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Klinik für Dermatologie und Venerologie
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof.Dr.med. Detlef Zillikens
Einfluss von ultraviolettem Licht und extrazellulärer Matrix
auf Pigmentzellhomöostase und Expression
melanozytärer Adhäsionsmoleküle
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- Aus der Medizinischen Fakultät -
vorgelegt von
Christian Geuchen
aus Bocholt
Lübeck 2007
1. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr.med. Sven Krengel
2. Berichterstatter: Priv.-Doz. Dr.med. Thomas Peter Kurz
Tag der mündlichen Prüfung: 14.01.2008
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 14.01.2008
gez. Prof. Dr.med. Werner Solbach
- Dekan der Medizinischen Fakultät-
I
INHALTSVERZEICHNIS SEITE
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG ............................................................................................................ 1
1.1 MELANOZYTEN.................................................................................................... 1
1.2 BASALMEMBRAN UND EXTRAZELLULÄRE MATRIX ................................................... 2
1.3 MELANOZYTÄRE ADHÄSIONSMOLEKÜLE ................................................................ 4
1.4 SIGNALTRANSDUKTION DURCH INTEGRINE ............................................................ 6
1.5 ULTRAVIOLETTE STRAHLUNG UND DEREN EINFLUSS AUF MELANOZYTÄRE
HOMÖOSTASE ................................................................................................................ 8
1.6 EINFLUSS VON INTEGRINEN AUF DEN PROGRAMMIERTEN ZELLTOD (APOPTOSE) VON
MELANOZYTEN ..............................................................................................................10
1.7 FRAGESTELLUNG ...............................................................................................12
2 MATERIAL UND METHODEN.................................................................................13
2.1 ZELLKULTUREN ..................................................................................................13
2.1.1 Zellkulturmedium ..........................................................................................13
2.1.2 Melanozytenkultur ........................................................................................14
2.1.3 Keratinozytenkultur.......................................................................................14
2.1.4 Passagieren der Melanozyten und Keratinozyten .........................................15
2.1.5 Einfrieren und Auftauen von Melanozyten und Keratinozyten.......................15
2.1.6 Beschichtung der Kulturplatten .....................................................................16
2.2 UV-BESTRAHLUNG.............................................................................................17
2.2.1 UV-Lichtquelle ..............................................................................................17
2.2.2 Festlegung der UV-Dosis..............................................................................17
2.2.3 Bestrahlung der Melanozyten .......................................................................17
2.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE ..................................................................................18
2.4 IMMUNFLUORESZENZ UND KONFOKALE LASERMIKROSKOPIE .................................22
2.5 STATISTISCHE AUSWERTUNG..............................................................................23
3 ERGEBNISSE .........................................................................................................24
3.1 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG DER INTEGRINEXPRESSION....................24
3.1.1 Integrinexpression nach UV-Bestrahlung......................................................24
3.1.2 Integrinexpression unter Einfluss von Zell-Matrix-Kontakt.............................25
3.1.3 Kinetik der α6-Integrin-Expression................................................................28
II
3.1.4 Einfluss des Radikalfängers Pyrrolidendithiocarbamat (PDTC) auf die
Expression von α6-Integrin.......................................................................................31
3.2 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG DER APOPTOSERATE ............................31
3.2.1 UVB-induzierte Apoptose auf unterschiedlichen EZM-Beschichtungen ........31
3.2.2 UVB-induzierte Apoptose bei Beschichtung mit Laminin-1 in unterschiedlicher
Konzentration...........................................................................................................35
3.2.3 UVB-induzierte Apoptose nach Zugabe eines Antikörpers gegen
α6-Integrin ......................................................................................................37
3.3 MIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN ................................................................42
4 DISKUSSION...........................................................................................................46
4.1 MELANOZYTÄRE INTEGRINEXPRESSION ...............................................................46
4.1.1 Einfluss der UVB-Bestrahlung auf die Expression melanozytärer
Adhäsionsmoleküle ..................................................................................................46
4.1.2 Einfluss extrazellulärer Matrix auf die Expression melanozytärer
Adhäsionsmoleküle nach UVB-Bestrahlung .............................................................48
4.2 MELANOZYTÄRE APOPTOSERATE ........................................................................52
4.2.1 Einfluss der UVB-Bestrahlung auf die melanozytäre Apoptoserate...............52
4.2.2 Einfluss von EZM-Bestandteilen auf die melanozytäre Apoptoserate nach
UVB-Bestrahlung .....................................................................................................53
4.2.3 Einfluss eines blockierenden Antikörpers gegen α6-Integrin auf die
melanozytäre Apoptoserate nach UVB-Bestrahlung.................................................54
4.3 REGULATION DER EXPRESSION MELANOZYTÄRER ADHÄSIONSMOLEKÜLE AUF
ZELLULÄRER EBENE NACH UVB-BESTRAHLUNG...............................................................55
5 ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................59
6 LITERATURVERZEICHNIS.....................................................................................60
7 ANHANG (BILDER, TABELLEN)............................................................................76
8 ERKLÄRUNG ..........................................................................................................88
9 DANKSAGUNG.......................................................................................................89
10 LEBENSLAUF.........................................................................................................90
III
Abkürzungsverzeichnis
1,5K Zellen eines eineinhalbjährigen
„Kaukasiers“
2,5N Zellen eines zweieinhalbjährigen
„Negroiden“
a Jahr(e)
AIF Apoptosis inducing factor
BPE Bovine pituitary extract
BSA Bovine serum albumine
D Dalton
EGF Epidermal growth factor
EZM Extrazelluläre Matrix
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
FACS Fluorescence activated cell sorter
FAK Focal adhesion kinase
FGF-2 Fibroblast growth factor 2
FITC Fluoresceinisothiozyanat
g Gramm
gn Normalfallbeschleunigung ( 9,81 m/s2 )
h Stunde(n)
Hepes N-2-Hydroxyethylpiperazin-2-
Ethansulfonsäure
ICAM Intercellular adhesion molecule
K Kilo
Keratinocyte-SFM Serum free keratinocyte medium
KZ Keratinozyten
l Liter
µ Mikro
m Milli
MAPK Mitogen activated protein kinase
MGM-M2 Melanocyte growth medium M2
min Minute(n)
IV
M Molarität
MZ Melanozyten
nm Nanometer
PBS Phosphate buffered saline
(Phosphatpufferlösung)
PE Phycoerythrin
p.i. post irridiationem
PI Propidiumiodid
PIK3 Phosphoinositol-3-Kinase
PDTC Pyrrolidendithiocarbamat
SD Standardabweichung
TNS Trypsine neutralizing solution
TPA Tetraphorbolazetat
UV Ultraviolett
x Mittelwert
Einleitung
1
1 Einleitung
In den letzten Jahren ist die Interaktion zwischen Zellen und ihrer Umgebung
(Nachbarzellen bzw. extrazelluläre Matrix) stärker in den Blickpunkt der Forschung
gerückt. Viele der zugrunde liegenden Mechanismen werden durch Adhäsionsmoleküle
vermittelt. Adhäsionsmoleküle dienen nicht nur der Verankerung von Zellen, sondern
beeinflussen maßgeblich zelluläre Prozesse wie Proliferation, Migration,
Differenzierung und Apoptose. Sie binden an Liganden und übertragen Signale in das
Zellinnere. Für Melanozyten und die sie umgebenden Strukturen, insbesondere
Keratinozyten und Bestandteile der extrazellulären Matrix, sind die hierbei wirksamen
Zusammenhänge noch weitgehend ungeklärt. Auch zum Einfluss von ultraviolettem
Licht (UV-Licht) auf die Umgebungsinteraktion von Melanozyten existieren nur wenige
Daten.
1.1 Melanozyten
Melanozyten sind die pigmentproduzierenden Zellen der Epidermis. Während der
Embryogenese wandern sie aus der Neuralleiste in die Haut ein (Holbrook et al.,
1989). Durch ihre Dendriten haben die Melanozyten Kontakt zu circa 30 Keratinozyten,
den Hornzellen der Epidermis, und bilden die „epidermal-melanozytäre Einheit“
(Fitzpatrick und Breathnach 1963; Hsu et al., 2002). Keratinozyten üben Ammen- und
Kontrollfunktionen aus, indem sie Wachstumsfaktoren produzieren, die Überleben,
Proliferation und Funktion der Melanozyten regulieren (Gordon et al., 1989; Thody,
1995). Melanozyten synthetisieren Melanin, ein braun-schwarzes Pigment, das in
makromolekularen Komplexen (Melanosomen) über die dendritischen Fortsätze in
umgebende Keratinozyten transportiert wird (Riley, 1997). Melanin hat eine
photoprotektive Funktion für die Haut, da es UV-Strahlung direkt absorbiert und
Sauerstoffradikale, die durch die Interaktion der UV-Photonen mit Membranlipiden und
anderen zellulären Chromophoren entstanden sind, deaktiviert (Kobayashi et al., 1998;
Riley, 2003). In den Keratinozyten ist Melanin in Form „supranukleärer Kappen“
angeordnet, die die DNA im Zellkern vor Lichteinstrahlung schützen (Kobayashi et al.,
1998). Die zwei Hauptvarianten, Eu- und Phäomelanin, werden in mehreren
enzymatischen Schritten aus der aromatischen Aminosäure Tyrosin gebildet, die in
spezialisierten Zellorganellen, den sogenannten Prämelanosomen, vorliegt. An diese
Einleitung
2
lagert sich das Schlüsselenzym Tyrosinase an, das durch UV-Licht aktiviert wird. Durch
Polymerisation und Verbindung mit Proteinanteilen des Prämelanosoms entsteht
Melanin. Das Melanosom, das nach Verlust der Tyrosinaseaktivität als
Melaningranulum bezeichnet wird, stellt das Endprodukt des Melanozyten dar (Kvam
und Dahle, 2003; Petrides, 2006; Riley, 1997; Thody und Higgins, 1991).
Melanozyten liegen innerhalb der basalen epidermalen Zellschicht. Somit haben sie
nicht nur Kontakt zu den Keratinozyten, der vor allem durch das Adhäsionsmolekül E-
Cadherin vermittelt wird (Tang et al., 1994), sondern auch zur Basalmembran
(Tarnowski, 1970). Die Interaktion zwischen Melanozyten und
Basalmembranmolekülen, insbesondere Laminin und Kollagen Typ IV, wird durch
Integrine vermittelt (Danen et al., 1993; Etoh et al., 1993).
1.2 Basalmembran und extrazelluläre Matrix
Die extrazelluläre Matrix (EZM) stellt ein komplexes Netzwerk aus hochmolekularen
Proteinen und Polysacchariden dar, das von Epithel- und Bindegewebszellen
sezerniert und organisiert wird (Timpl et al., 1981; Van der Flier und Sonnenberg;
2001). Die Basalmembran ist eine spezialisierte Form der extrazellulären Matrix, die in
allen epithelialen Geweben als Grenzstruktur zur angrenzenden Bindegewebsschicht
zu finden ist. Die Basalmembran der Epidermis ist eine dünne Lamelle (Durchmesser:
30-150 nm), die bei elektronenmikroskopischer Betrachtung aus zwei Hauptschichten,
der Lamina lucida und der Lamina densa besteht (Briggaman und Wheeler, 1975). Die
Lamina lucida stellt einen Spaltraum dar, durch den Verankerungsfilamente (u.a.
Laminin Typ 5) und hemidesmosomale Proteine von der Plasmamembran der basalen
Keratinozyten zur Lamina densa reichen (Bruckner-Tuderman, 2005).
Verankerungsfibrillen und Mikrofibrillenbündel verbinden wiederum die Lamina densa
mit der Dermis. Beide Laminae, Fibrillen, feine dermale Kollagenfasern und Matrix
bilden zusammen die dermoepidermale Junktionszone, die lichtmikroskopisch als
feines homogenes Band erkennbar ist (Burgeson und Christiano, 1997).
