Short communication Kurze Mitteilung

EinfluB von o-Phosphat auf das Spektrum des Myoglobins Friedrieh Bauer * und Klaus Hofmann Bundesanstalt f/ir Fleischforschung, E.-C.-Baumannstrasse 20, D-8650 Kulmbach, Bundesrepublik Deutschland

Influence of o-phosphate on the spectrum of myoglobin

Summary. o-Phosphate causes myoglobin solutions to change colour from brown to reddish-brown. The spectrum of myoglobin in the presence of o-phosphate is characterized by two peaks, one at 540 nm and the other at 575 nm and also by a shift in the Soret band at 409 nm to 420 nm.

Zusammenfassung. o-Phosphat bewirkt eine Farbver- schiebung von Metmyoglobinl6sungen von braun nach rotbraun. Das Metmyoglobinspektrum in Ge- genwart von o-Phosphat ist durch zwei Maxima bei 540 und 575 nm und durch eine Verschiebung der So- ret-Bande von 409 nach 420 nm charakterisiert.

Bei der Oberpr/ifung von Myoglobinpr/iparaten hin- sichtlich ihres Oxidationszustandes sowie der Ge- schwindigkeit der Oxidation von Oximyoglobin zu Metmyoglobin mittels Kaliumhexacyanoferrat(III) anhand des Spektrums zwischen 650 und 480 nm wur- de beobachtet, dab o-Phosphat (nicht dagegen Di- Phosphat!) eine deutliche Farbverschiebung und eine entsprechende Ver/inderung des Spektrums bewirkt. Die resultierende Spektralkurve entspricht weder der des Oximyoglobins noch der des Metmyoglobins. Bei Abwesenheit von o-Phosphat wurde das Spektrum des Metmyoglobins erhalten. Diese Beobachtung ist f/ir die spektrophotometrische Untersuchung und Be- stimmung der Myoglobine von Interesse.

Experimentelle Angaben

Myoglobin vom Pferd (Serva, Heidelberg) oder Rind (hergestellt nacb [1]) in dest. Wasser 16sen (Konzentration ca. 1 mg/ml) und Phosphatpuffer pH 7,0 in verschiedenen Konzentrationen (siehe un- ten) zugeben. In verschiedenen Ans/itzen zus~itzlich Kaliumhexacya- noferrat(III) (Oxidation von Myoglobin zu Metmyoglobin [2]), As-

* Gegenwdrtige Adresse: Institut f/Jr Fleischhygiene, Fleischtechno- logie und Lebensmittelkunde, Veterin/ir-Medizinische Universit~it Wien, Linke Bahngasse 11, A-1030 Wien, Osterreich

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corbat, Natriumdithionit, Natriumdiphosphat, Tris, EDTA oder Ci- trat zufiigen. Spektren im sichtbaren Bereich mit einem selbstregi- strierenden Spektralphotometer (UVIKON 810) aufnehmen.

Ergebnisse und Diskussion

Bei Zusatz von o-Phosphatpuffer zu einer Metmyo- globinl6sung tritt eine spontane Farbverschiebung von braun nach braunrot ein. Das Spektrum der L6- sung unterscheidet sich von dem der phosphatfreien Myoglobinl6sung (Abb. 1).

Die Metmyoglobin-Maxima bei 502 und 630 nm verschwinden und es treten zwei neue Peaks bei 540 und 575 nm auf. Die Absorptionskurven der Metmyo- globinl6sungen mit und ohne o-Phosphat schneiden sich in zwei isobestischen Punkten bei 520 und 610 nm. Es ist ein mindestens dreifacher molarer Phosphat- /iberschuB notwendig, um eine sichtbare Ver/inderung im Spektrum zu bewirken. Eine maximale Spektral- ver/inderung wird bei einem ca. 3500fachen molaren Phosphat/iberschuB erzielt (Abb. 1). Die beschriebe- nen Spektralver/inderungen wurden auch bei Verwen- dung von Di-Natriumhydrogenphosphat- (pH 8,9)

