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Einfluss von Cadmiumverbindungen auf
die Struktur und die Funktion
des Tumorsuppressorproteins p53
vorgelegt von
Diplom-Lebensmittelchemikerin
Christina Thuy
aus Speyer
Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin (TU)
zur Erlangung des akademischen Grades
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
-Dr. rer. nat.-
genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dr. rer. nat. L.Kroh
Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. A. Hartwig
Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. M. Metzler
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 23.06.06
Berlin 2006 D 83
Inhalt
I
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung ......................................................................................... 1
2 Einleitung ....................................................................................................... 3
2.1 Thematische Einführung ......................................................................................... 3
2.2 Cadmium................................................................................................................... 4
2.2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften................................................. 4
2.2.2 Vorkommen und Verwendung ....................................................................... 4
2.2.3 Toxikokinetik ................................................................................................. 5
2.2.4 Kanzerogenität................................................................................................ 6 2.2.4.1 Direkte genotoxische Effekte................................................................................. 6 2.2.4.2 Indirekte genotoxische Effekte .............................................................................. 7
2.3 DNA-Reparatursyteme ............................................................................................ 8
2.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur........................................................................... 9
2.3.2 Rolle von p48 in der NER von UV-induzierten DNA-Schäden................... 11
2.4 Das Tumorsuppressorprotein p53 ........................................................................ 13
2.4.1 Eigenschaften des p53 Proteins .................................................................... 13
2.4.2 Regulation und Modulation des p53 Proteins .............................................. 14
2.4.3 Struktur des p53 Proteins.............................................................................. 15
2.4.4 Auswirkungen von Mutationen in p53 ......................................................... 17
2.4.5 Rolle von p53 in der NER ............................................................................ 17
2.4.6 Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle..................................................... 19
3 Fragestellung................................................................................................ 21
4 Material und Methoden .............................................................................. 22
4.1 Zellkultur ................................................................................................................ 22
4.1.1 Zellen............................................................................................................ 22
4.1.2 Koloniebildungsfähigkeit ............................................................................. 22
4.2 Behandlung der Zellen........................................................................................... 23
Inhalt
II
4.2.1 Inkubation..................................................................................................... 23
4.2.2 UVC-Bestrahlung ......................................................................................... 23
4.3 Zellzyklusmessung am Durchflusszytometer....................................................... 24
4.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip..................................................................... 24
4.3.2 Fluoreszenzfärbung ...................................................................................... 25
4.3.3 Zellzyklusmessung ....................................................................................... 26
4.4 Bestimmung des p53 Proteingehaltes ................................................................... 27
4.4.1 Zelllyse ......................................................................................................... 27
4.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford............................................................... 27
4.4.3 Elektrophorese und Westernblot .................................................................. 27
4.4.4 Detektion durch Chemilumineszenz............................................................. 28
4.4.5 Immunpräzipitation zur Konformationsbestimmung von p53 ..................... 28 4.4.5.1 Zelllyse und Vorklärung ...................................................................................... 28 4.4.5.2 Immunopräzipitation............................................................................................ 29
4.5 Bestimmung der relativen Genexpression ........................................................... 30
4.5.1 Probenvorbereitung ...................................................................................... 30 4.5.1.1 RNA-Isolierung.................................................................................................... 30 4.5.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung........................................................ 31 4.5.1.3 RNA Gelelektrophorese....................................................................................... 31 4.5.1.4 cDNA-Synthese ................................................................................................... 31
4.5.2 Quantitative Real Time PCR........................................................................ 32 4.5.2.1 Prinzip .................................................................................................................. 32 4.5.2.2 Geräteaufbau ........................................................................................................ 36 4.5.2.3 Effizienzbestimmung ........................................................................................... 36 4.5.2.4 PCR-Protokoll...................................................................................................... 38 4.5.2.5 Schmelzkurvenanalyse......................................................................................... 39 4.5.2.6 Relative Quantifizierung ...................................................................................... 40
5 Ergebnisse und Diskussion ......................................................................... 42
5.1 Messungen mit der Real Time PCR ..................................................................... 42
5.1.1 Schmelzkurvenanalyse ................................................................................. 42
5.1.2 Effizienzbestimmung.................................................................................... 44
5.2 UVC-Bestrahlung ................................................................................................... 45
5.2.1 Koloniebildung ............................................................................................. 45
5.2.2 Induktion von p53......................................................................................... 46
Inhalt
III
5.2.3 Genexpression von p21, p48 und XPC......................................................... 48 5.2.3.1 p21 ....................................................................................................................... 48 5.2.3.2 p48 ....................................................................................................................... 49 5.2.3.3 XPC...................................................................................................................... 50
5.2.4 Zellzyklusphasenverteilung.......................................................................... 51
5.3 Cadmium................................................................................................................. 53
5.3.1 Koloniebildung ............................................................................................. 53
5.3.2 Induktion von p53......................................................................................... 55
5.3.3 Immunpräzipitation ...................................................................................... 56
5.3.4 Genexpression von p21, p48 und XPC......................................................... 58 5.3.4.1 p21 ....................................................................................................................... 58 5.3.4.2 p48 ....................................................................................................................... 60 5.3.4.3 XPC...................................................................................................................... 61
5.4 Kombinationsuntersuchungen .............................................................................. 63
5.4.1 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte Zytotoxizität..................... 63
5.4.2 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte p53 Induktion................... 64
5.4.3 Genexpression von p21, p48 und XPC......................................................... 65 5.4.3.1 p21 ....................................................................................................................... 65 5.4.3.2 p48 ....................................................................................................................... 67 5.4.3.3 XPC...................................................................................................................... 68
5.4.4 Zellzyklusphasenverteilung.......................................................................... 69
6 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick .......................................... 71
7 Literatur ....................................................................................................... 80
A Anhang.......................................................................................................... 89
A.1 Abkürzungsverzeichnis.......................................................................................... 89
A.2 Liste der verwendeten Chemikalien ..................................................................... 91
A.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchs-materialen .............................. 93
A.4 Verwendete Lösungen und Puffer ........................................................................ 95
A.4.1 Zellkultur ...................................................................................................... 95
A.4.2 Präparation der Proteinextrakte, Proteinbestimmung, Elektrophorese und Westernblot................................................................................................... 96
Inhalt
IV
A.4.3 RNA-Isolierung und Elektrophorese............................................................ 98
A.5 Primersequenzen .................................................................................................... 99
A.6 Darstellung eines RNA-Gels nach der RNA-Isolation ........................................ 99
A.7 Histogramme der Zellzyklusanalyse................................................................... 100
A.8 Dosis-Abstands-Kurve ......................................................................................... 100
A.9 cDNA-Verdünnungreihen ................................................................................... 101
Publikationsliste............................................................................................... 103
Lebenslauf ........................................................................................................ 107
Danksagung...................................................................................................... 108
Zusammenfassung
1
1 Zusammenfassung
Cadmiumverbindungen sind sowohl beim Mensch als auch im Tierversuch kanzerogen und
tragen aufgrund ihrer weiten Verbreitung in der Umwelt und am Arbeitsplatz erheblich zum
Krebsrisiko durch Schadstoffe bei. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nach
wie vor ungeklärt, zumal ihre Mutagenität nur schwach ausgeprägt ist. Diskutiert werden u.a.
die Induktion von oxidativem Stress sowie der Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse der
Zelle.
Bei der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität spielt das Tumorsuppressorprotein p53
eine große Rolle. Durch seine Funktion als Transkriptionsfaktor reguliert es die Expression
einer Vielzahl von Genen, die in verschiedenen Prozessen zum Schutz der Zelle involviert
sind, wie z.B. der Apoptose, der Zellzykluskontrolle und der DNA-Reparatur. Für diese
Eigenschaft ist eine gefaltete Proteindomäne essenziell, die durch die Koordination von einem
Zink-Ion durch drei Cystein- und einem Histidinrest stabilisiert wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von löslichem CdCl2 und partikulärem CdO
auf die Struktur und damit auch auf die Funktion des Tumorsuppressorproteins p53
untersucht. Beide Verbindungen verursachten eine Umfaltung der Wildtyp-Form des
Tumorsuppressorproteins p53 in die ungefaltete „mutante“ Form. Dies hatte auch eine
Hemmung von nachgeschalteten Signalwegen wie die Transkription der DNA-Reparaturgene
p48 und XPC zur Folge. Um den Einfluss der Verbindungen auf die p53-Stabilisierung
infolge der Wirkung DNA-schädigender Agenzien zu untersuchen, wurden Untersuchungen
in Kombination mit UVC-Strahlung durchgeführt. Während UVC-Strahlung zu einer
Induktion der Wildtyp-Form führte, zeigten beide Cadmiumverbindungen in Kombinations-
versuchen eine Hemmung der UVC-induzierten p53-Stabilisierung, wenn auch bei CdCl2
stärker ausgeprägt als bei CdO. Gleichzeitig resultierte eine Co-Inkubation in einer
verstärkten Bildung der „mutanten“ Konformation. Im Einklang damit zeigten beide
Verbindungen eine Hemmung der UVC-induzierten Genexpression der Zielgene p48 und
XPC. Da diese Proteine eine große Rolle bei der Reparatur von sperrigen DNA-Addukten,
wie sie z.B. durch UV-Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK)
entstehen, spielen, könnte eine Beeinträchtigung der Expression in einer Beeinflussung von
DNA-Reparaturprozessen resultieren.
Zusammenfassung
2
Um zu untersuchen, ob Cadmiumverbindungen auch andere Kontrollmechanismen stören,
wurde der Einfluss auf die Zellzykluskontrolle in Kombination mit UVC-Strahlung
untersucht. Während UVC-Strahlung 10 Stunden nach der Bestrahlung mit 5 J/m2 zu einem
S-Phasenarrest führte, zeigte eine Vorinkubation mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen
und anschließender Bestrahlung eine Zellzyklusphasenverteilung, die nahezu der von
unbestrahlten Zellen entspricht. Dagegen resultierte eine alleinige Behandlung mit den
jeweiligen Cadmiumverbindungen in einem leichten G1-Phasenarrest. Die Genexpression von
p21, einem Protein, dem sowohl im G1-Phasenarrest als auch im S-Phasenarrest eine Rolle
zugesprochen wird, wurde sowohl durch die jeweiligen Cadmiumverbindungen als auch
durch UVC-Strahlung erhöht, während die UVC-induzierte p21-Expression infolge einer Co-
Inkubation mit Cadmium und UVC-Strahlung inhibiert wurde.
Da p53 als Transkriptionsfaktor eine Vielzahl von Genen reguliert, die in verschiedenen
Prozessen zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität eine Rolle spielen, könnte eine
Beeinflussung seiner Struktur und damit auch seiner Funktion einen Mechanismus darstellen,
der zur krebserzeugenden Wirkung von Cadmiumverbindungen beiträgt
Einleitung
3
2 Einleitung
2.1 Thematische Einführung
Die kanzerogene Eigenschaft von Cadmiumverbindungen ist bekannt, dennoch sind die zu
Grunde liegenden Mechanismen noch weitestgehend unklar, zumal das mutagene Potenzial
nur schwach ausgeprägt ist.
Vor allem in der Metallindustrie sind Arbeiter chronisch gegenüber hohen Dosen partikulärer
und löslicher Cadmiumverbindungen exponiert. Allerdings haben Cadmiumverbindungen
aufgrund ihrer Persistenz in biologischen Systemen, sowie ihrer Akkumulation in
verschiedenen Geweben des Menschen auch für beruflich nicht exponierte Personen eine
große Bedeutung.
Für das in der vorliegenden Arbeit untersuchte Metall Cadmium konnte in früheren Studien
gezeigt werden, dass es die genotoxische Wirkung von DNA-schädigenden Agenzien erhöht.
So verstärkt Cadmium(II) die durch B[a]P (Benzo[a]pyren) verursachte Zelltransformation
syrischer Hamsterembryonalzellen (Rivedal und Sanner, 1981) und erhöht in V79 Zellen die
durch UVC-Strahlung induzierte Mutationsrate (Hartwig und Beyersmann, 1989). Es
scheinen sich also vielmehr indirekte genotoxische Eigenschaften hinter dem kanzerogenen
Potenzial zu verbergen als eine direkte DNA-Schädigung, in dem es z.B. in zelluläre
Reparaturmechanismen eingreift (Hartwig et al., 1998).
Zellen unterliegen einer permanenten Schädigung durch endogene und exogene
Einwirkungen. Zur Beseitigung von auftretenden DNA-Schäden, bevor sie durch unkorrekte
Replikation und als Folge davon zur Manifestierung von Mutationen führen, hat die Zelle
verschiedene Mechanismen entwickelt. Die wichtigsten Reparaturprozesse sind die NER
(Nukleotidexzisionsreparatur), die BER (Basenexzisionsreparatur) und die MMR
(Mismatchreparatur). Die NER beseitigt helixverzerrende DNA-Addukte, die z.B. durch UV-
Strahlung oder polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) gebildet werden,
während über die BER Basenmodifikationen wie sie z.B. durch reaktive Sauerstoffspezies
entstehen, repariert werden. Die MMR beseitigt Basenfehlpaarungen, die als Folge von
Replikationsfehlern auftreten. Eine Reparatur der DNA-Schäden ist häufig mit einer
Arretierung des Zellzyklus verbunden, um die notwenige Zeit zur Reparatur der Schäden zu
gewährleisten. Ist das Ausmaß der Schädigung zu groß, wird der programmierte Zelltod, die
Einleitung
4
Apoptose, eingeleitet. Ein zentrales Protein, welches diese drei Mechanismen koordiniert, ist
das Tumorsuppressorprotein p53. Das Protein p53 besitzt ein Zink-bindendes Proteinmotiv, in
dem ein Zink-Ion von drei Cysteinresten und einem Histidinrest koordiniert wird. Ergebnisse
der letzten Jahre haben gezeigt, dass „Zinkfingerstrukturen“ empfindliche Angriffspunkte für
toxische Metallverbindungen sind. Die Sequenzierung des menschlichen Genoms hat
inzwischen ergeben, dass ca. 3 % aller Gene für Proteine mit Zinkfingerstrukturen kodieren
(Maret, 2003). Das Tumorsuppressorprotein p53 wird zwar nicht zu den Zinkfingerproteinen
gezählt, da es keine fingerähnliche Struktur ausbildet (Hainaut und Mann, 2001), könnte aber
dennoch durch Wechselwirkung von Metall-Ionen mit der Zink-bindenden Domäne in seiner
Funktion beeinträchtigt werden.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zum Einfluss sowohl partikulärer
als auch löslicher Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die damit verbundene Funktion
des Tumorsuppressorproteins p53. Damit soll ein möglicher Einfluss auf DNA-
Reparaturprozesse sowie auf die Zellzykluskontrolle aufgeklärt werden.
2.2 Cadmium
2.2.1 Chemische und physikalische Eigenschaften
Das Element Cadmium ist ein Metall der 2. Nebengruppe des Periodensystems mit einem
Atomgewicht von 112,41 und der Ordnungszahl 48. Es sind acht natürlich vorkommende
Isoptope bekannt (114Cd, 112Cd, 111Cd, 110Cd, 113Cd, 116Cd, 106Cd und 108Cd). Es handelt sich
um ein silberweißes, glänzendes, sehr weiches und plastisch verformbares Metall. In seinen
Verbindungen hat es die Oxidationsstufe +2. Lösliche Verbindungen sind z.B.
Cadmiumchlorid, Cadmiumsulfat und Cadmiumacetat, wasserunlösliche z.B. Cadmiumsulfid,
Cadmiumcarbonat und Cadmiumoxid (Riedel, 1999).
2.2.2 Vorkommen und Verwendung
Cadmium wurde 1817 von F. Strohmeyer als Metall in Zinkcarbonat entdeckt (griech.:
cadmeia = Zinkerz (Galmei)). In der Erdrinde ist das Metall nur in sehr geringen Mengen
vertreten. Reine Cadmiumminerale sind der Greenockit (hexagonales CdS), Hawleyit
(kubisches CdS), Ovatit (CdCO3), Monteponit (CdO) und der Cadmoselit (CdSe). Cadmium
Einleitung
5
ist in Zinkmineralen wie der Zinkblende zu 0,1 bis 0,5 % und im Zinkspat bis zu 5 %
enthalten (Riedel, 1999).
Das Metall gelangt über Emission aus Industrieanlagen, vor allem Zinkhütten, Eisen- und
Stahlwerken, Müllverbrennungsanlagen und Braunkohlekraftwerken sowie durch
Verbrennung fossiler Brennstoffe und Einsatz von Phosphatdüngemitteln in der
Landwirtschaft in die Umwelt. Industriell wird Cadmium zur Herstellung von Nickel-
Cadmium-Batterien eingesetzt. Des Weiteren findet es für Korrosionsschutzüberzüge von
Metallen sowie als Stabilisator in der Kunststoffindustrie Verwendung (zusammengefasst in
Stöppler, 1991; Pinot et al., 2000).
2.2.3 Toxikokinetik
Cadmium ist ein toxisches, biologisch nicht essenzielles Schwermetall. Für einen beruflich
nicht exponierten Menschen ist die Hauptaufnahmequelle die Nahrung, hier vorwiegend
pflanzliche Lebensmittel und Innereien, einen geringen Anteil liefert das Trinkwasser (10 %).
Die durchschnittliche tägliche Aufnahme über Nahrung und Trinkwasser beträgt zwischen 10
und 30 µg, während die inhalative Aufnahme mit 0,02 µg bei Gehalten der Außenluft von 1
bis 5 ng/m3 nur unwesentlich zur Gesamtbelastung beiträgt. Einen großen Beitrag zur
täglichen Cadmiumaufnahme leistet allerdings Tabak, so dass Raucher erhöhte
Cadmiumgehalte im Körper aufweisen. Eine Zigarette enthält etwa 1-2 µg Cadmium. Davon
werden etwa 10 % inhaliert und hiervon wiederum 50 % resorbiert, so dass das Rauchen von
einer Schachtel Zigaretten pro Tag in einer zusätzlichen Aufnahme von etwa 1-2 µg resultiert.
Somit ist der Eintrag höher als über die Nahrung, da aus dem Gastrointestinaltrakt nur etwa
5 % des aufgenommenen Cadmiums resorbiert werden. Nach Aufnahme in den Körper
akkumuliert es an Metallothionein gebunden, vor allem in der Niere und der Leber und weist
Halbwertszeiten von bis zu 30 Jahren auf. Die totale Körperbelastung eines beruflich nicht
exponierten 50 Jahre alten Menschen beträgt etwa 15 mg (Oberdörster, 1989; Stöppler, 1991).
Die einzelnen Beiträge der Organe sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Einleitung
6
Tabelle 1: Cadmiumgehalte im Körper (zusammengefasst in IARC, 1993, 1997).
Gewebe bzw. Körperflüssigkeiten Gehalt
Niere 15-50 mg/kg Nassgewicht
Leber 1-3 mg/kg Nassgewicht
Lunge ca. 1,3 mg/kg Trockengewicht
Urin 0,4 - 4 µg/l
Blut 0,2 - 4 µg/l
2.2.4 Kanzerogenität
Cadmium wurde von der IARC (International Agency for Research on Cancer) als
kanzerogen für den Menschen eingestuft (IARC, 1993, 1997). Epidemiologische Studien
zeigen eine deutliche Korrelation zwischen Cadmiumexposition und einem erhöhten
Auftreten von Tumoren vor allem der Lunge, aber auch der Prostata, der Niere und des
Magens. Auch im Versuchstier zeigt sich die kanzerogene Wirkung aller untersuchten
Cadmiumverbindungen (CdCl2, CdSO4, CdS, CdO). Das kanzerogene Potenzial kann
allerdings nur teilweise durch seine direkte genotoxische Eigenschaft erklärt werden, da es
sich als nicht mutagen in bakteriellen Testsystemen und als nur schwach mutagen in
verhältnismäßig hohen Konzentrationen in Säugerzellen erwiesen hat (Hartwig et al., 1998).
2.2.4.1 Direkte genotoxische Effekte
Cadmium induziert Chromosomenabberationen (Ochi und Ohsawa, 1985) und DNA-
Strangbrüche (Ochi und Ohsawa, 1983; Snyder, 1988; Dally und Hartwig, 1997) in
kultivierten Zellen. Als ein möglicher Mechanismus für die genotoxische Wirkung wird die
Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) aufgrund einer Störung der zellulären
Verteidigungsmechanismen diskutiert. Eine vermehrte Bildung von ROS wurde in
verschiedenen Zelllinien gezeigt (Yang et al., 1997; Szuster-Ciesielska et al., 2000; Filipic
und Hei, 2004). Ochi et al. (1987) untersuchten in V79-Zellen den Einfluss von CdCl2 auf die
Aktivität von Enzymen, die an der Metabolisierung von ROS direkt oder indirekt beteiligt
sind, wie z.B. Superoxiddismutase, Katalase, GSH-Peroxidase und GSSG-Reduktase
(Glutathiondisulfid-Reduktase). Die Funktionsweise dieser Enzyme ist in Abbildung 1
dargestellt. Es konnte allerdings keine Beeinflussung der untersuchten Enzymaktivitäten
Einleitung
7
festgestellt werden, wohingegen der Gehalt an GSH signifikant abnahm. Als Gründe dafür
wurden verschiedene Punkte diskutiert. Einerseits könnte Cadmium in die Synthese des GSH
eingreifen, indem wichtige Enzyme für dessen Synthese (γ-Glutamyl-Cystein-Synthase,
Glutathionsynthase) beeinflusst werden. Andererseits könnte durch Induktion von Cystein-
reichem Metallothionein, welches durch Schwermetalle wie Cadmium induziert wird, die
Verfügbarkeit von Cystein in der Zelle deutlich gesenkt werden, wodurch weniger GSH
synthetisiert werden kann. Einen Zusammenhang zwischen GSH-Gehalt und
Cadmiumzytotoxizität zeigten auch die Ergebnisse von Kang et al. (1989) sowie von Kang
und Enger (1990), bei denen von einer Korrelation zwischen wachstumsbedingtem GSH-
Gehalt bzw. GSH-Depletion durch Hemmung der γ-Glutamyl-Cystein-Synthase mittels
Buthionin Sulfoximin (BSO) und Cadmiumzytotoxizität berichtet wurde. Des Weiteren zeigte
eine Studie an einer cadmiumresistenten A549 Subpopulation, dass die im Gegensatz zur
sensitiven A549 Subpopulation erhöhte Resistenz auf einen etwa 2-fach höheren GSH-Gehalt
zurückzuführen ist (Hatcher et al., 1995).
Abbildung 1: Metabolismus von ROS (Marquardt und Schäfer, 1997).
2.2.4.2 Indirekte genotoxische Effekte
Größere Relevanz wird allerdings den indirekten genotoxischen Effekten zugeschrieben, da
Cadmium die Mutagenität von anderen DNA-schädigenden Agenzien verstärkt. So
beobachteten Rivedal und Sanner (1981) eine Komutagenität von Cadmium(II) mit B[a]P in
syrischen Hamsterembryonalzellen und Hartwig und Beyersmann (1989) berichteten von
einer Erhöhung der, durch UVC-Strahlung induzierten Mutationsrate in V79 Zellen.