Epitheliale Gewebe nutzen die Basalmembran, deren Komponenten von Epithel- und
Bindegewebszellen gebildet wird, zu vielfältigen Zwecken. So steuert die
Basalmembran die Differenzierung adhärierender Zellen (Ingber, 2002), dient als
Depot für Wachstumsfaktoren (Folkman et al., 1988) und als Gerüst, an dem die Zellen
durch konstante Anhaftung überleben. Es konnte gezeigt werden, dass durch Verlust
dieser Haftung eine spezielle Form der Apoptose, die sogenannte Anoikis, induziert
Einleitung
3
wird (Frisch und Ruoslahti, 1997). Somit beruht die Stabilität und Homöostase
epithelialer Gewebe maßgeblich auf einer intakten Basalmembran (Ingber, 2002;
Simian et al., 2001).
Zwei Proteine der EZM, Laminin und Kollagen Typ IV, sind die wichtigsten
Komponenten der Basalmembran in der dermoepidermalen Junktionszone. Sie
organisieren ihre räumliche Anordnung in der Basalmembran z.T. selbständig
(Yurchenko et al., 1992; Yurchenko und Furthmayer, 1984), z.T. werden sie dabei von
zellulären Adhäsionsmolekülen geleitet (Fleischmajer et al., 1998). Beide Moleküle
gewährleisten in vitro Zellhaftung und Migration verschiedener Zellen (Aumailley et al.,
1987; Deutzmann et al., 1990; Goodman et al., 1989).
Laminine sind heterotrimere Glykoproteine (ca. 850 kD), bestehend aus drei Ketten (α,
β und γ), die sich α-helikal über Disulfidbrücken zu kreuzförmigen Quartärstrukturen
verbinden (Sonnenberg et al., 1990; Timpl, 1996). Aus Isoformen dieser Untereinheiten
können sich verschiedene Laminine bilden (Aumailley und Krieg, 1996; Petrides,
2006). Bis heute sind elf verschiedene Isoformen bekannt (Suzuki et al., 2005). Sie
sind ausschließlich in Basalmembranen zu finden (Sonnenberg et al., 1990). Über
spezielle Bindungsstellen binden Laminine andere Proteine und Zellen. Die epidermale
Basalmembran enthält Laminin Typ 1, 5 und 6, das von epithelialen (Keratinozyten)
und mesenchymalen (Fibroblasten) Zellen bereitgestellt wird (Fleischmajer et al.,
1998).
Die Großfamilie der Kollagene wird in fibrilläre und nichtfibrilläre Kollagene unterteilt.
Zu letzteren zählen die Basalmembran-, kurzkettigen und fibrillenassoziierten
Kollagene (Petrides, 2006). Charakteristisches Merkmal aller Kollagentypen ist, dass
Teile des Moleküls aus Polypeptidketten bestehen, die in Form einer Tripelhelix
umeinander gewunden sind. Es sind neunzehn verschiedene Typen bekannt. Typ IV ist
für Basalmembranen spezifisch. Die Struktur dieses Moleküls kommt zum einen durch
die enzymatische Verknüpfung zweier C-terminaler Enden zu Dimeren und zum
anderen von vier N-terminalen Enden zu einem Tetramer zustande. Aus diesen Di- und
Tetrameren entsteht das Kollagen Typ IV-Netzwerk (Timpl, 1996). Dieses
unterscheidet sich von den fibrillären Kollagenen zudem durch N-glykosidische
Saccharidketten und einen wesentlich höheren Gehalt an hydroxylierten Lysyl- und
glykosylierten Hydroxylysylresten (Petrides, 2006).
Ein weiterer Bestandteil der extrazellulären Matrix sind adhäsive Glykoproteine oder
Nektine (u.a. Fibronektin), die den Kontakt zu den im Bindegewebe eingelagerten
Zellen vermitteln (Petrides, 2006; Ruoslahti, 1988). Fibronektin setzt sich aus zwei
Einleitung
4
Polypeptidketten zusammen, die durch Disulfidbrücken am C-terminalen Ende
verbunden sind und so ein Dimer (ca. 550 kD) bilden (Skorstengaard et al., 1986). Es
fördert Verankerung, Polarität, Migration und Differenzierung von Zellen (Ruoslahti,
1988) und die Zusammensetzung der Basalmembran (Couchman et al., 1990). Im
Zuge der Reepithelisierung von Wunden ist Fibronektin in der provisorischen Matrix
unter dem sich neu bildenden Epithel zu finden (Fritsch, 2004). Gleichzeitig
exprimieren einwandernde Zellen Fibronektinrezeptoren, um die Adhäsion zu
gewährleisten (Clark, 1990). Außerdem werden über Fibronektin Signaltransduktionen
im Zellinneren in Gang gesetzt und über eine Umorganisation des Zytoskeletts die
Migration der Zellen beeinflusst (Akiyama et al., 1995).
1.3 Melanozytäre Adhäsionsmoleküle
Melanozyten liegen nach der embryonalen Einwanderung aus der Neuralleiste in die
Haut im Stratum basale der Epidermis in direktem Kontakt zur Basalmembran. Somit
besteht neben der Interaktion mit Keratinozyten ein Einfluss durch Adhäsionsmoleküle,
die die Melanozyten mit der Basalmembran verbinden. Adhäsionsmoleküle sind
membranständige Moleküle, die die Interaktion der Zelle mit Nachbarzellen und
extrazellulärer Matrix gewährleisten. Zu ihnen zählen Cadherine (calcium dependent
adhesion), ICAMs (immunglobuline like cell adhesion molecule), Selektine und
Integrine (Albelda, 1993; Delwel et al., 1994; Tang et al., 1994; Tronnier et al., 1995).
Cadherine dienen hauptächlich als Adhäsionsmoleküle für die Interaktion zwischen
Melanozyten und Keratinozyten (Tang et al., 1994). ICAMs sind häufig mit
entzündlichen Prozessen assoziiert und sind unter physiologischen Bedingungen nicht
in der basalen Epidermis nachweisbar.
Adhäsionsmoleküle aus der Familie der Integrine sind auf beinahe allen Zellen zu
finden (Delwel et al., 1994; Hynes, 1992), und viele Zellen exprimieren mehrere
verschiedene Integrine auf ihrer Zelloberfläche. Der Name beruht auf ihrer Funktion,
extrazelluläre Proteine (EZM) mit dem Zellinneren (Zytoskelett) zu verbinden (Van der
Flier und Sonnenberg, 2001). Integrine sind heterodimere
Transmembranproteinkomplexe, die aus zwei nichtkovalent verbundenen α- und β-
Untereinheiten bestehen (Hynes, 1992; Rupp und Little, 2001). Die α-Untereinheit
variiert zwischen 120 und 180 kD, die β-Untereinheit zwischen 90 und 110 kD. Bis
heute sind 18 verschiedene α-Untereinheiten und acht verschiedene β-Untereinheiten
bekannt (Huhtala et al., 2005), die untereinander assoziiert sein können. Allerdings ist
Einleitung
5
die Vielfalt der Zusammenlagerungen dadurch begrenzt, dass viele α-Untereinheiten
nur an bestimmte β-Untereinheiten binden können (Hynes, 1992). Die Kombination der
beiden Untereinheiten determiniert die Ligandenspezifität des Integrins. Dabei können
zahlreiche Integrine an mehrere unterschiedliche Liganden binden, ferner binden
verschiedene Integrine an den gleichen Liganden (Van der Flier und Sonnenberg,
2001). Einige Integrine sind Zelltyp-spezifisch. So wird α6β4-Integrin nur von
Keratinozyten exprimiert (Danen et al., 1993; Kajiji et al., 1989). Um die Komplexität
der Integrinfamilie übersichtlicher zu gestalten, wird sie in drei Gruppen gegliedert: (1)
Zell-Zell-Adhäsionsmoleküle, (2) Zell-Basalmembran-Bindungsmoleküle und (3)
matrixbindende Moleküle der Wundheilung, Entzündung und Entwicklung (Albelda,
1993; Clark, 1990; Shaw und Mercurio, 1994).
Die Ligandenbindungsstelle der Integrine befindet sich im globulären, aus α- und β-
Untereinheit geformten Kopf, der oberhalb des stielförmigen Halses aus der
Zellmembran ragt (Faull und Ginsberg, 1995). Der zytoplasmatische Anteil ist in der
Regel kurz. Er besteht aus 30 bis 50 Aminosäuren. Eine Ausnahme bildet die β4-
Untereinheit, deren zytoplasmatischer Schwanz aus ungefähr 1000 Aminosäuren
besteht (Humphries et al., 2004; Springer, 1997).
Abb.1. Struktur von Integrinen a) zeigt eine Übersichtsdarstellung des Aufbaus, wie er durch
Elektronenmikroskopie bekannt ist: Hervorgehoben sind die cystinreichen Repeats der β-Untereinheit
(schraffiert) und die Metallbindungsstellen in der α-Untereinheit (M++). Der schwarz ausgefüllte Bereich
repräsentiert die Liganden-Bindungsregion, die von beiden Untereinheiten gebildet wird. b) verdeutlicht
den chemischen Aufbau der Polypeptid-Ketten (nach Hynes, 1992)
Zellmembran
Einleitung
6
Die Integrinexpression durch humane Melanozyten bzw. deren Vorläuferzellen
unterliegt bereits im Rahmen der ontogenetischen Entwicklung (Einwanderung aus der
Neuralleiste in die Haut) einer gewissen Variabilität (Scott et al., 1992). Auch nach
Abschluß der Entwicklung ist die Expression von Integrinen auf Melanozyten
vermutlich durch exogene Faktoren beeinflussbar. So wirken sich Veränderungen der
Kulturbedingungen in vitro auf die Expression der Integrine aus (Scott et al., 1997;
Zambruno et al., 1993). Immunelektronenmikroskopisch konnten auf humanen
Melanozyten in vivo die Integrinuntereinheiten α3, α6, αV und β1 dargestellt werden
(Zambruno et al., 1993). In vitro wurde durch Immunopräzipitation α3β1-, α5β1-, α6β1-
und αVβ3-Integrin nachgewiesen (Zambruno et al., 1993). Danen et al. (1996) wiesen
auf Melanozyten in vitro α2β1- und α4β1-Integrin nach. Die Unterschiede in der
Expression der melanozytären Adhäsionsmoleküle in vitro sind durch die Zugabe
unphysiologischer Mitogene wie Phorbolester zum Kulturmedium (Danen et al., 1996),
die in vivo nicht vorliegen, zu erklären.
Durch α6-Integrin-Antikörper konnte die Haftung von Melanozyten an Laminin-1 in vitro
blockiert werden (Hara et al., 1994). In anderen Untersuchungen konnte durch α3-
Integrin-Antikörper die Bindung von Melanozyten an Laminin-5 inhibiert werden
(Mengeaud et al., 1996; Scott et al., 1999). Somit sind diese Integrinuntereinheiten als
wichtigste Rezeptoren für die Lamininisoformen zu betrachten. Melanozyten binden in
vitro über α2β1-Integrin an den Basalmembranbestandteil Kollagen Typ IV. Die
Bindung führt zu gesteigerter Zellmigration (Morelli et al., 1993). Die Bindung an
Fibronektin wird vor allem durch die Integrine α5β1 und αVβ3 vermittelt (Scott et al.,
1992; Zambruno et al., 1993).
1.4 Signaltransduktion durch Integrine
Zellen erhalten über Adhäsionsmoleküle Signale aus ihrer Mikroumgebung, wodurch
Proliferation (Frisch und Ruoslahti, 1997; Stupack et al., 2001), Migration (Neitmann et
al., 1999) und Differenzierung (Adams und Watt, 1993; Lin und Bissell, 1993)
maßgeblich beeinflusst werden. Die Bindungsstelle für viele Integrine, die an Proteine
der extrazellulären Matrix binden, ist das Tripeptid Arginin-Glycin-Aspartat (RGD;
Ruoslahti, 1991), das zunächst im Fibronektin-Molekül identifiziert werden konnte. Die
RGD-Bindungsstelle wird v.a. durch die Integrinuntereinheiten α4, α5, α8 und αV
erkannt. Laminine und Kollagene enthalten ebenfalls die RGD-Bindungsstelle, die
aufgrund der Molekülkonformation aber nicht als Rezeptorstelle erreichbar ist. Diese
Einleitung
7
EZM-Proteine werden von den Integrinen über die α3-, α6- oder α7-Untereinheit
(Laminin bindende Rezeptoren) erkannt (Van der Flier und Sonnenberg, 2001).
