekten auf die Zellzahl zeigten die dreiwertigen Verbindungen

stärkere Effekte auf die Koloniebildungsfähigkeit. Hier wird der Unterschied zwischen

Arsenit und den dreiwertigen Metaboliten besonders deutlich. Während MMA(III) und

DMA(III) die Koloniebildungsfähigkeit bei 5 µM auf 20% bzw. 2% reduzierten,

erzeugte Arsenit nur einen Effekt von 53% bei 20 µM. Für die beiden fünfwertigen

Verbindungen konnten bis in Konzentrationen von 500 µM nur geringe Effekte auf die

Koloniebildungsfähigkeit festgestellt werden (Abbildung 8). Für die beiden

Zytotoxizitätsparameter Zellzahl und Koloniebildungsfähigkeit ergibt sich in HeLa S3

Zellen dann folgende Reihenfolge der Reaktivität: MMA(V) < DMA(V) << Arsenit <

DMA(III) < MMA(III). Die Unterschiede bezüglich der Zytotoxizität der dreiwertigen

Verbindungen wurden auch anhand morphologischer Veränderungen der Zellen

deutlich. Lichtmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass sich die Zellen im Falle von


10

100

0 100 200 300 400 500

Arsenverbindung [µM]

Zellz

ahl (

% d

er K

ontr

olle

)

Arsenit

MMA(III)DMA(III)

MMA(V)

DMA(V)10

100

0 2 4 6 8 10

10

100

0 100 200 300 400 500


Zellz

ahl (

% d

er K

ontr

olle

)

ArsenitArsenit

MMA(III)MMA(III)DMA(III)DMA(III)

MMA(V)MMA(V)

DMA(V)DMA(V)10

100

0 2 4 6 8 10

Abbildung 7: Einfluss der Arsenverbindungen auf die Zellzahl nach 18 h Inkubation von

HeLa S3 Zellen. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 4 Bestimmungen ± SD.

10

100

0 100 200 300 400 500


Kol

onie

bild

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fähi

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t (%

der

Kon

trol

le)

ArsenitMMA(III)DMA(III)MMA(V)DMA(V)

1

10

100

0 2 4 6 8 10

10

100

0 100 200 300 400 500


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ArsenitArsenitMMA(III)MMA(III)DMA(III)DMA(III)MMA(V)MMA(V)DMA(V)DMA(V)

1

10

100

0 2 4 6 8 10

Abbildung 8: Einfluss der Arsenverbindungen auf die Koloniebildungsfähigkeit nach 18 h

Inkubation von HeLa S3 Zellen. Gezeigt sind Mittelwerte aus mindestens 12 Bestimmungen ± SD.


Arsenit und MMA(III) in zytotoxischen Konzentrationen abrundeten und auch vom

Boden der Zellkulturschale ablösten, während bei DMA(III) die Umrisse der Zellen

eine Art „Verfransung“ aufwiesen und die Zellen sich im Vergleich zu den anderen

Verbindungen nicht so leicht vom Boden der Schale lösten (siehe Abbildung 9).

20 µM MMA(III) 7,5 µM DMA(III)

Kontrollzellen

15 µm

10 µM Arsenit

20 µM MMA(III) 7,5 µM DMA(III)

Kontrollzellen

15 µm15 µm

10 µM Arsenit

Abbildung 9: Lichtmikroskopische Aufnahmen von HeLa S3 Zellen nach 3 h Inkubation mit den Arsenverbindungen.

Die viel stärkeren zytotoxischen Effekte der dreiwertigen Arsenspezies gegenüber

den fünfwertigen Verbindungen sind in der Literatur oft beschrieben worden. So

konnte sowohl in unserem Labor in menschlichen A549-Lungenzellen (Schwerdtle et

al., 2003b), in menschlichen Rattenhepatozyten (Petrick et al., 2000), primären

Rattenhepatozyten und verschiedenen menschlichen Zellen (Styblo et al., 2000),

menschlichen Keratinozyten (Vega et al., 2001) sowie menschlichen NB4-Zellen

(Chen et al., 2003) eine erhöhte Zytotoxizität der dreiwertigen gegenüber den

fünfwertigen Spezies festgestellt werden. In diesen Studien besitzen die dreiwertigen

Metabolite mindestens das gleiche zytotoxische Potential wie Arsenit. In den meisten

Fällen zeigt vor allem MMA(III) stärkere zelltoxische Effekte als das anorganische

Arsenit. Es ist jedoch schwierig eine generelle Reihenfolge für die Zytotoxizität

bezogen auf den Methylierungsgrad festzulegen. Die Ergebnisse variieren von


Zelllinie zu Zelllinie und sind von Faktoren wie z.B. dem intrazellulären Glutathion

(GSH)-Gehalt abhängig.

Die geringere Zytotoxizität der fünfwertigen Metabolite gegenüber den dreiwertigen

Verbindungen lässt sich durch deren viel schlechtere Aufnahme in die Zellen

erklären. Während in Rattenhepatozyten nach 2 h Inkubation 22% Arsenit und nach

8 h Inkubation 50% MMA(III) aufgenommmen werden, sind in nach 24 h Inkubation

mit DMA(V) weniger als 5% intrazellulär nachzuweisen (Styblo et al., 2000). Dies

kann einerseits an einer verschlechterten Aufnahme aus dem Zellkulturmedium

aufgrund von Konkurrenzreaktionen mit extrazellulärem Phosphat (Huang und Lee,

1996) oder aber auch an den unterschiedlichen Ladungsverhältnissen der

Arsenverbindungen liegen. So liegt die dreiwertige Verbindung Arsenit unter

physiologischen Bedingungen zu 99% ungeladen vor, während MMA(V) und DMA(V)

vorwiegend geladen sind. Diese Ladung könnte einerseits die Aufnahme

verlangsamen, jedoch auch dafür sorgen, dass die fünfwertigen Metabolite schneller

aus den Zellen ausgeschleust werden. Buchet et al. (1981) konnten zeigen, dass

nach oraler Gabe von MMA(V), DMA(V) und Arsenit jeweils 78%, 75% bzw. 45% des

Arsens nach 4 h im Urin gefunden wurden. In metabolisch kompetenten Zellen wird

der gebildete Hauptmetabolit DMA(V) schnell in das Medium abgegeben (Styblo et

al., 2000). Es ergiebt sich folgende Reihenfolge in der Menge der aufgenommenen

Verbindungen: DMA(III) > MMA(III) > Arsenit > Arsenat > MMA(V), DMA(V) (Dopp et

al., 2004; Dopp et al., 2005). Hughes et al. (2005) zeigten in Mäuseversuchen für

MMA(V) und MMA(III) eine schnelle Aufnahme und Verteilung in allen Organen,

wobei MMA(III) schneller aufgenommen wurde als MMA(V) (Hughes et al., 2005).

Die Aufnahme der dreiwetigen Verbindungen Arsenit und MMA(III) erfolgt vermutlich

u.a. durch Aquaglyceroporine, die normalerweise für den Transport von Glycerin

verantwortlich sind (Liu et al., 2006).

Die stärkeren zytotoxischen Effekte der dreiwertigen Metabolite gegenüber

anorganischem Arsenit sind noch nicht geklärt. Es ist jedoch zu vermuten, dass die

Metabolite eine erhöhte Reaktivität gegenüber Makromolekülen der Zelle, und vor

allem Thiolgruppen von Proteinen haben, die eine wichtige Rolle bei der Einleitung

zytotoxischer Mechanismen der Zelle spielen. Auf die Reaktivität der dreiwertigen

methylierten Metabolite gegenüber SH-haltigen Proteinen wird in den nächsten

Kapiteln dieser Arbeit genauer eingegangen.


5.3 Einfluss auf die Aktivität von Fpg

Zur Untersuchung des Einflusses von Arsenverbindungen auf Zinkfingerproteine, die

an der DNA-Reparatur beteiligt sind, wurde als erstes die Fpg ausgewählt. Die

Aktivität isolierter Fpg wurde mit Hilfe eines DNA-Relaxationstests bestimmt.

Zunächst wurde für den Versuch PM2-DNA aus mit dem Bakteriophagen PM2

infizierten Bakterienzellen gewonnen. Zum Abschluss der Isolierung wurde die

Ausbeute und die Qualität der frisch isolierten DNA bestimmt (Daten siehe Anhang).

Für die Aktivitätsbestimmung wurde Fpg zunächst mit den Arsenverbindungen

vorinkubiert und anschließend mit oxidativ geschädigter DNA koinkubiert. Fpg setzt

in der geschädigten DNA einen Strangbruch, die daraufhin aus einer

superspiralisierten in eine offen ringförmige Form übergeht. Abbildung 10 zeigt

beispielhaft für eine Inkubation mit DMA(III), inwieweit Fpg noch in der Lage ist in

PM2-DNA einzuschneiden. So nimmt mit steigenden Konzentrationen der Anteil an

eingeschnittener, offen ringförmiger DNA ab, während die Intensität der Bande für

superspiralisierte DNA zunimmt.

0 50 100 200 400

DMA(III) [µM]

offen ringförmige DNA

superspiralisierte DNA

lineare DNA

0 50 100 200 400

DMA(III) [µM]



lineare DNA

Abbildung 10: Einfluss von DMA(III) auf die Aktivität von isolierter Fpg. Isolierte Fpg wurde

30 min bei 37°C mit den Arsenverbindungen inkubiert und die Aktivität gegenüber oxidativ

geschädigter DNA mittels DNA-Relaxationstest bestimmt. Dargestellt ist ein repräsentatives Agarose-

Gel.

Aus dem Verhältnis der beiden Banden lässt sich nun der Einfluss der

Arsenverbindungen auf die Aktivität isolierter Fpg berechnen. Dreiwertiges

anorganisches Arsenit und seine fünfwertigen methylierten Metabolite MMA(V) und

DMA(V) zeigten bis zu Konzentrationen von 10 mM keinen Effekt, wohingegen

MMA(III) und DMA(III) eine konzentrationsabhängige und signifikante Hemmung der

Fpg verursachten. So hemmte DMA(III) Fpg bereits ab 100 µM um etwa 20% und


reduzierte die Aktivität bei 1 mM auf ca. 10%, während MMA(III) erst bei 2 mM eine

Hemmung auf 20% verursachte (Abbbildung 11).

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5

Arsenverbindung [mM]

Fpg

Akt

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t (%

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Kon

trol

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ArsenitMMA(III)DMA(III)

MMA(V)DMA(V)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 1 2 3 4 5


Fpg

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le)

ArsenitMMA(III)DMA(III)

MMA(V)DMA(V)

Abbildung 11: Einfluss der Arsenverbindungen auf die Aktivität von isolierter Fpg. Isolierte Fpg

wurde 30 min bei 37°C mit den Arsenverbindungen inkubiert und die Aktivität gegenüber oxidativ

geschädigter DNA mittels DNA-Relaxationstest bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens

5 Bestimmungen ± SD.

Als ein möglicher molekularer Ansatzpunkt zur Erklärung der Fpg-Hemmung durch

die dreiwertigen Metabolite gilt deren hohe Affinität zu Thiolgruppen. Die

Zinkfingerstruktur, deren Funktion essentiell für die Aktivität der Fpg ist, könnte daher

durch die Arsenverbindungen zerstört werden. Um eine Beteiligung dieser Domäne

nachzuweisen, wurden Koinkubationsversuche von DMA(III) und ZnCl2 durchgeführt.

Wie in Abbildung 12 zu sehen ist, war ZnCl2 in der Lage die Fpg-Hemmung durch

DMA(III) konzentrationsabhängig aufzuheben. So wurde die Hemmung schon ab

kleiner als äquimolaren Konzentrationen teilweise aufgehoben und konnte bei einer

ZnCl2 Konzentration von 1000 µM auf 45 % reduziert werden, wobei zu beachten ist,

dass 1000 µM ZnCl2 alleine schon eine Fpg-Hemmung um 20% verursachten. Für

MMA(III) konnten leider keine Koinkubationsversuche durchgeführt werden, da die

nötigen höheren ZnCl2-Konzentrationen von 2-10 mM selbst schon eine zu starke

Fpg-Hemmung hervorriefen.


0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

400 400 400 400

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Akt

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0DMA(III) [µM]

0 40 400 1000 1000ZnCl2 [µM]

Abbildung 12: Einfluss von ZnCl2 auf die Fpg-Hemmung durch DMA(III). Isolierte Fpg wurde

30 min bei 37°C mit den Arsenverbindungen und ZnCl2 inkubiert und die Aktivität gegenüber oxidativ

geschädigter DNA mittels DNA-Relaxationstest bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens

5 Bestimmungen + SD.

Es ist wahrscheinlich, dass die Hemmung der Fpg durch die dreiwertigen

methylierten Arsenmetabolite mit einer Interaktion mit dem Zinkfingermotiv des

Enzyms zusammenhängt. Durch Bindung der Metabolite an die Cysteine des

Zinkfingers könnte es zu einer Freisetzung von Zink und damit zur Zerstörung der

Domäne kommen. So konnten O’Connor et al. (1993) zeigen, dass der

Funktionsverlust von einem Cystein-Rest des Zinkfingers zu einer Hemmung des

ganzen Enzyms führt. Die Koinkubationsversuche mit ZnCl2 haben einen weiteren

Hinweis auf den Zinkfinger als molekularen Angriffspunkt geliefert, jedoch weisen sie

auch darauf hin, dass es unter diesen Bedingungen wohl nicht zu einer kovalenten

Bindung der Metabolite an den Zinkfinger kommt, die durch eine Zinkzugabe nicht

rückgängig gemacht werden könnte. Der fehlende Effekt von anorganischem Arsenit,

der auch schon von Asmuss et al. (2000) gezeigt werden konnte, ist wohl auf die

geringere Thiolreaktivität im Vergleich zu MMA(III) und DMA(III) zurückzuführen, die

sich auch in anderen Systemen zeigt. Zudem ist es denkbar, dass die


Zinkfingerstruktur für Arsenit im Vergleich zu den methylierten Metaboliten eine

unterschiedliche Zugänglichkeit zeigt (siehe folgende Kapitel und

zusammenfassende Diskussion). Mit diesen Versuchen ist es zum ersten Mal

gelungen eine Hemmung eines isolierten DNA-Reparaturproteins, wenn auch in

relativ hohen Konzentrationen, durch die dreiwertigen methylierten Arsenmetabolite

zu zeigen. Eine Hemmung von Fpg bewirkt in E. coli, vor allem aufgrund der

gestörten Reparatur des prämutagenen DNA-Schadens 8-Oxoguanin, eine Zunahme

von G → T Transversionen und damit von Mutationen (Cabrera et al., 1988). Eine

Übertragung dieser Ergebnisse von E. coli auf den Menschen ist schwierig. Die

Entdeckung der menschlichen Homologen von Fpg, den DNA-Glykosylasen Neil I,II

und III gibt jedoch einen ersten Hinweis auf eine Relevanz dieser Ergebnisse auch in

Säugerzellen (Hazra et al., 2003).


5.4 Einfluss auf XPA

Ausgehend von den Versuchen mit dem BER-Enzym Fpg wurden weitere Versuche

mit dem Zinkfingerprotein XPA als ein Vertreter für die NER durchgeführt. Für XPA

sollte zunächst gezeigt werden, ob Arsenverbindungen in der Lage sind Zink aus

seiner Zinkfingerstruktur freizusetzen. Hierzu wurde ein synthetisches Peptid,

bestehend aus 37 Aminosäuren, so mit Zink gesättigt, dass sich die

Zinkfingerstruktur von humanem XPA ausbildete.