Nocentini (1987) zeigte bereits sehr früh eine Beeinflussung der DNA-Replikation und
Reparatur UV-geschädigter DNA in menschlichen Zellen. Snyder et al. (1989) sowie
Hartmann und Hartwig (1998) zeigten eine Hemmung der Schadenserkennung nach UV-
Einleitung
8
Bestrahlung in HeLa S3 Zellen. Dieser Befund sowie die Ergebnisse von Fatur et al. (2003)
die eine Hemmung der Exzision UV-induzierter CPDs in chinesischen Hamsterzellen zeigten,
weisen darauf hin, dass die komutagene Wirkung von Cadmium auf eine Störung zellulärer
Reparaturmechanismen zurückzuführen ist
Auf molekularer Ebene zeigten Asmuss et al. (2000), dass bei Verwendung von gereinigtem
XPA, einem Protein, das an der NER beteiligt ist, dessen Bindung an ein UVC-geschädigtes
Oligonukleotid durch CdCl2 vollständig gehemmt wird. Dieser Effekt wird durch eine
equimolare Konzentration an Zink aufgehoben, was auf eine Verdrängung von Zink in der
DNA-bindenden Zinkfingerdomäne des XPA-Proteins schließen lässt. Untersuchungen an
einem synthetisierten Peptid, das die Zinkfingerstruktur des humanen XPA-Proteins
repräsentiert, konnten eine quantitative Substitution von Zn(II) durch Cd(II) zeigen. Darüber
hinaus erwiesen sich die Cadmium-gebundenen Thiole durch die hohe Bindungskonstante
von Cd(II) als oxidationsunempfindlich gegen H2O2 (Kopera et al., 2004).
Eine Hemmung der Reparatur von DNA-Schäden hat zur Folge, dass die Schäden infolge
stattfindender DNA-Replikation zu Mutationen führen können. Besonders kritisch sind
Mutationen in Onkogenen, die zu einem unkontrollierten Wachstum der Zelle führen können,
sowie Mutationen in Tumorsuppressorgenen, deren Genprodukte u.a. an der
Zellzykluskontrolle beteiligt sind.
2.3 DNA-Reparatursyteme
Die DNA unterliegt einer permanenten Schädigung sowohl durch endogene
Stoffwechselprozesse und durch exogene Quellen wie UV-Strahlung, ionisierende Strahlung
als auch durch eine Reihe von chemischen Kanzerogenen. Das entstehende Schadensspektrum
reicht von oxidativen Basenschäden bis zu DNA-Einzel- und DNA-Doppelstrangbrüchen,
DNA-Alkylierungsschäden und DNA-Addukten.
Um die Integrität des Genoms zu gewährleisten, hat die Zelle verschiedene DNA-
Reparaturmechanismen entwickelt, bevor die Schäden infolge einer fehlerhaften Replikation
zu Mutationen führen können. Die so genannte MMR (Mismatchreparatur) ist für die
Reparatur von Basenfehlpaarungen, wie sie durch Replikationsfehler entstehen,
verantwortlich. Für oxidative Basenmodifikationen, die durch reaktive Sauerstoffspezies
gebildet werden, ist die BER (Basenexzisionsreparatur) spezifisch. Für Umweltmutagene ist
das bedeutendste Reparatursystem die NER (Nukleotidexzisionsreparatur). Sie erkennt und
Einleitung
9
repariert großräumige DNA-Addukte, die zu einer Verzerrung der Helixstruktur der DNA
führen. Hierzu zählen z.B. UV-induzierte Schäden, sowie Benzo[a]pyren- und Aflatoxin-
induzierte DNA-Addukte.
2.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur
Da in der vorliegenden Arbeit als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung eingesetzt
wurde, wird im Folgenden näher auf den Mechanismus der NER eingegangen.
Es kann grundsätzlich zwischen sechs Schritten unterschieden werden:
• Schadenserkennung
• Entwindung der Doppelhelix am DNA-Schaden
• Einzelstrang-Inzision an beiden Seiten des Schadens
• Exzision des Schadens in Form eines 24 bis 30 Nukleotide langen Oligonukleotids
• DNA-Neusynthese des zuvor ausgeschnittenen Oligonukleotids
• Ligation
Für die NER ist ein koordiniertes Zusammenwirken von mindestens 30 verschiedenen
Proteinen erforderlich. Mutationen in NER-Genen verursachen die seltene Erbkrankheit
Xeroderma pigmentosum, bei der die Patienten extrem lichtempfindlich und anfällig für die
Entstehung von Hautkrebs sind. Es existieren acht Komplementationsgruppen (XPA bis XPG
und XPV), die auf jeweils verschiedene Gendefekte von an der NER beteiligten Proteinen
zurückzuführen sind und letztendlich in allen Fällen (mit Ausnahme von XPV) zu einer
Beeinträchtigung der Inzision führen.
Je nachdem in welchem Bereich der DNA sich der Schaden ereignet, kann die NER in zwei
Untergruppen eingeteilt werden. Schäden, die sich im transkribierten Strang aktiv
transkribierter Gene ereignen, werden über die TCR (transkriptionsgekoppelte Reparatur)
repariert, während Schäden im restlichen Genom über die GGR (globale genomische
Reparatur) beseitigt werden. Diese beiden Prozesse unterscheiden sich nur im ersten Schritt
der NER. Nach der Schadenserkennung verlaufen die beiden Wege analog. In der TCR
scheint die RNA Polymerase II das eigentliche Schadenserkennnungssignal für die
Rekrutierung der NER-Proteine darzustellen. Nach erfolgter Schadenserkennung kommt es in
Folge einer Konformationsänderung der DNA zur Anlagerung von NER-Proteinen. In der
GGR ist ein Protein-Komplex bestehend aus XPC und hHR23B für die Schadenserkennung
Einleitung
10
zuständig. Volker et al. (2001) konnten durch die Anwendung einer lokalen UV-Bestrahlung
und dem Einsatz von fluoreszenzmarkierten Antikörpern die Reihenfolge der Anlagerung der
NER-Proteine zeigen (Abbildung 2). Nach Anlagerung des XPC-Genproduktes im Komplex
mit hHR23B bindet der Transkriptionsfaktor TFIIH. Dieser besteht aus mehreren
Untereinheiten und beinhaltet als größte Untereinheiten die beiden Helikasen XPB und XPD
(Egly, 2001). Im Anschluss an die lokale Entwindung der DNA kommt es zur Anlagerung der
3´-Nuklease XPG, von XPA, RPA und letztendlich zur Rekrutierung des 5´-Nuklease-
Komplexes bestehend aus ERCC1 und XPF. Während die Anlagerung der Helikase XPG
unabhängig von XPA erfolgt, kann der Komplex aus ERCC1 und XPF erst nach erfolgter
Bindung des XPA erfolgen. Dennoch ist die Aktivität des Enzyms XPG abhängig von XPA.
Abbildung 2: Modell für den Aufbau des menschlichen NER-Exzisions-Komplexes. (Volker et al., 2001).
Nach erfolgter Exzision des Schadens in Form eines 24 bis 30 Nukleotide langen
Oligonukleotids wird die entstandene Lücke durch eine DNA-Neusynthese durch die
Polymerasen δ und ε mit Hilfe von PCNA, RPA und RFC aufgefüllt. Die Ligation durch die
Ligase I schließt letztendlich den Reparaturprozess ab (zusammengefasst in Friedberg, 2001).
TFIIH
XPG XPA-RPA
ERCC1-XPF
XPC-hHR23B
Einleitung
11
2.3.2 Rolle von p48 in der NER von UV-induzierten DNA-Schäden
UV-Strahlung kann in drei Wellenlängenbereiche eingeteilt werden. UVA umfasst die
Wellenlängen von 400 bis 320 nm, UVB die von 320 bis 290 nm und UVC schließt den
Bereich zwischen 290 und 100 nm ein. Als umweltrelevante, DNA-schädigende UV-
Strahlung spielen nur UVA und UVB eine Rolle, da Wellenlängen kleiner 320 nm fast
vollständig von der Ozonschicht absorbiert werden. Dabei handelt es sich bei den durch
UVA-Strahlung induzierten Schäden hautsächlich um oxidative Basenschäden, während
UVB-Strahlung, analog zu UVC-Strahlung, DNA-Photoprodukte induziert. Da allerdings das
Absorptionsmaximum der Basen innerhalb der DNA bei 260 nm liegt und somit durch
Bestrahlung mit UVC eine effiziente photochemische Reaktion stattfindet, wird in den
meisten Studien UVC-Strahlung angewendet. UVB- und UVC-Strahlung führen
hauptsächlich durch eine [2+2]-Cycloaddition benachbarter Pyrimidine zur Bildung von zwei
Produkten, zum einen von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren (CPD), die mit ca. 75 % den
Hauptteil der Photoprodukte einnehmen und zum anderen von (6-4)-Photoprodukten
(Abbildung 3) (van Steeg und Kraemer, 1999).
Abbildung 3: Entstehung von DNA-Schäden nach UVC-Bestrahlung.
Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer
(6-4)-Photoprodukt
UVC-Strahlung
Einleitung
12
Nach heutigem Kenntnisstand wird zusätzlich zum XPC einem weiteren Protein, dem DDB-
Komplex bestehend aus dem XPE-Genprodukt p48 (DDB2) und p127 (DDB1) eine Rolle im
ersten Schritt der Schadenserkennung zugeschrieben. Dieser Komplex scheint vor allem bei
der Schadenserkennung von CPDs von Bedeutung zu sein, indem er die Anlagerung von XPC
an CPDs vermittelt (Fitch et al., 2003b; Wang et al., 2004). XPC erkennt eine spezifische
DNA-Struktur, die aufgrund einer Störung der Basenpaarung infolge des DNA-Adduktes
einzelsträngige Bereiche innerhalb der DNA-Doppelhelix beinhaltet. (6-4)-Photoprodukte
führen zu einer stärkeren Helixverzerrung als CPDs und können somit vermutlich direkt
durch XPC erkannt werden. CPDs werden nicht komplett von XPC erkannt und benötigen
zunächst die Bindung des DDB-Komplexes (Sugasawa et al., 2002). Ein weiterer Grund für
die unterschiedliche Schadenserkennung der beiden Photoprodukte besteht in der Tatsache,
dass sich (6-4)-Photoprodukte weniger häufig in Nukleosomen gebundener DNA ereignen als
CPDs (Fitch et al., 2003a; Thoma, 1999). Für die Reparatur im Kontext mit Chromatin ist
zunächst ein DNA-Remodeling von Nöten, um die Zugänglichkeit der DNA für die NER-
Proteine zu gewährleisten. Hwang et al. (1998) erkannten ein Tryptophan-Asparaginsäure-
Motiv (WD-Motiv) im p48 Protein, das eine Ähnlichkeit zu den WD-Motiven in Proteinen
besitzt, die in der Re-Organisation von Chromatin involviert sind. So z.B. in einer
Untereinheit des „chromatin assembly factors“ CAF-1, dessen Bezug zur Reparatur von UV-
induzierten Schäden bereits von Gaillard et al. (1996) gezeigt wurde. Des Weiteren konnte
eine Interaktion zwischen DDB und der CBP/p300 Histon-Acetyl-Transferase gezeigt
werden, die als Folge einer Acetylierung von Histonen zur Relaxation des Chromatins führt
(Datta et al., 2001; Moser et al., 2005; Rapic-Otrin et al., 2002). Im Anschluss an die
Anlagerung des DDB-Komplexes an die DNA kommt es zu einer Ubiquitinierung von DDB2.
Dies hat den proteasomalen Abbau von DDB2 zur Folge, wodurch dann XPC an das DNA-
Addukt binden kann (Chen et al., 2001; Matsuda et al., 2005; Rapic-Otrin et al., 2002;
Sugasawa et al., 2005).
Abbildung 4: Model für die Schadenserkennung von UV-induzierten Photoprodukten (Adimoolam und Ford, 2003; Ford, 2005).
6-4PP CPD
DDB2
DDB1
XPC hHR23
Ubiquitin DDB2
XPC hHR23
Einleitung
13
2.4 Das Tumorsuppressorprotein p53
2.4.1 Eigenschaften des p53 Proteins
Bei der Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität hat das Tumorsuppressorprotein p53 eine
große Bedeutung. Seine tumorsuppressive Eigenschaft zeigt sich schon allein durch die
Tatsache, dass das Gen, welches für p53 kodiert, in ca. 50 % aller menschlichen Tumoren
mutiert ist. Die meisten Mutationen ereignen sich in Bereichen des Gens, die für die DNA-
Bindungsdomäne des Proteins kodieren. Dabei handelt es sich oftmals um Punktmutationen
(Martin et al., 2002). p53 ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 53 kDa. Seine
Sequenz lässt sich in eine N-terminale Transaktivierungsdomäne, eine DNA-
Bindungsdomäne und eine C-terminale regulatorische Region einteilen. Die C-terminale
Domäne beinhaltet drei funktionelle Motive, zum einen drei Kernlokalisierungssignale und
ein Kernexportsignale, die die subzelluläre Lokalisation regulieren sowie eine
Oligomerisierungsdomäne (Abbildung 5) (Stewart und Pietenpol, 2001; Michael und Oren,
2003).
Abbildung 5: verschiedene Domänen des p53 Proteins (Michael und Oren, 2003).
NLS: Kernlokalisierungssignal; NES: Kernexportsignal. Die Eigenschaft, als Tumorsuppressorprotein zu fungieren, lässt sich auf seine Funktion als
Transkriptionsfaktor zurückführen. Wie Cho et al. (1994) sowie Clore et al. (1994) zeigten,
bindet p53 in seiner aktiven Form als Tetramer bestehend aus vier identischen Untereinheiten
an DNA, die vier Wiederholungen der Pentamersequenz 5´-Pu-Pu-Pu-C-A/T-3´ enthält und
steuert so die Expression einer Vielzahl von Genen. Reguliert werden u.a. Gene, die in die
Zellzykluskontrolle, in die Apoptose aber auch direkt in die DNA-Reparatur involviert sind.
Einleitung
14
2.4.2 Regulation und Modulation des p53 Proteins
In normalen ungestressten Zellen unterliegt das Protein einem ständigen Ubiquitin-
vermittelten mdm2 abhängigen Abbau und wird somit auf einem niedrigen Level in der Zelle
gehalten (Halbwertszeit von 15 bis 20 Minuten). Das Protein mdm2 bindet hierzu an die
Transaktivierungsdomäne im N-teminalen Bereich des p53 Proteins (siehe Abbildung 5) und
überträgt dann als E3-Ligase Ubiquitinreste auf p53, wodurch der Abbau durch das 26S-
Proteasom eingeleitet wird (Abbildung 6).
Abbildung 6: Ubiquitin-vermittelter Proteinabbau (Ciechanover, 1998).
(A) Konjugation von Ubiquitin an das zu degradierende Protein. (B) Abbau des Proteins durch das 26S-Proteasom. (1) Aktivierung von Ubiquitin durch E1. (2) Transfer des aktivierten Ubiquitins von E1 auf ein Mitglied der E2-Familie. (3) Transfer des aktivierten Ubiquitins von E2 auf eine substratspezifische E3-Ligase. (4) Ausbildung einer mit dem Substrat kovalent verknüpften Polyubiquitin-Seitenkette. (5) Bindung des polyubiquitinierten Substrats an den Ubiquitin-Rezeptor in der 19S-Unterheinheit des 26S-Proteasoms und proteolytische Spaltung des Substrats zu kurzen Peptiden durch die 20S-Untereinheit. (6) Recycling von Ubiquitin durch Isopeptidasen.
A B
Einleitung
15
Infolge von DNA-Schäden kommt es zu verschiedenen Modifikationen, wie Acetylierung und
Phosphorylierung am Protein. Phosphorylierungen haben zur Folge, dass die Bindung von
mdm2 verhindert wird und somit kein Abbau des Proteins mehr stattfinden kann. Dies führt
somit zu seiner Stabilisierung und Erhöhung der Halbwertszeit. Acetylierungen erhöhen die
Sequenz-spezifische DNA-Bindung an so genannte p53 responsive Elemente in der
Promotorregion bzw. in intronischen Segmenten seiner Zielgene und führen somit zu deren
Transkription (zusammengefasst in Hainaut und Hollstein, 2000; Stewart und Pietenpol,
2001).
2.4.3 Struktur des p53 Proteins
Die Bindung von p53 an spezifische DNA Sequenzen wird durch seine
konformationsspezifische Struktur in der zentralen Bindungsdomäne (Aminosäuren 102-292)
vermittelt. Die Struktur besitzt ein Sandwich von 2 ß-Faltblättern, bestehend aus 4 bzw. 5 ß-
Strängen, des Weiteren ein Loop-β-Faltbatt-Helix-Motiv, das mit der großen Furche der DNA
interagiert sowie ein Loop-Helix-Motiv (L2/L3), das mit der kleinen Furche der DNA
interagiert. Das Motiv L2/L3 wird durch die Koordinierung eines Zink-Ions mittels dreier
Cysteine (Cys176, Cys238, Cys242) und eines Histidins (His179) stabilisiert (Abbildung 7
und Abbildung 8).
Im Gegensatz zu so genannten Zinkfingerproteinen, in denen sich durch die Koordination
eines Zink-Ions eine fingerähnliche Struktur ausbildet, die sich in die große Furche der DNA
einlagert, ist im p53 die Zink-bindende Domäne nicht direkt an der DNA-Bindung beteiligt.
Der Hauptkontakt zwischen DNA und p53 wird stattdessen über Arg248 innerhalb des L3-
Loop vermittelt und erfolgt über die kleine Furche der DNA. Das Vorhandensein des Zink-
Ions ist aber dennoch essenziell für seine Struktur und Funktion als Transkriptionsfaktor. Eine
Behandlung mit Metallchelatoren führt zu einer Herauslösung des Zink-Ions aus der Struktur,
wodurch es durch Auffaltung des Proteins zum Verlust der Tertiärstruktur und damit auch zu
einem Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit kommt (Hainaut und Milner, 1993b; Verhaegh et
al., 1998; Meplan et al., 2000). Ebenso führte eine Oxidation der Cysteine mittels Diamid zu
einer Konformationsänderung und damit zu einer Hemmung der DNA-Bindung (Hainaut und
Milner, 1993a). Darüber hinaus resultierte eine Substitution der Zink-bindenden Cysteine
gegen Lysin in einer verminderten DNA-Bindung von p53 (Rainwater et al., 1995).
Einleitung
16
Abbildung 7: Topologisches Diagramm der Sekundärstruktur von p53 (Cho et al., 1994).
Abbildung 8: DNA-Bindungsdomäne von p53 (modifiziert nach Wang et al., 2001).
Zink-Ion
Einleitung
17
2.4.4 Auswirkungen von Mutationen in p53
Als Folge von Mutationen im Gen, das für das p53 Protein codiert, kann es zu einem
Funktionsverlust als Tumorsuppressorprotein kommen. Die meisten Mutationen führen zu
einer Beeinträchtigung der sequenzspezifischen Transaktivierungs-Aktivität, wodurch die
Expression von Genen, die z.B. in der Zellzykluskontrolle und der Apoptose involviert sind,
beeinträchtigt wird. Dennoch zeigten verschiedene Studien, dass bestimmte Arten von
Mutationen, so genannte gain-of-function-Mutante zu einem Funktionsgewinn des Proteins
führen, die dem Protein eine onkogene Eigenschaft verleihen. Eine der zusätzlichen
Funktionen ist die Hochregulierung von Genen, die für die Steuerung der Zellproliferation
zuständig sind (z.B. c-myc, c-fos, PCNA, EGFR). Ein weiterer Mechanismus, durch den
Mutationen in p53 heterozygoten Zellen zur Tumorprogression beitragen könnten, ist die
dominant-negative Inhibierung der Wildtyp-Form durch mutantes p53. Die infolge einer
Aktivierung von wildtyp p53 erfolgten Tetramerisierung und somit die sequenzspezifische
DNA-Bindung kann durch die Bildung von Hetero-Oligomeren aus Wildtyp- und „mutanter“
Form inhibiert werden (Chan et al., 2004; Sigal und Rotter, 2000; van Oijen und Slootweg,
2000).
2.4.5 Rolle von p53 in der NER
Erste Hinweise darauf, dass p53 eine Rolle in der NER spielt, kommen von Beobachtungen
von Wang et al. (1995) die zeigten, dass p53 mit den Helikasen XPB und XPD wechselwirkt.
Allerdings zeigen in vitro Versuche keine Notwendigkeit von p53 für den Ablauf der NER, so
dass p53 eine Rolle in der NER im Kontext mit Chromatin zu spielen scheint. Des Weiteren
zeigten Versuche an Hautfibroblasten, die homozygote Mutationen des p53-Gens tragen, dass
p53 für die globale genomische Reparatur von UV-induzierten CPDs benötigt wird, während
die transkriptionsgekoppelte Reparatur unbeeinflusst ist (Ford und Hanawalt, 1995). Die
Reparatur wurde mit Hilfe der T4-Endonuklease, die spezifisch CPDs erkennt, gemessen.
Ford und Hanawalt (1997) konnten mittels eines Immunoassays mit spezifischen Antikörpern
gegen CPDs und auch gegen (6-4)-Photoprodukte zeigen, dass der Effekt von p53 auf die
Reparatur von (6-4)-Photoprodukte, die sich im Gegensatz zu CPDs weniger häufig in
Nukleosomen gebundener DNA ereignen, geringer ist als auf CPDs. Hwang et al. (1999)
sowie Adimoolam und Ford (2002) konnten zeigen, dass p53 als Transkriptionsfaktor die
Einleitung
18
NER-Proteine p48 und XPC induziert und somit eine indirekte Rolle in der NER einnimmt.
Für eine Anlagerung des Schadenserkennungsprotein XPC an CPDs ist p53 essenziell. Dies
ist vermutlich auf die Induktion von p48 infolge von DNA-Schäden zurückzuführen (Wang et
al., 2003). Die Beteiligung von p48 in der NER und seine Rolle beim DNA-Remodeling
wurde schon in Kapitel �2.3.2 vorgestellt. Allerdings zeigen Arbeiten von Rubbi und Milner
(2003), dass XPE-Zellen eine normale UV-induzierte Chromatin-Relaxation aufweisen, so
dass die p53 vermittelte Relaxation unabhängig von p48 ist. Ebenso wie p48 ist auch p53 in
der Lage, die Histon-Acetyltransferase p300 an Chromatin zu rekrutieren und so eine Histon
Acetylierung auszulösen. Es scheint von Bedeutung zu sein, zwischen Chromatin-Relaxation,
für die p48 entbehrlich ist und Chromatin-Remodeling, das durch p48 eingeleitet wird, zu
unterscheiden (Allison und Milner, 2004).
Abbildung 9: Auslösung der Transkription von DDB2 und XPC durch Bindung von p53 an p53 responsive Elemente (p53RE) (modifiziert nach Adimoolam und Ford, 2003).
DDB2 p53RE
p53
XPC p53RE
p53
p53
Einleitung
19
2.4.6 Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle
Eine Zelle durchläuft von einer Teilung bis zur nächsten vier Phasen im Zellzyklus
(Abbildung 10).
Abbildung 10: Übersicht über die einzelnen Phasen des Zellzyklus (Eisenbrand und Metzler, 1994).