Adhäsionsmoleküle Bindungspartner
α2β1
α3β1
α5β1
α6β1
αVβ1
αVβ3
Kollagen, Laminin
Laminin (-5)
Fibronektin
Laminin (-1)
Fibronektin
Fibronektin
Tabelle 1. Bevorzugte Bindungspartner ausgewählter Integrine (nach Van der Flier und Sonnberg, 2001)
Zunächst müssen Integrine je nach Zelltyp durch Agonisten aktiviert werden, bevor sie
an Liganden binden. Für Leukozyten und Thrombozyten sind diese Agonisten z.B.
Epinephrin bzw. Thrombin (Van der Flier und Sonnenberg, 2001). Änderungen der
Affinität zum Liganden resultiert aus Konformationsänderungen des Integrins.
Insbesondere divalente Kationen (z.B. Mg2+) können die aktive Form der Integrine
induzieren und stabilisieren (Diamond und Springer, 1994; Van der Flier und
Sonnenberg, 2001). Ebenso wird die Bindungsaffinität der Integrine durch Clustering
erhöht. Die Clusterbildung kann durch Bindung eines Liganden mit multiplen
Bindungsstellen oder durch Interaktionen mit dem intrazellulären Zytoskelett entstehen
(Sampath et al., 1998). Ein weiterer Mechanismus, der die Bindungsfähigkeit der
Integrine reguliert, ist die Internalisierung (Leitinger und Hogg, 2002; Powelka und Sun,
2004). Aufnahme der Integrine in Vesikel, die sich aus der Zellmembran lösen und die
Integrine umschließen, verhindert die Ligandenbindung. In adhärierenden Zellen, zu
denen auch Melanozyten gehören, befinden sich die Integrine meistens in ihrer aktiven
Form (Cruz et al., 1997). An besonders eng zusammenliegenden Stellen zwischen
Zellmembran und darunter liegender extrazellulärer Matrix formen adhärierende Zellen
besondere fokale Kontaktstellen aus. Die Ausbildung ist zu beobachten, nachdem die
Liganden an Integrine binden (Miyamoto et al., 1995 A). Intrazellulär setzt dies eine
Signalkaskade in Gang. Da der kleine zytoplasmatische Anteil der Integrine keine
intrinsische katalytische Fähigkeit besitzt (Zhao et al., 2004), vermittelt eine große
Anzahl intrazellulärer Bindungspartner, von denen bislang erst ein Teil identifiziert
wurde, die intrazelluläre Signalübertragung. Diese Bindungspartner lassen sich
verschiedenen Gruppen von Signalmolekülen zuordnen. Das Adapterprotein Tensin
Einleitung
8
bindet an Aktin und interagiert über eine Phosphotyrosinbindungsstelle mit dem
zytoplasmatischen Integrinanteil (Lo, 2004). Über die Signalproteine FAK (focal
adhesion kinase), MAPK (mitogen-activated protein kinase) und PI3K (Phosphoinositol
3-Kinase) wird die Zellzyklusprogression reguliert (Chen und Bailey, 2000; Schwartz
und Assoian, 2001). Des Weiteren werden die Zytoskelettkomponenten Vinculin, Talin
und α-Aktinin gebunden (Aplin et al., 1999; Miyamoto et al., 1995 B; Sampath et al.,
1998). Hierdurch kommt es zu Umlagerungen des Zytoskeletts und
verankerungsabhängigem Übergang in die S-Phase des Zellzyklus sowie zu
integrinvermittelter Gentranskription (Boudreau und Bissell, 1998). Weitere
Transmembranproteine interagieren mit Integrinen als Korezeptoren (Porter und Hogg,
1998). Sie beeinflussen Zellmigration sowie die Expression und wahrscheinlich auch
das Clustering der Integrine (Miyamoto et al., 1995 A; Sterk et al., 2002). Neben der
allgemeinen zellbiologischen Bedeutung dieser Mechanismen scheint gerade die
integrinvermittelte Signaltransduktion eine wichtige Grundlage gewebs- bzw.
zellspezifischer Signalübertragungsprozesse darzustellen. Hierdurch kommt der
Charakterisierung der Integrinregulation in einzelnen Zelltypen eine besondere
Bedeutung zu. Für Pigmentzellen der Haut ist diese Regulation bislang unzureichend
bekannt.
1.5 Ultraviolette Strahlung und deren Einfluss auf melanozytäre
Homöostase
UV-Strahlung besteht aus elektromagnetischer Energie und deckt einen
Wellenlängenbereich zwischen 100 und 400 nm ab. Sie gliedert sich in Vakuum-UV,
UVC, UVB und UVA. Die prädominante Form der UV-Strahlung, die die Erde erreicht,
ist das langwellige UVA-Licht (320-400 nm). Nur wenig Strahlung (weniger als 10%)
erreicht die Erde in Form von UVB-Licht (280-320 nm; Dissanayake et al., 1993;
Kadekaro et al., 2003). Das kurzwellige UVC-Licht (200-280 nm) ist hochenergetisch,
durchdringt aber genau wie Vakuum-UV (100-200 nm) kaum die Erdatmosphäre. UVA-
und UVB-Spektrum differieren in ihrem biologischen Effekt und in ihrer Eindringtiefe in
die Hautschichten. Das kurzwelligere UVB-Licht wird größtenteils in der Epidermis
absorbiert, ist aber energetischer und vielfach stärker kanzerogen als UVA. Es hat eine
ungefähr eintausendfach höhere biologische Aktivität als UVA-Strahlung. UVB-Strahlen
werden direkt von der Zell-DNA absorbiert und verursachen charakteristische
Thymidindimere innerhalb des DNA-Stranges (Freeman et al., 1989; Kobayashi et al.,
Einleitung
9
1998; Schothorst et al., 1991). UVB-Licht induziert darüber hinaus die Bildung von
Sauerstoffradikalen (Kvam und Tyrell, 1997; Yaar und Gilchrest, 1998). Somit ist die
UVB-Strahlung hauptverantwortlich für das Entstehen von Sonnenbränden, Keratosen
und Hautkrebs. Bei hellen Hauttypen ist die Empfindlichkeit gegen UV-Licht erhöht. Es
reicht eine niedrige UV-Dosis aus, um einen Sonnenbrand zu induzieren. Aufgrund der
höheren Wellenlänge erreichen UVA-Strahlen die mittlere Dermis. UVA induziert, in
geringerem Ausmaß als UVB-Strahlung, primär Schäden durch die Bildung von
Sauerstoffradikalen, die Einzelstrangbrüche in der DNA hervorrufen und zu DNA-
Protein-Verbindungen führen (Kvam und Dahle, 2003).
In Melanozyten induziert UV-Strahlung die Melanogenese (Aberdam et al., 1993;
Bologna et al., 1989). Hierbei handelt es sich um einen zweistufigen Prozess: eine
sofortige Pigmentierung, die innerhalb weniger Minuten nach UV-Exposition einsetzt,
und eine verzögerte Bräunung, die zwei bis drei Tage nach Strahlungsexposition
erkennbar wird (Barker et al., 1995; Pathak und Fanselow, 1983). Sofortige Bräunung
wird primär durch UVA induziert und entsteht durch Photooxidation schon
vorgebildeten Melanins. Dieser sofortige Effekt erfordert die Reorganisation von
Intermediärfilamenten in Melanozyten und Keratinozyten, um die melaninhaltigen
Melanosomen von den Melanozyten in die Keratinozyten zu transportieren. Der
verzögerte Bräunungsprozess wird vorwiegend durch UVB-Licht induziert. Die Zahl
aktiver Melanozyten steigt dabei parallel zu Synthese und Transfer von Melanin an
(Gilchrest et al., 1999; Kadekaro et al., 2003; Slominski und Pawelek, 1998).
UV-Strahlung führt im Rahmen dieser metabolischen Veränderungen auch zu
morphologischen Veränderungen in Melanozyten. So kommt es nach UV-Exposition zu
einer Größenzunahme und zu einer Vermehrung der Melanozyten sowie zu einer
verstärkten Dendrizität (Archambault et al., 1995; Badawy et al., 2003; Stierner et al.,
1989). Auf molekularer Ebene ist eine verstärkte Expression des Antigens HMB-45,
einem Marker für melanozytäre Aktivität, festzustellen (Badawy et al., 2003; Tronnier et
al., 1995). Eine gesteigerte mitogene Aktivität lässt sich an der vermehrten Aufnahme
des Pyrimidin-Isotops 3H-methyl-Thymidin erkennen (Rosdahl und Szabó, 1978).
Auch sind Effekte von UV-Strahlung auf die Expression epidermaler
Adhäsionsmoleküle gezeigt worden: Sowohl eine Heraufregulation von α3β1 und α6β1
(Tronnier et al., 1997) wurde beschrieben, als auch die Herunterregulation von
Cadherinen und ICAMs (Jamal und Schneider, 2002; Norris et al., 1990; Seline et al.,
1996). Zudem konnte gezeigt werden, dass Melanozyten durch verstärkte Expression
Einleitung
10
von α5β1-Integrin nach UV-Bestrahlung stärker an Fibronektin haften (Neitmann et al.,
1999).
Ist die melanozytäre DNA durch Noxen wie z.B. UV-Strahlung geschädigt, wird sie
durch spezielle Enzyme repariert (De Leo et al., 1984; Schothorst et al., 1991). Gelingt
die Reparatur, kehrt die Zelle in ihren ursprünglichen Zustand zurück oder reagiert
wahrscheinlich sogar auf die DNA-Reparaturenzyme mit gesteigerter Melanogenese
(Eller et al., 1996; Gilchrest et al., 1993). Nehmen die DNA-Schäden allerdings ein zu
großes Ausmaß an, so kommt es zur Ausbildung von Mutationen. Die Zelle kann
entarten und den malignen Tumor der Pigmentzellen, das Melanom, entwickeln. Zum
Schutz vor negativen Folgen für den Gesamtorganismus kommt es ab einem gewissen
Ausmaß von z.B. UV-bedingter Schädigung der Zelle zum Zelltod, d.h. zu Nekrose
oder Apoptose (Bowen et al., 2003; Kim et al., 2000).
1.6 Einfluss von Integrinen auf den programmierten Zelltod (Apoptose)
von Melanozyten
Apoptose stellt den durch die Zelle selbst induzierten, programmierten Zelltod ohne
reaktive Begleitentzündung dar (Riede et al., 2003). Sie ist ein wichtiger Vorgang für
die Entwicklung und die Aufrechterhaltung von Geweben in Säugetierorganismen
(Cohen, 1993; Levine, 1997). Kernstück des Zelltodprogramms ist ein kaskadenartig
aktivierbares System von „Zelltod-Proteasen“ (Caspasen), die Zytoskelett,
Kernproteine und nukleäre Regulator- und Schutzproteine angreifen und letztendlich
die Zelle fragmentieren. Die Apoptose kann auf zwei Wegen induziert werden: zum
einen über sogenannte Todesrezeptoren, zum zweiten über den mitochondrialen Weg
(Riede et al., 2003). Apoptose als Antwort auf DNA-Schäden besteht aus einem
komplexen Ablauf von Schritten, in denen p53 und Mitglieder der p53-Proteinfamilie
eine entscheidende regulatorische Rolle spielen. p53 ist ein Tumorsuppressorprotein,
das nach der Einwirkung von DNA-Schäden und anderen Zellstressoren entscheidet,
ob die Zelle apoptotisch wird oder im Zellarrest verharrt (Levine, 1997; Wahl und Carr,
2001). Ist die DNA nur leicht geschädigt, kann sie durch Enzyme repariert werden
(Kastan et al., 1991; Kuerbitz et al., 1992), ist sie schwer geschädigt, so wird durch p53
die Apoptose über Caspasen induziert (Levine, 1997; McArthur Lewis et al., 2002). Aus
Mitochondrien freigesetzte Bestandteile aktivieren ebenfalls Caspasen. Die Aktivierung
dieses Weges wird durch eine Reihe von Inhibitoren in Schach gehalten. Zu diesen
Inhibitoren zählt das Protoonkogen c-bcl-2. Es verhindert die Freisetzung von
Einleitung
11
Cytochrom-c und einem mitochondrialen Apoptosefaktor, dem sogenannten AIF
(Apoptosis-inducing factor).