Abbildung 13 zeigt, dass alle dreiwertigen Arsenverbindungen in der Lage waren

nach 30minütiger Inkubation bei 37°C Zink aus XPAzf konzentrationsabhängig

freizusetzen. Auch hier konnte nachgewiesen werden, dass die methylierten

Metabolite MMA(III) und DMA(III) eine höhere Reaktivität als anorganisches Arsenit

besitzen. Während für MMA(III) eine Zinkfreisetzung ab 25 µM, die mit 100 µM 100%

erreichte, nachgewiesen wurde, begann für DMA(III) die Freisetzung ab 50 µM und

0

20

40

60

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Zink

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olle

)

Arsenit

MMA(III)

DMA(III)

MMA(V)

DMA(V)

0

20

40

60

80

100

120

1 10 100 1000 10000


Zink

frei

setz

ung

aus

XPA

zf(%

der

H2O

2K

ontr

olle

)

Arsenit

MMA(III)

DMA(III)

MMA(V)

DMA(V)

Abbildung 13: Einfluss der Arsenverbindungen auf die Zinkfreisetzung aus XPAzf. XPAzf wurde

30 min bei 37°C mit den Arsenverbindungen inkubiert und die Zinkfreisetzung mittels 4-2-

Pyridylazoresorcinol quantifiziert. Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 Bestimmungen ± SD.


erreichte 100% bei einer Konzentration von 1000 µM. Für Arsenit konnte eine

Zinkfreisetzung ab 100 µM festgestellt werden, die bei 10 mM einen Wert von 86%

erreichte. Für die beiden fünfwertigen Metabolite konnte nur im Falle von DMA(V)

eine sehr schwache Zinkfreisetzung von 18% bei 10 mM nachgewiesen werden.

Ausgehend von den Ergebnissen der Zinkfreisetzung aus XPAzf stellte sich nun die

Frage, welche Folgen dies für das ganze XPA-Protein hat. Hierzu wurde die DNA-

Bindungsfähigkeit von murinem XPA an ein UV-geschädigtes Oligonukleotid mittels

eines Gelshift-Versuchs untersucht. Die Untersuchungen zur DNA-Bindungsfähigkeit

konnten leider nur für DMA(III) durchgeführt werden, da aufgrund eines Ausfalls des

Biofreezer (-80°C Tiefkühler) das XPA-Protein vor Beginn der Versuche mit den

anderen Metaboliten irreversiebel geschädigt wurde. So konnte nur für DMA(III)

gezeigt werden, dass die XPA-Bindung an das UV-bestrahlte Oligonukleotid ab

Konzentrationen von 5 mM vollständig verloren geht (Abbildung 14). Auf anderen

Photofilmen ist zu sehen, dass bereits ab 2,5 mM eine leichte Reduzierung der DNA-

Bindungsfähigkeit festzustellen ist.

10.00010 50 100 500 1.000 5.000K + 1 5 K -

DMA(III) [µM]

Gebundenes Oligonukleotid

FreiesOligonukleotid

10.00010 50 100 500 1.000 5.000K + 1 5 K -

DMA(III) [µM]

Gebundenes Oligonukleotid

FreiesOligonukleotid

Abbildung 14: Einfluss von DMA(III) auf die DNA-Bindungsfähigkeit von XPA. XPA wurde 15 min

bei Raumtemperatur mit DMA(III) vorinkubiert, 30 min bei Raumtemperatur an das Oligonukleotid

binden gelassen und dann auf ein natives Polyacrylamidgel aufgetragen. Dargestellt ist ein

repäsentativer Photofilm. K+: Kontrolle mit XPA und Oligonukleotid, K-: Kontrolle mit Oligonukleotid.


Frühere Versuche aus unserem Labor zeigen, dass anorganisches Arsenit bis

Konzentrationen von 1 mM keine Reduzierung der DNA-Bindungsfähigkeit bewirkt.

Höhere Konzentrationen wurden damals nicht eingesetzt (Asmuss et al., 2000). Im

Gegensatz zu den Zinkfreisetzungsversuchen zeigt DMA(III) bei der Untersuchung

der DNA-Bindungsfähigkeit erst in sehr viel höheren milimolaren Konzentrationen

Effekte auf XPA. Dieser Unterschied kann einerseits durch die bessere

Zugänglichkeit für die Arsenverbindungen von XPAzf gegenüber murinem XPA

herrühren, oder aber auch davon kommen, dass bei dem Gelshift-Versuch hohe

Konzentrationen von 1 mM an Dithiotreitol (DTT) im Gelshift-Puffer verwendet

werden müssen, um eine oxidative Schädigung des XPA-Proteins zu verhindern.

Arsen hat eine hohe Affinität zu Ditholen wie DTT, so dass man davon ausgehen

kann, dass ein Teil der eingesetzten Arsenverbindung mit DTT abreagiert und gar

nicht die Möglichkeit hat mit XPA zu interagieren.

Die Zinkfreisetzungsversuche geben wie auch beim Fpg einen Hinweis darauf, dass

Zinkfingerstrukturen empfindlich gegenüber Arsenverbindungen sind und in Folge

einer Schädigung zur Inaktivierung des Proteins führen können. Hier konnten wir

erstmals zeigen, dass dreiwertige Arsenverbindungen Zink aus einem für die DNA-

Reparatur essentiellen Protein freisetzen können. Im Gegensatz zur Fpg ist der

Zinkfinger von XPA nicht direkt an der Wechselwirkung mit der DNA beteiligt. Er

stabilisiert jedoch die loopreiche Domäne, die für die Interaktion mit der DNA

verantwortlich ist (Morikawa und Shirakawa, 2000). Eine Schädigung des Zinkfingers

könnte also einen Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit bewirken. Daneben ist der

Zinkfinger von XPA an der Interaktion mit anderen NER-Proteinen wie z.B. RPA

beteiligt und trägt so zum Aufbau des Präinzisionskomplexes bei. So kommt es durch

Substitutuion eines der zinkbindenden Cysteine zum fast vollständigen Erliegen der

NER (Miyamoto et al., 1992).

Inwieweit diese Ergebnisse aus isolierten Systemen in Zusammenhang gebracht

werden können mit Zellkulturversuchen, die eine Hemmung der NER durch

Arsenverbindungen nach UV-Bestrahlung (Hartwig et al., 1997; Bau et al., 2001)

oder Benzo[a]pyren-Schädigung (Schwerdtle et al., 2003a) nachweisen, müssten

weitere Versuche mit XPA im zellulären System zeigen.


5.5 Einfluss auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung

Ausgehend von den Ergebnissen mit den isolierten DNA-Reparaturproteinen Fpg

und XPA stellten wir uns die Frage, ob es möglich ist eine Arsen-induzierte

Hemmung einer Reaktion, die vorwiegend von einem Zinkfingerprotein katalysiert

wird, auch im zellulären System nachzuweisen. Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung spielt

eine wichtige Rolle in der BER und wird zu ca. 90% durch das Zinkfingerenzym

PARP-1 katalysiert.

5.5.1 Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3-Zellen

Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in intakten HeLa S3-Zellen wurde nach Aktivierung

mittels H2O2-induzierten DNA-Strangbrüchen über immunologische Detektion des

Enzymprodukts Poly(ADP-Ribose) (PAR) mittels eines hochspezifischen

monoklonalen Antikörpers 10H und eines FITC-konjugierten sekundären Antikörpers

am Fluoreszenzmikroskop quantifiziert. Zusätzlich zur PAR wurde die nukleäre DNA

mittels DAPI eingefärbt.

Abbildung 15 zeigt zwei fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen. Links ist auf einer

dreidimensionalen Aufnahme zu sehen, dass das grüne FITC-Signal nur im

20 µm20 µm20 µm

Abbildung 15: Mikroskopische Aufnahmen von poly(ADP-Ribosyl)ierenden HeLa S3 Zellen. Links: Dreidimensionale Darstellung mittels Apotome-Technik (Zeiss). grüne Fluoreszenz: PAR, blaue

Fluoreszenz: DNA (Zellkern)

Rechts: Phasenkontrastaufnahme einer HeLa S3 Zelle. In der Mitte der Zelle ist die fluoreszierende

DNA und die markierte PAR zu erkennen (Mikroskop: Axioimager M1).


Bereich der blaue DAPI-Fluoreszenz und damit im Zellkern lokalisiert ist. Das rechte

Bild zeigt eine Phasenkontrast-Aufnahme einer HeLa S3 Zelle. In der Mitte der Zelle

ist der Zellkern mit den PAR-Signalen zu erkennen.

5.5.1.1 Einfluss der Arsenverbindungen auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung

Um die Effekte der methylierten Arsenmetabolite auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung zu

untersuchen, wurden logarithmisch wachsende HeLa S3 Zellen für 18 h mit den

Arsenverbindungen inkubiert. Wie zuvor in unserer Arbeitsgruppe für Arsenit

(Hartwig et al., 2003) gezeigt, konnte für MMA(III), DMA(III), MMA(V) und DMA(V)

keine Induktion der Poly(ADP-Ribosyl)ierung festgestellt werden. Die Zellen zeigten

hier nur ein konstant schwaches Hintergrundsignal (Daten nicht dargestellt).

Nach einer Induktion der Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch fünfminütige Inkubation mit

H2O2 ist es möglich, den Einfluss der Arsenverbindungen zu untersuchen. Für das

dreiwertige anorganische Arsenit konnte zuvor in unserem Labor eine

konzentrationsabhängige Hemmung der Reaktion schon in sehr niedrigen nicht-

zytotoxischen nanomolaren Konzentrationen gezeigt werden (Hartwig et al., 2003).

Der Vollständigkeit halber und zur besseren Vergleichbarkeit mit den Ergebnissen

der methylierten Metabolite, wird hier auch das Ergebnis für Arsenit dargestellt

(Abbildung 16).

Abbildung 17 zeigt immunfluorimetrische Aufnahmen des FITC-Kanals, der die

Poly(ADP-Ribosyl)ierung repräsentiert, nach Inkubation mit den methylierten

Arsenmetaboliten. Es ist zu sehen, dass die beiden dreiwertigen Verbindungen

MMA(III) und DMA(III) die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in nanomolaren Konzentrationen

hemmten, während MMA(V) und DMA(V) bis in hohe mikromolare Konzentrationen

keinen Effekt zeigten.

Nach Quantifizierung der Fluoreszenzintensität mit einem Auswertungsprogramm

zeigte sich, dass MMA(III) und DMA(III) die Poly(ADP-Ribosyl)ierung

konzentrationsabhängig und signifikant schon in sehr niedrigen nanomolaren und

nichtzytotoxischen Konzentrationen hemmten. Eine erste Reduktion war schon ab

1 nM zu sehen, die bei 1000 nM für MMA(III) und 100 nM für DMA(III) ein Minimum

bei 59% bzw. 49% erreicht (Abbildung 18). In höheren und beginnend zytotoxischen


0

20

40

60

80

100

120

0 10 100 500 1000

Arsenit [nM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

10

100K

oloniebildungsfähigkeit (% der K

ontrolle)

*** ***

***

***

0

20

40

60

80

100

120

0 10 100 500 1000

Arsenit [nM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

10

100K

oloniebildungsfähigkeit (% der K

ontrolle)

*** ***

***

***

Abbildung 16: Effekt von Arsenit auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen. Logarithmisch wachsende Zellen wurden für 18 h mit Arsenit vorinkubiert und die Poly(ADP-

Ribosyl)ierung 5 min mit 100 µM H2O2 induziert. PAR wurde immunfluorimetrisch am

Fluoreszenzmikroskop quantifiziert. Gezeigt sind Mittelwerte aus mind. 4 Bestimmungen mit jeweils

mindestens 100 Zellen + 95% Konfidenzintervall. Statistisch unterschiedlich von alleine H2O2-

behandelten Zellen: *** P < 0,001 (Student’s t-Test) (Hartwig et al., 2003).

Konzentrationen war keine weitere Hemmung und im Fall von DMA(III) für 1000 nM,

wie auch für Arsenit (Hartwig et al., 2003) sogar ein leichter Anstieg der Poly(ADP-

Ribosyl)ierung zu erkennen (Daten nicht dargestellt), was auf eine Sättigung des

inhibitorischen Effekts hinweist. Im Vergleich zu anorganischem Arsenit erwiesen

sich die dreiwertigen methylierten Metabolite auch in diesem Testsystem als

toxischer. Für Arsenit ist ein Beginn der Hemmung ab 10 nM zu sehen, während für

MMA(III) und DMA(III) schon in 10-fach niedrigeren Konzentrationen eine erste

Reduktion der Poly(ADP-Ribosyl)ierung auftrat.

Im Gegensatz zu den dreiwertigen Verbindungen konnte weder für MMA(V) noch für

DMA(V) bis in beginnend zytotoxische Konzentrationen von 500 µM bzw. 250 µM

keine Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung festgestellt werden (Abbildung 19). So

konnte auch in diesem Versuch gezeigt werden, dass die Wertigkeit der

Arsenverbindungen entscheidend für deren Toxizität ist.


MMA(III) [nM] 0 0,1 1 10 100

DMA(III) [nM] 0 0,1 1 10 100

MMA(V) [µM] 0 1 10 100 500

DMA(V) [µM] 0 1 10 100 250

MMA(III) [nM] 0 0,1 1 10 100MMA(III) [nM] 0 0,1 1 10 100MMA(III) [nM] 0 0,1 1 10 100

DMA(III) [nM] 0 0,1 1 10 100DMA(III) [nM] 0 0,1 1 10 100DMA(III) [nM] 0 0,1 1 10 100

MMA(V) [µM] 0 1 10 100 500MMA(V) [µM] 0 1 10 100 500MMA(V) [µM] 0 1 10 100 500

DMA(V) [µM] 0 1 10 100 250DMA(V) [µM] 0 1 10 100 250DMA(V) [µM] 0 1 10 100 250

Abbildung 17: Effekt von MMA(III), DMA(III), MMA(V) und DMA(V) auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen. Logarithmisch wachsende Zellen wurden für 18 h mit Arsenit

vorinkubiert und die Poly(ADP-Ribosyl)ierung 5 min mit 100 µM H2O2 induziert. PAR wurde

immunfluorimetrisch am Fluoreszenzmikroskop quantifiziert. Gezeigt sind repräsentative

Immunfluoreszenzaufnahmen des FITC-Kanals.

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen für die dreiwertigen methylierten

Arsenmetabolite MMA(III) und DMA(III) zum ersten Mal einen Zusammenhang

zwischen der Hemmung der DNA-Reparatur durch Arsen und einer konkreten

enzymatischen Reaktion unter zellulären Bedingungen. Die Hemmung der

Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch die dreiwertigen Arsenverbindungen ist damit die

sensitivste Reaktion, die mit der DNA-Reparaturhemmung verbunden ist, die jemals

beschrieben wurde. Für MMA(III) und DMA(III) existieren in der Literatur keine

Vergleichswerte zu einer Interaktion mit der Poly(ADP-Ribosyl)ierung, während es zu

anorganischem Arsenit widersprüchliche Studien gibt. So beschreiben Yager und

Wiencke (1997) eine Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung in Konzentrationen

über 5 µM Arsenit in menschlichen Molt-3 Zellen, während Lynn et al. (1998) eine

Stimulierung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung in hohen Konzentrationen über 40 µM


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0,1 1 10 100 1000

MMA(III) [nM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

10

100Zytotoxizität(%

der Kontrolle)

ZellzahlKoloniebildungsfähigkeit

A

****

******

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0,1 1 10 100 1000

MMA(III) [nM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

10

100Zytotoxizität(%

der Kontrolle)


A

****

******

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0,1 1 10 100

DMA(III) [nM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

10

100

Zytotoxizität(% der K

ontrolle)

B

**

*** ***


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0,1 1 10 100

DMA(III) [nM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

10

100


ontrolle)

B

**

*** ***


Abbildung 18: Effekt von MMA(III) (A) und DMA(III) (B) auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen. Logarithmisch wachsende Zellen wurden für 18 h mit Arsenit vorinkubiert und die

Poly(ADP-Ribosyl)ierung 5 min mit 100 µM H2O2 induziert. PAR wurde immunfluorimetrisch am


mindestens 50 Zellen + SD. Statistisch unterschiedlich von alleine H2O2-behandelten Zellen:

** P < 0,01; *** P < 0,001 (Student’s t-Test).


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0,01 0,1 1 10 100 500

MMA(V) [µM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

10

100Zytotoxizität(%

der Kontrolle)

AZellzahlKoloniebildungsfähigkeit

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0,01 0,1 1 10 100 500

MMA(V) [µM]

Poly

(AD

P-R

ibos

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der

Kon

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10

100Zytotoxizität(%

der Kontrolle)

AZellzahlKoloniebildungsfähigkeit

0

20

40

60

80

100

120

140

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0 0,01 0,1 1 10 100 250

DMA(V) [µM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

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10

100


ontrolle)

BZellzahlKoloniebildungsfähigkeit

0

20

40

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80

100

120

140

160

0 0,01 0,1 1 10 100 250

DMA(V) [µM]

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

10

100


ontrolle)

BZellzahlKoloniebildungsfähigkeit

Abbildung 19: Effekt von MMA(V) (A) und DMA(V) (B) auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen. Logarithmisch wachsende Zellen wurden für 18 h mit Arsenit vorinkubiert und die

Poly(ADP-Ribosyl)ierung 5 min mit 100 µM H2O2 induziert. PAR wurde immunfluorimetrisch am


mindestens 50 Zellen + SD.