Nach der Zellteilung (M-Phase) geht die Zelle in die so genannte G1-Phase über. Hier wird
die Zellmasse verdoppelt und Nukleotide für die nächste Phase, die S-Phase (Synthesephase)
synthetisiert. In der S-Phase wird die DNA repliziert bis dann nach einer zweiten Ruhephase
(G2-Phase) die Zellteilung stattfindet und so an deren Ende zwei identische Zellen vorliegen.
In einer typischen, sich teilenden eukaryotischen Zelle verbleibt die Zelle etwa 12 Stunden in
der G1-Phase, sechs bis acht Stunden in der S-Phase, bis sie dann nach einer Ruhephase (G2-
Phase) von ca. drei bis sechs Stunden in die etwa 30 Minuten anhaltende Mitose übergeht.
Die exakte Länge der einzelnen Phasen variiert allerdings zwischen Zelltyp und
Wachstumsbedingungen (Shackelford et al., 1999).
Um zu gewährleisten, dass sich auftretende DNA-Schäden durch fehlerhafte Replikation nicht
in Mutationen manifestieren, besitzt eine Zelle mehrere Kontrollpunkte im Zellzyklus. Die
Zelle kann hier den Zellzyklus vorübergehend arretieren, um Zeit zur Reparatur der Schäden
zu gewährleisten. An der Kontrolle des Zellzyklus ist ein komplexes, interargierendes
Netzwerk verschiedener regulatorischer Faktoren involviert. Im Zentrum der Regulation
stehen zunächst einmal die CDKs (cyclin dependent kinase) mit ihren regulatorischen
Untereinheiten, den Cyclinen. Die Assoziation der Cycline mit den CDKs bildet den ersten
Schritt ihrer Aktivierung. Im zweiten Schritt muss der Cyclin-CDK-Komplex durch eine
Einleitung
20
CAK (CDK activating kinase) phosphoryliert werden. Ein wichtiges Substrat, welches durch
CDKs phosphoryliert wird, ist das Tumorsuppressorprotein pRB, das Produkt des
Retinoblastom-Gens. Dieses Protein hat eine wichtige Funktion im G1-Kontrollpunkt. Der
G1-Kontrollpunkt, auch Restriktionspunkt genannt, ist der am besten untersuchte
Kontrollpunkt. Die Rolle von p53 wird hier gut verstanden. p53 wird infolge von auftretenden
DNA-Schäden phosphoryliert und kann dann als Transkriptionsfaktor die Expression des
CDK-Inhibitors p21 induzieren. In normalen menschlichen Fibroblasten liegt p21 in einem
quartären Komplex zusammen mit Cyclin, CDK und PCNA vor. Durch Bindung eines
weiteren p21 Proteins, infolge einer verstärkten Expression, wird die Phosphorylierung und
somit die Aktivierung des Cyclin-CDK-Komplexes durch die CAK verhindert (Gartel et al.,
1996). Dies hat zur Folge, dass pRB nicht mehr phosphoryliert werden kann. In der
hypophosphorylierten Form bindet pRB den Transkriptionsfaktor E2F. Erst durch die
Phosphoryierung des pRB durch die Cyclin-CDK-Komplexe wird seine Affinität zum E2F
reduziert und so der Trankriptionsfaktor freigesetzt. Dieser induziert die Transkription
wichtiger Gene, deren Produkte für den Fortgang durch die S-Phase essenziell sind (Bartek
und Lukas, 2001) so z.B. Dihydrofolatreduktase, DNA-Polymerase α, Cyclin A und E,
Thymidinkinase, sowie E2F selbst (zusammengefasst in Pucci und Giordano, 1999).
Die Induktion von p21 kann allerdings auch in einem S-Phasenarrest resultieren. Durch seine
Bindung an PCNA, eine Untereinheit, die von der Polymerase δ benötigt wird, verhindert p21
den Elongationschritt der DNA-Replikation (Waga und Stillman, 1998). Da allerdings PCNA
allgemein ein für die DNA-Synthese essenzieller Faktor ist, und somit auch für eine DNA-
Neusynthese infolge stattfindender Reparatur benötigt wird, wurde die Hemmung von PCNA
durch p21 zunächst kontrovers diskutiert. Während Li et al. (1994) keinen inhibierenden
Effekt von p21 auf die DNA-Reparatur feststellen konnten, zeigten Studien von Cooper et al.
(1999), sowie von Pan et al. (1995) eine Hemmung der Reparatur. Allerdings zeigte sich hier,
dass die NER im Gegensatz zu der in der S-Phase stattfindenden DNA-Replikation, weniger
sensitiv gegenüber einer Hemmung durch p21 ist.
Wie bereits Rhind und Russell (2000) darstellten scheint die Reihenfolge, dass zunächst die
Replikation gestoppt bis anschließend durch die Reparatur der Schäden der Zellzyklus
fortgesetzt wird, ein veraltetetes Modell zu sein. Vielmehr scheint der S-Phasenkontrollpunkt
eine Modifikation der DNA-Replikation zur Folge zu haben, indem eine
rekombinationsabhängige Reparatur aktiviert wird. Infolge von UV-Schäden kann es auch zur
sogenannten PPR (post-replication repair) durch eine spezielle Polymerase η, dem
Genprodukt von XPV kommen.
Fragestellung
21
3 Fragestellung
Die kanzerogene Eigenschaft von Cadmiumverbindungen ist bekannt, dennoch sind die zu
Grunde liegenden Mechanismen noch weitestgehend unklar, zumal das mutagene Potenzial
nur schwach ausgeprägt ist. Empfindliche Zielstrukturen für Metallverbindungen sind Zink-
bindende Domänen in so genannten Zinkfingerproteinen. Drei Prozent der Gene codieren für
Zinkfingerstrukturen. Das Strukturelement ist häufig in Transkriptionsfaktoren beinhaltet. Ein
wichtiger Transkriptionsfaktor mit einer Zink-bindenden Struktur ist das Tumorsuppressor-
protein p53. Das Protein ist in einer Vielzahl von Mechanismen zum Schutz der Zelle
beteiligt, so z.B. in der Zellzykluskontrolle, in der Apoptose, aber auch in der DNA-
Reparatur.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zum Einfluss sowohl löslicher als
auch partikulärer Cadmiumverbindung auf die Struktur und die damit verbundene Funktion
des Tumorsuppressorproteins p53. Ein möglicher Einfluss auf DNA-Reparaturprozesse sowie
auf die Zellzykluskontrolle soll aufgeklärt werden. Da Cadmium in der Umwelt meist in
partikulärer Form als CdO vorkommt ist die Abklärung der Frage, ob das Wirkspektrum von
löslichem CdCl2 dem des partikulären CdO entspricht von zentraler Bedeutung für die
Risikobewertung von umweltrelevanten Cadmiumverbindungen. Ausgehend von einer
Hemmung der Reparatur UV-induzierter und BPDE-induzierter DNA-Schäden, soll in
Kombinationsuntersuchungen die Genexpression zweier Zielgene von p53, p48 und XPC,
untersucht werden. Die Genprodukte sind in die Schadenserkennung der
Nukleotidexzisionsreparatur involviert. Hierzu muss zunächst die Real Time RT-PCR-
Methode etabliert werden, mit der die Amplifikation eines Oligonukleotids in Echtzeit
verfolgt werden kann und quantitative Aussagen getroffen werden können. Ein weiterer
wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist die
Zellzykluskontrolle. Treten DNA-Schäden auf, muss der Zellzyklus vorübergehend
angehalten werden bis die Schäden repariert sind, damit sie sich nicht infolge stattfindender
DNA-Replikation in Mutationen manifestieren können. Das Genprodukt von p21 besitzt hier
eine große Bedeutung und wird ebenfalls über p53 reguliert. Somit soll des Weiteren die
Genexpression von p21 untersucht werden. Versuche zur Zellzyklusphasenverteilung am
Durchflusszytometer in Kombinationsuntersuchungen mit UVC-Strahlung sollen letztendlich
zeigen, ob Cadmiumverbindungen in die Zellzykluskontrolle eingreifen.
Material und Methoden
22
4 Material und Methoden
Eine Auflistung von allen eingesetzten Chemikalien und Lösungen, deren Konzentrationen
sowie eine Liste der verwendeten Geräte ist im Anhang zu finden.
4.1 Zellkultur
Medien, Puffer, Lösungen und alle verwendeten Verbrauchsmaterialien für die Zellkultur
wurden sterilfiltriert oder autoklaviert bzw. hitzesterilisiert.
4.1.1 Zellen
In der vorliegenden Arbeit wurde die humane Zelllinie A549 (Lungenadenokarzinomzellen)
eingesetzt. Die Zellen werden in einem Einfriermedium bestehend aus 90 % FKS (fötales
Kälberserum) und 10 % DMSO bei -196°C in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Kultiviert
werden sie in DMEM-Medium mit 10 % FKS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml
Streptomycin bei 37°C, 5 % CO2-Atmosphäre und 100 % Luftfeuchtigkeit. Die Zellen
wachsen als Monolayer mit einer Generationszeit von etwa 24 Stunden. Bei etwas 70 %
Konfluenz werden die Zellen abtrypsiniert, in neue Schalen ausgesät und mit frischem
Medium versetzt. Die Zellen werden mittels PCR auf Kontamination mit Mykoplasmen
getestet.
4.1.2 Koloniebildungsfähigkeit
Mit Hilfe der Koloniebildungsfähigkeit von Zellen kann die Zytotoxizität der zu
untersuchenden Verbindung ermittelt werden. Hierfür wird die Zellzahl nach Ablauf der
Inkubationszeit bestimmt, eine definierte Anzahl von Zellen weitergesetzt und diese unter
normalen Wachstumsbedingungen mehrere Tage kultiviert. Anhand der, im Vergleich zu
unbehandelten Zellen, Anzahl gebildeter Kolonien lässt sich feststellen ob und in welchen
Konzentrationen das getestete Agens zu Langzeitschäden, die die Reproduktionsfähigkeit der
Zellen beeinflussen, führt.
Material und Methoden
23
Zur Untersuchung der Koloniebildungsfähigkeit werden jeweils 1 x 106 Zellen in eine
Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml Kulturmedium ausgestreut. Nach einem
Teilungszyklus (24 Stunden) erfolgt die Inkubation mit der zu untersuchenden Verbindung,
indem die entsprechende Menge an jeweiliger Stammlösung in das Kulturmedium zupipettiert
wird. Nach Ablauf der Inkubationszeit wird das Medium abgenommen und die Schalen
werden mit je 5 ml Medium gewaschen. Die Zellen werden abtrypsiniert, die Zellzahl wird
bestimmt und jeweils 300 Zellen werden in eine Zellkulturschale (60 x 15 mm) mit 5 ml
frischem Kulturmedium überführt. Nach etwa 7 Tagen im Brutschrank sind die Kolonien mit
bloßem Auge sichtbar. Das Medium wird abgenommen, die Zellen werden mit PBS
gewaschen und mit 2-3 ml 100 %igem Ethanol fixiert. Durch eine Blaufärbung der Kolonien
mit Giemsa-Farbstoff können die Kolonien ausgezählt werden.
4.2 Behandlung der Zellen
4.2.1 Inkubation
Für die Inkubation mit dem wasserlöslichen CdCl2 wird eine Stammlösung (10 mM) in
bidestillierten Wasser angesetzt, sterilfiltriert und bei 4°C gelagert. Je nach gewünschter
Endkonzentration im Kulturmedium wird nach Bestimmung des Kulturmediumvolumens die
entsprechende Menge der Stammlösung zupipettiert.
Die Stammsuspension des schlecht löslichen, partikulären CdO wird unmittelbar vor
Versuchsbeginn hergestellt. Hierfür werden die Partikel für 30 min bei 110°C sterilisiert und
anschließend die Stammsuspension (0,5 mg/ml) in bidestilliertem autoklaviertem Wasser
hergestellt. Um die Teilchen nahezu vollständig und fein verteilt in Suspension zu bekommen,
wird die Suspension 15 min im Ultraschallbad behandelt und im Anschluss 5 min auf dem
Vibrationsmischer geschüttelt.
4.2.2 UVC-Bestrahlung
Für die Kombinationsuntersuchungen wird als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung
(254 nm) verwendet. Vor der Bestrahlung der Probe wird mit einem Dosimeter eine Dosis-
Abstands-Kurve aufgenommen, aus der dann die Bestrahlungsparameter (Entfernung der
Lampe zur Zellkulturschale, Zeit der Bestrahlung) entnommen werden.
Material und Methoden
24
Zur Bestrahlung der Zellen wird nach Beendigung der Vorinkubation bzw. nach Ablauf der
Anwachsphase das Kulturmedium abgenommen und gesammelt. Um Reste des Mediums zu
entfernen wird die Zellkulturschale mit PBS gespült. Zur Bestrahlung werden die Schalen
ohne Deckel unter die UVC-Lampe gestellt und für 5 sec im Abstand von 30 cm bestrahlt
(entsprechend einer Dosis von 5 J/m2). Im Anschluss werden die Zellen mit dem jeweiligen
Ursprungsmedium versetzt und im Brutschrank gelagert.
4.3 Zellzyklusmessung am Durchflusszytometer
In der vorliegenden Arbeit wird die Verteilung der Zellen im Zellzyklus mit einem
Durchflusszytometer bestimmt. Daher wird im Folgenden auf den Aufbau und das
Messprinzip eingegangen.
Ein Durchflusszytometer ist ein optisches Messsystem, mit dem Fluoreszenz- und
Streulichtsignale von Zellen, die sich in Suspension befinden, analysiert werden können.
4.3.1 Geräteaufbau und Messprinzip
Die sich in Suspension befindlichen Zellen werden durch einen Flüssigkeitsstrom in einer
konisch zulaufenden Kapillare fokussiert (Abbildung 11). Die Abstände der Zellen
voneinander vergrößern sich dadurch auf dem Weg durch die Kapillare, so dass gewährleistet
ist, dass die Zellen nacheinander die Messstelle durchlaufen.
Abbildung 11: Aufbau der Messküvette eines Durchflusszytometers und Prinzip der hydrodynamischen Fokussierung (Dickinson, 2000).
Material und Methoden
25
Passiert eine Zelle die Messstelle, wird sie von einem Laser bestrahlt, wodurch es zu
mehreren Effekten kommt. Zum einen wird das Licht gestreut, wobei es je nach Zellgröße
nach vorne (Vorwärtsstreulicht), und je nach Oberflächenbeschaffenheit zur Seite
(Seitwärtsstreulicht) gestreut wird. Zum anderen kommt es durch eine vorangehende Färbung
von Zellbestandteilen wie z.B. der DNA mittels eines fluoreszierenden Farbstoffes zu einem
Fluoreszenzsignal. Die Intensitäten der auftretenden Emissionen werden mit Hilfe eines
optischen Detektionssystems quantifiziert (Abbildung 12) (Schmitz und Rothe, 1994).
Abbildung 12: Aufbau des optischen Systems eines Durchflusszytometers (Schmitz und Rothe, 1994).
4.3.2 Fluoreszenzfärbung
Für die Zellzyklusmessungen wird der DNA-Gehalt einer Zelle mittels DAPI (4’, 6’-
Diamidino-2-phenylindol), einem spezifischen DNA-Farbstoff, bestimmt. Hierfür werden die
Zellen nach Ablauf der Inkubationszeit abtrypsiniert, gezählt und 1 x 106 Zellen in ein 15 ml
Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zentrifugation bei 1200 rpm wird der Überstand
entfernt und das Zellpellet in 1 ml PBS aufgenommen. Durch Zugabe von 3 ml 100 %igem
Ethanol (-20°C) unter Schütteln auf dem Vibrationsmischer werden die Zellen fixiert und bis
zur Fluoreszenzfärbung bei -20°C aufbewahrt.
Am Tag vor der Messung wird erneut bei 1200 rpm abzentrifugiert, der Überstand
abgenommen und das Zellpellet in 1 ml DAPI-Fertiglösung durch mischen suspendiert. Bis
zur Messung am Durchflusszytometer werden die Proben bei 4°C aufbewahrt.
Material und Methoden
26
4.3.3 Zellzyklusmessung
Die Intensität des erhaltenen Fluoreszenzsignals ist abhängig vom DNA-Gehalt der Zelle.
Dieser ist wiederum abhängig davon, in welcher Phase des Zellzyklus sich die Zelle befindet.
Während der G1-Phase besitzt die Zelle einen einfachen DNA-Gehalt. Im Verlauf der S-
Phase kommt es auf Grund der Replikation der DNA zu einem Anstieg des DNA-Gehalts, bis
am Ende der doppelte Gehalt vorliegt. Die Zelle besitzt also während der G2- und M-Phase
einen doppelten DNA-Gehalt, bis sie sich teilt und somit am Ende der M-Phase zwei Zellen
mit jeweils einfachem DNA-Gehalt entstehen (Abbildung 13).
Abbildung 13: Änderung des DNA-Gehalts während des Zellzyklusses (Dickinson, 2000). Für die Auswertung der durchflusszyotometrischen Analyse werden die Intensitätssignale
jeder Zelle, die dem DNA-Gehalt proportional sind, aufsummiert, wodurch eine
Häufigkeitsverteilung erhalten wird. Mittels eines Algorithmus ermittelt die Software
schließlich die einzelnen Flächen des Histogramms, die den jeweiligen Phasen des
Zellzyklusses entsprechen (Abbildung 14).
Abbildung 14: DNA-Histogramm einer Zellzyklusmessung (Dickinson, 2000).
Material und Methoden
27
4.4 Bestimmung des p53 Proteingehaltes
Zur Bestimmung des p53 Proteingehaltes werden die Proteine aus den Zellen isoliert. Nach
Ermittlung der Proteinkonzentration nach Bradford (Bradford, 1976) wird ein Aliquot des
Zellextraktes denaturiert, auf ein SDS-Polyacrylamidgel (12 %) aufgetragen und die Proteine
bei einer Spannung von 100 V aufgetrennt. Im Anschluss erfolgt der Transfer der Proteine auf
eine PVDF-Membran. Auf jedem Gel wird ein Molekulargewichtsmarker mitgeführt der
gleichzeitig auch als Kontrolle des erfolgten Proteintransfers nach dem Westernblot dient.
4.4.1 Zelllyse
Zur Zelllyse werden 5 Millionen Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt und bei
1200 rpm 3 min abzentrifugiert. Das Pellet wird mit 100 µl RIPA-Puffer versetzt, in ein
Eppendorfreaktionsgefäß überführt und im Ultraschall sonifiziert (5 x pulse). Nach
Abzentrifugieren der Zelltrümmer (15.000 rpm, 15 min) kann der Proteingehalt im Überstand
bestimmt werden.
4.4.2 Proteinbestimmung nach Bradford
Zur Proteinbestimmung nach Bradford werden jeweils 2 µl Proteinextrakt mit 98 µl Wasser
in einer 24-Mikrotiterlochplatte vermischt (Dreifachbestimmung) und dazu 900 µl
Bradfordlösung (Bio-Rad Reagenz) gegeben. Fünf Minuten nach Reagenzzugabe wird die
Absorption bei 595 nm in einem Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN SpektraFluor) bestimmt.
Durch die Bindung des in der Bradfordlösung enthaltenen Farbstoffs Coomasie Brillantblau
G 250 an Proteine verschiebt sich in saurer Lösung die Absorption von 465 nm nach 595 nm.
Zur Berechnung der Proteinkonzentration wird auf jeder Lochplatte eine Kalibriergerade mit
Rinderserumalbumin im Bereich von 1- 15 µg/ml mitgeführt.
4.4.3 Elektrophorese und Westernblot
20 µg Gesamtprotein wird mit 5 µl Lämmli-Ladepuffer (4x) versetzt, mit H2O auf 20 µl
aufgefüllt und bei 95°C für 5 min denaturiert. Im Anschluss werden die Proben auf ein
denaturierendes Popyacylamidgel (5 %iges Sammelgel, 12 %iges Trenngel) aufgetragen. Die
Material und Methoden
28
Elektrophorese erfolgt bei 80 V im Sammelgel und zur Trennung der Proteine im Trenngel
bei 100 V. Als Molekulargewichtsmarker wird auf jedem Gel ein Rainbow-
Molekulargewichtsmarker mitgeführt, anhand dessen Farben die 53 kD-Bande des p53-
Proteins zugeordnet werden kann. Zur Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Membran
werden die Proteine nach erfolgter Trennung in einer Semidry-Blot-Apparatur bei 0,8 A/cm2
Membran für 1 h auf eine PVDF-Membran geblottet.
4.4.4 Detektion durch Chemilumineszenz
Um aktive Bindungsstellen der Membran zu blockieren, wird die Membran nach dem
Westernblot für 30 min in Magermilchpulver (5 % in PBS) geschwenkt. Anschließend wird
die Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur (oder bei 4°C über Nacht) mit dem Anti-
p53-Antikörper DO-7 (Mausserum) inkubiert. Hierzu wird die Membran mit einer Lösung
bestehend aus 3 µl des Antikörpers und 3 ml Blockierlösung luftblasenfrei eingeschweißt. Im
Anschluss erfolgt nach jeweils dreiminütigem, viermaligem Waschen der Membran in PBS
(0,3 % Tween 20) die Inkubation mit dem an Peroxidase gekoppelten Anti-Maus IgG-
Antikörper. Dazu werden 1,2 µl des Antikörpers in 3 ml Blockierlösung gegeben und dies
zusammen mit der Memran eingeschweißt. Nach Ablauf von einer Stunde erfolgt nach vier
Waschschritten mit PBS (0,3 % Tween 20) für jeweils drei Minuten die Detektion mittels
Chemilumineszenz. Hierzu wird die Membran für eine Minute mit etwa 1 ml der ECL-
Lösung von Amersham (1:1 Mischung) inkubiert und im Anschluss die Reaktion der
Peroxidase mit dem Substrat anhand der Chemilumineszenz detektiert.
4.4.5 Immunpräzipitation zur Konformationsbestimmung von p53
Um zwischen Wildtyp- und „mutanter“-Konformation von p53 unterscheiden zu können,
wird eine Immunopräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt.
4.4.5.1 Zelllyse und Vorklärung
Die Zellen werden mit 500 µl Immunpräzipitationspuffer (4°C) lysiert, mittels Zellschaber
von der Zellkulturschale abgelöst und in 2,2 ml Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Alle
nachfolgenden Arbeiten werden auf Eis durchgeführt. Die Zelltrümmer werden bei 15.000 g
für 5 min abzentrifugiert und der Überstand in neue Reaktionsgefäße überführt. Um
unspezifische Bindungsreaktionen zu minimieren werden die Proben vorgeklärt. Hierzu wird
Material und Methoden
29
pro Ansatz 1 µg Pab 416 zugegeben, ein Antikörper gegen das nicht in Lösung befindliche
SV40T-Antigen. Um das gebildete Präzipitat aus der Lösung zu entfernen, wird 20 µl Protein
A/G-Agarose-Lösung zugegeben und nach 45 min im Rotator bei 10.000 g für 1 min
abzentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und der Proteingehalt nach Bradford (siehe
Kapitel �4.4.2) bestimmt.
4.4.5.2 Immunopräzipitation
Abbildung 15: Schematische Darstellung einer Immunpräzipitation.