PO~"

\\

\ \ \ N

I J 5t00 I i I I L L t i I ~ ~ I h t I

480 550 600 nm 650

We(ieni~nge

Abb. 1. Absorptionsspektrum von Metmyoglobin (MetMb) in Ab- wesenheit und in Gegenwart yon o-Phosphat (PO~-) sowie Na- triumdodecylsulfat (SDS)

Z Lebensm Unters Forsch (1988) 187:125-126 © Springer-Verlag 1988

und Kaliumdihydrogenphosphat- (pH 4,7) L6sungen beobachtet (es traten lediglich geringe Extinktionsun- terschiede auf). Die durch Phosphat verursachte Farb- verschiebung und die damit verbundene Ver/inderung des Spektrums ist somit im untersuchten pH-Bereich weitgehend unabhfingig vom pH-Wert der Pufferl6- sung. Geht man von einer Oximyoglobinl6sung aus (hergestellt durch Reduktion yon gel6stem Metmyo- globin mit Ascorbat), so bewirkt die Zugabe yon o- Phosphat keine Verfinderung des Oximyoglobin-Spek- trums. Auch die Phosphatzugabe zu deoxigeniertem Fe(II)-Myoglobin (hergestellt durch Reduktion mit Ascorbat unter gleichzeitiger Zugabe yon Natriumdi- thionit) bewirkt keine spektrale Verschiebung der Wel- lenl/ingenmaxima. Gleichzeitige Zugabe von Kalium- hexacyanoferrat(III) und o-Phosphat zu einer L6sung von Fe(II)-Myoglobin fiihrt dagegen wiederum zu der bei Metmyoglobin beobachteten Spektralver/inde- rung. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Kaliumhexa- cyanoferrat(III), Phosphat und Cyanid erh/ilt man das Spektrum des Cyanometmyoglobins. Im Gegensatz zu o-Phosphat hat Diphosphat keinerlei Einflul3 auf das Spektrum des Metmyoglobins im sichtbaren Be- reich, ebenso nicht EDTA, Tris und Citrat. Einen star- ken Einflul3 hat dagegen Natriumdodecylsulfat (Abb. 1).

Der Zusatz yon o-Phosphat hat offensichtlich ei- nen stabilisierenden Einflul3 auf die L6slichkeit des Myoglobins. W/ihrend es bei der Erhitzung einer phosphatfreien Myoglobin-L6sung (10 min auf 80 °C) bereits zu einer deutlichen Ausflockung des

Myoglobins kommt, wird in Gegenwart yon Phosphat geringfiigiger Niederschlag beobachtet. Das charakte- ristische Spektrum der L6sung bleibt ebenfalls erhal- ten, die Farbe bleibt unver~indert. Untersuchungen an H/imoglobin fiihrten zu analogen spektralen Ver/inde- rungen.

Die hier beschriebenen Einfliisse von o-Phosphat auf das Absorptionsspektrum von Metmyoglobin sind fiir photometrische Myoglobinbestimmungsme- thoden, bei denen Phosphatpuffer verwendet wird, von Bedeutung, insbesondere, wenn der anteilige Ge- halt an Met- und Oximyoglobin bestimmt werden soll. Durch das in Gegenwart von Phosphat auftretende Spektrum des Metmyoglobins kann Oximyoglobin vorget/iuscht werden.

Die Ursache fiir das Auftreten der beschriebenen Ver/inderung des Metmyoglobinspektrums durch o- Phosphat ist noch ungekl/irt. Die bisherigen Beobach- tungen sprechen fiir die Bildung eines Myoglobin- phosphat-Komplexes.

Zum gegenw/irtigen Zeitpunkt kann nur empfoh- len werden, bei spektralphotometrischen Myoglobin- bestimmungen keine phosphathaltigen Pufferl6- sungen zu verwenden.

Literatur

1. Biinnig, K, Harem R (1969) J Chromatogr 43:450 2. Herbertz G (1972) Z Anal Chem 260:124

Eingegangen am 11. Dezember 1987

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