Es existiert eine Vielzahl von potentiellen proapoptotischen Stimuli. UV-Licht induziert
eine gesteigerte Expression von p53-abhängigen Genen (Aragane et al., 1998; El-
Deiry et al., 1993). In Melanozyten steigt die Apoptoserate nach UV-Bestrahlung
dosisabhängig an (Barker et al., 1995; Kim et al., 2000). Dabei kann der Beginn der
Apoptose durch unterschiedliche Signalwege vermittelt werden. Intrazelluläre
Sauerstoffradikale oder Rezeptoren auf der Zelloberfläche können der Auslöser sein
(Aragne et al., 1998; Kulms et al., 2002). Zum anderen stellt die Verankerung
(Attachment) epithelialer Zellen auf der Basalmembran für viele Zellen einen Schutz
vor Apoptose dar (Ingber, 2002; Stupack und Cheresh, 2004). In diesem
Zusammenhang kommt Integrinen vermutlich eine wichtige Rolle zu. So wie sie durch
Bindung eines Liganden die Proliferation fördern (s. 1.4), wird umgekehrt davon
ausgegangen, dass durch Verlust der Bindung intrazelluläre Signalwege induziert
werden, die zu Apoptose führen (Matters und Ruoslahti, 2001; Stupack et al., 2001).
Dieser durch Verankerungsverlust ausgelöste Vorgang hat eine besondere Bedeutung
für die Gewebeintegrität und wird daher begrifflich von anderen Formen der Apoptose
als Anoikis abgegrenzt. Adhäsionsverlust führt zur Induktion einer ganzen Reihe von
Ereignissen. Es kommt zur Reorganisation des Zytoskeletts (Flusberg et al., 2001)
sowie zur Umverteilung und Änderung der Aktivierung von Todesrezeptoren (Aoudjit
und Vuori, 2001; Arora et al., 1995). Diese Ereignisse können letztendlich zu einer
Aktivierung von Caspasen über Signalproteine führen (Frisch und Screaton, 2001;
Stupack und Cheresh, 2004). Andererseits können Integrine nicht nur im Rahmen der
Aufrechterhaltung normaler Zellhomöostase Apoptose verhindern, sondern sind auch
aktiv in der Lage, eine zelluläre Resistenz gegenüber apoptosefördernden Signalen
einzuleiten. So reguliert die Signaltransduktion durch α5β1- und αVβ3-Integrine die
Expression und Aktivierung von Proteinen der bcl-2-Familie (Matters und Ruoslahti,
2001).
Einleitung
12
1.7 Fragestellung
Es gibt bislang keine systematischen Untersuchungen zu der Frage, welchen Einfluss
UV-Bestrahlung auf die Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle hat. In
vorangegangenen Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe wurden erste Hinweise auf
eine UV-dosisabhängige Modifikation der Integrinexpression erarbeitet. Zunächst
galten meine Bemühungen daher der Vervollständigung dieser Ergebnisse,
insbesondere in Hinsicht auf die Frage, inwiefern die Integrinexpression vom Kontakt
der Melanozyten zu EZM-Molekülen beeinflusst wird und welchem zeitlichen Verlauf
sie unterliegt.
In einem weiteren Teil der Arbeit beschäftigte mich die Frage, ob die integrinvermittelte
Adhäsion von EZM-Molekülen die UV-induzierte Apoptose von Melanozyten
beeinflusst.
Schließlich sollten die durchflusszytometrischen Expressionsdaten durch eine
konfokalmikroskopische Analyse auch auf zellulärer Ebene morphologisch dargestellt
werden.
Material und Methoden
13
2 Material und Methoden
Die Arbeit lässt sich methodisch in zwei Teilbereiche gliedern:
1. Zum einen wurde an Melanozytenprimärkulturen die Expression von
Adhäsionsmolekülen in Abhängigkeit von UVB-Bestrahlung sowie von verschiedenen
Matrixbeschichtungen durchflusszytometrisch gemessen. Darüber hinaus wurde -
ebenfalls durchflusszytometrisch- die Apoptoserate von Melanozyten- und
Keratinozytenprimärkulturen in Abhängigkeit von UVB-Bestrahlung und den genannten
Matrixbeschichtungen gemessen.
Für die Untersuchung der Apoptoserate und der Expression der Adhäsionsmoleküle,
die Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Verbindungen vermitteln, stellt die Durchflusszytometrie
eine geeignete Methode dar. Im Gegensatz zu immunzytochemischen Färbungen, bei
denen die Intensität der Farbreaktion lediglich in groben Abstufungen zur Menge des
Antigens proportional ist und so nur richtungweisende Aussagen über die Stärke der
Expression erlaubt, ist die Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse (FACS, fluorescence-
activated cell sorter) ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von
Oberflächenmolekülen. Auch die Apoptoserate der Melanozyten kann durch die
Kopplung von Aminosäuren an der Zelloberfläche durch spezifische Antikörper und
deren Bindung mit Fluoreszenz-aktiven Farbstoffen durchflusszytometrisch quantitativ
dargestellt werden.
2. Zum zweiten wurde die Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle mittels
Konfokalmikroskopie immunzytologisch untersucht. Die räumliche Anordnung von
Antigenen auf der Zelloberfläche bzw. innerhalb der Zelle ist durchflusszytometrisch
nicht darstellbar. Für qualitative morphologische Aussagen auf dem Niveau der
Einzelzellen stellt die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie eine geeignete Methode
dar.
2.1 Zellkulturen
2.1.1 Zellkulturmedium
Melanozytenmedium
Melanocyte growth medium M2 (Promo Cell, Heidelberg): definiertes, serum- und
phorbolesterfreies Kulturmedium. Eine genaue Zusammensetzung des Mediums gibt
Material und Methoden
14
die Firma nicht bekannt, ein Hauptbestandteil ist jedoch der Wachstumsfaktor FGF-2
(fibroblast growth factor-2). Das Medium enthält antibiotische Zusätze.
Keratinozytenmedium
Keratinocyte-SFM (serum-free medium), Invitrogen (Invitrogen, Karlsruhe). Eine
genaue Zusammensetzung des Kulturmediums gibt die Firma nicht bekannt,
Hauptbestandteile sind jedoch die Wachstumsfaktoren EGF (epidermal growth factor)
und BPE (bovine pituitary extract).
2.1.2 Melanozytenkultur
Für die Durchführung der Versuche verwendete ich Melanozytenprimärkulturen der
Firma Promocell (normal human epidermal melanocytes M2, NHEM M2; Promocell,
Heidelberg). Es handelte sich hierbei um epidermale, aus neonatalem Vorhautgewebe
eines hellhäutigen, 18 Monate alten Individuums („Kaukasier“) extrahierte
Melanozyten, die in der ersten Passage in kryokonservierter Form geliefert wurden.
Die Zellen wurden zunächst in 10ml MGM-M2 (melanocyte growth medium-M2;
Promocell, Heidelberg) resuspendiert. Nach zwei Tagen Wachstum bei 37°C, 5% CO2
in einer 75 cm2 Kulturflasche (Greiner, Frickenhausen) wurde das Medium erstmals
gewechselt und das Anwachsen der Zellen kontrolliert. Nun wurden die Melanozyten
so lange kultiviert, bis eine 80%ige Konfluenz erreicht war, wobei ein Mediumwechsel
dreimal wöchentlich stattfand.
Eine weitere Melanozytenkultur wurde aus epidermalen, neonatalen
Vorhautmelanozyten eines dunkelhäutigen Individuums („negroid“) extrahiert
(Promocell, Heidelberg). Die Kultivierung erfolgte analog zu den „kaukasischen“
Melanozyten.
2.1.3 Keratinozytenkultur
Normale humane Keratinozyten aus neonataler Vorhaut wurden von der Firma
Cambrex (Verviers, Belgien) erworben. Die Zellen wurden in serumfreiem K-SFM
(Keratinocyte serum-free medium; Invitrogen, Karlsruhe), das 0,12 mmol Ca2+ enthielt,
bei 37°C, 5% CO2 in 75 cm2 Kulturflaschen (Greiner, Frickenhausen) kultiviert. Das
Kulturmedium wurde dreimal pro Woche gewechselt, bis 80%-ige Konfluenz erreicht
war.
Material und Methoden
15
2.1.4 Passagieren der Melanozyten und Keratinozyten
Die Zellen wurden, sobald sie subkonfluent gewachsen waren, auf jeweils drei neue
Flaschen aufgeteilt. Hierfür wurde das Kulturmedium zunächst abgesaugt und durch
einmaliges Spülen mit PBS (Phosphate Buffered Saline ohne Ca2+ und Mg2+; Cambrex,
Verviers, Belgien) ausgewaschen. Nach Zugabe von 7,5 ml 0,025%-igem Trypsin
(Trypsin/ EDTA Solution; Sigma, Heidelberg) lösten sich die Zellen im Wärmeschrank
bei 37°C innerhalb von fünf bis zehn Minuten nahezu vollständig vom
Kulturplattenboden. Durch Zugabe von 7,5 ml TNS (Trypsine Neutralizing Solution,
TNS; Clonetics Cell Systems, Remagen) wurde die proteolytische Aktivität des
Trypsins abgesättigt und die Zellsuspension anschließend in ein 50 ml
Kunststoffröhrchen (Greiner, Frickenhausen) aufgenommen. Das Abzentrifugieren der
Zellen erfolgte bei 96 G für drei Minuten. Der zellfreie Überstand wurde abgesaugt,
das Zellpellet in 3 ml Kulturmedium resuspendiert und jeweils auf drei neue
Kulturflaschen verteilt.
Um in den Versuchen möglichst vergleichbare Bedingungen zu schaffen, benutzte ich
durchweg Melanozyten und Keratinozyten in ähnlichen Passagen (5.-10. Passage).
Hierfür wurden die Zellen nach Expansion zum Teil eingefroren.
2.1.5 Einfrieren und Auftauen von Melanozyten und Keratinozyten
Zum Einfrieren der Zellen wurden diese zunächst wie oben beschrieben trypsiniert und
das Zellpellet abzentrifugiert. Die anschließende Aufschwemmung des Pellets erfolgte
mit 1 ml eiskaltem Einfriermedium (Cryptoprotective Medium; Bio Whittaker/Cambrex,
Apen). Die Zellsuspension wurde dann in auf Eis stehende Einfriercups überführt und
die Zellen zunächst bei minus 70°C tiefgefroren. Nach 48 Stunden erfolgte das
Überführen in flüssigen Stickstoff (minus 196°C).
Für das Auftauen tiefgefrorener Zellen wurden diese aus dem Stickstoff genommen
und durch einmaliges, kurzes Öffnen des Einfriercups der darin befindliche Überdruck
abgelassen. Im 37°C warmen Wasserbad wurde das Röhrchen mit den gefrorenen
Zellen so lange geschwenkt, bis ca. 90% der Zellen aufgetaut waren. Die
Zellsuspension wurde mit einer Pipette aufgenommen und in das bereits erwärmte
Kulturmedium einer 25 cm2 Kulturflasche überführt. Nach 24 Stunden erfolgte der erste
Mediumwechsel. Zu diesem Zeitpunkt sollten ungefähr 70% der Zellen angewachsen
sein.