Für die Unterscheidung zwischen Wildtyp- und „mutanter“-p53-Konformation wird der
Zellextrakt nach Proteinbestimmung durch Verdünnung mit Immunpräzipitationspuffer auf
gleiche Proteinmenge und Volumina eingestellt. Jede Probe wird auf verschiedene Ansätze
aufgeteilt und anschließend die Immunpräzipitation mit konformationsspezifischen
Antikörpern durchgeführt. Hiezu werden die entsprechenden Ansätze jeweils mit 1 µg
monoklonalem Antikörper (PAb 1620 = Wildtyp, PAb 240 = „mutante“ Konformation) und
15 µl Protein A/G-Agarose-Lösung versetzt. Nach 18 h im Rotor wird das gebildete Präzipitat
bei 10.000 g für 1 min abzentrifugiert (Abbildung 15). Das Pellet wird dreimal mit eiskaltem
Immunpräzipitationspuffer und zuletzt einmal mit eiskaltem PBS gewaschen. Der Rückstand
bestehend aus einem p53-Protein-anti-p53-Antikörper und Protein A/G-Agarose-Komplex
wird mit Lämmli-Ladepuffer versetzt und für 10 min bei 95 °C aufgekocht, wodurch der
Antikörper denaturiert, das p53-Protein in Lösung geht und nach erfolgter Elektrophorese
mittels Westernblot und Chemilumineszensdetektion quantifiziert wird. Hierzu wird wie unter
Kapitel �4.4.3 beschrieben vorgegangen. Da der für die Immunpräzipitation verwendete,
konformationsspezifische Antikörper aus der Maus stammt, wird als anti-p53-Antikörper für
den Westernblot ein Antikörper einer anderen Spezies (CM1 (Kaninchenserum)) eingesetzt,
da sonst ein gegen Maus IgG gerichteter sekundärer Antikörper, zusätzlich die schwere Kette
Zugabe von Antikörper
Zugabe von Protein A/G gekoppelt an Agarose
Zentrifugation Überstand
Pellet
Material und Methoden
30
des denaturierten, zur konformationsspezifischen Fällung verwendeten Antikörpers erkennen
würde und dies in einer Bande in Höhe des p53-Proteins resultieren würde. Als sekundärer
Antikörper wird somit ein mit Peroxidase gekoppelter anti-Kaninchen IgG-Antikörper
eingesetzt.
4.5 Bestimmung der relativen Genexpression
Um Unterschiede im Expressionslevel bestimmter Gene nach Inkubation mit einer
Testverbindung zu untersuchen wird eine RT-PCR durchgeführt. Hierzu wird die Gesamt-
RNA aus den Zellen isoliert, in cDNA umgeschrieben und die Expression des zu
untersuchenden Gens mittels spezifischen Primern mit Hilfe der PCR untersucht.
4.5.1 Probenvorbereitung
4.5.1.1 RNA-Isolierung
Die Isolation der RNA erfolgt mittels Säulenisolationskit von BD Bioscience. Das Prinzip
beruht auf einem Silikat-Filter, der Nukleinsäuren bindet und somit die RNA von Proteinen
und Zellbestandteilen abtrennt. Nach DNase-Verdau und verschiedenen Waschschritten kann
die RNA von der Säule eluiert werden.
Es werden jeweils 1 x 106 Zellen in eine Zellkulturschale (100 x 20 mm) mit 10 ml
Kulturmedium ausgestreut. Nach einem Teilungszyklus (24 Stunden) erfolgt die Inkubation
mit der zu untersuchenden Verbindung. Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Zellen
abtrypsiniert, die Zellzahl bestimmt und 2 x 106 Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen
überführt, bei 1200 rpm abzentrifugiert und der Überstand abgenommen. Das Zellpellet wird
in 1 ml PBS resuspendiert, in ein 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß überführt und erneut bei
1200 rpm abzentrifugiert. Nach Abnehmen des Überstandes wird das Pellet mit 350 µl
Lysepuffer (R1-Puffer) und 3,5 µl Mercaptoethanol versetzt und durch fünfmaliges Aufziehen
durch eine Kanüle (∅ 0,4 mm) geschert. Im Anschluss wird das gleiche Volumen 70 %iges
Ethanol zugegeben, gemischt, die gesamte Lösung auf ein Reaktionsgefäß mit Filtereinsatz
überführt und bei 9000 g für 30 sec abzentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und die
Säule mit 350 µl MDB-Puffer (membrane desalting buffer) versetzt. Nach Abzentrifugieren
bei 11 000 rpm für 1 min wird der Durchlauf erneut verworfen und ein DNase-Verdau auf der
Säule durchgeführt. Hierzu werden 95 µl DNase Reaktionsgemisch (10 µl DNase + 90 µl
Material und Methoden
31
DNase Reaktionspuffer) 15 min bei Raumtemperatur auf die Säule gegeben. Daraufhin
werden zum Abstoppen 200 µl RA2-Puffer auf den Filter gegeben und 30 sec bei 9.000 rpm
zentrifugiert. Die Säule wird im Anschluss auf ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt und
mit 600 µl RA3-Puffer gewaschen. Nach Zentrifugieren für 30 sec bei 9.000 rpm wird der
Durchlauf verworfen und die Säule ein zweites Mal mit RA3-Puffer (250 µl) gewaschen.
Nach Zentrifugation für 2 min bei 13.000 rpm wird die RNA durch zweimaliges
zentrifugieren mit je 50 µl RNase freiem Wasser bei 13.000 rpm von der Säule eluiert. Die
Lagerung erfolgt bei -80°C.
4.5.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung
Zur Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA wird zunächst eine 1:50 Verdünnung
hergestellt. Hierfür werden 98 µl Wasser mit 2 µl der RNA-Lösung versetzt und im Anschluss
die Extinktion der verdünnten Lösung bei 260 nm bestimmt.
1 OD260nm = 40 µg RNA
4.5.1.3 RNA Gelelektrophorese
Zur Überprüfung der Integrität der isolierten RNA wird eine denaturierende RNA
Gelelektrophorese durchgeführt.
Hierzu wird ein 1,2 %iges formaldehydhaltiges Agarosegel hergestellt. Es werden 1,2 g
Agarose mit 83 µl Wasser und 5 ml 20 x MOPS-Puffer aufgekocht und nach Abkühlung auf
ca. 65°C mit 12 ml Formaldehydlösung (37 %) versetzt.
1 µg der isolierten Gesamt-RNA wird mit FDP (Formamid-Denaturierungs-Puffer) auf 15 µl
Gesamtvolumen gebracht und 10 min bei 65°C auf dem Heizblock denaturiert, so dass die
RNA einzelsträngig vorliegt. Nach Zugabe von ca. 1,5 µl Lämmli-Ladepuffer erfolgt die
Eletrophorese mit MOPS (1x) bei 60 V für ca. 2 h. Zur Detektion wird das Gel bei 520 nm
abfotografiert.
4.5.1.4 cDNA-Synthese
Die Synthese der cDNA erfolgt mittels cDNA-Synthesekit von Bio-Rad, welches auf einer
modifizierten MMLV reversen Transkriptase mit RNAse H+-Aktivität sowie einem Gemisch
aus Oligo(dT)- und random hexamer Primern basiert (Abbildung 16).
Material und Methoden
32
Abbildung 16: Schema der cDNA-Synthese.
Der Reaktionsansatz wird bei 4°C im Eisblock nach folgendem Pipettierschema pipettiert:
15 – x µl RNase freies Wasser x µl (entsprechend 1 µg) RNA-Probe 4 µl 5 x iScript Reaktiongemisch 1 µl iScript Reverse Transkriptase
Dieser Ansatz wird bei 25°C für 5 min inkubiert, damit sich die Primer an die einzelsträngige
RNA anlagern. Im Anschluss erfolgt bei 42°C die reverse Transkrition für 30 min. Durch eine
Erhitzung auf 85°C für 5 min wird die Reaktion letztendlich beendet und die synthetisierte
cDNA kann für die PCR eingesetzt werden.
4.5.2 Quantitative Real Time PCR
4.5.2.1 Prinzip
Die PCR (Polymerase Chain Reaction) wurde 1985 von K. B. Mullis entwickelt und dient zur
in vitro Vervielfältigung von Nukleinsäuren. Das Reaktionsprinzip ist die enzymatische
Amplifizierung eines DNA-Abschnittes zwischen zwei Oligonukleotidprimern, die
gegenläufig an komplementären DNA-Strängen gebunden sind und den zu amplifizierenden
DNA-Abschnitt begrenzen. Die Reaktion basiert auf einer zyklischen Wiederholung von drei
Schritten: Denaturierung, Annealing und Elongation (Abbildung 17).
5´------------------------aaaaa-3´ mRNA Oligo-dT 5´------------------------aaaaa-3´ ttttt-5´ Reverse Transkriptase 5´------------------------aaaaa-3´ cDNA 3´------------------------ttttt-5´
Material und Methoden
33
Abbildung 17: Schema einer Polymerasekettenkeaktion (PCR).
Während der Denaturierungsphase wird der DNA-Doppelstrang aufgrund der Aufspaltung der
Wasserstoffbrücken durch hohe Temperatur zwischen den gegenüberliegenden Basenpaaren
aufgetrennt, so dass sich im nächsten Schritt, der Annealingsphase, die Primer an
komplementäre Sequenzen anlagern können. Im letzten Schritt kommt es bei 72°C, dem
Temperaturoptimum der Polymerase, zur Elongation d.h. zur Auffüllung der Stränge mit
Nukleotiden. In jedem Zyklus kommt es so zu einer Verdopplung der eingesetzten DNA-
Menge. Diese exponentielle Zunahme lässt sich mit folgender Gleichung beschreiben:
5´--------tgcaccaccaactgcttagc--------3´ 3´--------acgtggtggttgacgaatcg--------5´
Denaturierung
5´--------tgcaccaccaactgcttagc--------3´
+
3´--------acgtggtggttgacgaatcg--------5´
Annealing
5´---------tgcaccaccaactgcttagc--------3´ cgaatcg-5´
+
5´-tgcacca x 3´--------acgtggtggttgacgaatcg--------5´
Elongation
5´--------tgcaccaccaactgcttagc--------3´ 3´--------acgtggtggttgacgaatcg-5´ X
+
X 5´-tgcaccaccaactgcttagc--------3´ 3´--------acgtggtggttgacgaatcg--------5´
Material und Methoden
34
N = N0 x (1 + E)n
Aufgrund einer Konkurrenzreaktion zwischen Strang-Reannealing und Primer-Annealing bei
höheren Zyklenzahlen, sowie aufgrund einer Inaktivierung der Polymerase durch thermische
Belastung sowie durch Akkumulation von Pyrophosphat, das sich während der Reaktion
bildet, kommt es bei fortlaufender Reaktion zu einer Plateaubildung (Köhler, 1995; Mülhardt,
2003). Für eine Quantifizierung ist es entscheidend, den Zyklenbereich festzulegen, in dem
ein linearer Zusammenhang zwischen Ampifikatbildung und Zyklenzahl besteht. Der Vorteil
der Real Time PCR gegenüber der herkömmlichen PCR ist die Möglichkeit, den gesamten
Amplifikationsvorgang online zu verfolgen (Abbildung 18).
Abbildung 18: Vergleich densitometrische Auswertung konventioneller PCR (A) mit online-Auswertung bei der Real Time PCR (B).
Hierzu wurden in den letzten Jahren verschiedene Methoden entwickelt, die auf dem Einsatz
unterschiedlicher Fluorophore beruhen. Gemessen wird dabei die direkt oder indirekt mit der
DNA-Amplifikation verbundene Fluoreszenz, während bei der konventionellen PCR die
Proben nach einer definierten Zyklenzahl densitometrisch nach erfolgter Elektrophorese
vermessen werden (Bustin, 2000). In der hier vorliegenden Arbeit wird die DNA-
Amplifikation durch den Einsatz des Fluoreszensfarbstoff SYBR Green ermittelt. Hierbei
handelt es sich um einen Fluoreszenzfarbstoff, der unspezifisch in doppelsträngige DNA
A
B
N0 – Anfangsmenge der DNA
N – Menge an Amplifikat nach n Zyklen
n – Anzahl der Zyklen
E – Effizienz der PCR
Material und Methoden
35
interkaliert und somit mit fortschreitender Zyklenzahl zu einem Fluoreszenzanstieg führt
(Abbildung 19).
Abbildung 19: Interkalation des Fluoreszenzfarbstoffs SYBR Green während der Elongation durch die DNA-Polymerase.
Für den Probenansatz werden pro Reaktionsgefäß
12,5 µl SYBR Green Supermix 10,5 µl Wasser 0,5 µl forward Primer 0,5 µl reverse Primer 1 µl cDNA
eingesetzt. Um Pipettierfehler zu minimieren, wird für jede zu untersuchende cDNA-Probe
ein Mastermix angesetzt, der Supermix, cDNA und Wasser enthält. Dieser wird dann auf die
verschiedenen Ansätze verteilt (Gen X, Housekeeping Gen) und im Anschluss werden die
Primerpaare zugegeben.
Material und Methoden
36
4.5.2.2 Geräteaufbau
Der Aufbau des optischen Systems iCycler von Bio-Rad ist in Abbildung 20 dargestellt. Die
Proben werden mit Hilfe des Anregungsfilters mit einer Wellenlänge von 494 nm bestrahlt
und das emittierte Fluoreszenzlicht bei 521 nm wird am Detektor erfasst.
Abbildung 20: Aufbau des iCycler von Bio-Rad.
4.5.2.3 Effizienzbestimmung
Für optimierte Reaktionsbedingungen erhält man je nach zu untersuchendem Gen in der
Regel Effizienzen der PCR im Bereich von 0,78 bis 0,97 (Köhler, 1995). Die Effizienz der
Reaktion hängt u.a. von der Amplifikationslänge (kurze Amplifikate liefern größere
Effizienzen), von evtl. im Amplikon enthaltenen Sekundärstrukturen und vom G/C-Gehalt des
Amplikons ab. Geringere Effizienzen weisen auf eine nicht optimale PCR-Reaktion hin. Auch
Effizienzen größer 2, also größer 100 % sind bei der Verwendung von SYBR Green möglich.
Dies weist daraufhin, dass zusätzlich zu dem spezifischen zu untersuchenden Gen ein
weiteres unspezifisches Produkt gebildet wird. Daher ist es notwendig zunächst die
Effizienzen zu bestimmen und evtl. die PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur,
Annealingzeit, eingesetzte Primer) zu optimieren. Bei der Wahl der Primerpaare ist es wichtig
verschiedene Eigenschaften zu gewährleisten. Zum einen sollten sie eine Länge von 15 bis 20
Basen und einen G/C-Gehalt zwischen 50 und 60 %. besitzen. Um die Bildung von Primer-
Dimeren zu verhindern ist zum anderen darauf zu achten, dass forward und reverse Primer
keine 3´ komplementären Strukturen aufweisen. Eine zusätzliche Amplifizierung von
eventuell in der Probe enthaltenen DNA-Verunreinigung sollte durch Verwendung von
Intron-überspannenden Primern verhindert werden (Gassen, 1994; Köhler, 1995).
1 Wolfram-Lampe 2a/2b Filterrad mit 5 Positionen für Anregungs(2a)-
bzw. Emissions(2b)-Filter 3 Verstärker der Lichtintensität 4 Probenplatte 5 CCD (charge-coupled device)-Detektor
Material und Methoden
37
Die Effizienz lässt sich durch verschiedene Methoden bestimmen (Pfaffl, 1994):
• anhand einer Verdünnungsreihe
• anhand des absoluten Fluoreszenzanstiegs
• anhand mathematischer Algorithmen
In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Effizienz anhand einer Verdünnungsreihe
bestimmt. Daher wird im Folgenden näher darauf eingegangen.
Abbildung 21: Real Time PCR-Analyse einer hergestellten cDNA-Verdünnungsreihe (A)
mit daraus resultierender Auswertung (B).
A
B
Material und Methoden
38
Zunächst wird aus den zu untersuchenden cDNA-Proben eine Mischprobe hergestellt, in dem
die verschiedenen cDNA-Proben zu gleichen Teilen miteinander versetzt werden. Nach
Herstellung einer Verdünnungsreihe wird nach abgeschlossener PCR (Abbildung 21 A) die
eingesetzte cDNA-Menge in einer logarithmischen Funktion gegen den so genannten Ct-Wert
(Thresholdcycle) dargestellt (Abbildung 21 B). Die Ct-Werte entsprechen der Anzahl der
Zyklen die nötig sind, um ein konstant festgelegtes Fluoreszensniveau zu erreichen. Bei
diesem Wert befindet sich in allen Reaktionsgefäßen die gleiche Menge an neu synthetisierter
DNA. Daher ist die Zahl der Zyklen, die für die amplifikationsbedingte Fluoreszenzzunahme
zum Erreichen des Ct-Wertes erforderlich sind, invers proportional zu der Menge an
ursprünglich eingesetzter DNA. Die Effizienz (E) errechnet sich aus der Steigung (m) der
erhaltenen Geraden nach folgender Gleichung:
1101
−=−
mE (Ginzinger, 2002)
4.5.2.4 PCR-Protokoll
Die Real Time PCR-Analyse erfolgt über die iCycler Real-Time PCR Detection Software von
Bio-Rad. Das angewendete Analysenprogramm ist in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: PCR-Analysenprotokoll.
Cycle (Anzahl) Step Prozess Temperatur (°C) Zeit (min)
Cycle 1 (1x)
Step 1
Aktivierung der Polymerase
95
01:30
Cycle 2 (37x) Datengewinnung und Echtzeitanalyse
Step 1 Step 2 Step 3
Denaturierung Primer-Anlagerung Elongation
95 60 72
00:30 00:30 00:30
Cycle 3 (1x) Step 1
Denaturierung
95
01:00
Cycle 4 (1x) Step 1 Zusammenlagerung 60 01:00 Cycle 5 (70x) Datengewinnung und Echtzeitanalyse
Step 1
langsame Denaturierung
60
Steigerung der Temperatur nach
Zyklus 2 um 0,5ºC/10 sec
00:10
Cycle 6 (1x) Step 1
Ende
4
∞
Material und Methoden
39
4.5.2.5 Schmelzkurvenanalyse
Da es sich bei SYBR Green um eine unspezifische Interkalation handelt, wird bei dem
Fluoreszenzanstieg auch die Amplifikation unspezifischer Produkte wie z.B. die Bildung von
Primer-Dimeren oder die Bildung unspezifischer PCR-Produkte aufgrund unspezifischer
Primer-Bindung an die DNA erfasst. Daher muss nach abgeschlossener PCR die Spezifität
überprüft werden und evtl. müssen die PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur,
Annealingzeit, eingesetzte Primer) optimiert werden.
Abbildung 22: Schmelzkurve (A) mit erhaltener Ableitungsfunktion (B).
Die mit SYBR Green markierten PCR-Produkte werden durch Erhöhung der Temperatur kontinuierlich bis zu ihrem definierten Schmelzpunkt denaturiert. Dies führt zu einer Abnahme der Fluoreszenz. Die Ableitungsfunktion der relativen Fluoreszenzänderung über die Temperatur (-dRFU/dT) weist am Schmelzpunkt ein Maximum auf.
Eine Differenzierung zwischen spezifischen und unspezifischen Produkten kann weitgehend
über eine Schmelzkurvenanalyse erfolgen (Abbildung 22). Hierbei werden die PCR-Produkte
nach abgeschlossener PCR kontinuierlich über einen bestimmten Temperaturbereich
A B
A
B
Material und Methoden
40
aufgeheizt. Währenddessen kommt es zu einer Denaturierung der Doppelstränge, wobei die
Denaturierungstemperatur u.a. von der Länge des PCR-Produktes abhängt. Am Schmelzpunkt
des Amplifikats kommt es zu einer schlagartigen Abnahme des Fluoreszenzsignals was sich
in der Ableitungsfunktion der Fluoreszenz gegenüber der Temperatur als Peakmaximum
detektieren lässt.
4.5.2.6 Relative Quantifizierung
Als Maß für die Quantifizierung werden die Ct-Werte herangezogen. Im Falle einer
100 %igen Effizienz der Reaktion verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Stränge während der
exponentiellen Phase der PCR mit jedem Zyklus. Eine Probe, die zu Reaktionsbeginn doppelt
so viele DNA-Moleküle wie die Vergleichsprobe enthält, benötigt somit einen Zyklus
weniger, um den gleichen Ct-Wert zu erreichen. Anhand der unterschiedlichen Ct-Werte der
beiden Proben lässt sich also der relative Unterschied des Nukleinsäure-Gehaltes zwischen
den Proben berechnen (Walker, 2002).
Aufgrund von Schwankungen während der cDNA-Synthese und um Pipettierfehler beim
Einsatz der RNA-Menge für die cDNA-Synthese zu vermeiden, wird zusätzlich zu dem zu
untersuchenden Gen ein weiteres, so genanntes Housekeeping-Gen untersucht (Abbildung 23
und Abbildung 24). Hierbei handelt es sich um ein Gen, bei dem davon ausgegangen wird,
dass es unabhängig von äußeren Einflüssen d.h. unabhängig von der Behandlung der Zellen,
exprimiert wird. In der hier vorliegenden Arbeit wurde als Housekeeping-Gen GAPDH
(Glycerinaldehyd-3-Phosphat-dehydrogenase), einem Enzym, das in der Glykolyse beteiligt
ist, verwendet. Die für das zu untersuchende Gen erhaltenen Ct-Werte werden somit im
Endeffekt auf die für das Housekeeping-Gen erhaltenen Ct-Werte normalisiert. Mit der in
Kapitel �4.5.2.1 gezeigten Gleichung für den exponentiellen Reaktionsverlauf lässt sich somit
die relative Expression (R) der behandelten Probe in Bezug auf die unbehandelte Kontrolle
darstellen (Livak und Schmittgen, 2001; Pfaffl, 2001):
)()1(
)()1(,,
,,
GAPDHBehandeltGAPDHKontrolleGAPDH
XGenBehandeltXGenKontrolleXGen
CtCtE
CtCtER −+
−+=
Material und Methoden
41
Abbildung 23: relative Quantifizierung
Abbildung 24: Fließdiagramm
�Ct Gen X �Ct GAPDH
Threshold
Kontrolle, GAPDH
Kontrolle
Kontrolle, Gen X
Behandelt, GAPDH
Behandelt
Behandelt, Gen X
Zellen
RNA
cDNA
PCR
Ergebnisse und Diskussion
42
5 Ergebnisse und Diskussion
Im Vordergrund dieser Arbeit stand zunächst die Etablierung der Real Time RT-PCR-
Methode. Daher wird zuerst auf die Validierung der Messmethode eingegangen, bevor im
Anschluss die Effekte des für die Untersuchungen zur NER eingesetzten schädigenden Agens
UVC-Strahlung gezeigt werden. Um später auf die Wirkung von Cadmiumverbindungen in
Kombination mit UVC einzugehen, werden zuvor die Ergebnisse der jeweiligen Verbindung
aus den unterschiedlichen Teilbereichen der Fragestellung vorgestellt.
5.1 Messungen mit der Real Time PCR
Um die Eignung der Methode für die Analyse der Genexpression nachzuweisen, wurden für
jedes zu untersuchende Gen die Spezifität des Primers mittels Schmelzkurvenanalyse und die
Linearität mit Hilfe einer cDNA-Verdünungsreihe untersucht.