Arsenit in CHO-K1 Zellen zeigen. Im Gegensatz zu den niedrigen nanomolaren

Konzentrationen, die in den Versuchen in unserem Labor eine Hemmung durch

Arsenit zeigten (Hartwig et al., 2003), wurden in beiden oben genannten Studien

jedoch sehr hohe zytotoxische Konzentrationen eingesetzt.

Auch wenn die Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch die dreiwertigen Arsenverbindungen

nicht komplett gehemmt wird, stellt sie einen relevanten Parameter für die

genomische Stabilität der Zelle dar. So konnten Bürkle et al. (1987) zeigen, dass

eine Reduzierung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch 3-Aminobenzamid in

ähnlichem Umfang wie durch die dreiwertigen methylierten Arsenmetabolite zu einer

erhöhten MNNG-induzierten DNA-Amplifikation führte, was auf eine erniedrigte

genomische Stabilität hindeutet. Eine Hemmung von PARP-1 hat weitreichende

Konsequenzen für die Zelle. Sie ist an verschiedenen DNA- Reparaturprozessen wie

der BER oder der Rekombinationsreparatur beteiligt und wirkt als negativer

Regulator der genomischen Stabilität (zusammengefasst in Bürkle et al., 2005a). So

kommt es beispielsweise in PARP-1-/--Zellen zu einer erhöhten Menge an

klastogenen Schäden, wie Chromosomenabberationen (CA) und

Schwesterchromatidaustauschen (SCE) (Le Rhun et al., 1998), während PARP-1

überexprimierende Zellen einen verbesserten Schutz vor SCE’s, die durch

Alkylierung induziert wurden, zeigen (Meyer et al., 2000). Ganz ähnliche klastogene

Schäden werden auch für Arsenit (zusammengefasst in Gebel, 2001) und seine

dreiwertigen methylierten Metabolite (Kligerman et al., 2003) beschrieben, so dass

hier über einen Zusammenhang der Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung und der

Klastogenität von Arsen spekuliert werden kann. Eine mögliche Rolle von PARP-1 in

der arseninduzierten Genotoxizität zeigten vor kurzem Poonepalli et al. (2005)

(Poonepalli et al., 2005). So induziert Arsenit in PARP-1-/--Zellen im Vergleich zu

PARP-1+/+-Zellen eine erhöhte Anzahl an Mikrokernen.

Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung ist eine komplexe zelluläre Reaktion, die auf ganz

verschiedene Art und Weise gestört werden kann. Eine mögliche Erkärung für die

reduzierte Poly(ADP-Ribosyl)ierung nach Inkubation mit den dreiwertigen

Arsenverbindungen könnte beispielsweise eine Reduzierung der zellulären

Konzentration von NAD+, dem Substrat der PARP, sein. So berichten Lynn et al.

(1998) von einer leichten Reduktion der NAD+-Level nach Inkubation mit

mikromolaren Konzentrationen von Arsenit. In unserem System ist jedoch nicht

davon auszugehen, dass es zu einem Abfall der NAD+-Konzentration kommt. Eine


Reduktion des NAD+-Levels wäre verbunden mit einer Wachstumshemmung der

Zellen, da NAD+ an fast allen metabolischen Reaktionen der Zelle beteiligt ist. Solche

Effekte wurden in den niedrigen nanomolaren Arsenkonzentrationen, bei denen die

Effekte auf die Poly(ADP-Ribosyl)ierung auftraten, jedoch nicht beobachtet.

Im Folgenden wurden weitere mögliche Gründe für die Hemmung der Poly(ADP-

Ribosyl)ierung untersucht. Zudem soll geklärt werden, ob die Reduzierung der

Poly(ADP-Ribosyl)ierung auf eine Hemmung von PARP-1 zurückzuführen ist.

5.5.1.2 Zeitverlauf der Poly(ADP-Ribosyl)ierung nach Arseninkubation

Der Aufbau der Poly(ADP-Ribose) zu 200 bis 400 Einheiten großen Polymeren wird

vor allem durch PARP-1 und PARP-2 während der fünfminütigen Inkubation mit H2O2

katalysiert, welche sich in Vorversuchen als optimal herausstellte (Hartwig et al.,

2003). Die Poly(ADP-Ribose) wird dann jedoch schnell durch PARG abgebaut. Die

Halbwertszeit der Poly(ADP-Ribose) liegt bei ca. 1 min. Um festzustellen, ob es sich

bei der Reduzierung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung nach fünfminütiger H2O2-

Inkubation durch die dreiwertigen Metabolite MMA(III) und DMA(III) wirklich um eine

Hemmung handelt und nicht nur die Reaktion zeitlich nach hinten verschoben wird,

wurde die Poly(ADP-Ribosyl)ierung nach verschiedenen H2O2-Inkubationszeiten

quantifiziert.

Wie Abbildung 20 zeigt, konnte, wie auch für Arsenit (Hartwig et al., 2003), weder für

MMA(III) noch für DMA(III) eine zeitliche Verschiebung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung

festgestellt werden. Die Signale der arseninkubierten Zellen waren in keinem Fall

stärker als die parallel mitgeführten Kontrollzellen, so dass davon ausgegangen

werden kann, dass es sich um eine wirkliche Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung

handelt.


0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 30

H2O2- Behandlung (min)

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

100 µM H2O2

100 µM H2O2 + 100 nM MMA(III)

A

***

0

20

40

60

80

100

120

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0 5 10 15 30


Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

trol

le)

100 µM H2O2

100 µM H2O2 + 100 nM MMA(III)

A

***

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 30

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

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le)


100 µM H2O2

100 µM H2O2 + 100 nM DMA(III)

B

***

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 30

Poly

(AD

P-R

ibos

e) (%

der

Kon

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le)


100 µM H2O2

100 µM H2O2 + 100 nM DMA(III)

B

***

Abbildung 20: Zeitabhängigkeit der Poly(ADP-Ribosyl)ierung nach Inkubation mit MMA(III) (A) und DMA(III) (B). Logarithmisch wachsende Zellen wurden für 18 h mit den Arsenverbindungen

vorinkubiert und die Poly(ADP-Ribosyl)ierung 5, 10, 15 bzw. 30 min mit 100 µM H2O2 induziert. PAR

wurde immunfluorimetrisch am Fluoreszenzmikroskop quantifiziert. Gezeigt sind Mittelwerte aus mind.

5 Bestimmungen mit jeweils mindestens 50 Zellen + SD. Statistisch unterschiedlich von den

dazugehörigen Kontrollzellen: *** P < 0,001 (Student’s t-Test).


5.5.2 Einfluss der Arsenverbindungen auf die DNA-Schadens-induktion durch H2O2 und auf die Genexpression der PARP-1

Zur Klärung des Wirkungsmechanismus der Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung

wurden in unserem Labor zwei weitere Parameter untersucht. Diese Ergebnisse

wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Tanja Schwerdtle und Dr. Christina Thuy

durchgeführt.

Im ersten Versuch sollte geklärt werden, ob die Arsenverbindungen während der

Schadensinduktion mit H2O2 interagieren und möglicherweise weniger DNA-

Strangbrüche induzieren. Eine Reduzierung der Strangbruchrate hätte eine geringere

PARP-1 und PARP-2 Aktivierung und damit einen geringeren Grad an Poly(ADP-

Ribose) zur Folge. Aus diesem Grund wurde mit Hilfe der Alkalischen Entwindung

(AU) (Hartwig et al., 1997) die Menge an DNA-Strangbrüchen nach Koinkubation der

Arsenverbindungen mit H2O2 bestimmt. In Abbildung 21 ist zu sehen, dass es für

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

DN

A-S

tran

gbrü

che

/ 106

Bas

enpa

are 0 µM H2O2

100 µM H2O2

Kontrolle 0,1 µM

MMA(III)100 µMMMA(V)

0,1 µMDMA(III)

100 µMDMA(V)

*** ***

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

DN

A-S

tran

gbrü

che

/ 106

Bas

enpa

are 0 µM H2O2

100 µM H2O2

Kontrolle 0,1 µM

MMA(III)100 µMMMA(V)

0,1 µMDMA(III)

100 µMDMA(V)

*** ***

Abbildung 21: Effekt der Arsenverbindungen auf die DNA-Strangbruchinduktion durch H2O2. Logarithmisch wachsende HeLa S3 Zellen wurden für 18 h mit den Arsenverbindungen vorinkubiert,

dann 5 min mit 100 µM H2O2 koinkubiert, und die DNA-Strangbrüche mittels Alkalischer Entwindung

(AU) bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 Bestimmungen + SD. Statistisch unterschiedlich von

der nur mit H2O2 inkubierten Kontrolle: *** P < 0,001 (Student’s t-Test).


keinen der methylierten Arsenmetabolite MMA(III), DMA(III), MMA(V) und DMA(V) zu

einer reduzierten DNA-Strangbruchrate nach Koinkubation mit 100 µM H2O2 im

Vergleich zu H2O2 allein kam. Die monomethylierten Verbindungen MMA(III) und

MMA(V) zeigen sogar einen leichten Anstieg der Menge an DNA-Strangbrüchen

(Walter et al., 2007). Auch für anorgansiches Arsenit konnte ein leichter Anstieg der

DNA-Strangbruchrate festgestellt werden (Hartwig et al., 2003). Die

unterschiedlichen Effekte der Arsenverbindungen bezüglich ihres Methylierungs-

grades und ihrer Wertigkeit deuten auf komplexe Interaktionen mit H2O2 hin. So

könnte die Induktion eines redox cyclings oder die Hemmung der Reparatur der

H2O2-induzierten DNA-Schäden eine Rolle spielen.

In einem weiteren Versuch zur Klärung der Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung

wurde die Genexpression der PARP-1, die den größten Teil der Poly(ADP-

Ribosyl)ierung katalysiert, nach Arseninkubation untersucht. Es konnte bereits für

eine Reihe von DNA-Reparaturgenen gezeigt werden, dass sie nach Inkubation mit

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Kontrolle1 µM

Arsenit0,1 µM

MMA(III)0,1 µM

DMA(III)100 µMMMA(V)

100 µMDMA(V)

PAR

P-1

Gen

expr

essi

on

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Kontrolle1 µM

Arsenit0,1 µM

MMA(III)0,1 µM

DMA(III)100 µMMMA(V)

100 µMDMA(V)

PAR

P-1

Gen

expr

essi

on

Abbildung 22: Effekt der Arsenverbindungen auf die Genexpression von PARP-1. Logarithmisch

wachsende HeLa S3 Zellen wurden für 18 h mit den Arsenverbindungen inkubiert und die

Genexpression mit Real-Time RT-PCR bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte aus drei unabhängigen

Versuchen mit jeweils 3 Messungen bezogen auf die Kontrolle und normiert auf das housekeeping

Gen GAPDH + SD.


Arsenit in menschlichen Keratinozyten aber auch in arsenexponierten Menschen

eine erniedrigte Genexpression aufweisen (Hamadeh et al., 2002; Andrew et al.,

2003). Die Messung der Genexpression wurde mit Real-Time RT-PCR im Falle der

dreiwertigen Arsenverbindungen für die Konzentrationen durchgeführt, die die größte

Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung hervorriefen. Nach einer Inkubation von 18 h

mit Arsenit und den methylierten Metaboliten zeigte sich, dass keine der fünf

Verbindungen die Genexpression von PARP-1 signifikant veränderte. Es kann daher

ausgeschlossen werden, dass die Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch

eine reduzierte Genexpression von PARP-1 hervorgerufen wird (Abbildung 22)

(Walter et al., 2007).


5.5.3 Bestimmung des Proteingehalts von PARP-1

Eine mögliche Erklärung für die gehemmte Poly(ADP-Ribosyl)ierung könnte eine

Reduzierung der Proteinmenge von PARP-1 sein. Aus diesem Grund wurde mittels

Western Blot Analyse der Proteingehalt von PARP-1 in HeLa S3 Zellen nach

18stündiger Inkubation mit den Arsenverbindungen bestimmt. Zur Detektion der

PARP-1 wird der monoklonale Antikörper CII-10 verwendet, der neben dem intakten

Protein auch das apoptotische Fragment der PARP-1 erkennt. So ist mit diesem

Versuch zusätzlich auch eine Aussage über die Induktion von Apoptose durch die

Arsenverbindungen möglich.

Abbildung 23 zeigt PARP-1 Western Blots mit Aktin als Ladekontrolle für Arsenit und

seine drei- und fünfwertigen Verbindungen. Es ist zu erkennen, dass es nur in hohen

zytotoxischen Konzentrationen zu einer Reduzierung der PARP-1 Menge durch

Arsenit, MMA(III) und DMA(III) kommt. Für Arsenit war in hohen zytotoxischen

Konzentrationen die Bildung des Apoptose-Fragments zu sehen. Auch MMA(III) und

DMA(III) bilden ab Konzentrationen von 10 µM das Apoptose-Fragment, wenn auch

in viel geringerem Ausmaß als Arsenit (Western Blots nicht dargestellt). MMA(V) und

DMA(V) zeigen bis zu zytotoxischen Konzentrationen von 1000 µM keine

Reduzierung der PARP-1 Bande.

Nach Quantifizierung der Western Blots mit Hilfe eines Auswertungsprogramms,

zeigte sich für Arsenit eine signifikante Reduktion des PARP-1-Proteingehalts erst ab

der zytotoxischen Konzentration von 10 µM. Der Proteingehalt der PARP-1 fällt bei

100 µM Arsenit bis auf 32% der Kontrolle ab und es kommt mit 29% der Kontrolle zur

Bildung des Apoptose-Fragments (Abbildung 24). Auch für MMA(III) und DMA(III)

kam es erst in beginnend zytotoxischen Konzentrationen von 1 µM zu einem Abfall

der PARP-1- Menge auf 58% bzw. 43%. Bei einer Konzentration von 50 µM bildeten

sich nur geringe Mengen von 2,3% bzw. 10,7% des Apoptose-Fragments (Abbildung

25). Der Beginn der Abnahme der Proteinmege variirte etwas von Versuch zu

Versuch, worauf auch die großen Fehlerbalken in den Graphiken zurückzuführen

sind. Für die beiden fünfwertigen Verbindungen MMA(V) und DMA(V) konnte bis zu

Konzentrationen von 1000 µM keine Reduzierung des PARP-1-Gehalts und keine

Bildung des Apoptose-Fragments festgestellt werden (Abbildung 26). Zusammen mit

den Ergebnissen zur Genexpression zeigt die Quantifizierung des PARP-1-

Proteingehalts, dass die Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung in den niedrigen


PARP-1

Aktin

0,5 1 5 10 50 100

isol.