Material und Methoden
16
2.1.6 Beschichtung der Kulturplatten
Um den Einfluss der extrazellulären Matrix auf die Expression von
Adhäsionsmolekülen und die Apoptoserate zu untersuchen, kultivierte ich parallel zu
den bisher geschilderten Versuchen einen Teil der Melanozyten auf mit Laminin-1,
Kollagen-IV oder Fibronektin beschichteten Kulturplatten. Als charakteristische
Vertreter der extrazellulären Matrix (EZM) wurden für die Beschichtung Laminin-1
(Basalmembran), Kollagen Typ IV (Basalmembran) bzw. Fibronektin (dermale EZM)
ausgewählt, da diese Moleküle für melanozytäre Funktionen in vitro von besonderer
Bedeutung sind (Hedley et al., 1996; Mortarini et al., 1995; Scott et al., 1992).
Laminin-1 (Engelbrecht-Holm-Schwarm-Sarkom; Sigma, Deisenhofen) wurde in
Hepes-Puffer (N-2- Hydroxyethylpiperazin-2-Ethansulfonsäure; Clonetics, Verviers,
Belgien) in einer Konzentration von 20 µg/ml, Fibronektin (30 µg/ml; Sigma,
Deisenhofen) bzw. Kollagen Typ IV (60 µg/ml, Engelbrecht-Holm-Schwarm-Sarkom;
Sigma, Deisenhofen) in steril filtriertem destilliertem Wasser angesetzt. Von dieser
Lösung wurde je 1 ml pro Feld (9,5 cm2) einer 6-well-Platte (Greiner, Frickenhausen)
gegeben. Die so befüllten Kulturplatten wurden nun für 24 Stunden im Kühlschrank bei
4°C gelagert. Es folgte das Absaugen und ein einmaliges Waschen mit PBS, bevor die
Kulturplatten für eine Stunde bei 37°C mit 1 ml, denaturiertem, 3%-igem BSA (Bovine
Serum Albumine; Sigma, Deisenhofen) in Hepes überschichtet wurden. Hierdurch
wurden unspezifische, d.h. nicht durch Laminin-1 oder Fibronektin bzw. Kollagen-IV
abgesättigte Bindungsstellen der Plastikoberfläche blockiert. Dann wurde mit PBS das
nicht gebundene BSA ausgewaschen, und die Melanozyten nun in einer Dichte von
30.000/cm2 (Kontrolle in einer Neubauer-Zählkammer) ausgesät.
Für die Messung der Apoptoserate wurden die Zellen auf analoge Weise ausgesät. In
der Versuchsreihe, in der ich den blockierenden Ratte-anti-Mensch-Antikörper gegen
α6-Integrin (Isotyp Ratte IgG2a, Klon NKI-GoH3; Chemicon, Ternecula, USA)
verwendete, wurden die Melanozyten nach der Trypsinierung in Kunststoffröhrchen
pipettiert und für 20 min bei Raumtemperatur mit 1 µl/ml M2-Medium des Ratte-anti-
Mensch-Antikörpers (Antikörper-Endkonzentration: 1 mg/ml) inkubiert und regelmäßig
aufgeschwemmt, um Sedimentation und Koagulation zu verhindern. Die Melanozyten
wurden nach der Inkubation sofort auf 6-well-Platten, die mit Laminin-1 beschichtet
waren, ausgesät, ohne das Medium zu wechseln. Der Ratte-anti-Mensch-Antikörper
gegen α6-Integrin konnte so weiter wirken. Nach 24-stündiger Kultur erfolgte die UVB-
Bestrahlung.
Material und Methoden
17
2.2 UV-Bestrahlung
2.2.1 UV-Lichtquelle
Die Bestrahlung wurde mit einem UV-Monochromator durchgeführt. An dem Gerät
(Dermolum®; Müller Elektronik-Optik, Moosinning) kann mittels einer speziellen
Gitterfiltertechnik die Wellenlänge des austretenden Lichtes, das von einer 1 kW
Xenonlampe mit sonnenähnlichem Spektrum emittiert wird, im Bereich von 270 bis 700
nm stufenlos eingestellt werden. Dabei ist die Bandbreite von 5 bis 80 nm variierbar.
Die Bestrahlung in den hier dargestellten Versuchen erfolgte bei einer
Zentralwellenlänge von 297,5 nm mit einer Bandbreite von 35 nm, d.h. mit einem
Spektrum von 280 bis 315 nm. Dies entspricht dem unteren UVB-Anteil des
Sonnenlichtes. Die UV-Dosis wurde mit einem PRC-Photometer (Photometry,
Radiometry, Colorimetry; Krochmann, Berlin) gemessen.
2.2.2 Festlegung der UV-Dosis
In Vorversuchen stellte sich heraus, dass sich ab einer Bestrahlungsdosis von 10
mJ/cm2 UVB nach 24 Stunden zahlreiche Zellen von der Kulturplatte abgelöst hatten
und im Kulturmedium trieben. Mittels Trypanblauinklusion konnte der Anteil
abgestorbener Zellen in der Neubauer-Zählkammer quantifiziert werden und stellte sich
im Untersuchungsbereich in etwa linear dosisabhängig dar (10 mJ/cm2 24 h p.i. ca.
15%, 15 mJ/cm2 24 h p.i. ca. 18%, 20 mJ/cm2 24 h p.i. ca. 30%).
Daraus lässt sich ableiten, dass bereits bei dieser Dosis UV-Effekte wirksam sind und
den Anteil adhärenter, d.h. vitaler Zellen, an der Gesamtzahl reduzieren. Ich führte die
Versuche im Bereich dieser Bestrahlungsdosen durch, um zu untersuchen, ob
subletale UV-Dosen, wie sie in vivo bei einem Sonnenbrand wirksam sein dürften, zu
spezifischen Effekten für einzelne Adhäsionsmoleküle führen. Zudem konnte ich so die
Apoptoserate in Abhängigkeit von den Matrixbeschichtungen untersuchen.
2.2.3 Bestrahlung der Melanozyten
Für die Bestrahlung wurde das Kulturmedium zunächst abgesaugt und durch Spülen
mit PBS ausgewaschen. Pro Feld der 6-well-Platte wurde 1 ml PBS mit Ca2+ (130 mg/l;
Cambrex/Biowhittaker, Apen) vorgelegt. Dann erfolgte - bei einer UV-undurchlässigen
Abdeckung der nicht zu bestrahlenden Felder - die UVB-Bestrahlung
(Wellenlängenspektrum 280-315 nm) mit 10, 15 bzw. 20 mJ/cm2. In jedem
Versuchsansatz blieb die Hälfte der Kulturplatten zum Vergleich unbestrahlt. Die
Bestrahlung erfolgte in der Regel 24 Stunden nach der Aussaat. In dem Versuch zur
Material und Methoden
18
Apoptoserate nach Inkubation mit dem blockierenden Antikörper gegen α6-Integrin
(Isotyp Ratte IgG2a, Klon NKI-GoH3; Chemicon, Ternecula, USA) erfolgte die
Bestrahlung der Melanozyten bereits nach sechs Stunden. In Vorversuchen hatte sich
mikroskopisch gezeigt, dass Melanozyten auf Laminin-1-beschichteten
Kulturoberflächen in Gegenwart dieses Antikörpers nach sechs Stunden einen
rundlichen Zelleib und kurze, dicke Dendriten bei wesentlich geringerer Zellhaftung
aufwiesen, während Zellen in Abwesenheit des Antikörpers längere Dendriten
aufwiesen (Abb. 34 und 35 [s. Anhang]). Somit schien dieser Zeitpunkt für die UV-
Bestrahlung optimal, da eine frühere Bestrahlung (3h nach der Aussaat) zu nicht
verwertbaren Ergebnissen in der Durchflusszytometrie geführt hätte, und neun
Stunden nach der Aussaat die morphologischen Unterschiede zwischen den mit bzw.
ohne blockierenden Antikörper inkubierten Zellen mikroskopisch bereits nicht mehr so
deutlich zu erkennen waren.
2.3 Durchflusszytometrie
Die durchflusszytometrische Messung erfolgte 24 Stunden nach UVB-Bestrahlung. Die
Melanozyten wurden mit 0,025%-igem Trypsin von der 6-well-Platte abgelöst,
zentrifugiert und in PBS resuspendiert. Auf eine möglichst große Zellausbeute mit
einem Zielwert von etwa 100.000 Zellen pro ml war zu achten (Kontrolle in Neubauer-
Zählkammer).
Jeweils 100 µl Zellsuspension wurden in Eppendorfgefäße überführt und mit 10 µl des
jeweiligen primären Antikörpers (Verdünnung 1:50, entspricht 20 µg/ml) zehn Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Die verwendeten Antikörper sind in Tabelle 3 (s.
Anhang) aufgelistet. Bei allen von uns verwendeten Primärantikörpern handelte es sich
um unkonjugierte Antikörper, an die der Fluoreszenzfarbstoff nicht direkt gekoppelt
war. In einem weiteren Schritt wurden sie mit einem fluoreszenzmarkierten
Sekundärantikörper (Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-F(ab`)2 Ziege-anti-Maus; Dako,
Hamburg) inkubiert (Konzentration 20 µg/ml, 10 min bei Raumtemperatur in
Dunkelheit). Zwischen bzw. nach den beiden Inkubationsschritten wurden die Zellen
mit PBS gewaschen und abzentrifugiert.
In einem Nebenversuch untersuchten wir die Expression von α6-Integrin unter Zugabe
des Radikalfängers Pyrrolidendithiocarbamat (PDTC) in einer Konzentration von 50
µM, den wir eine Stunde vor der Bestrahlung zur Zellkultur gaben und der auch nach
der Bestrahlung im Medium blieb.
Material und Methoden
19
Die Messung der Apoptoserate erfolgte durchflusszytometrisch mit dem Human
Annexin V-FITC Kit (Bender Med. Systems, Wien, Österreich). Zunächst wurden
hierfür das Kulturmedium mit den nach UV-Bestrahlung darin schwimmenden Zellen
aus der jeweiligen Kammer der 6-well-Platte in ein Kunststoffröhrchen überführt, um
auch die bereits abgelösten Zellen für die nachfolgende Messung zu erhalten. Dann
wurden die haftenden Zellen, wie oben beschrieben, trypsiniert. Die Suspension wurde
zu den abgeschwemmten Zellen in dasselbe Kunstoffröhrchen überführt und
zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde abpipettiert. Im nächsten Schritt wurde mit
einem nach Zellzählung ermittelten Volumen von Bindungspuffer aus dem Annexin V-
Kit, der in einer Verdünnung von 1:4 mit destilliertem Wasser vorlag, resuspendiert, so
dass sich eine Konzentration von 500.000 Zellen pro ml Bindungspuffer ergab. Von
dieser Zellsuspension wurden 195 µl in ein Eppendorfgefäß überführt und durch
Zugabe von 5 µl Annexin V für zehn Minuten bei Raumtemperatur in Dunkelheit
inkubiert. Anschließend wurde mit PBS auf ein Volumen von 500 µl aufgefüllt,
gewaschen, zentrifugiert und der zellfreie Überstand abpipettiert. Der Zellbodensatz
wurde mit 380 µl Bindungspuffer aufgeschwemmt. 20 µl Propidiumiodid (PI) wurden
hinzugegeben. Direkt danach erfolgte die durchflusszytometrische Messung. Die vom
Hersteller vorgeschlagenen Volumina an Bindungspuffer und Propidiumiodid wurden
jeweils verdoppelt, um ein ausreichendes Volumen für die durchflusszytometrische
Messung zu gewährleisten.
Humanes Annexin V erkennt Phosphatidylserin auf der äußeren Oberfläche von
Zellmembranen. Phosphatidylserin befindet sich vor allem in Membranschichten, die
sich auf zytoplasmatischer Seite befinden. Während der Apoptose wird
Phosphatidylserin jedoch an der Zelloberfläche exprimiert (Homburg et al., 1995;
Koopman et al., 1994; Vermes et al., 1995). Durch die FITC-Kopplung ist eine direkte
durchflusszytometrische Messung möglich. Gegenfärbung mit Propidiumiodid erlaubt
die Differenzierung von nekrotischen Zellen. Dadurch lassen sich bei der graphischen
Darstellung der durchflusszytometrischen Messergebnisse (sog. Dot-plot) nach
Annexin V- und PI-Färbung apoptotische, nekrotische und vitale Zellpopulationen
quantitativ differenzieren (Abb. 2):
Material und Methoden
20
Abb. 2. Dot plot. Beispiel einer durchflusszytometrischen Messung mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC,
Annexin V) und Propidiumiodid (PI): 1. nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv, links oben in
Quadrant F1), 2. spät apoptotisch bzw. früh nekrotische Zellen (Annexin V positiv, PI positiv, rechts oben
in Quadrant F2), 3. vitale Zellen (Annexin V negativ, PI negativ, links unten in Quadrant F3), 4. früh
apoptotische Zellen (Annexin V positiv, PI negativ, rechts unten in Quadrant F4).