5.1.1 Schmelzkurvenanalyse
Zur Untersuchung der Spezifität der eingesetzten Primer, wurde nach abgeschlossener PCR-
Reaktion eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt.
Bei den eingesetzten Primerpaaren wurde darauf geachtet, dass keine komplementären
Strukturen enthalten sind, die zu einer Primer-Dimer-Bildung führen, und so in einer Primer-
Amplifizierung resultieren könnten. Dies würde sich in einem zusätzlichen Schmelzpunkt bei
niedrigeren Temperaturen zeigen. Analog hierzu würde auch die Amplifikation unspezifischer
Produkte in der Schmelzkurvenanalyse zu zusätzlichen Peaks führen. Eine Vervielfältigung
von DNA-Verunreinigungen in der Probe würde sich in einem zusätzlichen Peak oberhalb des
spezifischen mRNA-Peaks zeigen, da DNA aufgrund der enthaltenen Introns zu längeren
PCR-Produkten führt und somit höhere Temperaturen zur Denaturierung nötig sind. Um eine
Vervielfältigung von DNA zu vermeiden, wurden die RNA-Proben zum einen einem DNAse-
Verdau unterzogen, zum anderen wurden möglichst Intron-übergreifende Primer eingesetzt.
Alle zu untersuchenden Gene wiesen nur einen Schmelzpunkt auf, was auf die Spezifität der
eingesetzten Primer schließen lässt (Abbildung 25). Wie in Tabelle 3 zu erkennen ist,
korrelierte die Länge des Amplifikats mit der Höhe des Schmelzpunktes. So denaturierte p21
Ergebnisse und Diskussion
43
mit der geringsten Länge von 90 Basenpaaren bereits bei 84,5°C, während XPC mit einer
Länge von 112 Basenpaaren einen Schmelzpunkt von 87°C hatte. Die Schmelztemperatur
hängt allerdings nicht nur von der Länge, sondern zusätzlich auch vom G/C-Gehalt des
Amplifikats ab. Zwischen G/C kommt es zur Ausbildung von drei Wasserstoffbrücken im
Gegensatz zu zwei, die zwischen A/T gebildet werden. Hohe G/C-Anteile benötigen somit
höhere Temperaturen zur Denaturierung als A/T-Bereiche.
Abbildung 25: Schmelzkurvenanalyse der Amplifikate von GAPDH (A), XPC (B), p21 (C), p48 (D).
Die mit SYBR Green markierten PCR-Produkte wurden durch Erhöhung der Temperatur kontinuierlich bis zu ihrem definierten Schmelzpunkt denaturiert. Dies führt zu einer Abnahme der Fluoreszenz. Die Ableitungsfunktion der relativen Fluoreszenzänderung über die Temperatur (-dRFU/dT) weist am Schmelzpunkt ein Maximum auf.
Tabelle 3: Eigenschaften der amplifizierten Templates.
Gen Amplifikatlänge (bp) Schmelztemperatur (°C)
GAPDH 90 84,5
p48 103 85
XPC 112 87
p21 97 86,5
B A
D C
Ergebnisse und Diskussion
44
5.1.2 Effizienzbestimmung
Zur Überprüfung der Linearität und Sensitivität wurde die Amplifikation der cDNA mittels
einer seriellen cDNA-Verdünnung gemessen. Die ermittelten Effizienzen für die untersuchten
Gene sind in Tabelle 4 dargestellt.
Tabelle 4: Effizienzbestimmung mittels cDNA-Verdünnungreihe.
Gen Effizienz (%)
GAPDH 93,6
p48 101,0
XPC 92,9
p21 83,7
In der Literatur werden für optimierte Reaktionsbedingungen je nach zu untersuchendem Gen
in der Regel Effizienzen im Bereich von 78 bis 97 % angegeben (Köhler, 1995). Die Effizienz
der Reaktion hängt u.a. von der Amplifikationslänge, evtl. im Amplikon enthaltenen
Sekundärstrukturen und vom GC-Gehalt des Amplikons ab. Geringere Effizienzen weisen auf
eine nicht optimale PCR-Reaktion hin. Auch Effizienzen größer 1, also größer 100 % sind bei
der Verwendung von SYBR Green möglich. Dies weist daraufhin, dass zusätzlich zu dem
spezifischen zu untersuchenden Gen ein weiteres unspezifisches Produkt gebildet wird.
Sowohl die Ergebnisse der Schmelzkurvenanalyse als auch die erhaltenden Effizienzen
verdeutlichen, dass die zugrunde liegenden PCR-Bedingungen (Annealingtemperatur,
Annealingzeit, eingesetzte Primer) geeignet sind für das verwendete Testsystem.
Ergebnisse und Diskussion
45
5.2 UVC-Bestrahlung
Zur Untersuchung der über die NER vermittelten Beseitigung sperriger DNA-Addukte wird
als DNA-schädigendes Agens UVC-Strahlung eingesetzt. Da das Absorptionsmaximum der
DNA bei 260 nm liegt und somit die photochemische Reaktion durch UVC-Strahlung sehr
effizient ist, wird in den meisten Studien UVC-Strahlung angewendet. Durch UVC-Strahlung
wird ein gut definiertes Schadensspektrum erhalten, so kommt es vorwiegend zur Bildung
von CPDs und (6-4)-Photoprodukten (Ravanat et al., 2001).
Im Folgenden werden die Einflüsse von UVC-Strahlung auf die Koloniebildungsfähigkeit, die
Zellzyklusphasenverteilung, den p53-Gehalt und die Genexpression von durch p53 regulierten
Genen (p48, XPC, p21) gezeigt.
5.2.1 Koloniebildung
Zur Abschätzung der Bestrahlungsdosis, die zum einen eine genügend große Zahl an Schäden
verursacht, zum anderen aber das Überleben eines großen Anteils der Zellen sicherstellt,
wurde die Zytotoxizität der UVC-Strahlung anhand der Koloniebildungsfähigkeit in einem
Dosisbereich von 0 bis 20 J/m2 ermittelt.
Abbildung 26: Koloniebildungsfähigkeit von A549 Zellen nach UVC-Bestrahlung.
Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.
Ergebnisse und Diskussion
46
UVC-Bestrahlung führte zu einer rapiden Abnahme der Koloniebildungsfähigkeit mit
zunehmender UVC-Dosis. Während eine Bestrahlung mit 5 J/m2 noch in einer
Koloniebildungsfähigkeit über 70 % im Vergleich zu unbestrahlten Kontrollzellen resultierte,
war die Anzahl der Kolonien nach einer Behandlung mit 7,5 J/m2 nur noch bei etwa 50 %
(Abbildung 26). Für die nachfolgenden Versuche wurde eine UVC-Dosis von 5 J/m2
eingesetzt.
5.2.2 Induktion von p53
Das Protein p53 besitzt in ungestressten Zellen aufgrund eines ständigen Ubiquitin-
vermittelten mdm2-abhängigen Abbaus eine geringe Halbwertszeit von 15 bis 20 Minuten.
Infolge von DNA-Schäden wird die Bindung von mdm2 an p53 durch Phosphorylierung in
der N-teminalen Transaktivierungsdomäne des p53 verhindert und somit der Abbau von p53
reduziert (zusammengefasst in Alarcon-Vargas und Ronai, 2002; Giaccia und Kastan, 1998).
UVC-Strahlung generiert DNA-Addukte (CPDs und (6-4)-Photoprodukte). Zur Untersuchung
der zeitabhängigen Induktion des p53-Gehaltes in Folge der UVC-Bestrahlung, wurde der
p53-Protein-Gehalt zu verschiedenen Zeitpunkten nach einer UVC-Bestrahlung durch eine
Westernblot-Analyse mittels eines monoklonalen Antikörpers gegen p53 bei einer Dosis von
5 J/m2 bestimmt. Es zeigte sich eine starke Induktion des p53-Protein-Gehalts mit einem
Maximalgehalt drei Stunden nach der Bestrahlung. Daraufhin führte die Bestrahlung zu einer
Abnahme an p53, bis nach etwa 24 Stunden wieder annähernd das Niveau unbestrahlter
Zellen erreicht wurde (Abbildung 27).
Abbildung 27: Westernblot nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.
Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde ein Westernblot mit anti-p53-Antikörper DO-7 aus dem Zelllysat durchgeführt. Dargestellt ist ein Westernblot. Insgesamt wurden drei unabhängige Versuche durchgeführt, die alle das gleiche Ergebnis aufwiesen.
0 1 3 6 10 12 18 24 Zeit nach UVC-Bestrahlung (h)
Ergebnisse und Diskussion
47
Von einer Induktion von p53 in Folge von UVC-Stahlung berichteten ebenfalls
Untersuchungen von Ford und Hanawalt (1997) in menschlichen Fibroblasten. Allerdings
zeigten diese Zellen bei einer Bestrahlungsdosis von 20 J/m2 eine etwas verzögerte Induktion
mit einem Maximum zwischen 12 und 24 h. Dies könnte auf die in der Studie verwendete
primäre Zelllinie und somit längeren Generationszeit im Vergleich zu der in der hier
vorliegenden Arbeit verwendeten A549 Zellen zurückzuführen sein. Ebenfalls konnten
Studien von Hwang et al. (1999) sowie von Adimoolam und Ford (2002) und Adimoolam et
al. (2001) eine Induktion von p53 durch UV-Strahlung nachweisen.
Der genaue Mechanismus für die Auslösung der Phosphorylierung und damit der Aktivierung
von p53 infolge von UVC- induzierter Schäden ist nicht bekannt. Dagegen gut untersucht ist
die Aktivierung infolge von �-Strahlung. Hier scheint der so genannten ATM (Ataxia
Telangiectasia mutated)-Kinase eine große Bedeutung zuzukommen. �-Strahlung führt zur
Bildung von Strangbrüchen, die eine Aktivierung der ATM und somit eine Phosphorylierung
von p53 zur Folge haben. Während AT-Zellen, in denen das Gen, das für ATM codiert,
mutiert ist, eine verzögerte Phosphorylierung von p53 infolge von �-Strahlung aufweisen, ist
die Aktivierung von p53 durch UV-Strahlung unbeeinflusst. Bei durch UV-Strahlung
induzierten Schäden spielt die so genannte ATR (Ataxia Telengiectasia Related)-Kinase eine
Rolle (zusammengefasst in Abraham, 2001; Caspari, 2000; Tibbetts et al., 1999). Der genaue
Auslöser für die p53-Phosphorylierung durch ATR ist allerdings nicht bekannt. Kaufmann
und Paules (1996) sowie Nelson und Kastan (1994) vermuten die Bildung von DNA-
Strangbrüchen, die kurzfristig während der Reparatur der durch UV-Strahlung induzierten
Photoprodukte gebildet werden. Allerdings führt eine Bestrahlung von XPA defizienten
Zellen ebenfalls zu einer p53-Akkumulation und dies bei geringeren UV-Dosen als für
normale Zellen zur Aktivierung nötig sind. In diesen Zellen ist allerdings die
Schadenserkennung und folglich auch die Inzision der DNA verhindert, so dass keine
intermediär gebildeten Strangbrüche infolge einer stattfindenden Reparatur entstehen können.
Dem gegenüber zeigen XPC defiziente Zellen, in denen nur die globale genomische Reparatur
beeinflusst ist, nicht aber die transkriptionsgekoppelte Reparatur, keine verstärkte p53
Aktivierung im Vergleich zu normalen Zellen. Diese Ergebnisse sowie die Beobachtung, dass
eine Blockierung der Transkription durch den RNA Polymerase Inhibitor α-Amanitin
ebenfalls zu einer p53 Akkumulation führt, lassen die Vermutung zu, dass DNA-Schäden in
aktiv transkribierten Genen der Auslöser der Aktivierung von p53 sein könnten (Yamaizumi
und Sugano, 1994; Ljungman und Zhang, 1996; Dumaz et al., 1997).
Ergebnisse und Diskussion
48
5.2.3 Genexpression von p21, p48 und XPC
p53 ist als Transkriptionsfaktor an der Expression einer Vielzahl von Genen involviert. Zur
Untersuchung der Auswirkung des erhöhten Proteingehaltes infolge der UVC-Bestrahlung auf
die Expression seiner Zielgene, wurde die Genexpression verschiedener, durch p53 regulierter
Gene mittels Real Time RT-PCR untersucht.
5.2.3.1 p21
Für p21, ein Gen dessen Produkt in der Zellzykluskontrolle eine Rolle spielt, ist die p53-
abhängige Induktion in Folge von DNA-Schäden schon lange bekannt. Es zeigte sich ein
zeitabhängiger Verlauf des p21 mRNA-Gehaltes in Folge einer UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.
Abbildung 28: Relative Genexpression von p21 nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.
Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zu unbehandelten Kontrollzellen aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
Zunächst führte die Bestrahlung zu einer Induktion der Genexpression relativ zur auf 1
normierten Kontrolle. Zwischen drei und zehn Stunden nach der Bestrahlung wurden
Maximalwerte von vier- bis fünffach erhöhten mRNA Gehalten im Vergleich zur
unbehandelten Kontrolle erreicht. Ab 12 Stunden fand ein Rückgang der Genexpression statt
Ergebnisse und Diskussion
49
und erreichte nach etwa 18 Stunden einen noch etwa doppelten Wert im Vergleich zur
unbestrahlten Kontrolle, der bis hin zu 24 Stunden erhalten blieb (Abbildung 28).
5.2.3.2 p48
Zur Untersuchung der Kinetik der Induktion von p48 in den in der vorliegenden Arbeit
verwendeten menschlichen Lungenkrebszellen wurde die Genexpression mittels Real Time
RT-PCR ermittelt.
Die UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2 verursachte eine zeitabhängige Steigerung der
Genexpression von p48 mit einer Verdopplung der mRNA-Menge im Vergleich zu
unbestrahlten Zellen nach etwa 10 bis 12 Stunden. Ab etwa 18 Stunden nach der Bestrahlung
näherte sich die Genexpression bis hin zu 24 Stunden dem Ausgangwert von unbehandelten
Kontrollzellen (Abbildung 29).
Abbildung 29: Relative Genexpression von p48 nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.
Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zu unbehandelten Kontrollzellen aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
Analog hierzu zeigten auch die Ergebnisse von Hwang et al. (1999) eine zeitabhängige
Induktion der mRNA von p48 durch UV-Strahlung in menschlichen Lungenfibroblasten. Hier
wurde von einer etwa zweifachen Induktion der Genexpression 16 Stunden nach der
Ergebnisse und Diskussion
50
Bestrahlung im Vergleich zu unbestrahlten Zellen berichtet. Somit entsprechen die
Absolutwerte der maximalen Induktion der in dieser Arbeit ermittelten relativen
Genexpression. Die im Vergleich zu den hier gezeigten Ergebnissen verzögerte Induktion von
p48, könnte auf der in der Studie eingesetzten primären Ziellinie und somit längeren
Generationszeit zurückzuführen sein.
5.2.3.3 XPC
Ein weiteres Gen, dessen Expression durch p53 reguliert wird, ist das XPC. Eine UVC-
Bestrahlung mit 5 J/m2 führte zunächst zu einer gesteigerten Expression, die etwa sechs
Stunden nach der Bestrahlung einen Maximalwert erreichte und im Vergleich zur
unbestrahlten Zellen einen doppelt so hohen mRNA-Gehalt aufwies. Die mRNA-Menge
nahm daraufhin nach etwa 12 Stunden ab, blieb allerdings bis hin zu 24 Stunden nach der
Bestrahlung auf im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle erhöhten Werten (Abbildung 30).
Abbildung 30: Relative Genexpression von XPC nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.
Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
Die Ergebnisse sind im Einklang mit Versuchen von Adimoolam und Ford (2002), in denen
eine Zeit- und p53-abhängige Induktion von XPC infolge einer UVC-Bestrahlung gezeigt
wurde.
Ergebnisse und Diskussion
51
5.2.4 Zellzyklusphasenverteilung
Ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität ist die
Zellzykluskontrolle. Treten DNA-Schäden auf, werden so genannte Kontrollpunkte aktiviert,
um einen Übergang der Zelle in die nächste Phase des Zellzyklus zu verhindern.
Um zu untersuchen, ob die durch UVC-Strahlung induzierten Photoprodukte zu einer
Aktivierung von Kontrollpunkten führen, wurde die Zellzyklusphasenverteilung von A549
Zellen nach einer Bestrahlung mit 5 J/m2 ermittelt. Hierzu wurden die Zellen zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung fixiert, die DNA mit dem
Fluoreszenzfarbstoff DAPI gefärbt und schließlich die vom DNA-Gehalt abhängige
Fluoreszenz am Durchlusszytometer bestimmt.
Problematisch ist allerdings die Anzahl der ausgestreuten Zellen pro Zellkulturschale. Bei zu
großer Konfluenz kommt es aufgrund der Kontaktinhibition zu einem Wachstumsstopp, der
sich in einem zunehmenden Anteil der G1-Phase bemerkbar macht (Tabelle 5). Um allerdings
zum Zeitpunkt des Bestrahlens gleiche Bedingungen und damit gleiche Konfluenz zu
gewährleisten, muss die ausgestreute Zellzahl möglichst gering gewählt werden, um im
gesamten Messbereich keine Konfluenz der Schale zu erhalten.
Tabelle 5: Einfluss der Konfluenz auf die Zellzyklusphasenverteilung in A549 Zellen.
Anzahl Zellen (105)
G1 S G2
4 55,7 29,3 15,0
10 61,3 24,5 14,2
15 70,8 18,6 10,6
20 75,9 13,7 10,4
In Abbildung 31 ist der Anteil der Zellen in den jeweiligen Phasen des Zellzyklus gegen die
Zeit nach der UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2 aufgetragen. Es ist deutlich zu erkennen, dass die
Bestrahlung nach etwa sechs Stunden zu einer Zunahme des Anteils der Zellen in der S-Phase
führte, während im gleichen Maße der G1-Phasenanteil abnahm. Der maximale Anteil der
Zellen in der S-Phase zeigte sich im Bereich von zehn bis zwölf Stunden. In den darauf
folgenden Stunden näherten sich die Anteile der Zellen in den jeweiligen Phasen denen der
Ergebnisse und Diskussion
52
unbehandelten Kontrollzellen. Die nach etwa 12 Stunden erfolgte Aufhebung des S-
Phasenarrests könnte auf eine Reparatur der DNA-Schäden zurückgeführt werden.
Abbildung 31: Zellzyklusphasenverteilung nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.
Exponentiell wachsende Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach verschiedenen Zeitpunkten wurde die Zellzyklusphasenverteilung am Durchflusszytometer ermittelt. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen ± SD.
Verschiedene Arbeiten in menschlichen Zellen zeigen, dass die Reparatur von 6-4-PP sehr
schnell und effizient erfolgt, mit einer nahezu vollständigen Reparatur nach drei Stunden,
wohingegen die Reparatur von CPDs selbst nach 24 Stunden nur 50 bis 80 % beträgt. (Ford
und Hanawalt, 1997; Hwang et al., 1999; Riou et al., 2004). Während der DNA-Replikation
in der S-Phase des Zellzyklus führen die verbleibenden Schäden zu einer Aktivierung des S-
Phasenkontrollpunktes. Der erfolgte S-Phasenarrest und somit die Inhibierung der DNA-
Synthese-Rate äußert sich sowohl auf der Ebene der Kettenverlängerung als auch auf Ebene
der Replikon-Initiation der DNA-Synthese. Die replikativen DNA-Polymerasen ε und δ sind
nicht in der Lage, an Photoprodukten vorbei zu replizieren, so dass eine „translesion
synthesis“ durch eine spezielle Polymerase η eingeleitet werden muss. Des Weiteren spielen
auch Prozesse eine Rolle, in denen die Proteinkinase ATR, sowie die von ATR domnstream
regulierte Kinase Chk1 (checkpoint kinase) involviert sind und zur Phosphorylierung von p53
führen (Heffernan et al., 2002). p53 kann dann Gene induzieren, deren Genprodukte den
Fortgang des Zellzyklus kontrollieren.
G1
S
G/M
Ergebnisse und Diskussion
53
5.3 Cadmium
Im folgenden Teil dieser Arbeit werden vergleichende Untersuchungen zum Einfluss von
löslichem CdCl2 und partikulärem CdO auf die Zytotoxizität und die Induktion des
Tumorsuppressorproteins p53 vorgestellt. Im Anschluss werden die Effekte der eingesetzten
Cadmiumverbindungen auf die Struktur und die Funktion des p53-Proteins näher betrachtet.
Die Größenverteilung und das Agglomerationsverhalten der CdO-Partikel wurden mit dem
Rasterelektronenmikroskop (LEO 1530) am Institut für Werkstoffe der Elektrotechnik der
Universität Karlsruhe untersucht. Die Aufnahmen zeigen, dass die eingesetzten Partikel
kleiner sind als 1 µm (Abbildung 32) und somit phagozytiert werden können.
Abbildung 32: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der verwendeten CdO-Partikel.
5.3.1 Koloniebildung
Zur Abschätzung der Zytotoxizität von CdCl2 und CdO wurden A549 Zellen auf die beiden
Endpunkte Zellzahl und Koloniebildungsfähigkeit nach einer 24 Stunden-Inkubation mit der
jeweiligen Cadmiumverbindung untersucht.
Werden die Ergebnisse von löslichem CdCl2 und unlöslichem CdO miteinander verglichen, so
zeigten 75 µM CdCl2 und 1,5 µg CdO ähnliche zytotoxische Eigenschaften, mit einer
Reduktion der Koloniebildungsfähigkeit auf etwa 50 % in Bezug zur unbehandelten
Kontrolle. Während bei CdO im untersuchten Konzentrationsbereich die Zellzahl annähernd
im gleichen Maße reduziert wurde wie die Koloniebildungsfähigkeit, war bei CdCl2 die
Koloniebildung der sensitivere Endpunkt im Vergleich zur Zellzahl. Während eine Inkubation
1 µm 10 µm
Ergebnisse und Diskussion
54
mit 100 µM CdCl2 die Zellzahl um 30 % erniedrigte, war die Koloniebildung bereits um 80 %
des Ausgangswertes reduziert (Abbildung 33).
Abbildung 33: Koloniebildungsfähigkeit und Zellzahl von A549 Zellen nach 24 h Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B).
Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen ± SD.
A
Koloniebildungsfähigkeit
Zellzahl
B
Koloniebildungsfähigkeit
Zellzahl
Ergebnisse und Diskussion
55
5.3.2 Induktion von p53
Das Protein p53 unterliegt aufgrund einer Ubiquitin vermittelten Degradation einem ständigen
Auf- und Abbau in der Zelle. Die kurze Halbwertszeit von etwa 20 Minuten in ungestressten
Zellen wird durch eine Stabilisierung infolge von DNA-Schäden erhöht.
Ein möglicher Einfluss einer 24-Stunden-Inkubation mit CdCl2 und CdO auf den p53-
Proteingehalt wurde mittels Westernblot-Analyse untersucht.
Abbildung 34: Westernblot nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B).
Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde ein Westernblot mit anti-p53-Antikörper DO-7 aus dem Zelllysat durchgeführt. Dargestellt ist ein Westernblot. Insgesamt wurden drei unabhängige Versuche durchgeführt, die alle das gleiche Ergebnis auswiesen.