PARP-10Arsenit [µM]

PARP-1

Aktin

0,5 1 5 10 50 100

isol.

PARP-10Arsenit [µM]

PARP-1

Aktin

0,05 0,1 0,5 1,0 2,5 5,0

isol.

PARP-10MMA(III) [µM]

PARP-1

Aktin

0,05 0,1 0,5 1,0 2,5 5,0

isol.

PARP-10MMA(III) [µM]

PARP-1

Aktin

0,05 0,1 0,5 1,0 2,5 5,0

isol.

PARP-10DMA(III) [µM]

PARP-1

Aktin

0,05 0,1 0,5 1,0 2,5 5,0

isol.

PARP-10DMA(III) [µM]

PARP-1

Aktin

10 50 100 250 500 1000

isol.

PARP-10MMA(V) [µM]

PARP-1

Aktin

10 50 100 250 500 1000

isol.

PARP-10MMA(V) [µM]

PARP-1

Aktin

10 50 100 250 500 1000

isol.

PARP-10DMA(V) [µM]

PARP-1

Aktin

10 50 100 250 500 1000

isol.

PARP-10DMA(V) [µM]

Abbildung 23: PARP-1 Western Blots nach Inkubation mit Arsenit, MMA(III), DMA(III), MMA(V) und DMA(V). HeLa S3 Zellen wurden für 18 h mit den Arsenverbindungen inkubiert, ein Zellextrakt

präpariert und auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen. Dargestellt ist je ein repräsentativer Western

Blot.


0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0,5 1 5 10 50 100

Arsenit [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

)

******

*

PARP-1 (ganzes Protein)PARP-1 Apoptose-Fragment

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 0,5 1 5 10 50 100

Arsenit [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

)

******

*


Abbildung 24: PARP-1-Proteingehalt nach Inkubation mit Arsenit. HeLa S3 Zellen wurden für

18 h mit Arsenit inkubiert, ein Zellextrakt präpariert und auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen. Die

Banden wurden mit einem computergestützten Auswertungsprogramm quantifiziert. Dargestellt sind

Mittelwerte aus mind. 3 Versuchen ± SD. Statistisch unterschiedlich von der Kontrolle: * P < 0,05; ***

P < 0,001 (Student’s t-Test).

nanomolaren Konzentrationen nicht auf eine Veränderung der Gen- oder

Proteinexpression der PARP-1 zurückzuführen ist. Neben der Quantifizierung des

PARP-1-Proteingehalts konnte für Arsenit und die dreiwertigen methylierten

Metabolite eine Bildung des apoptotischen PARP-1- Fragments nachgewiesen

werden. Für alle drei Verbindungen konnte das apoptotische Fragment jedoch erst in

sehr hohen zytotoxischen Konzentrationen festgestellt werden. Das typische 85 kDa-

Fragment bildete sich bei den methylierten Metaboliten jedoch sowohl in niedrigeren

Konzentrationen als auch in gerigerem Umfang verglichen mit anorganischem

Arsenit.

In der Literatur existieren eine Vielzahl von Studien zur Induktion von Apoptose durch

die verschiedenen Arsenverbindungen. So konnten Chen et al. (2003) durch

durchflusszytometrische Messungen wie auch durch Nachweis des apoptotischen

PARP-1-Fragments die Induktion von Apoptose in menschlichen NB4-Zellen für

Arsenit, MMA(III) und DMA(III) zeigen. Im Vergleich zu unseren Ergebnissen in HeLa

S3-Zellen konnte das PARP-1-Fragment in NB4-Zellen nach


0

20

40

60

80

100

120

0 0,05 0,1 0,5 1 2,5 5 10 50

MMA(III) [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

)

******

******

**


0

20

40

60

80

100

120

0 0,05 0,1 0,5 1 2,5 5 10 50

MMA(III) [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

)

******

******

**


0

20

40

60

80

100

120

0 0,05 0,1 0,5 1 2,5 5 10 50

DMA(III) [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

)

******

******

***


0

20

40

60

80

100

120

0 0,05 0,1 0,5 1 2,5 5 10 50

DMA(III) [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

)

******

******

***


Abbildung 25: PARP-1-Proteingehalt nach Inkubation mit MMA(III) (A) und DMA(III) (B). HeLa S3

Zellen wurden für 18 h mit den Arsenverbindungen inkubiert, ein Zellextrakt präpariert und auf ein

Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Banden wurden mit einem computergestützten Auswertungs-

programm quantifiziert. Dargestellt sind Mittelwerte aus mind. 3 Versuchen ± SD. Statistisch

unterschiedlich von der Kontrolle: *** P < 0,001 (Student’s t-Test).


0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 50 100 250 500 1000

MMA(V) [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

) A

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 50 100 250 500 1000

MMA(V) [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

) A

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 50 100 250 500 1000

DMA(V) [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

)

B

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 50 100 250 500 1000

DMA(V) [µM]

PAR

P-1

(% d

er K

ontr

olle

)

B

Abbildung 26: PARP-1-Proteingehalt nach Inkubation mit MMA(V) (A) und DMA(V) (B). HeLa S3

Zellen wurden für 18 h mit den Arsenverbindungen inkubiert, ein Zellextrakt präpariert und auf ein

Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Banden wurden mit einem computergestützten Auswertungs-

programm quantifiziert. Dargestellt ist sind Mittelwerte aus mind. 3 Versuchen ± SD.


24 h Inkubation schon in sehr niedrigen Konzentrationen von 1 µM nachgewiesen

werden, wobei sich MMA(III) und DMA(III) als stärker Apoptose-auslösend verglichen

mit Arsenit erwiesen. Man geht davon aus, dass anorganisches Arsenit vor allem

Nekrose und weniger Apoptose induziert (Sakurai et al., 1998).

Für die fünfwertigen Verbindungen konnte in HeLa S3 Zellen kein Apoptose-

Fragment detektiert werden. Die Induktion von Apoptose durch die fünfwertigen

Metabolite scheint stark vom GSH-Gehalt der Zellen abzuhängen. Während GSH für

die Induktion von Apoptose im Falle von DMA(V) essentiell ist (Ochi et al., 1996;

Sakurai et al., 2002), konnte für MMA(V) Apoptose nur nach Depletion von GSH

nachgewiesen werden (Sakurai et al., 2005). Der GSH-Gehalt von HeLa Zellen, der

verglichen mit anderen Zelllinien relativ gering ist, liegt bei 16,45 nmol/106 Zellen was

bei einem Volumen von ca. 2 x 10-12 l einer Konzentration von 8,2 mM entspricht

(Yamauchi et al., 1990).

Ein weiterer wichtiger Parameter ist der richtige Zeitpunkt der Apoptose-Messung. So

findet die Spaltung von PARP-1 durch die Caspasen 3 und 7 früh im Verlauf der

Apoptose statt. Um eine bessere Aussage über die Induktion des programmierten

Zelltods durch die Arsenverbindungen zu treffen, sind weitere Western Blot-Versuche

mit verschiedenen Inkubationszeiten sowie andere Apoptosetests nötig.

99% der menschlichen Zervixcarcinomzelllinien, wie auch HeLa S3, entstanden

durch Infektion mit dem humanen Papillomavirus HPV, was zur Folge hat, dass die

Onkogene E6 und E7 aktiviert werden, die unter anderem den Ubiquitin-vermittelten

Abbau von p53 beschleunigen. Dies ist wohl ein Gund für die geringere Induktion von

Apoptose und die beschleunigte Proliferationsrate in HeLa S3 Zellen. In

verschiedenen Studien und auch in unserem Labor (Daten nicht gezeigt) konnte

jedoch gezeigt werden, dass HeLa S3 Zellen nach wie vor eine basale p53-

Expression besitzen. Inwieweit die reduzierte p53-Menge Einfluss auf die

arseninduzierte Apoptose hat ist unklar. Andere Substanzen wie Staurosporin

induzieren in HeLa S3 Zellen jedoch nach wie vor Apoptose und weisen evtl. auf eine

p53 unabhängige Aktivierung der Apoptose hin, wie sie auch für Arsenverbindungen

nicht ausgeschlossen werden kann (Bernard et al., 2003).


5.5.4 Poly(ADP-Ribosyl)ierung isolierter PARP-1

Die bisherigen Ergebnisse im zellulären System deuten darauf hin, dass die

Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch die Arsenverbindungen auf eine

Wechselwirkung mit PARP-1 zurückzuführen ist. Aus diesem Grund wurde als

nächstes die Hemmung isolierter PARP-1 untersucht. Zunächst wurde für diesen

Versuch PARP-1 aus mit rekombinanten Bacculoviren infizierten Sf9- Insektenzellen

isoliert. Diese Arbeiten wurden an der Universität Konstanz im Arbeitskreis von Prof.

Bürkle durchgeführt. Die Methode zur Bestimmung der PARP-1 Aktivität konnte

folglich für unser Labor etabliert werden. Zunächst wurde isolierte PARP-1 mit den

Arsenverbindungen 30 min bei 37°C vorinkubiert, und dann die PARP-Reaktion 10

min bei 37°C durchgeführt. Nach Aufsaugen des Gemischs auf eine Membran mittels

Slot-Blot konnte die Poly(ADP-Ribose) immunologisch detektiert werden.

Arsenit

DMA(III)

MMA(III)

DMA(V)

MMA(V)

Kontrolle

0,01

0,5

0,1

1 2,5

5 10


- - --

- - --

Arsenit

DMA(III)

MMA(III)

DMA(V)

MMA(V)

Kontrolle

0,01

0,5

0,1

1 2,5

5 10


- - --

- - --

- - --

- - --

Abbildung 27: Effekt der Arsenverbindungen auf die Aktivität isolierter PARP-1. Isolierte

PARP-1 wurde für 30 min bei 37°C mit den Arsenverbindungen vorinkubiert, die PARP-Reaktion mit

einem Oligonukleotid als Aktivator-DNA 10 min bei 37°C durchgeführt, die Reaktion gestoppt und der

Reaktionsmix auf eine Membran mittels Slot-Blot aufgesaugt. Die Poly(ADP-Ribose) wurde

anschließend immunologisch bestimmt. Gezeigt ist für jede Arsenverbindung ein repräsentativer Slot-

Blot.


Abbildung 27 zeigt Slot-Blots für alle fünf eingesetzten Arsenverbindungen. Es ist zu

sehen, dass nur die dreiwertigen Verbindungen Arsenit, MMA(III) und DMA(III) in der

Lage sind die Aktivität isolierter PARP-1 zu hemmen, während für MMA(V) und

DMA(V) keine Abnahme der Bandenintensität zu erkennen war. Die Hemmung durch

die dreiwertigen Verbindungen konnte jedoch erst in sehr hohen millimolaren

Konzentrationen beobachtet werden.

Nach Quantifizierung der Banden der Slot-Blots ergab sich für die dreiwertigen

Arsenverbindungen eine signifikante, konzentrationsabhängige Hemmung der

PARP-1 in millimolaren Konzentrationen. Während für Arsenit und DMA(III) eine

signifikante Abnahme ab 2,5 mM festzustellen ist, begann die Abnahme der

Bandenintensität für MMA(III) erst ab 5 mM (Signifikanzdaten nicht dargestellt). Bei

einer Konzentration von 10 mM ist für Arsenit, MMA(III) und DMA(III) nur noch eine

PARP-1-Aktivität von 27%, 37% bzw. 31% detektierbar. Für MMA(V) und DMA(V) ist

keine Abnahme der PARP-1-Aktivität festzustellen (Abbildung 28).

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10Arsenverbindung [mM]

PAR

P-1

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le)

Arsenit

MMA(III)DMA(III)

MMA(V)

DMA(V)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 2 4 6 8 10Arsenverbindung [mM]

PAR

P-1

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le)

Arsenit

MMA(III)DMA(III)

MMA(V)

DMA(V)




Reaktionsmix auf eine Membran mittels Slot-Blot aufgesaugt. Die Poly(ADP-Ribose) wurde

anschließend immunologisch bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte aus mindestens 3 Bestimmungen.


Im Gegensatz zu den anderen Parametern, die in dieser Arbeit untersucht wurden,

zeigte Arsenit hier sogar eine etwas stärkere Hemmung als die beiden methylierten

Metabolite MMA(III) und DMA(III). Die Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung tritt im

Vergleich zu den nanomolaren Konzentrationen im zellulären System hier erst in

millimolaren Konzentrationen auf.

Aus diesem Grund wurden von unserem Arbeitskreis in Zusammenarbeit mit Prof.

Dianov von der Universität Oxford die dreiwertigen Arsenverbindungen in einem

zweiten System zur Messung der Aktivität isolierter PARP-1 eingesetzt.

Hochaufgereinigte PARP-1 wurde 10 min bei Raumtemperatur mit den

Arsenverbindungen vorinkubiert, 5 min bei 37°C durch ein eingeschnittenes Plasmid

aktiviert, die Reaktion gestoppt und schließlich das Reaktionsgemisch auf ein

PAR

P-1

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le)

0

20

40

60

80

100

0 10 50 100 200 500


Arsenit

MMA(III)

DMA(III)***

*** **

**

***

***

***

***

***

******

***

***

***

PAR

P-1

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le)

0

20

40

60

80

100

0 10 50 100 200 500


Arsenit

MMA(III)

DMA(III)***

*** **

**

***

***

***

***

***

******

***

***

***


PARP-1 wurde für 10 min bei Raumtempertur mit den Arsenverbindungen vorinkubiert, die PARP-

Reaktion mit einem eingeschnittenen Plasmid als Aktivator-DNA 5 min bei 37°C durchgeführt, die

Reaktion gestoppt und der Reaktionsmix auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Poly(ADP-Ribose)

wurde anschließend immunfluorimetrisch bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte aus mindestens 4

Bestimmungen + SD. Statistisch unterschiedlich von der Kontrolle: * P < 0,05; ** P < 0,01;

*** P < 0,001 (Student’s t-Test).


Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Quantifizierung erfolgte immunologisch über den

primären Anti-PAR-Antikörper 10 H sowie einen sekundären fluoreszenzgekoppelten

Antikörper. Auch in diesem zweiten System ist zu sehen, dass die dreiwertigen

Arsenverbindungen die Aktivität der PARP-1 konzentrationsabhängig hemmen. Die

Hemmung konnte hier allerdings schon ab einer Konzentration von 10 µM festgestellt

werden. MMA(III) und DMA(IIII) erwiesen sich hier als toxischer verglichen mit

anorganischem Arsenit (Abbildung 29) (Walter et al., 2007). Im Gegensatz zu den

Ergebnissen des Slot-Blot-Testsystems konnte hier, wie auf für Fpg und XPA eine

höhere Reaktivität von MMA(III) und DMA(III) verglichen mit Arsenit festgestellt

werden. Worauf dieser Unterschied zurückzuführen ist, bleibt ungeklärt.

Im Folgenden sollte geklärt werden, worauf die unterschiedliche Sensitivität der

beiden Testsysteme beruht. Zunächst wurde mit beiden Versuchen auch die

Hemmung von PARP-1 durch CuSO4 untersucht. Für Cu2+ ist bekannt, wenn auch in

höheren Konzentrationen als Arsen, dass es die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa

S3 Zellen hemmt (Hartwig et al., 2002; Schwerdtle et al., 2007). Vergleicht man nun

die Hemmung isolierter PARP-1 in beiden Testsystemen, ergaben sich nahezu

identische Kurvenverläufe mit einer signifikanten Hemmung ab 50 µM CuSO4 (Daten

siehe Anhang) (Schwerdtle et al., 2007). Diese Ergebnisse lassen auf einen für

Arsen spezifischen Grund für die unterschiedliche Sensitivität schließen. Daher ist es

unwahrscheinlich, dass die unterschiedliche PARP-1-Aktivierung, die

unterschiedliche Aufreinigung der isolierten PARP-1, verschiedene Inkubationszeiten

oder die unterschiedliche Detektion einen großen Einfluss haben. Viel

wahrscheinlicher ist, dass Pufferkomponenten, wie der Gehalt an Thiolreagenzien,

einen entscheidenden Einfluss auf die Reaktivität der Arsenverbindungen haben. In

beiden Versuchen wird DTT als Oxidationsschutz zur Stabilisierung der PARP-1

eingesetzt. Im Slot-Blot System liegt die Konzentration mit 1 mM um mehr als den

Faktor 100 über der verwendeten Dosis im PAGE-Testsystem. Wie schon für den

XPA-Gelshift (Kapitel 5.4) beschrieben, ist es möglich, dass ein Großteil der

Arsenverbindungen aufgrund ihrer hohen Affinität zu vicinalen Thiolgruppen

bevorzugt mit DTT abreagieren. Eine solch hohe Affinität zu Thiolgruppen ist für

Kupfer nicht beschrieben und könnte daher den Unterschied erklären.