Für die Untersuchungen stand das Durchflusszytometer EPICS/XL-MCL (Coulter-
Immunotech, Hamburg) des Instituts für Immunologie und Transfusionsmedizin des
Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, zur Verfügung, das ich
freundlicherweise in Zusammenarbeit mit Herrn Privatdozent Dr. P. Schlenke nutzen
durfte. Die Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist ein Verfahren zur
quantitativen Messung von Zelloberflächenmolekülen. Grundlage ist eine Antigen-
Antikörper-Reaktion dieser Moleküle mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern. Als
typische Fluorochrome dienen hierbei Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und
Phycoerythrin (PE). Die Lichtquelle besteht aus einem luftgekühlten Argonlaser mit
einer Wellenlänge von 488 nm, dessen Strahl durch Linsensysteme in eine elliptische
Form gebracht wird. Soll die Zelle vollständig und gleichmäßig beleuchtet werden,
muss sie direkt durch das Zentrum des Laserstrahls fließen, damit die Fluorochrome
maximal angeregt werden und das Licht direkt partikelabhängig gebeugt wird. Hierfür
werden die zu untersuchenden Zellen in Suspension, umgeben von einem inneren
Proben- und einem äußeren Hüllstrom, durch die Messzelle des Durchflusszytometers
geleitet. Durch den höheren Druck des äußeren Hüllstroms wird der innere
Probenstrahl zu einem dünnen Faden ausgezogen, in dem die Zellen perlschnurartig
hintereinander aufgereiht den Laserstrahl im rechten Winkel kreuzen.
PI
1.1.1
Material und Methoden
21
Abb.3: Schematische Darstellung des Prinzips der Durchflusszytometrie (aus: Internet;
http://www.berlin.ptb.de/8/83/832/DurchflussZytometrie; Tag des Zugriff: 10.03.2005)
Bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den mono-
chromatischen Laserstrahl werden diese in ein höheres Energieniveau gehoben. Nach
dem Laserimpuls fallen die Elektronen unter Abgabe von Energie in Form von
Photonen auf ihr Ursprungsniveau zurück. Spezielle Photodetektorsysteme registrieren
die ermittelte Photonenkonzentration, die sich proportional zur Menge des gebundenen
Antikörpers pro Zelle verhält. Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und -streuung
Informationen über die Zellgröße und Binnenstruktur (Granularität des Zytoplasmas,
Größe des Zellkerns) der Zellen gewonnen, die das Durchflusszytometer durch
Detektoren für das Vorwärts- und Seitwärtsstreulicht der Zellen erhält. Es wird nur der
Teil der Einzelereignisse zur Fluoreszenzmessung herangezogen, der sich am
Bildschirm gezielt anhand der Streulichteigenschaften als vitale Zellpopulation
eingrenzen lässt. Für die Apoptosemessungen lassen sich, wie oben ausgeführt,
neben dem Anteil vitaler Zellen auch nekrotische sowie früh- und spätapoptotische
Zellen differenziert quantitativ erfassen.
In den vorliegenden Versuchen wurden als Negativkontrollen jeweils Färbungen mit
dem Sekundärantikörper allein (als Maß für die unspezifische Bindung des
Sekundärantikörpers) und mit einem Isotyp-Antikörper (als Maß für die unspezifische
Bindung von Maus-Immunglobulinen) mitgeführt. Diese Kontrollen zeigten eine jeweils
sehr schwache Fluoreszenz, deren Ausmaß zur Definition des Schwellenwertes für
positive Immunreaktivität (maximal 2% unspezifische Bindung) diente.
Material und Methoden
22
2.4 Immunfluoreszenz und konfokale Lasermikroskopie
Melanozyten wurden auf zweikammerigen sog. Chamber-Slides (Falcon, Beckton-
Dickinson, Heidelberg) ausgesät. Dabei handelt es sich um Glasobjektträger mit einem
Plastikaufsatz, auf denen die Zellen zunächst kultiviert, bestrahlt und dann ohne
zwischenzeitliches Ablösen fixiert und für die Mikroskopie gefärbt werden können. 24
Stunden nach der Aussaat wurden die Zellen mit einer Dosis von 10 mJ/cm2 und 20
mJ/cm2 in jeweils nur einer Kammer der Kulturplatte bestrahlt, wobei die unbestrahlte
Kammer als Negativkontrolle diente. 24 Stunden später wurden die bestrahlten und
unbestrahlten Melanozyten mit 4%-igem Paraformaldehyd (Merck, Darmstadt) für 10
Minuten fixiert und die Zellmembran in zehn Minuten mit 1%-igem Triton X-100 (Merck,
Darmstadt) perforiert. Danach wurden die Zellen auf der feuchten Kulturplatte mit
einem monoklonalen Ratte-anti-Mensch-Antikörper gegen α6-Integrin (Isotyp Ratte
IgG2a, Klon NKI-GoH3; Chemicon, Ternecula, USA) bzw. mit einen monoklonalen
Maus-anti-Mensch-Antikörper gegen α3-Integrin (Isotyp Maus IgG1; Klon P1B5;
Chemicon, Ternecula, USA) in einer Konzentration von 20 µg/ml für 30 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Spülen mit PBS wurden die Zellen mit einem
Alexa 555-konjugierten Sekundärantikörper Ziege-anti-Ratte IgG (20 µg/ml; Invitrogen,
Karlsruhe) für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaliger Spülung mit
PBS wurden die Zellen zur Kerngegenfärbung in einem weiteren Schritt mit
Bisbenzimid Hoechst 33258 (1:10.000; Sigma, Deisenhofen) für 30 bis 60 Minuten
inkubiert. Die Objektträger wurden mit Mowiol eingedeckt und mit dem konfokalen
Laser-scanning-Mikroskop Zeiss LSM 510 bei 351 nm und 543 nm untersucht.
Für diese Untersuchungen stand mir das Konfokalmikroskop des Instituts für Anatomie
des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, Campus Lübeck, zur Verfügung, das ich
freundlicherweise in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Andreas Gebert nutzen durfte.
Die computergestützte Bilddarstellung gelingt bei dieser Technik durch Anregung der
fluorochrommarkierten Zellen mittels Laserbestrahlung. Das von den Lasermodulen
emittierte Anregungslicht wird an einem Hauptfarbteiler reflektiert und durch das
Objektiv in die Probe fokussiert. Im Fokuspunkt ist die Anregungsintensität am
höchsten, aber trotzdem werden Fluoreszenzfarbstoffe innerhalb des gesamten
Lichtkegels angeregt. Das vom Präparat zurückkommende Licht wird mit dem Objektiv
gesammelt und auf eine sehr kleine Blende, das Pinhole, fokussiert. Da der
Fokuspunkt im Präparat und das Pinhole in konjugierten Ebenen liegen, also konfokal
Material und Methoden
23
sind, kann nur Licht aus dem Fokuspunkt das Pinhole passieren und vom
Photomultiplier registriert werden. Emissionslicht, das oberhalb und unterhalb der
Fokusebene entstanden ist, wird durch die konfokale Blende wirksam unterdrückt. Das
Ergebnis ist eine scharfe, vom Streulicht weitestgehend befreite Abbildung des
Fokuspunktes. Mit Hilfe des Scanners, der das fokussierte Anregungslicht Punkt für
Punkt durch die Probe führt, kann so ein optischer Schnitt durch das Präparat gelegt
werden. Die auf dem Objektträger bestrahlten und anschließend gefärbten
Melanozyten wurden im xy-Durchlauf von der oberen zur unteren Zelloberfläche in 0,46
µm-Schritten abgesucht. Die Dicke der optischen Bereiche betrug in maximaler
Auflösung 0,9 µm.
2.5 Statistische Auswertung
Mittelwerte und Standardabweichungen der durchflusszytometrischen Daten werden
im Ergebnisteil dargestellt. In die Berechnung gingen die Messwerte aus fünf,
mindestens jedoch drei unabhängigen Versuchen ein. Die Versuchszahl n sowie die
Standardabweichung sind im Ergebnisteil im Text bzw. in den Diagrammen
angegeben. In Einzelfällen wird in den Abbildungen das Ergebnis eines
repräsentativen Versuchs gezeigt und ist dann als solches ausgewiesen. Die
Signifikanz nach Mann-Whitney wurde im U-Test, einem nicht-parametrischen Test für
ungepaarte Stichproben (Computerprogramm SPSS, Version 12.0) errechnet. Speziell
für die Auswertung der α6-Integrin-Expression an unbestrahlten Melanozyten kam der
Test nach Kruskal-Wallis zur Anwendung (s. 3.1.3). p-Werte <0,05 wurden als
signifikant gewertet.
Ergebnisse
24
3 Ergebnisse
3.1 Durchflusszytometrische Messung der Integrinexpression
3.1.1 Integrinexpression nach UV-Bestrahlung
Die Änderung der Expression der untersuchten Integrinuntereinheiten ist in Abbildung
4 und Tabelle 4 (s. Anhang) dargestellt. Insgesamt kam es bei allen untersuchten
Integrinen zu einem Rückgang der Expression. Das Säulendiagramm in Abbildung 4
zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchung mit Auftragung der einzelnen untersuchten
Integrinuntereinheiten auf der Abszisse gegenüber der jeweiligen Expressionsstärke in
Prozent auf der Ordinate.
0
20
40
60
80
100
Integrine
Unbestrahlt
UVB 10 mJ/cm²
UVB 15 mJ/cm²
UVB 20 mJ/cm²
α 2 α 3 α 5 α 6 α V β 3
Abbildung 4. Expression von Integrinuntereinheiten unbestrahlt und nach
einer UVB-Dosis von 10, 15 bzw. 20 mJ/cm2. Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).
Exp
ress
ion
[% d
er p
ositi
ven
Zel
len]
Der Rückgang der Expression war am ausgeprägtesten bei α2-Integrin. Die Expression
fiel von 83,1% für unbestrahlte Zellen auf 49,3% (UVB-Dosis 20 mJ/cm2).
Die Expression von α3-Integrin änderte sich durch UVB-Bestrahlung kaum. Sie blieb
konstant zwischen 97,5% (unbestrahlt) und 87,5% (10 mJ/cm2). Bei stärkeren UVB-
Dosen zeigte sich eine noch geringere Herunterregulation.
Die Expression von α5-Integrin ging unter UVB-Bestrahlung deutlich zurück. Sie fiel
von 93,2% (unbestrahlt) auf 66,8% (20 mJ/cm2).
Ergebnisse
25
Die Expression von α6-Integrin zeigte einen deutlichen Rückgang. Die Expression
erreichte ein Minimum von 53,5% (UVB-Dosis 15 mJ/cm2), die bei höheren UVB-Dosen
(20 mJ/cm2) wieder leicht auf durchschnittlich 62,9% anstieg.
Die Expression von αV-Integrin zeigte bei 10 mJ/cm2 konstante Werte (76,7%),
schwächte sich aber bei UVB-Dosen von 20 mJ/cm2 auf 50,2% deutlich ab.
Das Ausgangsniveau der Expression von β3-Integrin war sehr niedrig (33,1%). Die
Expression ging unter UVB-Bestrahlung auf 11,7% (20 mJ/cm2) zurück.
3.1.2 Integrinexpression unter Einfluss von Zell-Matrix-Kontakt
Um die Adhäsion an EZM-Moleküle, die Melanozyten in vivo aufweisen, zu simulieren
und einen eventuellen Einfluss dieser Adhäsion auf die Integrinexpression zu
überprüfen, wurden die in 3.1.1 geschilderten Experimente parallel auf EZM-
beschichteten Kulturschalen durchgeführt.