Sowohl CdCl2 als auch CdO resultierte in einer konzentrationsabhängigen Zunahme der
Bandenintensität in A549 Zellen. Eine Inkubation mit CdCl2 zeigte bereits ab 10 µM eine
deutliche Steigerung des p53-Proteingehaltes. Ab etwa 50 µM wurde eine Art Plateau erreicht
und die Expression zeigte bis hin zu 75 µM einen maximalen Wert. Ebenso verstärkte CdO
bereits bei geringen Konzentrationen von etwa 0,2 µg/cm2 Wachstumsfläche der Zellen die
Expression von p53, die bis hin zu 1,5 µg/cm2 stetig anstieg (Abbildung 34).
Ein Mechanismus der zu einem gesteigerten p53-Proteingehalt führen könnte, wäre eine
Induktion von oxidativen DNA-Schäden als Folge einer verstärkten Bildung von reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) aufgrund einer Störung der zellulären Verteidigungsmechanismen
0 0 10 25 50 60 75 CdCl2 [µM]
0 0 0,1 0,2 0,5 1 1,5 CdO [µg/cm²]
A
B
Ergebnisse und Diskussion
56
(Stohs und Bagchi, 1995; Valko et al., 2005). Eine vermehrte Bildung von ROS, vermutlich
in erster Linie Superoxidradikalanion und Wasserstoffperoxid wurde durch CdCl2 in
kultivierten menschlichen Lungenfibroblasten und Makrophagen nachgewiesen (Hassoun und
Stohs, 1996; Yang et al., 1997). Dally und Hartwig (1997) konnten in Hela-Zellen eine
Induktion von DNA-Strangbrüchen durch CdCl2 nachweisen. Als ein weiterer Mechanismus
zur Entstehung oxidativer DNA-Schäden wird neben der ROS-vermittelten Induktion, eine
Hemmung der Reparatur von endogen-induzierten oxidativen DNA-Schäden diskutiert. So
konnten Dally und Hartwig (1997) eine verminderte Reparatur von lichtinduzierten Fpg-
sensitiven Stellen durch CdCl2 in HeLa-Zellen zeigen. Die beobachtete Hemmung der
Basenexzisionsreparatur könnte auf einer Hemmung der Schadenserkennung durch spezielle
Glykosylasen zurückzuführen sein. So zeigen neue Studien eine Herunterregulierung der
Expression der menschlichen Ogg1 (8-Oxoguanin-Glykosylase) durch Cadmium (Potts et al.,
2003; Youn et al., 2005). SP1, der Transkriptionsfaktor für Ogg1, besitzt einen Zinkfinger, so
dass die Hemmung der Ogg1-Expression auf eine Beeinträchtigung des Zinkfingers
zurückzuführen sein könnte (Youn et al., 2005).
5.3.3 Immunpräzipitation
Zur Untersuchung der Struktur von p53 wird eine Immunpräzipitation mit
konformationsspezifischen Antikörpern durchgeführt. Die Struktur von p53 wird durch die
Komplexierung eines Zink-Ions aufrechterhalten. Wird das Zink-Ion durch Metallchelatoren
oder durch Oxidation der Zink-bindenden Cysteine aus dem Proteinmotiv entfernt, kommt es
zu einer Konformationsänderung. Zwischen den beiden p53-Formen, der gefalteten Wildtyp-
Form und der ungefalteten „mutanten“ Form, wurde mit konformationsspezifischen
Antikörpern unterschieden. Der Antikörper PAb 1620 ist gegen ein konformationsabhängiges
Epitop in der DNA-Bindungsdomäne gerichtet, das empfindlich gegenüber Denaturierung ist
und somit die Wildtyp-Konformation erkennt. Im Gegensatz dazu bindet der Antikörper
PAb 240 an ein Aminosäuremotiv, das in der Wildtyp-Form verborgen ist und erst bei der
„mutanten“-Form durch Umfaltung des Proteins zum Vorschein kommt (Milner, 1995). Die
Bezeichnung „mutante“ Form resultiert aus der Tatsache, dass Mutationen, die zu einer
Inaktivierung von p53 als Tumorsuppressorprotein führen einen gemeinsamen Effekt auf die
Konformation des Proteins haben und das Protein folglich keine Reaktion mit dem Antikörper
PAb 1620 zeigt, stattdessen aber eine Bindung des Antikörpers PAb 240 (Gannon et al.,
1990).
Ergebnisse und Diskussion
57
Abbildung 35: Immunpräzipitation mit konformationsspezifischen Antikörpern gegen wildtyp- und „mutante“ Konformation von p53 nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B).
A549 Zellen wurden 24 h mit CdCl2 inkubiert und anschließend wurde eine Immunpräzipitation vom p53 aus dem Zellysat mit entsprechenden Antikörpern gegen die Wildtyp- (PAb 1620) bzw. „mutante“ Konformation (PAb 240) durchgeführt. Immunopräzipitiertes p53 wurde im Anschluss durch Westernbot-Analyse mit dem anti-p53-Antikörper CM-1 detektiert. Dargestellt ist ein Ergebnis von drei Versuchen.
Die Effekte von CdCl2 und CdO auf die Konformation des p53 Proteins werden in Abbildung
35 gezeigt. Dargestellt sind jeweils nur die spezifischen Banden der resultierten Blots.
Generell wiesen die Blots unspezifische Banden auf, die allerdings auch dann auftraten, wenn
an Stelle des Zelllysats nur Immunpräzipitationspuffer für die Immunpräzipitation verwendet
wurde. Diese Artefakte lassen sich vermutlich auf die Verwendung von Protein A/G
zurückführen. IgGs binden unabhängig von der Antigenspezifität durch den FC-Teil an
Proteine A/G, somit kann der sekundäre Antikörper sowohl spezifisch an p53 als auch
unspezifisch an Protein A/G binden.
Beide Verbindungen zeigten eine deutliche konzentrationsabhängige Induktion der
ungefalteten „mutanten“-Form des Proteins, während die gefaltete Wildtyp-Form nahezu
unverändert war. CdCl2 führte bereits bei einer Konzentration von 10 µM zu einer schwachen
Bildung der „mutanten“ Konformation. Eine starke Bildung der „mutanten“ Konformation
war ab Konzentrationen von 50 µM bis hin zu 75 µM zu sehen. Ebenso resultierte die
Wildtyp-Konformation
„mutante“ Konformation
Wildtyp-Konformation
„mutante“ Konformation
0 10 25 50 75 75 0 10 25 50 75 75 CdCl2 [µM]
0 0,2 0,5 0,75 1 0 0,2 0,5 0,75 1 CdO [µg/cm²]
A
B
Ergebnisse und Diskussion
58
Behandlung mit CdO schon bei 0,2 µg/cm2 Wachstumsfläche in einer Denaturierung von p53,
die konzentrationsabhängig bis hin zu 1 µg/cm2 verstärkt wurde.
Die mittels Westernblot in Kapitel �5.3.2 gezeigte Induktion von p53 infolge der Inkubation
mit der jeweiligen Cadmiumverbindung scheint also vielmehr auf einer Umwandlung in die
„mutante“ Form als auf einer Induktion der Wildtyp-Form zu beruhen. Die „mutante“ Form
besitzt eine mit 5 bis 10 Stunden deutlich längere Halbwertszeit als die Wildtyp-Form mit
maximal 20 Minuten (Soussi, 2000). Dadurch führt eine Umwandlung in die „mutante“ Form
zu einer Akkumulation von p53.
Ob Cadmium allerdings dennoch in der Lage ist, p53-Wildtyp zu induzieren (infolge
eventuell gebildeter oxidativer DNA-Schäden) und diese Wildtyp-Form dann direkt in die
„mutante“ Form umgewandelt wird, bedarf noch weiterer Klärung.
Während frühere Studien für das lösliche CdCl2 bereits eine Umwandlung der Wildtyp-Form
in die „mutante“ Form zeigen konnten (Hainaut und Milner, 1993b; Meplan et al., 1999),
wurde in der hier vorliegenden Arbeit erstmalig eine Konformationsänderung für das
unlösliche partikuläre CdO nachgewiesen.
5.3.4 Genexpression von p21, p48 und XPC
Um zu untersuchen inwieweit die Cadmium-vermittelte Strukturveränderung von p53 einen
Einfluss auf die Expression seiner Zielgene hat, wurde die Genexpression verschiedener,
durch p53 regulierter Gene mittels Real Time RT-PCR untersucht.
5.3.4.1 p21
In Abbildung 36 ist die Genexpression von p21 in Abhängigkeit von der inkubierten
Cadmiumkonzentration gezeigt. Die Ergebnisse sind jeweils relativ zu der auf 1 normierten
Kontrolle dargestellt. Mit steigender Konzentration führte die Inkubation zu einer Zunahme
der Genexpression. Die Induktion durch CdCl2 war bereit ab 10 µM deutlich zu erkennen. Die
Werte stiegen bis hin zu 50 µM linear an, bis sich ab etwa 50 µM eine Art Plateau einstellte,
nach dem mit steigender Konzentration keine weitere Erhöhung erzielt werden konnte. Im
Gegensatz dazu resultierte die Behandlung mit CdO in einer allmählichen Induktion der
Genexpression, die insgesamt schwächer ausgeprägt war als bei CdCl2.
Ergebnisse und Diskussion
59
Abbildung 36: Relative Genexpression von p21 nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B)
Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
A
B
Ergebnisse und Diskussion
60
5.3.4.2 p48
Versuche zum Einfluss der jeweiligen Cadmiumverbindungen auf den basalen mRNA Gehalt
von p48 zeigten eine Hemmung der Genexpression mit steigender Cadmiumkonzentration
(Abbildung 37).
Abbildung 37: Relative Genexpression von p48 nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B).
Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
B
A
Ergebnisse und Diskussion
61
CdCl2 reduzierte konzentrationsabhängig den mRNA Gehalt in A549 Zellen ab 50 µM und
erreichte bei 75 µM nur noch etwa 50 % des Ausgangswertes. Eine Inkubation mit CdO
resultierte ebenfalls in einer Abnahme der Genexpression, wenn auch nicht so stark
ausgeprägt wie bei CdCl2.
5.3.4.3 XPC
In Abbildung 38 ist der Einfluss von CdCl2 und CdO auf die basale Genexpression von XPC
dargestellt. Die Kontrolle wurde auf 1 normiert und alle gezeigten Werte relativ zur
unbehandelten Kontrolle errechnet.
Abbildung 38: Relative Genexpression von XPC nach Inkubation mit CdCl2 (A) und CdO (B). Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert und anschließend wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
A
B
Ergebnisse und Diskussion
62
Sowohl CdCl2 als auch CdO zeigten im untersuchten Konzentrationsbereich einen nur
schwach ausgeprägten Effekt auf die relative Genexpression von XPC. In wieweit sich
allerdings selbst kleinste Änderungen im mRNA Gehalt auf den für die Wirkung in der Zelle
ausschlaggebende Proteinmenge auswirkt, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet
werden.
Ergebnisse und Diskussion
63
5.4 Kombinationsuntersuchungen
5.4.1 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte Zytotoxizität
Der Effekt der jeweiligen Cadmiumverbindung auf die UVC-induzierte Zytotoxizität wurde
anhand der Koloniebildungsfähigkeit nach 24 h Vorinkubation mit CdCl2 bzw. CdO im
Anschluss an eine Bestrahlung mit einer nicht zytotoxischen Dosis von 5 J/m2 UVC-
Strahlung konzentrationsabhängig untersucht.
Abbildung 39: Einfluss von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte Zytotoxizität.
Die jeweiligen Werte bei den entsprechenden Cadmiumkonzentrationen sind normiert auf unbehandelte Zellen für alleinige Cadmium-Inkubation bzw. auf UVC behandelte Zellen für UVC + Cadmium. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmung +SD.
CdCl2
UVC 5J/m2 + CdCl2
CdCl2
UVC 5J/m2 + CdCl2
A
B
Ergebnisse und Diskussion
64
Beide Verbindungen zeigten keine deutliche Verstärkung der zytotoxischen Eigenschaft von
UVC-Strahlung (Abbildung 39). Eine mögliche durch Cadmium verursachte
Reparaturhemmung UVC-induzierter Schäden muss allerdings nicht zwangsläufig in einem
Replikationsstopp und somit in einer Abnahme der Überlebensrate resultieren. Nicht
reparierte DNA-Addukte können über so genannte TLS (translesion synthesis) durch die
Polymerase η entfernt werden.
5.4.2 Einfluss von Cadmium auf die UVC-induzierte p53 Induktion
Wie in Kapitel �5.2.2 gezeigt werden konnte, führte eine UVC-Behandlung zu einer Zunahme
des p53 Gehalts mit einem Maximalwert drei Stunden nach der Bestrahlung. Der Effekt von
Cadmium auf den basalen Level von p53 wurde in Kapitel �5.3.3 beschrieben. Beide
untersuchten Verbindungen führten zu einer Denaturierung der Wildtyp-Form von p53 und
induzierten dadurch die Bildung der „mutanten“ Konformation. Zur Untersuchung des
Einflusses von Cadmium auf das durch UVC-Strahlung induzierte p53 Protein, wurden
Kombinationsuntersuchungen durchgeführt. Hierzu wurden A549 Zellen 24 Stunden mit der
jeweiligen Cadmiumverbindungen vorinkubiert, anschließend mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und
im Anschluss nach drei Stunden Nachinkubation mit Cadmium die Konformation des
resultierenden p53 Proteins mittels Immunpräzipitation bestimmt.
In Abbildung 40 sind zunächst die Effekte einer alleinigen Behandlung mit UVC bzw. mit der
jeweiligen Cadmiumverbindung dargestellt. Des Weiteren ist der Einfluss einer Co-
Inkubation auf die p53 Konformation gezeigt. Es konnte zunächst beobachtet werden, dass es
sich bei der in Abschnitt �5.3.2 gezeigten Induktion von p53 infolge der UVC-Bestrahlung um
eine Zunahme des Gehalts der Wildtyp-Form handelte und nicht um eine Stabilisierung
aufgrund einer Bildung der „mutanten“ Konformation. Die Kombinationsversuche zeigten,
dass beide Verbindungen zu einer Abnahme der Wildtyp-Konformation im Vergleich zu
UVC behandelten Zellen führten. Hierbei war der Effekt bei CdCl2 stärker ausgeprägt als bei
CdO. Allerdings führte eine Co-Inkubation sowohl mit CdCl2 als auch mit CdO zu einer
Zunahme der „mutanten“ Konformation, die eine längere Halbwertszeit besitzt. Ob dennoch
eine UV-induzierte p53 Induktion stattfindet, gebildetes p53 dann allerdings durch die
jeweilige Cadmiumverbindung sofort in die „mutante“ Form überführt wird, oder ob eventuell
sogar die Induktion der Wildtyp-Konformation gehemmt wird, indem Cadmium in die
Signalkaskade eingreift, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht geklärt werden.
Ergebnisse und Diskussion
65
Abbildung 40: Einfluss von 60 µM CdCl2 (A) und 1,0 µg/cm2 CdO (B) auf die UVC- induzierte p53 Induktion.
A549 Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und nach 3 Stunden Nachinkubation wurde eine Immunpräzipitation aus dem Zellysat mit entsprechenden Antikörpern gegen die Wildtyp- (PAb 1620) bzw. „mutante“ Konformation (PAb 240) durchgeführt. Immunopräzipitiertes p53 wurde im Anschluss durch Westernbot-Analyse mit dem anti-p53-Antikörper CM-1 detektiert. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis von drei Versuchen.
5.4.3 Genexpression von p21, p48 und XPC
Der Einfluss der Cadmiumverbindungen auf die UVC-induzierte Genexpression der p53
Zielgene p21, p48 und XPC wurde nach 24 Stunden Vorinkubation untersucht. Da für die drei
betrachteten Gene die Induktion infolge der UVC Bestrahlung zwischen 6 und 10 Stunden
nach der Bestrahlung maximal ist, wurde für die Kombinationsuntersuchungen die
Genexpression 10 Stunden nach der UVC Behandlung mittels Real Time RT PCR untersucht.
5.4.3.1 p21
In Abbildung 41 ist der Einfluss von Cadmium auf die durch UVC-Strahlung induzierte p21
Genexpression dargestellt. Zunächst ist erneut der in Kapitel �5.2.3.1 beschriebene Effekt einer
alleinigen UVC-Bestrahlung 10 Stunden nach der Behandlung gezeigt. Die Bestrahlung
resultierte in einer etwa fünffachen Zunahme der Genexpression im Vergleich zur
unbestrahlten Kontrolle. Eine Inkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung erreichte
Ko CdCl2 UV
wildtyp-Konformation „mutante“ Konformation
UV CdCl2 +
UV
CdCl2 +
UV
Ko CdCl2 UV UV CdCl2 +
UV
CdCl2 +
UV
Ko CdO UV
wildtyp-Konformation
„mutante“ Konformation
UV CdO +
UV
CdO +
UV
Ko CdO UV UV CdO +
UV
CdO +
UV
A
B
Ergebnisse und Diskussion
66
dagegen nur mRNA-Gehalte von etwa doppeltem Gehalt bei 60 und 75 µM CdCl2 (Abbildung
41 A) bzw. dreifachen bei 1,0 und 1,5 µg/cm2 CdO (Abbildung 41 B).
Abbildung 41: Auswirkung von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte p21 Genexpression.
Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p21 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
A
B
Ergebnisse und Diskussion
67
5.4.3.2 p48
Die UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2 verursachte eine zeitabhängige Steigerung der
Genexpression von p48 mit einer mehr als doppelten mRNA-Menge im Vergleich zu
unbestrahlten Zellen nach etwa 10 bis 12 Stunden (Kapitel �5.2.3.2).
Abbildung 42: Auswirkung von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte p48 Genexpression.
Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung inkubiert, anschließend wurde mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von p48 relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
A
B
Ergebnisse und Diskussion
68
Inwieweit dieser Effekt durch eine Vorinkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung
beeinflusst wird, ist in Abbildung 42 dargestellt. Sowohl CdCl2 als auch CdO führten zu einer
konzentrationsabhängigen Abnahme der durch alleinige UVC-Bestrahlung nach 10 Stunden
induzierten mRNA-Menge.
5.4.3.3 XPC
Eine UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2 führte wie in Kapitel �5.2.3.3 gezeigt zu einer
zeitabhängigen Induktion der XPC Genexpression mit einer maximalen Induktion 12 Stunden
nach der Bestrahlung.
Abbildung 43: Auswirkung von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die UVC-induzierte XPC Genexpression.
Exponentiell wachsende Zellen wurden 24 h mit der jeweiligen Cadmiumverbindung vorinkubiert, anschließend mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und in Gegenwart von Cadmium 10 h nachinkubiert. Im Anschluss wurde eine Real Time RT-PCR durchgeführt. Die Werte wurden normiert auf das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte der Genexpression von XPC relativ zur unbehandelten Kontrolle aus mindestens drei unabhängigen Bestimmungen + SD.
A
B
Ergebnisse und Diskussion
69
10 Stunden nach der Bestrahlung wies die Genexpression noch den 2fachen Wert der
unbehandelten Kontrolle auf. Wie in Abbildung 43 zu sehen, führte sowohl CdCl2 als auch
CdO zu einer Abnahme der durch alleinige UVC-Bestrahlung nach 10 Stunden induzierten
mRNA-Menge.
Eine Beeinflussung der UVC-induzierten Genexpression der Zielgene von p53 durch
Cadmiumverbindungen konnte in der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden. Die
verminderte Induktion ist möglicherweise auf verschiedene Mechanismen zurückzuführen.
Zum einen könnte die Induktion des Transkriptionsfaktors p53 dennoch stattfinden, die
induzierte Wildtyp-Form aber direkt durch Cadmium in die „mutante“ Form umgewandelt
werden und somit nicht mehr die Transkription der Zielgene einleiten. Zum anderen wäre eine
Beeinflussung der Wildtyp-Form durch die „mutante“ Form denkbar. p53 bindet in seiner
aktiven Form als Tetramer an bestimmte Bereiche seiner Zielgene und löst in diesem Zustand
deren Transkription aus. Durch eine Bildung von gemischten Tetramere aus Wildtyp- und
„mutanter“Form könnte es somit ebenfalls zu einer Inhibierung der Funktion des
Transkriptionsfaktors kommen. Denkbar wäre auch eine verminderte Induktion von p53
aufgrund von Störungen der Signalkaskade und somit einer Störung der Stabilisierung des
p53 Proteins.
5.4.4 Zellzyklusphasenverteilung
In Tabelle 6 ist sowohl der Effekt von CdCl2 als auch die Auswirkung von CdO in
Kombination mit UVC auf die Zellzyklusphasenverteilung in A549 Zellen dargestellt. CdCl2
führt zu einer leichten Zunahme des Anteils der Zellen in der G1-Phase (von 63,9 % G1-
Phase in unbehandelten Zellen auf 70,4 % nach einer Inkubation mit 75 µM CdCl2). Wie
bereits in Kapitel �5.2.4 gezeigt, führt eine Bestrahlung mit 5 J/m2 UVC zu einer
Akkumulation der Zellen in der S-Phase 10 Stunden nach Bestrahlung (von 25,6 % S-Phase
in unbehandelten Zellen auf 46,1 % nach UVC-Bestrahlung). Dieser durch UVC-Strahlung
verursachte S-Phasenarrest wird durch die Vorinkubation mit CdCl2 nahezu vollständig
aufgehoben. So befinden sich 10 Stunden nach der Bestrahlung bei einer vorherigen
Inkubation mit 75 µM CdCl2 für 24 Stunden nur noch 28,8 % der Zellen in der S-Phase. Die
Verteilung entspricht damit nahezu der von unbehandelten Zellen. Ein ähnliches Resultat
zeigte auch die Behandlung mit CdO. Auch hier führte CdO zu einer leichten Steigerung des
Anteils der Zellen in der G1-Phase (von 66,9 % G1-Phase in unbehandelten Zellen auf 70,7 %
Ergebnisse und Diskussion
70
nach einer Inkubation mit 1,5 µg/cm2), während eine Vorinkubation mit CdO den durch
UVC-Strahlung hervorgerufenen S-Phasenarrest aufhob (von 24,1 % S-Phase in bestrahlten
Zellen auf 22,1 % nach vorheriger Inkubation mit 1,5 µg/cm2 CdO).
Tabelle 6: Auswirkung von CdCl2 (A) und CdO (B) auf die Zellzyklusphasenverteilung 10 Stunden nach UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2.
Dargestellt sind die prozentualen Anteile der Zellen in der jeweiligen Zellzyklusphase ± SD.