Die Konzentrationen, in denen Arsen die Poly(ADP-Ribosyl)ierung isolierter PARP-1

hemmt, liegen jedoch in beiden Testsystemen weit über den Konzentrationen die

nötig sind, um die zelluläre Poly(ADP-Ribosyl)ierung zu hemmen. Auch hier könnte


der hohe Gehalt von DTT eine mögliche Erklärung für die Unterschiede sein. Des

weiteren konnte für Arsenit gezeigt werden, dass es in der Zelle akkumuliert und

extrazelluläre Konzentrationen um ungefähr das 15-fache übersteigt (Hartwig et al.,

1997). Ähnliche Effekte könnten auch für MMA(III) und DMA(III) denkbar sein. Ein

weiterer Unterschied zwischen zellulärem umd isoliertem System könnte darin

liegen, dass es unter zellulären Bedingungen zur Bildung von noch reaktiveren

Arsenverbindungen, wie z.B. Arsen-GSH-Komplexen, kommt.

Als möglicher molekularer Ansatzpunkt zur Hemmung von PARP-1 durch Arsen

gelten, wie auch schon für Fpg und XPA, die Zinkfingerstrukturen von PARP-1. Mit

den bisherigen Daten lässt sich jedoch keine Aussage zur Beteiligung des

Zinkfingers machen. So hat die DNA-bindende Domäne mit 11 Cystein-Resten eine

hohe Dichte an Thiolgruppen, jedoch auch in der Automodifikationsdomäne und der

katalytischen Domäne mit einem bzw. zwei Cysteinen finden sich mögliche

Angriffspunkte für Arsenverbindungen (Ame et al., 1999). Hier sind weitere Studien,

wie Untersuchungen der DNA-Bindung von arsengeschädigter PARP-1 oder Arsen-

PARP-1 Bindungsversuche nötig.

78 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick

6. Zusammenfassende Diskussion und Ausblick

Die vorliegende Arbeit liefert einen Beitrag zum Verständnis der genotoxischen

Wirkung von Arsen. Es konnte gezeigt werden, dass neben der bekannten Induktion

von oxidativen DNA-Schäden durch Arsenverbindungen, auch indirekte Effekte, wie

Hemmungen von DNA-Reparaturproteinen, eine wichtige Rolle spielen. Aufgrund der

hohen Affinität von vor allem dreiwertigen Arsenverbindungen zu vicinalen

Thiolgruppen konnten Zinkfingerstrukturen als ein möglicher molekularer

Angriffspunkt identifiziert werden.

Die Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen erwies sich dabei als

empfindlichste Reaktion. Die Poly(ADP-Ribosyl)ierung wird zu über 90% von dem

Zinkfingerenzym PARP-1 katalysiert, das an vielen zellulären Reaktion beteiligt ist

und entscheidenden Einfluss auf die genomische Stabilität hat. Man geht heute

davon aus, dass PARP-1 als Regulator der zellulären Stabilität wirkt. Die Hemmung

der Poly(ADP-Ribosyl)ierung konnte spezifisch für die dreiwertigen

Arsenverbindungen schon in extrem niedrigen nanomolaren Konzentrationen

festgestellt werden. Bisher ist in der Literatur keine andere mit der DNA-Reparatur

verbundene, zelluläre Reaktion bekannt, auf die Arsen in ähnlich niedrigen

Konzentrationen einen Einfluss ausübt. In der vorliegenden Arbeit ist es zudem

gelungen, zum ersten Mal eine Hemmung einer zellulären Reaktion durch die

dreiwertigen Arsenmetabolite MMA(III) und DMA(III) zu zeigen, die direkt mit der

DNA-Reparatur und der Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität in

Zusammenhang gebracht werden kann. Inwieweit die Hemmung der Poly(ADP-

Ribosyl)ierung spezifisch für Arsenverbindungen ist und damit einen wichtigen

Mechanismus der arseninduzierten Kanzerogenese darstellt, muss weiter untersucht

werden. Die Untersuchung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung kann zudem in Zukunft

einen wichtigen Biomarker für eine Arsenexposition darstellen. Epidemiologische

Studien könnten zeigen, dass eine berufliche Arsenexposition oder eine Aufnahme

von Arsen über das Trinkwasser mit einer reduzierten Aktivität der Poly(ADP-

Ribosyl)ierung in Lymphozyten einhergeht.

In umfangreichen Untersuchungen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden,

dass die Hemmung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung wahrscheinlich auf eine Interaktion

Zusammenfassende Diskussion und Ausblick 79

der Arsenverbindungen mit PARP-1 zurückzuführen ist. Wie bereits ausführlich

dargestellt, konnte keine zeitliche Verschiebung der Poly(ADP-Ribosyl)ierung zu

längeren H2O2-Inkubationszeiten, keine Reduzierung der DNA-Strangbruchinduktion

nach Koinkubation der Arsenverbindungen mit H2O2, keine Veränderung der PARP-

1-Genexpression sowie keine Veränderungen der PARP-1-Proteinmenge im

niedrigen Konzentrationsbereich beobachtet werden. Zudem ist eine NAD+-

Depletierung der Zelle in den niedrigen nanomolaren Konzentrationen aufgrund nicht

auftretender zytotoxischer Reaktionen auszuschließen. Aufgrund dieser Daten ist

anzunehmen, dass es zu direkten Wechselwirkungen der Arsenverbindungen mit

PARP-1 kommt, wobei nicht ganz ausgeschlossen werden kann, dass weitere

Reaktionen, wie z.B. eine Phosphorylierung der PARP-1 oder eine reduzierte PAR-

Polymerlänge eine Rolle spielen.

Die Hemmung isolierter PARP-1, wenn auch in hohen Konzentrationen, zeigt dass

eine solche Interaktion durchaus möglich ist. Eine Hemmung der PARP-1 konnte im

PAGE-Testsystem schon in mikromolaren Konzentrationen festgestellt. Verglichen

mit anderen Hemmungen von DNA-Reparaturproteinen stellt auch hier PARP-1 das

sensitivste Zielmolekül für Arsenverbindungen dar. Aufgrund der vorliegenden

Datenlage ist es jedoch nicht möglich, eine Aussage über den Mechanismus einer

möglichen PARP-1-Enzymhemmung zu treffen. Neben den Thiolgruppen der beiden

Zinkfingerstrukturen, könnten auch SH-Gruppen aus der Automodifikations- oder der

katalytischen Domäne der PARP-1 Ziel für die Arsenverbindungen sein.

Unersuchungen mit den beiden Zinkfingerproteinen Fpg und XPA zeigen jedoch,

dass Zinkfingerstrukturen einen molekularen Angriffspunkt vor allem für dreiwertige

Arsenverbindungen darstellen können. So weisen die Ergebnisse zur Koinkubation

mit ZnCl2 im Falle von Fpg und zur Zinkfreisetzung aus XPAzf auf den Zinkfinger als

Zielstruktur hin. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die in dieser Arbeit

durchgeführten Untersuchungen isolierter Zinkfingerproteine bzw. –peptide. Für Fpg

konnte neben PARP-1 zum ersten Mal eine Enzymhemmung eines isolierten DNA-

Reparaturproteins durch die dreiwertigen Metabolite MMA(III) und DMA(III) gezeigt

werden.

In der Literatur werden eine Vielzahl von Enzymhemmungen für Arsen beschrieben.

Eine sensitive Hemmung von isolierten DNA-Reparaturproteinen konnte bisher

jedoch noch nicht beschrieben werden. So konnten weder Asmuss et al. (2000) für


Tabelle 2: Wechselwirkungen der Arsenverbindungen mit den isolierten Proteinen bzw. Peptiden Fpg, XPAzf und PARP-1. + : Wechselwirkung, - : keine Wechselwirkung

Arsenit MMA(III) DMA(III) MMA(V) DMA(V)

Fpg -

bis 10 mM +

≤ 1 mM +

≤ 200 µM -

bis 10 mM -

bis 10 mM

XPAzf +

≤ 100 µM +

≤ 25 µM +

≤ 50 µM -

bis 10 mM -

bis 10 mM

PARP-1 +

≤ 2,5 mM +

≤ 5 mM +

≤ 2,5 mM -

bis 10 mM -

bis 10 mM

XPA bis 1 mM Arsenit noch Hu et al. (1998) im Falle von Ligase I, Ligase III und

Polymerase ß bis 5 mM Arsenit bzw. 30 mM Arsenat eine Hemmung zeigen. Für alle

Versuche mit isolierten Proteinen ist jedoch zu beachten, dass meistens hohe

Konzentrationen an DTT verwendet wurden, das, wie schon beschrieben, selbst mit

Arsen interagieren kann. Für in vitro Experimente wurde bisher nur für DNA-Ligase

eine Hemmung in sehr hohen millimolaren Konzentrationen berichtet (Li und

Rossman, 1989). Hemmungen isolierter Enzyme durch MMA(III) und DMA(III) sind

nur selten beschrieben worden. Es konnte gezeigt werden, dass die

Glutathionreduktase durch MMA(III) und DMA(III) in mikromolaren Konzentrationen

gehemmt wird, während Arsenit erst in 100-fach höheren Konzentrationen hemmt.

Auch die Thioredoxinreduktase wird durch MMA(III) stärker gehemmt als durch

Arsenit oder fünfwertige Arsenverbindungen (zusammengefasst in Thomas et al.,

2001).

Eine Hemmung von Zinkfingerproteinen konnte schon für eine ganze Reihe von

Metallen und Zinkfingerstrukturen gezeigt werden. Die Art und Weise, wie die

Interaktion zwischen Metall und Proteindomäne abläuft, ist dabei von den

Eigenschaften des Metalls wie auch von der Struktur des Zinkfingers abhängig. So

ist denkbar, dass es zu einem Austausch der Metalle, zu gemischten Komplexen mit

Zink oder auch zur Oxidation der Cysteine des Zinkfingers kommt. Alle

Wechselwirkungen führen in der Regel zu einem Funktionsverlust des Zinkfingers

und damit in den meisten Fällen zur Hemmung des gesamten Proteins (Hartwig,

2001). Aufgrund seiner hohen Affinität zu Thiolgruppen ist für dreiwertiges Arsen eine

direkte Interaktion mit den Cysteinen des Zinkfingers wahrscheinlich. So ist bekannt,


dass Arsenit Gluthation-Komplexe bildet (Hayakawa et al., 2005) und es konnte

gezeigt werden, dass Arsenit, MMA(III) und DMA(III) an Metallothionein binden. Bei

Metallothionein handelt es sich um ein metallspeicherndes Polypeptid mit 20

Cysteinresten. Während Arsenit drei Bindungsstellen für SH-Gruppen besitzt, können

MMA(III) und DMA(III) nur eine bzw. zwei Thiolgruppen binden. Ein Molekül

Metallothionein ist also in der Lage 6 Moleküle Arsenit, 10 Moleküle MMA(III) und 20

Moleküle DMA(III) zu binden (Jiang et al., 2003). Während diese Studien auf eine

kovalente Bindung von Arsen an Thiole auch in Zinkfingerstrukturen hindeuten,

weisen die Koinkubationsversuche von Zink und DMA(III) im Falle für Fpg eher auf

eine reversible Hemmung und damit auf eine nicht-kovalente Bindung an den

Zinkfinger hin. Arsen könnte Zinkfingerstrukturen allerdings auch indirekt schädigen.

So könnten durch Arsenverbindungen erzeugte reaktive Sauerstoff- oder

Zn

Zn

AsAs

As

S

S

S

S

+ Arsen

ROS

S

S

AsHS

HS

RNS

ZnZn

Zn

AsAs AsAs

AsAs

S

S

S

S

+ Arsen

ROS

S

S

AsAsHS

HS

RNS

Abbildung 30: Mögliche Wechselwirkungen von Arsenverbindungen mit Zinkfingerstrukturen. ROS: reaktive Sauerstoffspezies (modifiziert nach Hartwig, 2001)


Stickstoffspezies (Huang et al., 2004; Shi et al., 2004) eine Oxidation der SH-

Gruppen des Zinkfingers zu Disulfitbrücken und damit einen Funktionsverlust des

Proteins bewirken. Die möglichen Wechselwirkungen von Arsen mit

Zinkfingerstrukturen werden in Abbildung 30 zusammengefasst. Hier wird

beispielshaft davon ausgegangen, dass ein Molekül einer Arsenverbindung, wie z.B.

MMA(III) zwei Cysteine binden kann, so dass ein Zinkfinger bis zu zwei

Arsenmoleküle binden könnte. Zudem ist es denkbar, dass es neben einer Bindung

von Arsen an das Protein gleichzeitig zu Oxidationsreaktionen und zur Ausbildung

von Disulfitbrücken kommen kann.

Die Hemmung wichtiger DNA-Reparaturproteine könnte die bekannten hemmenden

Effekte auf die BER, NER oder auch im Falle von PARP-1 auch die klastogenen

Wirkungen von Arsen erklären. Diese Befunde sind scheinbar wiedersprüchlich zu

einer Arbeit von Snow et al. (2005). In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass es

in Fibroblasten und Keratinozyten nach 24stündiger Inkubation mit 0,5 µM Arsenit zu

einer geringeren ROS-Induktion verglichen mit der Kontrolle kam. Zudem fanden die

Autoren eine Stimulierung der Promotor-Aktivität von Polymerase ß und erhöhte

Polymerase ß-Gehalte nach Inkubation mit 0,1-0,5 µM Arsenit. Die Stimulierung von

DNA-Reparaturenzymen in niedrigen Arsenit-Konzentrationen deutet, so die

Interpretation der Autoren, damit eher auf protektiven Mechanismen durch Arsen hin.

Eine solche Induktion der Genexpression von DNA-Reparaturproteinen lässt sich

jedoch auch als Reaktion der Zelle auf genotoxische Effekte, wie die Induktion von

oxidativen DNA-Schäden oder Hemmungen von anderen DNA-Reparaturereignissen

z.B. der Poly(ADP-Ribosyl)ierung, interpretieren.

Die Konzentrationen, die nötig sind, die zelluläre Poly(ADP-Ribosyl)ierung zu

hemmen, liegen, wie schon ausführlich dargelegt, in extrem niedrigen nanomolaren

Konzentrationen. Diese Konzentrationen liegen im gleichen Bereich, wie

Urinkonzentrationen von über das Trinkwasser arsenexponierten Personen. In

verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass bei einer Arsenaufnahme über

das Trinkwasser (30-1100 µg/l) die Konzentrationen von Arsenit (64-828 nM),

MMA(III) (9-242 nM) und DMA(III) (47-937 nM) im Bereich der beobachteten

Enzymhemmung liegen (Aposhian et al., 2000; Del Razo et al., 2001; Mandal et al.,

2001). Le et al (2000) konnten in zwei Studien für MMA(III) bei einer Arsen-

Trinkwasserkonzentration von 550-610 µg/l sogar Urinkonzentrationen über 1 µM

nachweisen. Für die beiden fünfwertigen Verbindungen MMA(V) und DMA(V)


konnten Spitztenwerte von bis zu 4 µM festgestellt werden (Le et al., 2000a; Le et al.,

2000b; Del Razo et al., 2001). Die Arsenspeziation im Blut ist schwieriger als im Urin,

so dass hier nur Gesamtarsengehalte angegeben werden können. Während in der

nichtexponierten Allgemeinbevölkerung Gesamtarsengehalte von 4-27 nM gefunden

wurden, zeigen mit belastetem Trinkwasser (100-400 µg/l) exponierte Personen

Blutkonzentrationen zwischen 55 und 172 nM Gesamtarsen (NRC, 1999; NRC,

2001). Es ist durchaus möglich, dass die Arsenverbindungen in der Zelle

akkumulieren und damit die intrazellulären Arsenkonzentrationen noch höher liegen

(Hartwig et al., 1997).