Die Änderung der Expression der untersuchten Integrinuntereinheiten auf
unterschiedlichen EZM-Beschichtungen ist in Tabelle 5 (s. Anhang) und in den
Abbildungen 5-7 dargestellt. Der Kontakt zu extrazellulären Matrixmolekülen führte bei
unbestrahlten Melanozyten zu keiner signifikanten Änderung der Expression von
Adhäsionsmolekülen im Vergleich zu unbeschichtet kultivierten Melanozyten (Tab. 4
und 5 [s. Anhang]).
Insgesamt kam es auch auf beschichteten Kulturplatten nach UVB-Bestrahlung mit
einer Dosis von 20 mJ/cm2 bei allen untersuchten Integrinen zu einem tendenziellen
Rückgang der Expression. Der Rückgang der Expression von α2-Integrin war bei 20
mJ/cm2 auf Laminin-1- und Kollagen Typ IV-Beschichtung im Vergleich zu den
Versuchen ohne Beschichtung bei gleicher UVB-Dosis (20 mJ/cm2) geringer
ausgeprägt. So fiel die Expression nur auf 64,5% für Laminin-1, bzw. auf 62,9% für
Kollagen Typ IV.
Der Rückgang der Expression von α3-Integrin war bei 20 mJ/cm2 auf Laminin-1-
Beschichtung im Vergleich zu den Versuchen ohne Beschichtung bei gleicher UVB-
Dosis (20 mJ/cm2) stärker ausgeprägt. Die Expression lag bei durchschnittlich 71,2%.
α5-Integrin zeigte auf Fibronektin-Beschichtung einen nahezu identischen Rückgang
der Expression wie bei den Versuchen ohne Beschichtung.
α6-Integrin zeigte auf Laminin-1-Beschichtung einen signifikanten Rückgang der
Expression nach UVB-Bestrahlung mit einer Dosis von 20 mJ/cm2. Die entsprechenden
Experimente für α6-Integrin sind im nächsten Abschnitt (3.1.3) mit genaueren Angaben
zur Kinetik beschrieben.
Ergebnisse
26
Die Expression für αV-Integrin blieb bei den Messungen auf Fibronektin unter UVB-
Bestrahlung konstant, lag im Vergleich zu den Messungen ohne Beschichtung bei
einer UVB-Dosis von 20 mJ/cm2 aber deutlich niedriger.
β1-Integrin hat in vivo Kontakt zu Laminin-1, Kollagen Typ IV und in bestimmten
Situationen auch zu Fibronektin. In meinen Messungen zeigte sich für β1-Integrin bei
Beschichtung mit diesen EZM-Molekülen keine Herunterregulation der Expression
nach UVB-Bestrahlung (20 mJ/cm2). In Voruntersuchungen unserer Arbeitsgruppe
ohne Beschichtung hatte sich für β1-Integrin ebenfalls eine unter UVB-Bestrahlung
unveränderte Expression gezeigt.
Der Rückgang der Expression von β3-Integrin war bei 20 mJ/cm2 auf Fibronektin-
Beschichtung im Vergleich zu den Versuchen ohne Beschichtung bei gleicher UVB-
Dosis (20 mJ/cm2) geringer ausgeprägt.
0
20
40
60
80
100
Laminin-1 Unbestrahlt
Laminin-1 UVB 20 mJ/cm²
Unbeschichtet 20 mJ/cm²
α 2 α 3 β 1α 6Integrine
Exp
ress
ion
[% d
er p
ositi
ven
Zel
len]
Abbildung 5. Expression von Integrinuntereinheiten auf unbestrahlten und bestrahlten Melanozyten (Laminin-1-Beschichtung, 24 h p.i.). Zum
Vergleich unbeschichtete Melanozyten (20 mJ/cm2). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).
*
*signifikant (p < 0,05) gegenüber unbestrahlten Melanozyten (Laminin-1-Beschichtung)
Ergebnisse
27
0
20
40
60
80
100
Kollagen IV Unbestrahlt
Kollagen IV UVB 20 mJ/cm²
Unbeschichtet 20 mJ/cm²
α 2
Exp
ress
ion
[% d
er p
ositi
ven
Zel
len]
β 1Integrine
Abbildung 6. Expression von Integrinuntereinheiten auf unbestrahlten und bestrahlten Melanozyten (Kollagen Typ IV-Beschichtung, 24 h p.i.). Zum Vergleich
unbeschichtete Melanozyten (20 mJ/cm2). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).
0
20
40
60
80
100
Fibronektin Unbestrahlt
Fibronektin UVB 20 mJ/cm²
Unbeschichtet 20 mJ/cm²
α 5 α V β 1 β 3
Exp
ress
ion
[% d
er p
ositi
ven
Zel
len]
Integrine
Abbildung 7. Expression von Integrinuntereinheiten auf unbestrahlten und bestrahlten Melanozyten (Fibronektin-Beschichtung, 24 h p.i.). Zum Vergleich
unbeschichtete Melanozyten (20 mJ/cm2). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).
Ergebnisse
28
3.1.3 Kinetik der α6-Integrin-Expression
Da der Einfluss der Basalmembran auf die Zellhomöostase von Melanozyten
Gegenstand meines besonderen Interesses war und aufgrund von Voruntersuchungen
der Arbeitsgruppe davon auszugehen war, dass die Interaktion zwischen α6-Integrin
und Laminin-1 einen Einfluss auf die UVB-Empfindlichkeit der Melanozyten haben
könnte, wendete ich mich gezielt der weiteren Ausarbeitung dieses Zusammenhanges
zu. Hierzu wurde der zeitliche Verlauf der α6-Integrinexpression in Abhängigkeit von
einer Laminin-1-Beschichtung gemessen.
In den Abbildungen 8 und 9 sowie in der Tabelle 6 (s. Anhang) ist die α6-
Integrinexpression für bestrahlte versus unbestrahlte Melanozyten dargestellt. Die
Abbildung 8 zeigt die α6-Integrinexpression nach unterschiedlichen Zeitintervallen (24,
48, 72 h p.i.) und UVB-Dosen (0, 10, 20 mJ/cm2) ohne Beschichtung. Die Ergebnisse
zeigen, dass die UVB-induzierte Herunterregulation der α6-Integrinuntereinheit
dosisabhängig und reversibel ist. 24 h nach Bestrahlung mit UVB 10 mJ/cm2 war die
Expression von α6-Integrin im Vergleich zu unbestrahlten Kontrollen signifikant
herunterreguliert (mittlere Expression 74,87%, n = 3, SD ± 3,25%). Dieser Effekt war
nach 48 bzw. 72 h nicht mehr vorhanden, die Expression normalisierte sich. UVB-
Dosen von 20 mJ/cm2 führten zu einer stärkeren, zu jedem der drei Messzeitpunkte
signifikanten Herunterregulation von α6-Integrin, die erst nach 72h nachließ.
Ich führte die Messungen zum zeitlichen Verlauf der Expression von α6-Integrin
parallel mit Laminin-1-Beschichtung durch (Abb. 9). Insgesamt zeigte sich ebenfalls
eine Abschwächung der Expression, jedoch nicht so deutlich wie bei den Versuchen
ohne Beschichtung.
Ergebnisse
29
0
20
40
60
80
100
Zeit nach Bestrahlung
unbestrahlt
UVB 10 mJ/cm²
UVB 20 mJ/cm²
24h 48h 72h
Exp
ress
ion
[% d
er p
ositi
ven
Zel
len]
Abb.8. Zeitlicher Verlauf der Expression von α6-Integrin nach UVB-Bestrahlung. Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).
*
* *
*
* signifikant (p < 0,05) gegenüber unbestrahlten Melanozyten
0
20
40
60
80
100
Zeit nach Bestrahlung
unbestrahlt
UVB 10mJ/cm²
UVB 20mJ/cm²
24h 48h 72h
Exp
ress
ion
[% d
er p
ositi
ven
Zel
len]
Abb.9. Einfluss unterschiedlicher UVB-Dosen auf die Expression von α6-Integrin unter Laminin-1-Beschichtung. Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).
*
**
*
* signifikant (p < 0,05) gegenüber unbestrahlten Melanozyten
Ergebnisse
30
In den Abbildungen 10 und 11 ist der Effekt der Laminin-Beschichtungen in direktem
Vergleich zu den unbeschichteten Kulturen erkennbar.
0
20
40
60
80
100
Zeit nach Bestrahlung
unbeschichtet
Laminin-1
24 h 48 h 72 h
Abb.10. Zeitlicher Verlauf der Expression von α6-Integrin (UVB; 10 mJ/cm2, 24 - 72 h p.i.). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).
Exp
ress
ion
[% d
er p
ositi
ven
Zel
len]
0
20
40
60
80
100
Zeit nach Bestrahlung
unbeschichtet
Laminin-1
24 h 72 h
Abb.11. Zeitlicher Verlauf der Expression von α6-Integrin (UVB; 20
mJ/cm2, 24 - 72 h p.i.). Mittelwerte mit Standardabweichung (n=3).
Exp
ress
ion
[% d
er p
ositi
ven
Zel
len]
48 h
Ergebnisse
31
3.1.4 Einfluss des Radikalfängers Pyrrolidendithiocarbamat (PDTC) auf die
Expression von α6-Integrin
Um einen eventuellen Einfluss von durch UVB-Bestrahlung freigesetzten
Sauerstoffradikalen auf die α6-Integrinexpression auszuschließen, wurde die
Expression mit bzw. ohne Zusatz eines Radikalfängers vergleichend gemessen (Tab. 7
[s. Anhang]). Die Expression von α6-Integrin lag bei beiden Variablen ohne
Bestrahlung jeweils gleich hoch bei 90,4% bzw. 90,5%. Die mit einer UVB-Dosis von
20 mJ/cm2 bestrahlten Melanozyten zeigten 24 h p.i. eine Expression von 57,5%. Die
zusätzlich mit dem Radikalfänger PDTC inkubierten Melanozyten zeigten eine etwas
geringere Expression des Adhäsionsmoleküls von 48,4%, der Unterschied war
statistisch nicht signifikant.
3.2 Durchflusszytometrische Messung der Apoptoserate
Ausgehend von der Annahme, dass die integrinvermittelte Adhäsion an EZM-
Molekülen die Empfindlichkeit gegenüber UV-induzierter Apoptose beeinflusst,
untersuchte ich nun, inwiefern sich der Anteil von Zellen in frühen bzw. späten
Apoptosestadien sowie der Anteil nekrotischer Zellen unter Einfluss von UVB-
Bestrahlung und verschiedenen EZM-Beschichtungen ändert. Hierzu wurde das
Annexin-V-Kit (Bender Med. Systems, Wien, Österreich) eingesetzt.
Um die Ergebnisse des vorhergehenden Abschnitts außerdem auf ihre Spezifität für
die melanozytäre Zellreihe bzw. für Melanozyten von hellhäutigen Individuen zu
untersuchen, wurden die gleichen Experimente mit Keratinozyten aus der Vorhaut
eines kaukasischen Individuums und mit Primärkulturen von negroiden Melanozyten
aus der Vorhaut eines 2 ½-jährigen afrikanischen Kindes (Hauttyp VI nach Fitzpatrick;
im folgenden 2,5N genannt) durchgeführt.
3.2.1 UVB-induzierte Apoptose auf unterschiedlichen EZM-Beschichtungen
Insgesamt zeigte sich bei allen Melanozyten, unabhängig von der jeweiligen EZM-
Beschichtung, ein Anstieg der Apoptoserate in Abhängigkeit von der UVB-Dosis (Abb.