0 µM CdCl2 60 µM CdCl2 75 µM CdCl2 Phase - UV + UV - UV + UV - UV + UV
G1 63,9 ± 3,2 44,7 ± 2,0 69,2 ± 2,3 58,8 ± 3,6 70,4 ± 2,5 65,6 ± 2,5
S 25,6 ± 2,1 46,1 ± 3,9 22,0 ± 1,7 35,2 ± 2,8 22,3 ± 1,2 28,8 ± 1,2
G2/M 10,4 ± 1,8 99,2 ± 5,1 98,4 ± 1,1 95,9 ± 1,2 97,4 ± 1,8 95,6 ± 1,8
0 µg/cm2 CdO 1,0 µg/cm2 CdO 1,5 µg/cm2 CdO Phase - UV + UV - UV + UV - UV + UV
G1 66,9 ± 3,2 48,1 ± 1,4 69,1 ± 2,1 57,5 ± 1,4 70,7 ± 5,3 62,1 ± 5,8
S 24,1 ± 1,6 46,9 ± 1,2 22,6 ± 1,0 37,9 ± 2,4 22,1 ± 3,2 33,7 ± 5,5
G2/M 99,0 ± 1,8 95,0 ± 0,4 98,4 ± 1,3 94,6 ± 1,0 97,2 ± 2,1 94,2 ± 0,4
A
B
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
71
6 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
UVC-Strahlung führt zu helixverzerrenden DNA-Addukten, die über eine Zellzyklusphasen-
unabhängige NER entfernt werden. Um ein größeres Zeitfenster für die Reparatur zu
gewährleisten, existieren verschiedene Kontrollpunkte im Zellzyklus. Diese verzögern z.B.
beim G1-Phasen-Kontrollpunkt den Übergang von der G1-Phase zur S-Phase. Die Regulation
des G1-Phasen-Kontrollpunktes wird u.a. über das Protein p21 gesteuert, indem es an Cyclin-
CDK-Komplexe bindet und diese so in ihrer Aktivität inhibiert. CDKs (Cyclin dependent
kinase) sind für die Progression im Zellzyklus unentbehrlich und eine Inhibierung resultiert
folglich in einem Stillstand des Zellzyklus. Dennoch unerkannte Schäden oder Schäden die
sich erst in der darauf folgenden S-Phase ereignen, führen während der Replikation zu einem
Stopp der Polymerase an dem DNA-Addukt, was eine Verlangsamung der Replikation zur
Folge hat und somit in einem S-Phasenarrest resultiert. Über den Mechanismus des S-
Phasenarrestes ist wenig bekannt. Denkbar wäre, dass p21 auch hier eine Rolle spielt. Es ist
bekannt, dass p21 an PCNA bindet (Waga und Stillman, 1998). Dies hat eine Unterdrückung
der Aktivität der Polymerase δ zur Folge und führt somit zu einer Hemmung der Replikation
(S-Phasenarrest). Neben den normalen für die DNA-Replikation verantwortlichen
Polymerasen, existieren noch weitere Polymerasen, die für die Replikation von DNA-
Addukten verantwortlich sind. Die Polymerase κ repliziert beispielsweise BPDE-induzierte
DNA-Addukte und ist somit auch für den Fortgang des Zellzyklusses nach dem durch BPDE
induzierten S-Phasenarrestes verantwortlich (Bi et al., 2005), während die Polymerase η den
„Bypass“ von UV-induzierten Photoprodukten übernimmt (Goodman, 2002; Kannouche et
al., 2001; Kannouche und Stary, 2003). Mutationen des verantwortlichen Gens XPV führen
zu der UV-sensitiven Erbkrankheit Xeroderma Pigmentosum-V (XPV) (Friedberg, 2001;
Tuteja und Tuteja, 2001).
Die infolge der UVC-Bestrahlung resultierende Steigerung der Genexpression von p21 in
A549 Zellen korreliert zeitlich sehr gut mit dem gesteigerten Proteingehalt von p53. Die
Expression von p48 und XPC, deren Genprodukte in der Schadenserkennung der NER
involviert sind, werden ebenfalls durch p53 reguliert. Adimoolam und Ford (2002) und Tan
und Chu (2002) konnten p53 responsive Elemente in den jeweiligen Genen identifizieren. Die
Versuche zeigen einen zeitabhängigen Anstieg infolge von UVC-Strahlung, allerdings ist die
maximale Induktion zu späteren Zeitpunkten verschoben als die p53-Induktion. Eine
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
72
gesteigerte Expression findet allerdings bereits drei Stunden nach der Bestrahlung statt und
spiegelt sich somit in der Zeitachse der p53-Induktion wider. Warum allerdings die maximale
Zunahme zu späteren Zeitpunkten verschoben ist, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht
beantwortet werden. Denkbar ist eine Zwischenschaltung weiterer regulierender
Mechanismen, die letztendlich zur Einleitung der Transkription von p48 und XPC führen.
Kinetikversuche zur Bindung von p53 an die jeweiligen responsiven Elemente der Zielgene
könnten Aufschluss über die Ereignisse zwischen maximaler p53-Protein-Induktion und
maximaler Induktion seiner Zielgene geben.
UVC-Strahlung führt 10 Stunden nach der Bestrahlung zu einer Ansammlung von Zellen in
der S-Phase des Zellzyklusses, was auf einen stattfindenden S-Phasenarrest durch gestörte
DNA-Replikation von zuvor nicht reparierten DNA-Schäden hinweist. Zeitlich korreliert die
gesteigerte p21-Expression gut mit dem erhaltenen S-Phasenarrest, so dass hier evtl. ein
Zusammenhang bestehen könnte. Ob die drei Stunden nach der Bestrahlung bereits erhöhte
p21 Expression zuvor in einen G1-Arrest resultiert, dieser allerdings durch eine schnelle
Reparatur wieder aufgehoben wird und somit in dem zwischen 3 und 6 Stunden nicht
gemessenen Zeitfenster unerfasst bleibt, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet
werden. Schäden, die sich im Chromatin ereignen und somit nicht erkannt wurden, führen erst
während der Replikation zu einem Stillstand des Zellzyklusses und resultieren in einem S-
Phasenarrest bis die Schäden repariert sind. Die gesteigerte Expression der DNA-
Reparaturgene p48 und XPC 10 Stunden nach der Bestrahlung unterstützt die These, dass der
resultierende S-Phasenarrest eingeleitet wird, um Zeit zur Reparatur zu gewährleisten. Die
Abnahme der Expression der Reparaturgene sowie der Rückgang der Expression von p21
korrelieren zeitlich sehr gut mit der Aufhebung und somit Fortgang des Zellzyklusses, was
auf eine erfolgte Reparatur schließen lässt.
Ergebnisse der letzten Jahre haben gezeigt, dass so genannte „Zinkfingerstrukturen“, in denen
ein Zink-Ion an jeweils festgelegte Cystein- und/oder Histidinreste bindet, um die Struktur
einer kleinen, autonom gefalteten Proteindomäne zu stabilisieren, empfindliche
Angriffspunkte für toxische Metallverbindungen sind (Abbildung 44). Cadmium(II) besitzt
aufgrund seiner Größe, seiner kleinen positiven Ladungsdichte und seiner ungepaarten
Elektronen eine leichten Polarisierbarkeit und somit die Eigenschaft eines weichen Ions. Es
fungiert als Elektronenpaarakzeptor (Lewis-Säure) und kann nach der Lewis-Säure-Base-
Theorie mit einer weichen Base reagieren. Als weiche Base können in Proteinen der
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
73
Stickstoff aus Imidazolen (z.B. Histidin) und der Schwefel aus Thiolen (z.B. Cystein)
fungieren (Glusker, 1991). Cd(II) könnte somit in der Lage sein, Zink aus der Zink-bindenden
Domäne von Zinkfingerproteinen zu verdrängen, zumal es durch seine analoge
Elektronenkonfiguration eine ähnliche chemische Reaktivität aufweist.
Abbildung 44: Mögliche Wechselwirkung von Metallverbindungen mit Zink-bindenden Strukturen (Hartwig, 2001).
Das Tumorsuppressorprotein p53 wird zwar trotz seiner Zink-bindenden Domäne nicht zu
den Zinkfingerproteinen gezählt, da es keine fingerähnliche Struktur ausbildet (Hainaut und
Mann, 2001), dennoch ist die Komplexierung eines Zink-Ions durch 3 Cysteinreste und einem
Histidinrest essenziell für die Aufrechterhaltung der Struktur der DNA-bindenden Domäne
und somit auch für seine Funktion als Transkriptionsfaktor. Wie bereits Versuche mit
Metallchelatoren (Hainaut und Milner, 1993b; Verhaegh et al., 1998) und Oxidationen der
Cysteine mit Diamid (Hainaut und Milner, 1993a) zeigen konnten, kommt es durch eine
Herauslösung des Zink-Ions aus der Struktur von p53 zu einer Auffaltung des Proteins was
einen Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit zur Folge hat. Die Fähigkeit von löslichen
Cadmiumverbindungen, die Konformation von p53 zu beeinflussen und somit zur Bildung der
„mutanten“ Konformation zu führen, zeigen bereits frühere Studien mit CdSO4 und CdCl2
(Hainaut und Milner, 1993b; Meplan et al., 1999). Dass allerdings partikuläres CdO ebenfalls
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
74
in der Lage ist, eine Konformationsänderung von p53 Wildtyp hervorzurufen wurde in dieser
Arbeit erstmalig untersucht. Des Weiteren zeigten bisher keine Studien, dass
Cadmiumverbindungen einen Einfluss auf die basale Expression der p53-Zielgene p48 und
XPC haben und folglich in die DNA-Reparatur eingreifen könnten.
Eine Inkubation mit der jeweiligen Cadmiumverbindung reduziert die Genexpression von p48
und XPC. Dies könnte auf die Bildung der „mutanten“ Form infolge einer Bindung von
Cadmium-Ionen an p53 im Austausch von Zink zurückzuführen sein. So zeigt sowohl CdCl2
als auch CdO eine konzentrationsabhängige Bildung der „mutanten“ Form von p53. Aufgrund
der längeren Halbwertszeit von 5 bis 10 Stunden der „mutanten“ Form im Vergleich zu
maximal 20 Minuten der Wildtyp-Form (Soussi, 2000), beruht der durch Westernblot-
Analyse gezeigte gesteigerte Gesamtgehalt von p53 infolge der Cadmium-Inkubation
vermutlich auf der Bildung und Akkumulation der stabilen „mutanten“ Konformation und
nicht auf einer Stabilisierung der Wildtyp-Form. Da die Bindung von p53 an die DNA seiner
Zielgene als Tetramer erfolgt und so deren Expression ausgelöst wird, kann die Entstehung
der „mutanten“, nicht zur DNA-Bindung fähigen Form, dazu führen, dass gemischte
Heterotetramere aus Wildtyp- und „mutanter“-Form gebildet werden, die dann nicht mehr als
Transkriptionsfaktor wirken können (dominant negativer Effekt) (Kern et al., 1992; Cadwell
und Zambetti, 2001). Dies wäre eine Erklärung dafür, dass trotz eines annähernd konstanten
p53-Wildtyp-Gehaltes eine Beeinflussung nachgeschalteter Mechanismen stattfindet.
Oxidative DNA-Schäden infolge einer durch Cadmium indirekt verursachten Zunahme an
ROS könnten zu einer Stabilisierung von p53 führen. Andererseits könnte oxidativer Stress
ebenfalls durch Oxidation von Cysteinen in der DNA-Bindungsdomäne zu einer Inaktivierung
von p53 führen. So zeigen Arbeiten in menschlichen Zellen, exponiert mit NO, H2O2 und
Glutathion-depletierenden Agenzien eine durch Umfaltung verminderte DNA-
Bindungsfähigkeit (Calmels et al., 1997; Parks et al., 1997; Russo et al., 1995). Allerdings
unterliegt der Redoxstatus der p53 Wildtyp-Form in der Zelle einer Regulation über
Thioredoxin bzw. Thioredoxin-Reduktase und Ref-1 (Redoxfaktor 1) und ist somit gut
kontrolliert (Hainaut und Mann, 2001). Daher scheint es wahrscheinlicher, dass die
Umfaltung auf den Austausch des Zink-Ions in der DNA-bindenden Domäne von p53
zurückzuführen ist. Cadmium besitzt einen größeren Atomradius als Zink (Cd: 0,97 Å;
Zn: 0,74 Å) und könnte somit die Tertiärstruktur von p53 beeinflussen. Denkbar wäre auch
eine Beeinflussung der Zink-Bindung in p53 durch Methallothioneine (MT).
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
75
Methallothioneine sind niedermolekulare Proteine, die aufgrund ihres hohen Cysteinanteils
eine hohe Affinität zu essenziellen Metall-Ionen wie Zn(II), aber auch zu toxischen Metall-
Ionen wie Cd(II) besitzen und somit deren intrazelluläre Verfügbarkeit regulieren. So zeigte
eine Co-Transfektion von p53 und MT in p53 defizienten Zellen, dass die Überexpression von
MT relativ zur p53-Expression zu einer Hemmung der Transaktivierung von p53 führt. Diese
Beobachtungen lassen vermuten, dass MT als ein Regulator der Zink-Bindung von p53
fungiert. Bei hohen Gehalten an MT wirkt es als Chelator und führt somit zur Herauslösung
von Zn(II) aus p53 und damit zu dessen Inaktivierung (Hainaut und Mann, 2001). Da Cd(II)
die MT-Expression induziert, könnte sich dies direkt negativ auf p53 auswirken.
Eine dennoch durch die jeweilige Cadmiumverbindung erfolge Induktion von p21 könnte auf
p53-unabhängigen Mechanismen beruhen. So zeigen zum einen Ergebnisse von Russo et al.
(1995) eine p53 unabhängige Aktivierung der p21 Expression infolge von oxidativem Stress,
zum anderen berichten Haapajarvi et al. (1999) von einer gesteigerte p21 Expression infolge
einer UVC-Bestrahlung durch den Transkriptionsfaktor SP1. Der durch alleinige Cadmium-
Inkubation hervorgerufene G1-Arrest könnte durch p21 hervorgerufen werden.
Noch deutlicher sind die Effekte einer vermehrten Bildung der „mutanten“ Form von p53
infolge einer Inkubation mit den jeweiligen Cadmiumverbindungen bei
Kombinationsuntersuchungen mit UVC-Strahlung. Während UVC alleine zu einer Induktion
der Zielgene p48, XPC und p21 führt, hat die Vorinkubation mit den jeweiligen
Cadmiumverbindungen eine Hemmung der UVC-induzierten Expression zur Folge. Die
Effekte von CdCl2 sind hierbei etwas stärker als die von CdO. Dies lässt sich möglicherweise
auf den ebenfalls bei CdCl2 stärkeren Effekt auf die Hemmung der p53-Wildtyp-Induktion
durch UVC-Strahlung zurückführen. Während CdCl2 die Induktion von p53 vollständig
hemmt und p53 in die „mutante“ Konformation umgewandelt wird, führt eine Vorinkubation
mit CdO noch zu einer leichten Erhöhung des UVC-induzierten p53-wildtyp-Gehalts. Ob die
jeweiligen Cadmiumverbindungen allerdings schon in die Signalkaskade zur Stabilisierung
von p53 eingreifen und somit die Induktion durch UVC verhindert wird, oder ob die
Induktion zunächst stattfindet, induziertes p53 dann allerdings durch Cadmium in die
„mutante“ Form umgewandelt wird, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht geklärt werden.
Die Kombinationsversuche zur Koloniebildungsfähigkeit zeigen keine deutliche Verstärkung
der UVC-induzierten Zytotoxizität. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit Versuchen von
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
76
Tang et al. (2000) in Hamsterzellen, die aufgrund von Methylierungen des DDB2-Gens eine
verminderte p48 Expression aufweisen. Es konnte gezeigt werden, dass die Transfektion von
Hamsterzellen mit menschlichen p48 keinen Einfluss auf die Überlebensfähigkeit infolge
einer UV-Bestrahlung hat. Allerdings zeigten diese Versuche, dass die Mutationsrate im
nicht-transkribierten Strang in p48 transfizierten Zellen deutlich geringer ist. Der Effekt von
p48 auf die UV-induzierte Mutationsrate ist bei nicht-TT-CPDs größer als bei TT-CPDs.
Dieser Befund könnte auf die Fähigkeit der Polymerase η, Photoprodukte zu replizieren,
zurückzuführen sein. Diese hat die Eigenschaft Adenin gegenüber Photoprodukte einzubauen,
so dass TT-CPDs effizient und mit großer Genauigkeit über „translesion synthesis“ (TLS)
repariert werden können, während nicht-TT-CPDs durch falschen Einbau einer Adenin-Base
zu Mutationen führen können. Vorhandene Addukte resultieren somit nicht zwangsläufig in
einem Stopp der DNA-Polymerase, so dass die Überlebensrate unbeeinflusst bleibt. Eine
Reparaturhemmung infolge eines geringeren p48 und oder XPC-Gehalts kann also
möglicherweise zur fehlerbehafteten post-replicativen Reparatur führen, zumal die
Polymerase η ebenfalls einen Zinkfinger aufweist und somit möglicherweise auch durch
Cadmium gehemmt werden könnte. Hartwig und Beyersmann (1989) berichteten bereits von
einer Erhöhung der durch UVC-Strahlung induzierten Mutationsrate durch Cadmium in
chinesischen Hamsterzellen. Ob die Behandlung mit Cadmium allerdings in Kombination mit
UVC-Strahlung die Mutationsrate in den in dieser Arbeit eingesetzten humanen
Lungenadenokarzinomzelllinie erhöht, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden
und müsste mit in einem Mutationstest näher untersucht werden.
Des Weiteren führt eine Co-Behandlung mit den eingesetzten Cadmiumverbindungen zu einer
Hemmung des durch UVC-Behandlung resultierenden S-Phasenarrests, was möglicherweise
auf einer Hemmung der UVC-induzierten p21-Expression zurückgeführt werden könnte.
Allgemein muss berücksichtigt werden, dass es bei den hier vorgestellten Ergebnissen nur um
die Expression der betrachteten Gene auf mRNA-Ebene handelt. Ob und in wieweit sich die
erhaltenden Ergebnisse auf die Proteingehalte auswirken, müsste in weiteren Versuchen
überprüft werden.
Bei der Allgemeinbevölkerung liegen die Cadmiumkonzentrationen in der Lunge bei etwa
1,3 mg/kg Trockengewicht (Kollmeier et al., 1990). Mit dem in Kollmeier (1985)
angegebenen Umrechnungsfaktor von Trockengewicht auf Nassgewicht für Lungengeweben
ergeben sich Gehalte von ca. 0,3 mg/kg Nassgewicht in der Lunge. Ausgehend von einer
100 %igen Löslichkeit der Partikel in 9 ml Zellkulturmedium bei einer Schalengröße von
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
77
60 cm2 Wachstumsfläche, würde der eingesetzte Konzentrationsbereich von 0,1 bis
1,5 µg/cm2 etwa im Bereich von 0,6 bis 10 µg Cadmium/ml liegen und somit etwa dem von
10 µM bis 75 µM eingesetzten Bereich von löslichem CdCl2 entsprechen (1,1 bis 8,4 µg/ml).
Dadurch wird deutlich, dass die eingesetzten Konzentrationen durchaus im physiologisch
relevanten Bereich liegen, zumal die Gehalte bei Arbeitern der metallverarbeitenden Industrie
um ein vielfaches höher liegen können und in Geweben wie der Niere und der Leber, in denen
es zu einer Akkumulation des Metalls sogar Gehalte von bis zu 3 mg/kg bzw. 50 mg/kg
Nassgewicht erreicht werden. Die Interpretation der Ergebnisse mit partikulären CdO ist
allerdings schwierig, da CdO nahezu unlöslich in wässrigen Lösungen ist und die Partikel
über Phagozytose in die Zelle gelangen. Während bei löslichen Verbindungen von einer
homogenen Aufnahme über die Zellpopulation ausgegangen werden kann, werden in
Versuchen mit unlöslichen partikulären Substanzen die Effekte als Summenparameter
gemessen. Die Ergebnisse repräsentieren somit einen Mittelwert der Effekte von Zellen, die
Partikel durch Phagozytose aufgenommen haben und Zellen, die nicht phagozytiert haben.
Daher können die lokal auftretenden Effekte durch CdO weitaus stärker sein als die
vorgestellten Mittelwerte.
Die hohen Konzentrationen in der Niere resultieren aus der Induktion von MT durch
Cadmium. Die Bindung von Cadmium an MT resultiert in Halbwertszeiten von bis zu
30 Jahren. Durch die Eigenschaft, toxische Metall-Ionen zu binden, wird von einer
detoxifizierenden Wirkung ausgegangen. Ob allerdings das Abfangen tatsächlich mit einer
Aufhebung des toxischen Potenzials einhergeht, ist wenig untersucht. Ergebnisse unserer
Arbeitsgruppe zeigen, dass Methallothionein, das 3,23 Mol Cd(II), 1,41 Mol Cu(II) und
0,77 Mol Zn(II) enthält, sowohl eine konzentrationsabhängige Zunahme von Einzelstrang-
brüchen in PM2-DNA verursacht, als auch die Aktivität des Fpg-Proteins im PM2-Assay
hemmen kann (Hoffmann, 2000). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass trotz der Bindung
an Methallothioneine, Metall-Ionen ihre toxische Eigenschaft ausüben können.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass sowohl lösliches CdCl2 als auch partikuläres CdO in der
Lage sind, die Struktur des Tumorsuppressorproteins p53 zu beeinflussen. Beide
Verbindungen führen zu einer Induktion der „mutanten“ Konformation. Als mögliche Folge
könnten Signaltransduktionswege gestört werden, die zu einem veränderten
Expressionsmuster von z.B. für die Reparatur und die Zellzykluskontrolle entscheidenden
Proteine p21, p48 und XPC führen (Abbildung 44). Vor dem Hintergrund, dass frühere
Studien eine Hemmung der Schadenserkennung UV-induzierter DNA-Addukte in Folge eine
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
78
Cadmiumbehandlung zeigen (Hartmann und Hartwig, 1998), scheint dieses Resultat eine
mögliche Erklärung für die Cadmium-vermittelte Kanzerogenese zu liefern.
Abbildung 45: Schematische Darstellung des möglichen Mechanismus der durch Cadmium-vermittelten Kanzerogenese.
Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
79
Da auch Studien zur Reparatur von BPDE eine Beteiligung von p53 zeigen konnten und vor
allem Arbeiter der metallverarbeitenden Industrie aber auch die Allgemeinbevölkerung u.a.
durch Zigaretten oder Flugasche einer Mischexposition von oftmals partikulären
Metallverbindungen und zahlreichen mutagenen Agenzien wie UV-Strahlung, PAKs oder
Aflatoxinen ausgesetzt sind, kann diesem Protein eine entscheidende Funktion in der
Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität zugeschrieben werden (Lloyd und Hanawalt,
2000; Wani et al., 2002; Lloyd und Hanawalt, 2002).