Vergleicht man die dreiwertigen mit den fünfwertigen Arsenverbindungen ist zudem

zu beachten, dass dreiwertige Verbindungen vorwiegend ungeladen vorliegen,

während fünfwertige Arsenspezies geladen sind und damit schlechter in die Zelle

aufgenommen werden. Dies ist eine Erklärungsmöglichkeit für die teilweise um

mehrere Größenordnungen geringere Reaktivität der fünfwertigen gegenüber den

dreiwertigen Verbindungen. Die Reaktivitätsunterschiede je nach Wertigkeit konnten

in allen Untersuchungen dieser Arbeit gezeigt werden und bestätigen damit eine

Vielzahl von Genotoxizitätsprüfungen wie z.B. die Induktion von DNA-Schäden

(Schwerdtle et al., 2003b) oder die Hemmung Benzo[a]pyren-induzierter DNA-

Reparatur (Schwerdtle et al., 2003a). Während es in Bezug auf die Wertigkeit leicht

ist eine Reaktivitätsreihenfolge zu erkennen, fällt es schwer eine generelle

Reihenfolge bezogen auf den Methylierungsgrad der Arsenverbindungen

festzulegen. In den meisten Testsystemen zeigen die methylierten dreiwertigen

Arsenverbindungen ein höheres genotoxisches Potential verglichen mit ihrer

Ausgangssubstanz Arsenit. Vergleicht man allerdings MMA(III) mit DMA(III) ergibt

sich kein klarer Reaktivitätsunterschied. So setzt beispielsweise MMA(III) in

niedrigeren Konzentrationen Zink aus XPAzf frei, während DMA(III) den stärkeren

hemmenden Effekt auf Fpg ausübt. Wichtig festzuhalten ist allerdings, dass in fast

allen Versuchen dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die dreiwertigen

Metaboliten die stärksten Effekte aller Arsenverbindungen verursachten. Die Einzige

Ausnahme bildet die Hemmung isolierter PARP-1, bestimmt über das Slot-Blot-

Testsystem, wo Arsenit, MMA(III) und DMA(III) in etwa gleiche Effekte zeigten.

Ausgehend von diesen Ergebnissen zeigt sich, dass die Biomethylierung von Arsen

keine detoxifizierende Reaktion darstellt. Vielmehr ist es wahrscheinlich, dass vor

allem die dreiwertigen Arsenmetabolite MMA(III) und DMA(III) entscheidend zur


arseninduzierten Genotoxizität und damit auch zur Kanzerogenität von

anorganischem Arsen beitragen.

Es ist anzunehmen, dass die unterschiedlichen Arsenverbindungen verschiedene

Schädigungsmechanismen und/oder Schädigungsspektren besitzen. So zeigten die

dreiwertigen Verbindungen in zytotxischen Konzentrationen beispielsweise

unterschiedliche morphologische Veränderungen an HeLa S3 Zellen. Während

Arsenit und MMA(III) eine Abrundung der Zellen bewirkten, zeigte sich im Falle von

DMA(III) eine Ausfransung der Zellumrisse. Es wird zudem spekuliert, dass die

verschiedenen Arsenverbindungen unterschiedliche Zielorgane schädigen können. In

der Leber werden alle Arsenverbindungen gefunden, in der Niere vor allem MMA(V)

und DMA(V). In der Blase werden die fünfwertigen Verbindungen schnell

ausgeschieden. Obwohl hier keine Metabolisierung stattfindet kann es sein, dass

sich dreiwertige Arsenverbindungen durch Reduktion von fünfwertigen Spezies

bilden (Sampayo-Reyes et al., 2000) und damit zur Entstehung von Blasenkrebs

beitragen (zusammengefasst in Ahmad et al., 2002). In anderen Organen wie der

Haut, in der keine Metabolisierungsreaktionen ablaufen, werden synergistische

Effekte mit anderen genotoxischen Effekten wie z.B. UV-Strahlung diskutiert

(Rossman et al., 2001). Betrachtet man vor allem die berufliche Exposition

gegenüber Arsen, zeigt sich, dass es oft zu einer Mischexposition mit anderen

Metallen oder Umweltgiften wie z.B. Benzo[a]pyren kommen kann, die die Wirkung

der einzelnen Verbindungen noch erhöhen kann. Die Neubewertung und Einstufung

der Toxizität von Umweltkanzerogenen wie Arsen ist daher eine wichtige Aufgabe, zu

der die Ergebnisse dieser Arbeit beitragen können.

Die Daten dieser Arbeit liefern zudem einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der

DNA-Reparatur-Hemmung durch Arsenverbindungen. Zinkbindende Proteine, die an

wichtigen DNA-Reparaturwegen beteiligt sind könnten sensitive Angriffspunkte vor

allem für dreiwertige Arsenverbindungen darstellen. Neben den in dieser Arbeit

untersuchten Zinkfingerproteinen spielen noch weitere zinkbindende Proteine eine

wichtige Rolle an der Aufrechtherhaltung der genomischen Stabilität der Zelle. So ist

es beispielsweise denkbar, dass auch p53, welches Zink über drei Cyteine und ein

Histidin bindet, durch Arsen gestört wird und damit wichtige Funktionen wie z.B. die

Regulation des Zellzyklus oder das Auslösen von Apoptose nicht mehr erfüllen kann

(Levine, 1997). Die möglichen Auswirkungen auf wichtige Mechanismen zur


Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität nach einer arseninduzierten

Schädigung von zinkbindenden Proteinen stellt Abbildung 31 zusammen.

OH

O-

CH3O AsV

MMA(V)

OH

OH

CH3AsIII

MMA(III)

CH3

CH3

O-

O AsV

DMA(V)

OH

CH3CH3 AsIII

DMA(III)

OH

OHO AsIII

Arsenit

BER NER Doppelstrangbruch-reparatur

Zellzyklus-kontrolle

XPA

Fpg*PARP-1

PARP-1

p53 ?

Schädigungzinkbindender Proteine

? ?

OH

O-

CH3O AsV

OH

O-

CH3O AsV

MMA(V)

OH

OH

CH3AsIII

OH

OH

CH3AsIII

MMA(III)

CH3

CH3

O-

O AsV CH3

CH3

O-

O AsV

DMA(V)

OH

CH3CH3 AsIII

OH

CH3CH3 AsIII

DMA(III)

OH

OHO AsIII

OH

OHO AsIII

Arsenit

BER NER Doppelstrangbruch-reparatur

Zellzyklus-kontrolle

XPA

Fpg*PARP-1

PARP-1

p53 ?

Schädigungzinkbindender Proteine

? ?

Abbildung 31: Schematische Darstellung des möglichen Mechanismus der Hemmung der DNA-Reparatur durch dreiwertige Arsenverbindungen. Fpg: Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (* in

E. coli), PARP-1: Poly(ADP-Ribose)polymerase-1, XPA: Xeroderma Pigmentosum Protein A, BER:

Basenexzisionsreparatur, NER: Nukleotidexzisionsreparatur.

86 Literatur

7. Literatur

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Anhang 97

8. Anhang

8.1 Abkürzungsverzeichnis

10H monoklonaler Antikörper gegen PAR

A Adenin

ADP Adenosindiphosphat

AIF apoptosis inducing factor

ATP Adenosintriphosphat

AP- Stelle Apurin-/Apyrimidin-Stelle

ATSDR Agency for Toxic Substances and Disease Registry

AU Alkalische Entwindung

BER Basenexzisionsreparatur

bp Basenpaare

BPDE Benzo[a]pyrendiolepoxid

BRCA-1 breast cancer protein 1

BRCT BRACA-1 homologe Domöne

BSA Rinderserumalbumin

C Cytosin

CA Chromosomenabberation

CCA Chromiertes Kupferarsenat

cDNA komplementäre DNA

CII-10 monoklonaler Antikörper gegen PARP-1

CPD Cyclopyriminindimer

Cys Cystein

DAPI 4',6-Diamidino-2-Phenylindol

DDB damage DNA binding protein

DFG Deutsche Forschungsgemeinschaft

DMA(III) dimethylarsinige Säure

DMA(V) Dimethylarsinsäure

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTT Dithiotreitol

98 Anhang

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EPA Environmental Protection Agency

ERCC1 excision repair cross-complementing factor 1

F 12 F 12 Kulturmedium

FaPy Formamidopyrimidin

FEN-1 Flapendonuklease-1

FITC Flurescin-5-isothicyanat

FKS Fötales Kälberserum

Fpg Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase

G Guanin

GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase

GGR globale genomische Reapratur

GSSG Glutathion (ox.)

GSH Glutathion (red.)

HeLa S3 menschliche Zervixkarzinomzellinie

HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethansulfonsäure

His Histidin

hHR23B UV-Exzisionsreparaturprotein Rad 23 Homolog B

HPV humaner Papillomavirus

HRP Meerrettichperoxidase

HTH helix-turn-helix-Motiv

IARC Interational Agency for Reseach on Cancer

kDa Kilodalton

LAI Länderausschuss für Emmisionsschutz

MAK Maximale Arbeitsplatz Konzentration

MBD minimale Bindungsdomäne

MMA(III) monomethylarsonige Säure

MMA(V) Monomethylasonsäure

MMR Mismatch- Reparatur

MNNG N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin

moi multiplicity of infection = Verhältnis Viruszahl zu Zellzahl

NAD+ Nicotinamidadenindinukleotid

Neil I, II und III Endonuklease-VIII-like-DNA-glykosylase I,II und III

Anhang 99

NER Nukleotidexzisionsreparatur

NF-κB Nukleärer Faktor κB

NLS Kernerkennungssignal

NRC National Research Council

NTC-Puffer NaCl-CaCl2-TRIS-Puffer

OGG1 8-Oxoguanin-DNA-glycosylase-1

OD optische Dichte

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PAR Poly(ADP-Ribose)

PARG Poly(ADP-Ribose)glycohydrolase

PARP Poly(ADP-Ribose)polymerase

PBS phosphatgepupperte Salzlösung

PBS-T PBS mit Tween 20

PBS-MT PBS mit Tween 20 und Magermilchpulver

PCNA proliferating cell nuclear antigen

PEG Polyethylenglycol

PFU plaque forming unit

PM2 Bakteriophage

PMSF Phenylmethansulfonylfluorid

PVDF Polyvinylidenfluorid

RFC DNA Replications Faktor

RNA Ribonukleinsäure

ROS reaktive Sauerstoffspezies

RPA Replikationsprotein A

RT- PCR Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion

SAHC S-Adenosylhomocystein

SAM S-Adenosylmethionin

SCE Schwesterchromatidaustausch

SD Standardabweichung

SDS Natriumdodecylsulfat

Sf9 Spodoptera frugiperda Insektenzellen

Sp1 Transkriptionsfaktor Sp1

T Thymin

TBE-Puffer Tris-Borsäure-EDTA-Puffer

100 Anhang

TCA Trichloressigsäure

TCR transkriptionsgekoppelte Reparatur

TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine

TFIIH Transkriptionsfaktor II H

TFIIIA Transkriptionsfaktor III A

TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

UV ultraviolet

WHO Weltgesundheitsorganisation

XPA bis XPG, XPV Xeroderma Pigmentosum Protein A bis G und V

XPAzf Zinkfingerdomäne von XPA

XRCC1 X-ray repair cross-complementing faktror 1

ZF Zinkfinger

Anhang 101

8.2 Liste der verwendeten Chemikalien

Bezeichnung Lieferant

Acryamid-Bisacrylamid-Lösung 37,5:1 (40%) Merck, Darmstadt

Agarose NEEO Ultra-Qualität Roth, Karlsruhe

3-Aminobenzamid Alrich, Steinheim

Ammoniumperoxodisulfat Merck, Darmsatdt

Ammoniumsulfat Merck, Darmstadt

Anti-Actin-Antikörper (Kaninchen) Santa Cruz, Santa Cruz (USA)

Anti-Dig-POD-Antikörper Roche, Mannheim

Anti-Kaninchen-Antikörper-HRP Santa Cruz, Santa Cruz (USA)

Anti-Maus-Antikörper-FITC Sigma, Deisenhofen

Anti-Maus-Antikörper-HRP Santa Cruz, Santa Cruz (USA)

Anti-PAR-Antikörper, 10H (Maus) A. Bürkle, Konstanz

Anti-PARP-1-Antikörper (Maus) Alexis, Lausen (Schweiz)

ß-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt

Bacto Agar BD, Le Pont de Claix (Frankr.)

Bacto Trypton BD Le Pont de Claix (Frankr.)

Blockierreagenz Roche, Mannheim

Bromphenolblau Merck, Darmsadt

BSA (≥ 96%) Sigma, Deisenhofen

Borsäure p.a. Merck, Darmstadt

Calciumchlorid Merck, Darmstadt

Cäsiumchlorid Fisher, Loughbrorough (UK)

Casy-Ton Schärfe System, Reutlingen

Casy-Clean Schärfe System, Reutlingen

Chloroform Roth, Karlsruhe

Diiodomethylarsin (99,0 %) W.R. Cullen, University of

British Columbia (Kanada)

Dimethylarsinsäure (Cacodylsäure) 98,8% Riedel- de Haën, Seelze

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma, Deisenhofen

Dithiotreitol (DTT) Roth, Karlsruhe

Ds-DNA Cellulose Sigma, Deisenhofen

102 Anhang

ECL-Detektionslösung Amersham, Freiburg

ECL-Advanced-Detektionslösung Amersham, Freiburg

Entwickler für Photofilm Amersham, Freiburg

Ethidiumbromid Fluka, Buchs

Ethanol (Rotipuran > 99,8%) Roth, Karlsruhe

EDTA Riedel de Haën, Seelze

Ficoll 400 Sigma, Deisenhofen

Formamidopyrimidine-DNA Glykosylase (Fpg) Dr. Serge Boiteux, Fontenay

aux Roses (Frankreich)

Fötales Kälberserum (FKS) Sigma, Deisenhofen

Fixierer für Photofilm Amersham, Freiburg

Giemsa- Farbstoff Merck, Darmstadt

Glycerol Merck, Darmstadt

Glycin Roth, Karlsruhe

Harnstoff Roth, Karlsruhe

HEPES Merck, Darmstadt

Histone Typ IIa Sigma, Deisenhofen

2-Hydroxychinolin Aldrich, Steinheim

Inversionsöl für Fluoreszenzmikroskopie Zeiss, Oberkochen

Iododimethylarsin (99,0%) W.R. Cullen, University of


Isopropanol Sigma, Deisenhofen

Kaliumchlorid, p.a. Merck, Darmstadt

Kaliumdihxdrogenphosphat, p.a. Merck, Darmstadt

Di-Kaliumhydrogenphosphat p.a. Merck, Darmstadt

Kaliumhydroxid Merck, Darmstadt

Laborsand Bernd Kraft GmbH, Duisburg

Magermilchpulver Roth, Karlsruhe

Magnesiumsulfat Roth, Karlsruhe

Magnesiumchlorid Sigma, Deisenhofen

Maleinsäure Roth, Karlsruhe

Methanol Riedel de Haën, Seelze

Methylenblau p.a. Merck, Darmstadt

Anhang 103

Methyloxoasin (99,0%) W.R. Cullen, University of


Molekulargewichtsmarker RPN 800 Amersham, Freiburg MMA(V) (Natriumsalz, sesquihydrat, 96,0 %) Greyhound Chromatography

and allied Chemicals

(Birkenhead, UK)

ß-NAD+ Sigma, Deisenhofen

Natriumacetat p.a. Merck, Darmstadt

Natriumbisulfit Sigma, Deisenhofen

Natriumchlorid p.a. Merck, Darmstadt

Natriumdextransulfat Amersham, Freiburg

Natrium-Dihydrogenphosphat p.a. Merck, Darmstadt

Di-Natriumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt

Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck, Darmastadt

Natrium(meta)arsenit p.a. (≥ 99,0%) Fluka, Buchs

Natriumpyrophosphat Roth, Karlsruhe

Natronlauge Merck, Darmstadt

Nährmedium F12 Sigma, Deisenhofen

Nonidet P-40 Sigma, Deisenhofen

Nutrient broth Fluka, Buchs

Oligonukleotide MWG Biotech, Ebersberg

Penicilin/Streptomycin Sigma, Deisenhofen

Pepstatin A Sigma, Deisenhofen

Phenol (Roti-Phenol) Roth, Karlsruhe

Pluronsäure F-68 Sigma, Deisenhofen

PMSF Serva, Heidelberg

Polyethylenglycol 6000 Serva, Heidelberg

Protaminsulfat Sigma, Deisenhofen

4-2-Pyridylazoresorcinol Riedel de Häen, Seelze

Salzsäure Merck, Darmstadt

Sephadex G100-50sf Sigma, Deisenhofen

Sepharose 2B (für Gelfiltration) Amersham, Freiburg

TEMED Roth, Karlsruhe

Trichloressigsäure Roth, Karlsruhe

104 Anhang

TRIS-Base p.a. Sigma, Deisenhofen

Trypsin Sigma, Deisenhofen

Tween 20 Roth, Karlsruhe

Vectashield mit DAPI Vector, Burlingame (USA)

Wasserstoffperoxid Merck, Darmstadt

Xylencyanol FF Fluka, Buchs

XPAzf, Peptid Schafer-N, Kopenhagen

(Dänemark)

XPA-Protein (Maus) Dr. André Ecker, Universität

Rotterdamm (Niederlande)

Zinkchlorid Merck, Darmstadt

Anhang 105

8.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchs-matrialien

Bezeichnung Hersteller

Auflichtmikroskop, Axoivert 25 Zeiss, Oberkochen

Bildauswerteprogramm (Aida Image Analyzer) Raytest, Straubenhardt

Biophotometer Eppendorf, Köln

Blotmembran (Hybond P) Amersham, Freiburg

Blotmembran (Nylon Hybond N+) Amersham, Freiburg

Blotpapier Whatman, Dassel

Bottle Top Filter (0,2 µm) Nalgene, Hamburg

Brutschrank, Heracell Heraeus, Hanau

Elektrophorese-Kammer GNA 200 (Agarose Gel) Amersham, Freiburg

Elektrophorese-Kammer (PAGE) Hoefer, Wiesloch

Entwicklungskammer für Chemilumineszenz Siemens, München

Deckgläschen, 15 mm ∅ Marienfeld, Lauda Königshofen

Dialysekammer Pierce, Rockford (USA)

Fluoreszenzmikroskop, Eclipse E400 Nikon, Düsseldorf

Fluoreszenzmikroskop, Axioimager Zeiss, Oberkochen

Geldokumentationssystem Easy Win 32 Herolab, Wiesloch

Geldokumentationssystem Fuji LAS 3000 Raytest, Straubenhardt

H2O-Aufbereitungsanlage Ultra Clear SG, Barsbüttel

Glaspipetten Roth, Karlsruhe

Glaswolle Merck, Darmstadt

Homogenisator nach Potter Roth, Karlsruhe

Inkubator Heraeus. Hanau

Kolbenhubpipetten Eppendorf, Köln

Koloniezählgerät Colony counter BZG 30 WTW,Weilheim

Kryoröhrchen Greiner, Frickenhausen

Kühlschrank und Tiefkühler Liebherr, Ochsenhausen

Küvetten (UVetten) Eppendorf, Köln

Magnetrührer Heidolph, Schwabach

106 Anhang

MetaView (Version 4.1.5) Visitron Systems, Puchheim

Mikroreaktionsgefäße 1,5 ml Roth, Karlsruhe

Mikrotiterplatten Sarstedt, Nümbrecht

Mikrotiterplattenlesegerät Tecan, Crailsheim

Mulisteppipette Brand, Wertheim

Netzgerät Power Pac 200 Bio-Rad, München

Neubauer-Zählkammer Marienfeld, Lauda-Königshofen

Objektträger Marienfeld, Lauda-Königshofen

Petrischalen Amicrin, Scorze (Italien)

pH-Meter pH 320 WTW, Weilheim

Photometer Analytik Jena, Jena

Photofilm für Chemilumineszenzdetektion Amersham, Freiburg

Pipettierhilfe, Pipettus Hirschmann, Eberstadt

Pipettenspitzen Roth, Karlsruhe

Eppendorf, Köln

Polyprep-Säulen Bio Rad, München

Rotator Neolab, Heidelberg

Schikanekolben 2l TH Geyer, Renningen

Schüttelinkubator Vortemp 56 EVC Labnet, Ried im Innkreis

(Österreich)

Semidry-Blotter Amersham, Freiburg

Slot-Blot-Apperatur Roth, Karlsruhe

Spot RT Kamera für Fluoreszenzmikroskop Visitron Systems, Puchheim

Sterilbank, Hera safe Heraeus, Hanau

Stickstoffbehälter MVE, Brunsville (USA)

Taumler GFL, Burgwedel

Tiekühlschrank (-80°C) GFL, Burgwedel

Trockenschrank Heraeus, Hanau

Ultra-Zentrifuge (Typ!) Beckman-Coulter, Krefeld

UV-Lampe Bioblock Scientific, Illkirch

Cedex (Frankreich)

Vakuumpumpe Vacubrand, Wertheim

Vortex Genie 2 Scientific Industries, USA

Waage BP 61S Sartorius, Göttingen

Anhang 107

Wasserbad Julabo, Seelbach

Zentrifuge Biofuge pico Heraeus, Hanau

Zentrifuge Eppendorf, Köln

Zentrifuge Sorvall, Langenselbold

Zellzählgerät (CASY 1) Schärfe System, Reutlingen

Zellkulturschalen Ø 40, 60, 100 und 150 mm Biochrom, Trasadingen

(Schweiz)

Zentrifugenröhrchen, 15 und 50 ml Sarstedt. Nümbrecht

Zentrifügenröhrchen für Ultra-Zentrifuge TH Geyer, Renningen

108 Anhang

8.4 Verwendete Puffer und Lösungen

Alle Lösungen wurden mit über Austauschkanülen aufgereinigtem destilliertem

Wasser angesetzt. Die Medien und Lösungen für die Zellkultur und PM2-Isolierung

wurden sterilfiltiriert.

8.4.1 Zellkultur

F 12 Kulturmedium F12, pH 6,8

10% FKS

100 U/ml Penicillin

100 µg/ml Streptomycin

PBS, pH7,4 100 mM NaCl 7 mM Na2HPO4

4,5 mM KCl

3 mM KH2PO4

PBS-EDTA, pH 7,4 100 mM NaCl 7 mM Na2HPO4

4,5 mM KCl

3 mM KH2PO4

3 mM EDTA

Trypsin-Lösung 0,25% Trypsin in PBS-EDTA

8.4.2 PM2-Isolierung

AMS-Lösung 47 mM KCl

51 mM CaCl2 x 2 H2O

2,2 M NaCl

MgSO4 –Lösung 234 mM MgSO4

Anhang 109

Nutrient broth 8 g Nutrient broth in 0,6 l Wasser

Nährmedium 600 ml Nutrient broth

200 ml AMS-Lösung

200 ml MgSO4-Lösung

Lösungen getrennt ansetzten und

dann mischen

Bottom-Agar 4,5 g Nutrient broth

5 g Bacto-Agar

ad 300 ml Wasser

nach dem Autoklavieren zufügen:

100 ml AMS

100 ml MgSO4-Lösung

Top-Agar 0,8 g Bacto-Pepton

0,5 g Bacto Agar ab 60 ml H2O

nach dem Autoklavieren zufügen:

20 ml AMS

20 ml MgSO4 -Lösung

NTC-Puffer, pH 7,5 1 M NaCl

9,7 mM CaCl2 x 2 H2O

10,15 mM Tris/HCl

BE1-Puffer, pH 7,5 100 mM NaCl

20 mM Tris/HCl

1 mM EDTA

Phenollösung für die DNA-Fällung Roti-Phenol pH 7

1% SDS

0,1% Hydroxychinolin

110 Anhang

Ethanol/Na-Acetat-Lösung (DNA-Fällung) 95% Ethanol (-20°C)

5% Na-Acetat (125mM)

8.4.3 DNA-Relaxationstest

Elektrophoresepuffer (TBE), pH 8,2 445 mM Tris-Base

445 mM Borsäure

5 mM EDTA

Gebrauchslösung 1:5 verd.

Agarose-Gel (1 %) 2 g Agarose in 200 ml

Elektrophoresepuffer (1x)

Enzympuffer, pH 7,5 85 ml 50 mM Na2HPO4

15 ml 50 mM NaH2PO4

davon 80 ml zu 10 ml 1 M NaCl

und 10ml H2Obidest geben

Methylenblau- Lösung 40 mg in 10 ml H2Obidest

Gebrauchslösung 1:100 verd.

stets frisch ansetzten

Ethanol/Na-Acetat-Lösung (DNA-Fällung) 95% Ethanol (-20°C)

5% Na-Acetat (125mM)

Stoppreagenz 0,25% Bromphenolblau

0,25% Xylencyanol

15% Ficoll 400

Ethidiumbromid 10 mg/ml in H2Obidest

Anhang 111

8.4.4 XPA-Zinkfreisetztung

HEPES/NaOH-Puffer, pH 7,4 20 mM HEPES

pH mit NaOH einstellen

ZnCl2-Lösung 100 µM ZnCl2 in HEPES/NaOH

4-2 Pyridylazoresorcinol-Lösung 2,5 mM 4-2 Pyridylazoresorcinol

8.4.5 XPA-Gelshiftassay

Gelshift-Puffer, pH 8,3 25 mM HEPES-KOH

30 mM KCl

4 mM MgCl2

1 mM EDTA

10% Glycerol

45 µg/ml BSA

0,9 mM DTT (frisch am Versuchtag)

TBE-Puffer (5x) 0,5 M Tris

0,5 M Borsäure

0,01 M EDTA

Für Elekrophorese: pH 8

Für Blot: pH nicht einstellen

TE-Puffer (zur Verdünnung der Oligos) 100 mM Tris

10 mM EDTA

Ladepuffer TBE-Puffer (0,25x), pH 8

40% Glycerol

Oligonukleotidlösung 120 fmol/µl in TE-Puffer

112 Anhang

Ladepuffer mit Farbstoffen TBE-Puffer (0,25x), pH 8

40% Glycerol

0,2% Bromphenolblau

0,2% Xylencyanol

Polyacrylamid-Gel (5%) 5% Acrylamid

0,5 x TBE, pH 8

2,6% Glycerol

0,1% APS

1:1000 TEMED

Maleinsäurepuffer, pH 7,5 100 mM Maleinsäure

150 mM NaCl

pH mit ca. 40 NaOH-Plätzchen einst.

Blockiersubstanz-Stammlösung 10 g Blockiersunstanz in Maleinsäure-

Puffer, autoklavieren und aliquotieren

Blockier-Gebrauchslösung 90 ml Maleinsäurepuffer

10 ml Blockiersubstanz-Stammlösung

Waschpuffer Maleinsäurepuffer mit

0,3% Tween 20

8.4.6 Poly(ADP-Ribosyl)ierung in HeLa S3 Zellen

PBS, pH 7,4 siehe 8.4.1

Blockierlösung (PBS-MT) 5% Magermilchpuffer

0,05% Tween 20

im PBS, pH 7,4

Anhang 113

8.4.7 PARP-1 Proteingehalt

1,5 x Probenpuffer 93,75 mM Tris-HCl, pH 6,8

9 M Harnstoff

15% Glycerol

3% SDS

0,0045% Bromphenolblau

7,5% ß-Mercaptoethanol (frisch)

Proteaseinhibitorlösung 1 mM EDTA

10 mM Natriumbisulfit

10 µM Pepstatin A (frisch)

100 µM PMSF (frisch)

in PBS lösen


Elekrophoresepuffer 25 mM Tris

0,1% SDS

192 mM Glycin (frisch)

Trenn- und Sammelgelpuffer 1,5 M Tris, pH 8,8

Trenngel (10%) 10% Acrylamid

375 µM Tris

0,1% SDS

0,1% APS

1:1000 TEMED

Sammelgel (3%) 5% Acrylamid

125 µM Tris

0,1% SDS

0,1% APS

1:1000 TEMED

114 Anhang

Transferpuffer 192 mM Glycin

20 mM Tris

0,01% SDS

10% Methanol

Blockierlösung (PBS-MT) 5% Magermilchpulver

0,3% Tween 20

in PBS, pH 7,4

Waschpuffer (PBS-T) 0,3% Tween 20

in PBS, pH 7,4

8.4.8 PARP-1 Isolierung

Puffer A 25 mM Tris-HCl, pH 8

50 mM Glucose

10 mM EDTA

1 mM ß-Mercaptoethanol

1 mM PMSF

Puffer B 100 mM Tris-HCl, pH 7,4

10% Glycerin

0,5 mM EDTA


1 mM PMSF

Puffer BII 50 mM Tris-HCl pH 8.0

0,5 mM EDTA

5 mM MgCl2

5% Glycerol

12 mM β-Mercaptoethanol

1mM PMSF

Anhang 115

Puffer C 50 mM Tris-HCl, pH 8

1 mM EDTA

200 mM KCl

1 mM DTT


Puffer D 50 mM Tris-HCl, pH 8

0,5 mM EDTA

5 mM MgCl2

5% Glycerin


1 mM PMSF


8.4.9 Poly(ADP-Ribosyl)ierung isolierter PARP-1

10 x Reaktionspuffer, pH 7,8 100 mM Tris-HCl

100 mM MgCl2

Oligonukleotidlösung 1 mg/ml in 15 mM NaCl


Puffer zur Enzymverdünnung 20% Glycerin

in PBS, pH 7,4

Stopppuffer 10% TCA

2% Na2P2O7

Blockierlösung (PBS-MT) 5% Magermilchpulver

0,3% Tween 20

in PBS, pH 7,4

116 Anhang

Waschpuffer (PBS-T) 0,3% Tween 20

in PBS, pH 7,4

Anhang 117

8.5 Vergleich Methyloxoarsin-Diiodomethylarsin

Um festzustellen, ob die beiden Verbindungen Methyloxoarsin und Diiodomethlarsin,

die beide in wässriger Lösung MMA(III) bilden, die gleichen genotoxischen Effekte

verursachen, wurden vergleichende Untersuchungen zur Hemmung der Fpg und zur

Zinkfreisetzung aus XPAzf durchgeführt (Abbildung 32 und 33). Für beide Parameter

war kein großer Unterschied zwischen den beiden Verbindungen festzustellen, so

dass davon ausgegangen werden kann, dass das Iod in Diiodomethylarsin keinen

Effekt ausübt.