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Literatur
88
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Anhang
89
A Anhang
A.1 Abkürzungsverzeichnis
A549 - Menschliche Lungenadenokarzinomzelllinie
B[a]P - Benzo[a]pyren
BER - Basenexzisionsreparatur
Bp - Basenpaare
BSA - Rinderserumalbumin
BSO - Buthionin Sulfoximin
CAK - CDK activating kinase
CdCl2 - Cadmiumchorid
CDK - Cyclin dependent kinase
cDNA - komplementäre DNA
CdO - Cadmiumoxid
cm - Zentimeter
CPD - Cyclopyrimidindimere
Ct - Thresholdycle
Cys - Cystein
DDB - damage DNA binding Protein
DMEM - Dulbecos Modified Eagle Medium
DMSO - Dimethylsulfoxid
DNA - Desoxyribonukleinsäure
E - Effizienz
EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure
FDP - Formamid-Denaturieungspuffer
Fpg - Formamidopyrimidin-DNA Glycosylase
FKS - Fötales Kälberserum
GAPDH - Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase
GGR - Globale Genomische Reparatur
GSH - Glutathion
GSSG - Glutathiondisulfid
Anhang
90
h - Stunde
HeLa S3 - menschliche Cervixkarzinomzelllinie
His - Histidin
IARC - International Agency for Research on Cancer
Ig - Immunglobulin
J - Joule
kD - Kilodalton
mdm2 - murine double minute 2
MMR - Mismatchreparatur
MOPS - Morpholinopropansulfonsäure
mRNA - messenger Ribonukleinsäure
NER - Nukleotidexisionsreparatur
OGG - 8-Oxoguanin-DNA-Glycosylase
Oligo(dT) - Oligodesoxythymidin
PAK - Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe
PCR - Polymerase Chain Reaction
PBS - Phosphat-gepufferte Salzlösung
PCNA - proliferating cell nuclear antigen
PMSF - Phenylmethansulfonylfluorid
PVDF - Polyvinylidenfluorid
Ref1 - Redoxfaktor 1
RFU - relative Fluoreszenzunit
RPA - Replikationsprotein A
ROS - reaktive Sauerstoffspezies
rRNA - ribosomale RNA
RT-PCR - reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
SD - Standardabweichung
SDS - Natriumdodecylsulfat
Taq-Polymerase - Thermus aquaticus Polymerase
Tris - Tris-(hydroxylmethyl)-aminomethan
UV - Ultraviolettes Licht
V79 - Lungenfibroblasten des chinesischen Hamsters
XP - Xeroderma Pigmentosum
Anhang
91
A.2 Liste der verwendeten Chemikalien
Bezeichnung: Hersteller:
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung 37,5:1 (40 %) Merck, Darmstadt
Agarose Sigma, Deisenhofen
Ammoniumperoxodisulfat Merck, Darmstadt
Anti-Kaninchen-Antikörper-HRP Santa Cruz, Santa Cruz (USA)
Anti-Maus-Antikörper-HRP Santa Cruz, Santa Cruz (USA)
Anti-p53-Antikörper (Maus) Dako, Glostrup (Dänemark)
Anti-p53-Antikörper (Kaninchen) Novocastra, Newcastle (UK)
Anti-p53-Antikörper (PAb 1620) Oncogene, San Diego (USA)
Anti-p53-Antikörper (PAb 421) Oncogene, San Diego (USA)
Aprotinin Sigma, Deisenhofen
β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt
Bradford-Lsg Bio-Rad, München
Bromphenolblau Merck, Darmstadt
BSA (� 96 %) Sigma, Deisenhofen
CdCl2 (99,99 + %) Aldrich, Steinsheim
CdO (99,99 + %) Aldrich, Steinsheim
DAPI/SR-Lösung Partec, Münster
DMEM Sigma, Deisenhofen
DMSO p.a. Sigma, Deisenhofen
EDTA p.a. Merck, Darmstadt
ECL-Detektionslösung Amersham, Freiburg
Ethanol p.a. Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid p.a. Merck, Darmstadt
First Strand cDNA Synthesis Kit Bio-Rad, München
Formaldehyd Merck, Darmstadt
Formamid Merck, Darmstadt
FKS Sigma, Deisenhofen
Glycerol Merck, Darmstadt
Anhang
92
Guanidin-Isothiocyanat Merck, Darmstadt
Isopropanol Sigma, Deisenhofen
iQ SYBR
Green Supermix (2x) Bio-Rad, München
KCl Merck, Darmstadt
Leupeptin Merck, Darmstadt
Magermilchpulver Merck, Darmstadt
Methanol Riedel-de Haen, Seelze
Molekulargewichtsmarker RPN 800 Amersham, Freiburg
MOPS Sigma, Deisenhofen
NaCl p.a. Merck, Darmstadt
Na2HPO4 p.a. Merck, Darmstadt
NaH2PO4 p.a. Merck, Darmstadt
NaOH p.a. Merck, Darmstadt
PCR-Primer MwG Biotech, Ebersberg
Penicillin/Streptomycin 5000IU/ml Sigma, Deisenhofen
Pepstatin A Sigma, Deisenhofen
Protein G PLUS/Protein A – Agarose –Lösung Oncogene, San Diego (USA)
SDS (10 % in Wasser) Merck, Darmstadt
TEMED Serva, Heidelberg
Tris Sigma, Deisenhofen
Triton X-100 Pierce, Rockford (USA)
Trypsin (10x) Sigma, Deisenhofen
Anhang
93
A.3 Liste der verwendeten Geräte und Verbrauchs-materialen
Bezeichnung: Hersteller:
Auflichtmikroskop Axiovert 25 Zeiss, Oberkochen
Bildauswerteprogramm (Aida Image Analyzer) Raytest, Straubenhardt
Biophotometer Eppendorf, Köln
Bottle Top Filter (0,2 µm) Nalgene, Hamburg
Brutschrank Hera cell Heraeus, Hanau
Digitalwaage Sartorius, Göttingen
Durchflusszytometer PAS Partec, Münster
Elektrophoresekammer Hoefer, Wiesloch
Geldokumentationssystem Fuji LAS 3000 Raytest, Straubenhardt
H2O Aufbereitungsanlage Ultra Clear SG, Barsbüttel
iCycler (96 x 0,2 ml Modul) Bio-Rad, München
iCycler iQ Optical System Software (3.1) Bio-Rad, München
Kolbenhubpipetten Eppendorf, Hamburg
Kryoröhrchen Greiner, Frickenhausen
Kühlschrank Liebherr, Ochsenhausen
Kulturschalen Biochrom, Trasadingen (Schweiz)
Küvetten (UVetten) Eppendorf, Köln
Magnetrührer Heidolph, Schwabach
24-Mikrotiterlochplatten Sarstedt, Nümbrecht
Mikrotiterplattenlesegerät Tecan, Crailsheim
Mykoplasmendetektionskit Minerva Biolabs, Berlin
Netzgerät Bio-Rad, München
Neubauer-Zählkammer Marienfeld, Lauda-Königshofen
PCR-Reaktionsgefäße Bio-Rad, München
PCR-Reaktionsgefäße (8er Streifen) Sarstedt, Nümbrecht
PCR-Reaktionsgefäße (96 Lochplatte) Sarstedt, Nümbrecht
pH-Meter pH 320 WTW, Weilheim
Anhang
94
Pipettenspitzen Eppendorf, Köln
Pipettierhilfe Pipetus Hirschmann, Eberstadt
Ready-To-Go-PCR-Kit Amersham, Freiburg
Reaktionsgefäße, 1,5/2 ml Eppendorf, Köln
Rotator Neolab, Heidelberg
Spritzen Braun, Melsungen
Sterilbank Hera safe Heraeus, Hanau
Stickstoffbehälter MVE, Burnsville (USA)
Thermocycler MJ Research, USA
Tiefkühlschrank GFL, Burgwedel
Ultraschall-Sonifier 250 Branson, Hannover
UV-Lampe Bioblock Scientific, Illkirch Cedex (F)
UV-Radiometer PRC Krochmann, Berlin
Vakuum-Zentrifuge Heto, DK
Vortex Genie 2 Scientific Industries, USA
Wasserbad Julabo, Seelbach
Zellzähler Casy-1 Schärfe System, Reutlingen
Zellzyklusanalysensoftware FloMax Partec, Münster
Zentrifuge Biofuge pico Heraeus, Hanau
Zentrifuge Eppendorf, Köln
Zentrifugenröhrchen (15, 50 ml) Sarstedt, Nümbrecht
Anhang
95
A.4 Verwendete Lösungen und Puffer
Alle Lösungen werden mit über Austascherkanülen aufgereinigtem destilliertem Wasser
angesetzt. Die Medien und Lösungen für die Zellkultur werden sterilfilriert.
A.4.1 Zellkultur
A549 Kulturmedium
DMEM
10 % FKS
100 U/ml Penicillin
100 µg/ml Streptomycin
PBS, pH 7,4
100 mM NaCl
7 mM Na2HPO4
4,5 mM KCl
3 mM KH2PO4
PBS-EDTA, pH 7,4
100 mM NaCl
7 mM Na2HPO4
4,5 mM KCl
3 mM KH2PO4
3 mM EDTA
Trypsin-Lösung
0,25 % Trypsin in PBS-EDTA
Anhang
96
A.4.2 Präparation der Proteinextrakte, Proteinbestimmung, Elektrophorese und Westernblot
RIPA-Zelllysepuffer
10 mM Tris, pH 7,6
150 mM NaCl
1mM EDTA
1 % Triton X-100
1 % Na-Desoxycholat
0,1 % SDS
1 mM PMSF
Blockierlösung
5 % Magermilchpulver in PBS
Bradfordlösung
1:5 - Verdünnung Bio-Rad-Protein-Assay-Reagenz mit H2Obidest
BSA-Stammlösung
100 µg/ml in H2O
Lämmli-Laufpuffer (1x)
192 mM Glycin
25 mM Tris
0,1 % SDS
Lämmli-Ladepuffer (4x)
320 mM Tris
8 % SDS
32 % Glycerin
8 % Mercaptolethanol
0,04 % Bromphenolblau
Anhang
97
Trenngelpuffer
1,5 M Tris pH 8,8
Sammelgelpuffer
1 M Tris pH 6,8
Transferpuffer
192 mM Glycin
20 mM Tris
0,01 % SDS
10 % Methanol
Trenngel
12 % Acrylamid
375 µM Tris
0,1 % SDS
ca. 0,1 % APS
ca. 1:1000 TEMED
Sammelgel
5 % Acrylamid
125 µM Tris
0,1 % SDS
ca. 0,1 % APS
ca. 1:1000 TEMED
Immunpräzipitationspuffer
10 mM Tris pH 7,6
140 mM NaCl
0,5 % NP40
0,5 mM PMSF (Stammlösung: 18 mg/ml in Isopropanol)
0,5 µg/ml Leupeptin (Stammlösung: 0,2 mg/ml in H2O)
2 µg/ml Aprotinin (Stammlösung: 0,3 mg/ml in 50 mM Tris pH 7)
0,7 µg/ml Pepstatin A (Stammlösung: 1,05 mg/ml in DMSO)
Anhang
98
Waschpuffer
PBS mit 0,3 % Tween 20
A.4.3 RNA-Isolierung und Elektrophorese
MOPS pH 7,0 (20x)
400 mM MOPS
100 mM Na-Acetat
10 mM EDTA
Ethidiumbromid-Lösung
10 mg/ml in H2O
FDP (Formamid-Denaturierungspuffer)
54 µl H2O
35 µl Formalin (37 %)
10 µl MOPS (20x)
100 µl Formamid (rekristallisiert)
1 µl Ethidiumbromid (10 mg/ml)
Agarosegel
1,2 g Agarose
83 ml H2O
5 ml MOPS (20x)
12 ml Formaldehyd (37 %)
RNA-Laufpuffer
1x MOPS
Anhang
99
A.5 Primersequenzen
GAPDH reverse: 5´- GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG -3´ GAPDH forward: 5´- CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG -3´ p48 reverse: 5´- GCT GGC TTT CCC TCT AAC CTG -3´ p48 forward: 5´- CCT GAA CCC ATG CTG TGA TTG -3´ XPC reverse: 5´- GGC CAC GCG GTG TAG AT -3´ XPC forward: 5´- CGT GGA CGG GAA GGT GC -3´ p21 reverse: 5´- GTA CCA CCC AGC GGA CAA GT -3´ p21 forward: 5´- CCT CAT CCC GTG TTC TCC TTT -3´
A.6 Darstellung eines RNA-Gels nach der RNA-Isolation
Die qualitative Kontrolle der RNA-Isolation erfolge über eine denaturierende RNA-
Gelelektrophorese. Da die ribosomale RNA (rRNA) den größten Anteil an der Gesamt-RNA
einnimmt und eine definierte Größe besitzt, weisen die zwei scharfe Banden der 28 S rRNA
und der 18 S rRNA auf eine gute Integrität und geringe Denaturierung hin.
Abbildung 46: RNA-Gel zur Kontrolle der Integrität der isolierten RNA.
1 µl des RNA-Isolates wird pro Tasche aufgetragen und das Gel zwei Stunden bei 60 V und maximaler Amperezahl laufen gelassen. Zur Dokumentation wird das Gel bei 520 nm abfotografiert.
28 S rRNA
18 S rRNA
Anhang
100
A.7 Histogramme der Zellzyklusanalyse
Beispielhaft sind im Folgenden zwei Histogramme dargestellt, die die
Zellzyklusphasenverteilung 10 Stunden nach einer UVC-Bestrahlung mit 5 J/m2
(Abbildung 47 B) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen (Abbildung 47 A) zeigen.
Abbildung 47: Histogramme der Zellzyklusanalyse von Ko (A) und UVC (10 h, 5 J/m2) (B).
A.8 Dosis-Abstands-Kurve
Um bei den Versuchen mit dem DNA-schädigenden Agens UVC-Strahlung eine konstante
Dosis von 5 J/m2 einsetzen zu können, wurden im Vorfeld die geeigneten Parameter wie
Bestrahlungsabstand und Bestrahlungszeit festgelegt. Mit der in Abbildung 48 angegebenen
Leistung der Strahlungsquelle bei definiertem Abstand wird mit folgender Gleichung die
Bestrahlungszeit bei einem Abstand von 30 cm auf 5 sec bei festgelegt.
Watt = Joule/Sekunde
A B
Anhang
101
Abbildung 48: Aufnahme der Strahlungsintensität in Abhängigkeit von dem Abstand zur Strahlenquelle mittels UV-Radiometer.
A.9 cDNA-Verdünnungreihen
Die Verdünnungreihen wurde aus den entsprechenden cDNA-Proben hergestellt und dann
jeweils 1 µl der jeweiligen cDNA-Verdünnung in die PCR eingesetzt.
Abbildung 49: cDNA-Verdünnungsreihen mit den verwendeten Primern für GAPDH (A), p48 (B), XPC (C) und p21 (D).
A B
C D
Anhang
102
Im Fall von GAPDH (A), XPC (C) und p21 (D) wurden als Verdünnungsschritte zwischen
den aufeinander folgenden Proben 1:2, 1:5 und 1:2 eingesetzt. Eine Verdünnung um den
Faktor 2 resultiert theoretisch bei einer Verdopplung der DNA-Menge mit jedem Zyklus in
einer Verschiebung des Ct-Wertes um einen Zyklus, eine Verdünnung um den Faktor 5 um
2,3 Zyklen. Im Fall von p48 (B) liegt zwischen den einzelnen Verdünnungen ein
Verdünnungsfaktor von 10 und sollte somit in einer Verschiebung der Ct-Werte um jeweils
3,32 Zyklen resultieren.
103
Publikationsliste
Vorträge auf Fachtagungen GDCH Regionalverband 07. – 08.03.2005, Hamburg
Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und Funktion des
Tumorsuppressorproteins p53.
22. GUM Tagung, 21. - 24. 02. 2006, Darmstadt
Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und Funktion des
Tumorsuppressorproteins p53.
Posterbeiträge auf Fachtagungen DGPT Mainz 2001
Interference of arsenic(III), cadmium(II), and nickel(II) with cell cycle progression and
control in A549 human lung cells.
I. Ehleben, C. Thuy, U. Herzer, A.Hartwig
43. Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für experimentelle und klinische
Pharmakologie und Toxikologie 12. - 14.03.2002, Mainz
Interference of As(III), Cd(II),Co(II) and Ni(II) with cell cycle progression and control in
A549 human lung cells.
I. Ehleben, U. Herzer, D.Kostelac, C. Thuy, A. Hartwig
31. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 07. - 11. 09. 2002, Frankfurt
Einfluss von Cd(II) auf die Zellzykluskontrolle in menschlichen Lungenkrebszellen.
C. Thuy, I. Ehleben, A. Hartwig
32nd Annual Meeting of the EEMS, 03. - 03.09.2002, Waraw, Poland
Modulation of cell cycle control and gene expression by arsenic(III), cadmium(II), cobalt(II)
and nickel(II).
I. Ehleben, U. Herzer, C. Thuy, D. Kostelac, A. Hartwig
104
7. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 17. - 20.09.2002
Effects of arsenic(III), cadmium(II), cobalt(II) and nickel(II) on cell cycle control in human
lung carcinoma cells.
C. Thuy, I. Ehleben, D. Kostelac, A. Hartwig
33. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 13. - 15. 09. 2004 Bonn
Arsenit und seine dreiwertigen methylierten Metabolite MMA(III) und DMA(III) reduzieren
die Poly(ADP-Ribosyl)ierung in kultivierten menschlichen Zellen.
I. Walter, A. Pelzer, T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig
33. Deutscher Lebensmittelchemikertag, 13. - 15. 09. 2004 Bonn
Einfluss von Cd(II) auf die Genexpression des an der Nukleotid-Exzisions-Reparatur
beteiligten Proteins p48 in menschlichen Lungenkrebszellen.
C. Thuy, A. Hartwig
8. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 28.09. - 01.10. 2004 Ulm
Impact of arsenic compounds on the poly(ADP-ribosyl)ation in cultured human cells.
I. Walter, A. Pelzer, T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig
8. Tagung des DNA-Reparaturnetzwerks, 28.09. - 01.10. 2004 Ulm
Modulation of p48 gene expression by CdO in cultured human lung cells.
C. Thuy, A. Hartwig
21. GUM Tagung, 05. - 08. 10. 2004 Würzburg
Modulation der Genexpression des Reparaturproteins p48 durch CD(II) in menschlichen
Lungenkrebszellen.
C. Thuy, A. Hartwig
21. GUM Tagung, 05. – 08. 10. 2004, Würzburg
Inhibierung der DNA-Reparatur, p53-Konformationsänderung und Induktion oxidativer
DNA-Schäden durch lösliche und partikuläre Cadmiumverbindungen.
T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig
105
35th Annual Meeting of the EEMS, 03. - 07. 07. 2005, Kos, Greece
Biomethylated arsenicals interfere with poly(ADP-ribosyl)ation in cultured human cells.
I. Walter, T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig
22. GUM Tagung, 21. - 24. 02. 2006, Darmstadt
Hemmung von PARP-1 durch dreiwertige Arsenverbindungen.
I. Walter, T. Schwerdtle, C. Thuy, G.L. Dianov, A. Hartwig
Lebensmittelchemische Gesellschaft, Regionalverband Nord-Ost und Süd-Ost, Arbeitstagung
2006, 23. - 24. 03. 2006, Berlin
Dreiwertige Arsenverbindungen hemmen das DNA-Reparaturprotein PARP-1.
I. Walter, T. Schwerdtle, C. Thuy, A. Hartwig
Veröffentlichungen
Publikationen in Fachzeitschriften Submitted for publication:
Impact of arsenite and its methylated metabolites on PARP-1 activity, PARP-1 gene
expression and poly(ADP-ribosyl)ation in cultured human cells.
I. Walter, T. Schwerdtle, C. Thuy, J.L. Parsons, G.L. Dianov, A. Hartwig
Submitted for publication:
Genotoxicity of soluble and particulate cadmium compounds: oxidative DNA damage,
nucleotide excision repair and p53.
C. Thuy, T. Schwerdtle, A. Hartwig
Abstracts Lebensmittelchemie, 59 (5), 132. (2005)
Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und Funktion des
Tumorsuppressorproteins p53.
C. Thuy, T. Schwerdtle, A. Hartwig
106
Buchbeitrag Schriftenreihe der GMS als Buch, wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, in
press. (2006)
Zinkfinger-Proteine als empfindliche Angriffspunkte für toxische Metall-Ionen und essentielle
Spurenelemente.
T. Schwerdtle, H. Blessing, G. Jahnke, C. Thuy, A. Hartwig
107
Lebenslauf
Name Christina Thuy
Persönliche Daten Geburtsdatum: 03.01.1977 in Speyer
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulbildung
1983 – 1987 Zeppelin-Grundschule in Speyer
1987 – 1996 Edith-Stein-Gymnasium in Speyer
Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Studium
10/96 – 05/97 Studium der Diplomchemie an der Universität Karlsruhe
05/97 – Ende 2001 Studium der Lebensmittelchemie an der Universität Karlsruhe
29.09.1999 Vorprüfung der Staatsprüfung für Lebensmittelchemiker
2001 Wissenschaftliche Abschlussarbeit am Institut für Lebensmittelchemie
und Toxikologie der Universität Karlsruhe:
Thema: Einfluss von Cd(II) auf die Zellzykluskontrolle
Abschluss: Diplom-Lebensmittelchemikerin/
Zweiter Prüfungsabschnitt der Staatsprüfung für
Lebensmittelchemiker
Dissertation
05/02 – 07/04 Promotion am Institut für Lebensmittelchemie und Toxikologie der
Universität Karlsruhe (Prof. Dr. A. Hartwig)
Thema: Einfluss von Cadmiumverbindungen auf die Struktur und
die Funktion des Tumorsuppressorproteins p53
Seit 08/04 Fortsetzung der Promotion am Institut für Lebensmitteltechnologie und
Lebensmittelchemie der TU Berlin (Prof. Dr. A. Hartwig)
108
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Andrea Hartwig für die Überlassung des
interessanten Arbeitsthemas, ihre fachlich kompetente und stets freundliche Unterstützung
und die großzügig gewährten Freiräume bei der Durchführung während der gesamten
Promotion. Danken möchte ich ihr außerdem für ihren Wechsel nach Berlin. Dadurch wurde
ich um einiges reicher an Erfahrung.
Herrn Prof. Dr. Manfred Metzler vom Institut für Angewandte Biowissenschaften der
Universität Karlsruhe danke ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens.
Tanja Schwerdtle danke ich für ihre stete Hilfsbereitschaft und praktischer Unterstützung bei
meiner Arbeit.
Den Kollegen Gunnar Jahnke und Ingo Walter danke ich für den Zusammenhalt, vor allem
während der schweren Phase unseres gemeinsamen Umzuges aus dem Institut in Karlsruhe
nach Berlin.
Bei meiner Schreibtischnachbarin Caroline Hall möchte ich mich für ihre Freundschaft, ihren
Humor und ihre Unterstützung in allen Bereichen bedanken.
Jens Mäder und Thorsten Fiedler aus dem Arbeitskreis von Prof. Dr. Lothar W. Kroh danke
ich für die Kaffeepausen und die Einführung in das Berliner Leben sowie für die
kulinarischen Streifzüge durch die norddeutsche Küche.
Allen anderen Kollegen aus dem Arbeitskreis danke ich für die überaus offene und kollegiale
Arbeitsatmosphäre während meiner Promotion.
Meinem Freund Drazen Kostelac möchte ich für sein Verständnis und den Zusammenhalt
trotz der räumlichen Trennung vor allem in der Endphase meiner Arbeit danken.
Bei meinen Eltern und Großeltern möchte ich mich dafür bedanken, dass sie mir den Weg zu
dieser Arbeit ermöglicht haben.
Der deutschen Nationalmannschaft danke ich für eine tolle WM 2006 in Deutschland und das
Erreichen des 3. Platzes.