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,1 0,5 1 2 5 10Arsenverbindung [mM]

Fpg

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le)

Methyloxoarsin

Diiodomethylarsin

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0,1 0,5 1 2 5 10Arsenverbindung [mM]

Fpg

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le)

Methyloxoarsin

Diiodomethylarsin

Abbildung 32: Vergleich des Einflusses von Methyloxoarsin und Diiodomethylarsin auf die Aktivität von Fpg. Isolierte Fpg wurde 30 min bei 37°C mit den Arsenverbindungen inkubiert und die

Aktivität gegenüber oxidativ geschädigter DNA mittels DNA-Relaxationstest bestimmt. Dargestellt sind

Mittelwerte aus mindestens 5 Bestimmungen ± SD.

118 Anhang

0

20

40

60

80

100

120

5 10 25 50 75 100


Zink

frei

setz

ung

aus

XPA

zf(%

der

H2O

2-K

ontr

olle

)Methyloxoarsin

Diiodomethylarsin

0

20

40

60

80

100

120

5 10 25 50 75 100


Zink

frei

setz

ung

aus

XPA

zf(%

der

H2O

2-K

ontr

olle

)Methyloxoarsin

Diiodomethylarsin

Abbildung 33: Vergleich des Einflusses von Methyloxoarsin und Diiodomethylarsin auf die Zinkfreisetzung aus XPAzf. XPAzf wurde 30 min bei 37°C mit den Arsenverbindungen inkubiert und

anschließend das freigesetzte Zink mittels 2-4-Pyridylazoresorcinol quantifiziert. Dargestellt sind

Mittelwerte aus mindestens 6 Bestimmungen ± SD.

Anhang 119

8.6 Qualitätsprüfung der isolierten PM2-DNA

Die Ausbeute an isolierter PM2-DNA bei den beiden durchgeführten Versuchen lag

ausgehend von 8 l Bakteriensuspension bei 0,8 bzw. 1 mg. Dies entspricht den

Vorgaben aus dem Versuchsprotokoll, wo die Ausbeute mit 0,5 – 1,5 mg angegeben

wird. Zur Bestimmung der Qualität der DNA wurde sie zunächst oxidativ geschädigt

(Kapitel 4.4) und dann sowohl mit als auch ohne Fpg für 30 min inkubiert. Abbildung

34 zeigt einen Vergleich von zuvor in unserem Labor isolierter mit frisch gewonnener

DNA. Es ist zu sehen, dass der Anteil an offen ringförmiger DNA bei beiden Aliquots

mit ca. 20% gleich groß ist. Auch nach einer Inkubation mit Fpg wurde bei beiden

Proben ein Einschnitt auf ca. 63% offen ringförmige DNA erreicht.

früher isolierte DNA

Fpg +Fpg - Fpg +Fpg -

frisch isolierte DNA



lineare DNA

früher isolierte DNA

Fpg +Fpg - Fpg +Fpg -

frisch isolierte DNA



lineare DNA

Abbildung 34: Vergleich zwischen frisch und früher isolierter PM2-DNA. Dargestellt ist ein

repräsentatives Agarose-Gel.

120 Anhang

8.7 Hemmung isolierter PARP-1 durch CuSO4

Zum Vergleich der beiden Testsysteme zur Messung der Aktivität isolierter PARP-1

mittels Slot-Blot bzw. PAGE (Schwerdtle et al., 2007) wurde zusätzlich CuSO4

untersucht. Es ist zu sehen, dass beide Testsysteme die Hemmung der PARP-1 im

gleichen Konzentrationsbereich zeigen (Abbildung 35).

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 50 75 100 250

CuSO4 [µM]

PAR

P-1

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le) Slot-Blot

PAGE

***

***

***

***

******

***

*

0

20

40

60

80

100

120

140

0 10 50 75 100 250

CuSO4 [µM]

PAR

P-1

Akt

ivitä

t (%

der

Kon

trol

le) Slot-Blot

PAGE

***

***

***

***

******

***

*

Abbildung 35: Effekt von CuSO4 auf die Aktivität isolierter PARP-1. Slot-Blot: Isolierte



Reaktionsmix mittels Slot-Blot auf eine Membran aufgesaugt. Die Poly(ADP-Ribose) wurde

anschließend immunologisch bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte aus mindestens 3 Bestimmungen ±

SD. PAGE (Schwerdtle et al., 2007): Isolierte PARP-1 wurde für 10 min bei Raumtempertur mit den

Arsenverbindungen vorinkubiert, die PARP-Reaktion mit einem eingeschnittenen Plasmid als

Aktivator-DNA 5 min bei 37°C durchgeführt, die Reaktion gestoppt und der Reaktionsmix auf ein

Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Poly(ADP-Ribose) wurde anschließend immunfluorimetrisch

bestimmt. Gezeigt sind Mittelwerte aus mindestens 4 Bestimmungen ± SD. Statistisch unterschiedlich

von der Kontrolle: * P < 0,05; *** P < 0,001 (Student’s t-Test).

Publikationsliste 121

Publikationsliste

Publikationen in Fachzeitschriften

Tanja Schwerdtle, Ingo Walter, Iris Mackiw and Andrea Hartwig (2003) Induction of

oxidative DNA damage by arsenite and its trivalent and pentavalent methylated

metabolites in cultured human cells and isolated DNA. Carcinogenesis, 24(5), 967-

974.

Andrea Hartwig, Holger Blessing, Tanja Schwerdtle, Ingo Walter (2003) Modulation

of DNA repair processes by arsenic and selenium compounds. Toxicology, 193(1-2),

161-9.

Andrea Hartwig, Tanja Schwerdtle and Ingo Walter (2003) Current aspects on the

genotoxicity of arsenite and its methylated metabolites: Oxidative stress and

interactions with the cellular response to DNA damage. Proceedings Workshop

“Metall(oid)organische Verbindungen in der Umwelt”, Springer Verlag 2003, Berlin /

Heidelberg, 221-233.

Tanja Schwerdtle, Ingo Walter and Andrea Hartwig (2003) Arsenite and its

biomethylated metabolites interfere with the formation and repair of stable BPDE-

induced DNA adducts in human cells and impair XPAzf and Fpg. DNA Repair, 2(12),

1449-63.

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle, Christina Thuy, Jason L. Parsons, Grigory L. Dianov

and Andrea Hartwig (2007) Impact of arsenite and its methylated metabolites on

PARP-1 activity, PARP-1 gene expression and poly(ADP-ribosyl)ation in cultured

human cells. DNA Repair, 6(1), 61-70.

Tanja Schwerdtle, Ingrit Hamann, Gunnar Jahnke, Ingo Walter, Constanze Richter,

Jason L. Parsons, Grigory L. Dianov and Andrea Hartwig (2007) Impact of copper on

the induction and repair of oxidative DNA damage, poly(ADP-ribosyl)ation and

PARP-1 activity. Molecular Nutrition and Food Research, 51, 201-210

122 Publikationsliste

Veröffentlichte Abstracts

Tanja Schwerdtle, Iris Mackiw, Ingo Walter, Andrea Hartwig (2002) Genotoxizität

von Arsenit und seinen methylierten Metaboliten I: kultivierte menschliche Zellen.

Lebensmittelchemie, 56 (6): 136-137.

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle, Holger Blessing, Andrea Hartwig (2002)

Genotoxizität von Arsenit und seinen methylierten Metaboliten II: subzelluläre

Systeme. Lebensmittelchemie, 57 (1): 4.

Tanja Schwerdtle, Ingo Walter, Iris Mackiw, Andrea Hartwig (2003) Comparative genotoxicity of arsenite and its trivalent and pentavalent methylated metabolites. Archives of Pharmacology, 367 (1): R138 (537)

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle, Andrea Hartwig (2003) Interference by inorganic arsenic and its methylated metabolites with zinc finger proteins. Archives of Pharmacology, 367 (1): R146 (571)

Vorträge auf Fachtagungen

1st PARP Regio Meeting, 20.2.2004 Konstanz

Ingo Walter, Anke Pelzer, Tanja Schwerdtle, Christina Thuy und Andrea Hartwig

Inhibtion of PARP by very low-dose arsenic compounds.

21. GUM Tagung, 5. – 8.10.2004 Würzburg


Inhibierung der Poly(ADP-ribosy)lierung durch Arsenverbindungen in kultivierten

menschlichen Zellen

3rd PARP Regio Meeting, 19.5.2006 Strasbourg Ingo Walter, Tanja Schwerdtle, Christina Thuy und Andrea Hartwig Impact of trivalent arsenicals on cellular poly(ADP)ribose levels and on the activity of isolated PARP-1


Posterbeiträge auf Fachtagungen

32nd Annual Meeting of the EEMS, 3. - 7. 9. 2002, Warsaw, Poland

Tanja Schwerdtle, Ingo Walter, Iris Mackiw and Andrea Hartwig

Genotoxicity of arsenite and its trivalent and pentavalent methylated metabolites.

7. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 17 – 20. 9. 2002, Karlsruhe

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle and Andrea Hartwig

Genotoxicity of trivalent arsenic metabolites.

31. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 7. – 11. 9. 2002, Frankfurt

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle und Andrea Hartwig

Einfluss von methylierten Arsenverbindungen auf die Induktion und Reparatur

oxidativer DNA-Schäden.

ESCODD plenary meeting 2003, 12. – 13. 1. 2003, Firenze, Italy

Tanja Schwerdtle, Ingo Walter and Andrea Hartwig

Genotoxicity of biomethylated arsenicals in cultured human cells.

44. Tagung der DGPT und 20. Tagung der GUM, 17 - 20. 3. 2003, Mainz

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle and Andrea Hartwig

Einfluss von Arsenit und seinen methylierten Metaboliten auf Zinkfingerproteine.

33rd Annual Meeting of the EEMS, 24.-28.8. 2003, Aberdeen, Scotland

Tanja Schwerdtle, Ingo Walter and Andrea Hartwig

Arsenite and its biomethylated metabolites induce oxidative DNA damage and

interfere with DNA repair in cultured human cells and subcellular systems.

33. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 13. – 15. 9. 2004, Bonn


Arsenit und seine dreiwertigen methylierten Metabolite MMA(III) und DMA(III)

reduzieren die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in kultivierten menschlichen Zellen.

124 Publikationsliste

33. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 13. – 15. 9. 2004, Bonn

Tanja Schwerdtle,. Ingrit Lohter, Gunnar Jahnke, Ingo Walter, Andrea Hartwig,

Genotoxizität von Cu(II) in kultivierten menschlichen Zellen.

8. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 28.9. – 1.10. 2004, Ulm

Ingo Walter, Anke Pelzer, Tanja Schwerdtle, Christina Thuy and Andrea Hartwig

Impact of arsenic compounds on the poly(ADP-ribosyl)ation in cultured human cells

35th Annual Meeting of the EEMS, 3 .- 7.7. 2005, Kos, Greece

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle, Christina Thuy, and Andrea Hartwig

Biomethylated arsenicals interfere with poly(ADP-ribosyl)ation in cultured human

cells.

22. Tagung der GUM, 21. – 24.2. 2006, Darmstadt

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle, Christina Thuy, Grigory L. Dianov und Andrea

Hartwig

Hemmunng von PARP-1 durch dreiwertige Arsenverbindungen

9. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 12.9. – 15.9. 2006, Hamburg

Ingo Walter, Tanja Schwerdtle, Christina Thuy, Grigory L. Dianov and Andrea

Hartwig

Impact of trivalent arsenicals on poly(ADP-ribosyl)ation in cellular and sub-cellular

systems

9. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 12.9. – 15.9. 2006, Hamburg

Claudia Großkopf, Chiara Corso, Ingo Walter and Andrea Hartwig

Antimony – impact on zinc finger structures and DNA repair

Preise und Stipendien

Landesgraduiertenförderung Baden-Würtemberg, 1.10.2002 – 30.6.2004

Ingo Walter Promotionsstipendium


Karlsruher chemische Gesellschaft, 10.6.2003

Ingo Walter Procter & Gamble Förderpreis für ausgezeichnete Diplomarbeit

8. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 28.9. – 1.10. 2004, Ulm

Ingo Walter Meeting Fellowship Award 2004

21. GUM Tagung, 5. – 8.10.2004 Würzburg

Ingo Walter Tagungsstipendium

35th Annual Meeting of the EEMS, 3.-7.7. 2005, Kos, Greece

Ingo Walter EU Network of Excellence (ECNIS) fellowship

126 Lebenslauf

Lebenslauf

Name Ingo Walter

Persönliche Daten Gebutsdatum: 14.09.1976 in Konstanz

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Schulbildung 1983 - 1987 Wiestor-Grundschule in Überlingen

1987 -1996 Gymnasium Überlingen

Abschluss: 25.6.1996 Algemeine Hochschulreife

Studium 04/1997 - 07/2002 Studium der Lebensmittelchemie an der Univerität Karlsruhe

29.10.1999 Vorprüfung der Staatsprüfung für Lebensmittelchemiker

8.11.2001 2. Prüfungsabschnitt der Staatsprüfung für Lebensmittel-

chemiker

01/2002 - 07/2002 Wissenschaftliche Abschlussarbeit am Institut für

Lebensmittelchemie und Toxikologie der Universität Karlsruhe:

Thema: Genotoxizität von methylierten Arsenverbindungen

Abschluss: Diplom-Lebensmittelchemiker

Dissertation 10/2002 Promotion am Institut für Lebensmittelchemie und Toxikologie

der Universität Karlsruhe (Prof. Dr. A. Hartwig).

Thema: Einfluss von Arsenverbindungen auf die DNA-

Reparaturproteine Fpg, XPA und PARP-1

Seit 07/2004 Fortsetzung der Promotion am Institut für

Lebensmitteltechnologie und Lebensmittelchemie der TU Berlin

(Prof. Dr. A. Hartwig).

Danksagung 127

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Andrea Hartwig für die immer freundliche

Betreuung und fachliche Unterstützung mit vielen hilfreichen Diskussionen. Zudem möchte

ich ihr dafür danken mir den Umzug nach Berlin ermöglicht zuhaben, wodurch ich viele neue

Erfahrungen in einer faszinierenden Stadt machen konnte.

Besonders bedanken möchte ich mich auch bei Dr. Tanja Schwerdtle, die mich begonnen

mit der Diplomarbeit auch während der Promotion immer in praktischen und theoretischen

Fragen unterstützt hat.

Auch bei meinem Arbeitskreis sowohl in Karlsruhe, wie auch in Berlin möchte ich mich für

den guten Zusammenhalt während, aber auch außerhalb der Arbeitszeit bedanken.

Besonders erwähnen möchte ich Dr. Christina Thuy und Gunnar Jahnke mit denen ich mich

nach dem Umzug nach Berlin in der neuen Stadt erst zurechtfinden musste. Bei Dr. Holger

Blessing möchte ich mich speziell für die praktische Unterstützung im Labor bedanken. Die

Arbeit von Dr. Christina Thuy zur Genexpression von PARP-1 ist für die Interpretation meiner

Ergebnisse wichtig. Dafür bedanke ich mich herzlich.

Neben dem eigenen Arbeitskreis gilt mein Dank auch den Arbeitskreisen von Prof. Metzler in

Karlsruhe und Prof. Kroh in Berlin für die nette kollegiale Atmosphäre danken.

Ein besonderer Dank gilt zudem Prof. Dr. Alexander Bürkle und seinem Arbeitskreis und

dabei besonders Jörg Fahrer und Dr. Sascha Beneke, die mich bei der Isolierung der PARP-

1 und der Messung der PARP-1 Aktivität sehr gut unterstützt haben.

Zudem möchte ich mich bei Prof. Dr. W. Cullen für die freundliche Überlassung der

dreiwertigen methylierten Arsenmetabilote, bei Dr. S. Boiteux für das Fpg Protein und bei Dr.

André Ecker für das murine XPA bedanken.

Für die finanzielle Unterstützung während der Promotionszeit in Karlsruhe bedanke ich mich

bei der Landesgraduiertenförderung Baden-Würtemberg.

Zudem möchte ich mich bei meinen lieben Eltern dafür bedanken mir den Weg zu dieser

Arbeit ermöglicht zu haben.

Documents

Einfluss von Arsenverbindungen auf die Funktion der DNA