12 und 13; Tab. 8 und 9 [s. Anhang]). Bei den unterschiedlichen Beschichtungen
zeigten die auf Laminin-1 gewachsenen Melanozyten die geringste
Apoptoseempfindlichlichkeit, stärker war sie bei auf Fibronektin und Kollagen Typ IV
gewachsenen Melanozyten. Der Anteil nekrotischer Zellen stieg nach UVB-Bestrahlung
Ergebnisse
32
für auf Fibronektin und Kollagen Typ IV gewachsenen Melanozyten an, blieb aber für
unbeschichtet kultivierte, „negroide“ Melanozyten und für Keratinozyten in etwa
konstant (Abb. 14). Der Anteil vitaler Zellen fiel bei auf Fibronektin und Kollagen Typ IV
gewachsenen Melanozyten nach UVB-Bestrahlung signifikant ab, blieb aber für die
anderen Zellpopulationen (unbeschichtet, „negroid“, Keratinozyten) in etwa konstant
(Abb. 15). Den größten Anteil vitaler Zellen zeigten die auf Laminin-1 kultivierten
Melanozyten. Die Gesamtapoptoserate (frühe + späte Apoptose = F2 + F4, [s. Tab.2])
lag nach UVB-Bestrahlung bei auf Laminin-1 kultivierten Melanozyten deutlich unter
der Apoptoserate der auf Fibronektin und Kollagen Typ IV gewachsenen Zellen.
0
10
20
30
UVB-Dosis
unbeschichtet (1,5K MZ)
Laminin-1 (1,5K MZ)
Fibronektin-1 (1,5K MZ)
Kollagen IV (1,5K MZ)
2,5N
Keratinozyten
Abb.12. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht frühen Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss von EZM-Molekülen auf UVB-induzierte Apoptose bei Melanozyten. Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit negroiden MZ (2,5N) und Keratinozyten dargestellt.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er fr
üh-a
popt
otis
chen
Zel
len
[%]
*
*
*
*
* signifikant ( p< 0,05) gegenüber jeweils kleinerer UVB-Dosis (Fibronektin und Kollagen IV mit einer UVB-
Dosis von 10 mJ/cm2 versus unbestrahlt bzw. 20 mJ/cm2 vs. 10 mJ/cm2)
Ergebnisse
33
0
5
10
15
20
25
30
UVB-Dosis
unbeschichtet (1,5K MZ)Laminin-1 (1,5K MZ)
Fibronektin (1,5K MZ)Kollagen IV (1,5K MZ)
2,5NKeratinozyten
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er s
pät-
apop
totis
chen
Zel
len
[%]
Abb.13. Anteil FITC+, PI+ Zellen (entspricht späten Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss von EZM-Molekülen auf UVB-induzierte späte Apoptose bei Melanozyten. Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit negroiden MZ (2,5N) und Keratinozyten dargestellt.
0
2
4
6
8
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16
18
UVB-Dosis
unbeschichtet (1,5K MZ)
Laminin-1 (1,5K MZ)
Fibronektin (1,5K MZ)Kollagen IV (1,5K MZ)
2,5N
Keratinozyten
Abb.14. Anteil FITC-, PI+ Zellen (entspricht nekrotischen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss von EZM-Molekülen auf UVB-induzierte Nekrose bei Melanozyten. Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit negroiden MZ (2,5N) und Keratinozyten dargestellt.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er n
ekro
tisch
en Z
elle
n [%
] *
* signifikant ( p< 0,05) gegenüber jeweils kleinerer UVB-Dosis (Fibronektin mit einer UVB-Dosis von 20
mJ/cm2 vs. 10 mJ/cm2)
Ergebnisse
34
0
20
40
60
80
100
UVB-Dosis
unbeschichtetLaminin-1 (1,5K MZ)Fibronektin (1,5K MZ)Kollagen IV (1,5K MZ)2,5NKeratinozyten
Abb.15. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht vitalen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss von EZM-Molekülen auf Zellvitalität unter UVB-Bestrahlung. Zum Vergleich sind die Ergebnisse mit negroiden MZ (2,5N) und Keratinozyten dargestellt.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er v
itale
n Z
elle
n [%
]
**
* signifikant ( p< 0,05) gegenüber jeweils kleinerer UVB-Dosis ( für Kollagen IV Messung vs. unbestrahlte
Melanozyten, für Fibronektin Messung vs. 10 mJ/cm2)
UVB-Dosis \ EZM unbeschichtet Laminin-1 Fibronektin Kollagen IV
0 mJ/cm² 18,37% 3,86% 7,76% 20,71% 10 mJ/cm² 15,43% 10,35% 18,87% 36,80% 20 mJ/cm² 27,90% 24,50% 43,90% 47,20%
Tabelle 2. Gesamtapoptoserate (frühe + späte Apoptose = F2 + F4 in Tab. 8 und 9 [s.Anhang]) der
kaukasischen Melanozyten nach UVB-Dosen von 10 mJ/cm² und 20 mJ/cm² für verschiedene EZM-
Bestandteile. Zum Vergleich unbeschichtet kultivierte Melanozyten.
Ergebnisse
35
3.2.2 UVB-induzierte Apoptose bei Beschichtung mit Laminin-1 in unterschiedlicher
Konzentration
Um den Einfluss der Konzentration der Beschichtung mit Laminin-1 zu untersuchen,
wurden zusätzlich Experimente mit einer Lamininkonzentrationen von 2 µg/ml
durchgeführt. Als Kontrolle dienten unbeschichtet kultivierte Melanozyten (Abb. 16-19;
Tab. 9 [s. Anhang]).
Die unbestrahlten Zellen zeigten nur geringfügige Abweichungen in Apoptoserate,
Nekrose und Vitalität. Insgesamt zeigte sich für beide Lamininkonzentrationen bei allen
UVB-Dosen (10, 15, 20 mJ/cm2) stets eine höhere Zellvitalität im Vergleich mit den
unbeschichteten Kontrollen (Abb. 19). Die Nekroserate der unbeschichtet kultivierten
Zellen lag außer im Bereich der UVB-Dosis von 20 mJ/cm2 durchgehend über der von
auf Laminin-1 gewachsenen Melanozyten (Abb. 18). Nach UVB-Bestrahlung waren die
frühe und die späte Apoptoserate für die niedrige Laminin-Konzentration stets niedriger
als bei Melanozyten ohne Beschichtung. Die höhere Laminin-Konzentration ergab bei
der frühen Apoptoserate keine eindeutigen Ergebnisse, bei der späten Apoptoserate
lag sie außer bei einer UVB-Dosis von 20mJ/cm2 stets unter der Vergleichspopulation
ohne Beschichtung (Abb. 16, 17).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1 (2 µg/ml)
Laminin-1 (20 µg/ml)
Abb.16. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht frühen Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss unterschiedlicher Laminin-1-Konzentrationen auf UVB-induzierte frühe Apoptose.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 15 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er fr
üh-a
popt
otis
chen
Zel
len
[%]
Ergebnisse
36
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1 (2 µg/ml)
Laminin-1 (20 µg/ml)
unbestrahlt 10 mJ/cm2 15 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Abb.17. Anteil FITC+, PI+ Zellen (entspricht späten Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss unterschiedlicher Laminin-1-Konzentrationen auf UVB-induzierte späte Apoptose.
Ant
eil d
er s
pät-
apop
totis
chen
Zel
len
[%]
0
2
4
6
8
10
12
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1 (2 µg/ml)
Laminin-1 (20 µg/ml)
Abb.18. Anteil FITC-, PI+ Zellen (entspricht nekrotischen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss unterschiedlicher Laminin-1-Konzentrationen auf UVB-induzierte Nekrose.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm215 mJ/cm2
Ant
eil d
er n
ekro
tisch
en Z
elle
n [%
]
Ergebnisse
37
0
20
40
60
80
100
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1 (2 µg/ml)
Laminin-1 (20 µg/ml)
Abb.19. Anteil FITC-, PI- Zellen (entspricht vitalen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss unterschiedlicher Laminin-1-Konzentrationen auf die Zellvitalität unter UVB-Bestrahlung.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 15 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er v
itale
n Z
elle
n [%
]
3.2.3 UVB-induzierte Apoptose nach Zugabe eines Antikörpers gegen α6-Integrin
Es sollte nun ermittelt werden, ob der bei Laminin-1-Beschichtung beobachtete UV-
protektive Effekt durch Bindung an α6-Integrin vermittelt wird. Hierzu wurde ein
inhibitorisch wirksamer Antikörper gegen α6-Integrin eingesetzt. Melanozytenkulturen
ohne Beschichtung wurden als dritte Vergleichspopulation mitgeführt. Die Messungen
erfolgten nach 24 und 48 h (Abb. 20-23, 24-27). Blieben die drei Populationen
unbestrahlt, waren kaum Unterschiede für Vitalität, Nekrose und Apoptoserate
messbar (Tabelle 10 [s. Anhang]).
Bei einer UVB-Bestrahlung von 10 mJ/cm2 zeigten sich nach 24 h signifikante
Unterschiede zwischen den auf Laminin-1 gewachsenen nicht blockierten und den
durch den Antikörper gegen α6-Integrin blockierten Melanozyten. Sowohl die Rate
früh- und spät-apoptotischer Zellen als auch der Anteil nekrotischer Zellen waren bei
den Melanozyten ohne α6-Integrin-Inhibition signifikant geringer (Abb. 20-22), die
Zellvitalität hingegen signifikant höher (Abb.23) als bei den mit dem α6-Integrin-
Antikörper blockierten Zellen. Bei einer UVB-Bestrahlung von 20 mJ/cm2 zeigten sich
analoge Effekte.
Ergebnisse
38
0
2
4
6
8
10
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1
LM-1 + a6-block.mAb
Abb.20. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht frühen Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss von Laminin-1 mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte frühe Apoptose.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er fr
üh-a
popt
otis
chen
Zel
len
[%]
* *
* signifikant ( p< 0,05) gegenüber Laminin-1-kultivierte Melanozyten
0
5
10
15
20
25
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1
LM-1 + a6-block.mAb
unbestrahlt 10 mJ/cm220 mJ/cm2
Ant
eil d
er s
pät-
apop
totis
chen
Zel
len
[%]
Abb.21. Anteil FITC+, PI+ Zellen (entspricht späten Apoptosestadien) 24 h p.i.. Einfluss von Laminin-1 mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte späte Apoptose.
*1
*2
*1
*1 signifikant ( p< 0,05) gegenüber Laminin-1 kultivierte Melanozyten
*2 signifikant ( p< 0,05) gegenüber ohne Beschichtung kultivierte Melanozyten
Ergebnisse
39
0
2
4
6
8
10
12
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1
LM-1+ a6-block.mAb
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Abb.22. Anteil FITC-, PI+ Zellen (entspricht nekrotischen Zellen) 24 h p.i.. Einfluss von Laminin-1mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf die UVB-induzierte Nekrose.
Ant
eil d
er n
ekro
tisch
en Z
elle
n [%
]
*1
*2
*1
*2
*1 signifikant ( p< 0,05) gegenüber Laminin-1 kultivierte Melanozyten *2 signifikant ( p< 0,05) gegenüber ohne Beschichtung kultivierte Melanozyten
20
40
60
80
100
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1
LM-1 + a6-block.mAb
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Abb.23. Anteil FITC-, PI- Zellen (entspricht vitalen Zellen). Einfluss von Laminin-1 mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf die Zellvitalität unter UVB-Bestrahlung.
Ant
eil d
er v
itale
n Z
elle
n [%
]
*1*1
*2
*1 signifikant ( p< 0,05) gegenüber Laminin-1 kultivierte Melanozyten
*2 signifikant ( p< 0,05) gegenüber ohne Beschichtung kultivierte Melanozyten
Ergebnisse
40
Eine weitere Messung erfolgte 48 h nach UVB-Bestrahlung (Abb. 24-27). Insgesamt
zeigte sich die durch den Antikörper gegen α6-Integrin induzierbare Erhöhung der
Apoptoseempfindlichkeit hier nicht mehr so deutlich.
Die unbestrahlten Zellen zeigten zu diesem Zeitpunkt kaum Unterschiede (Tab 11 [s.
Anhang]). Die auf Laminin-1 gewachsenen Melanozyten zeigten eine durchgehend
niedrigere Apoptoserate als die durch den Antikörper blockierten Melanozyten (Abb.
24-27), aber die Zellvitalität der auf Laminin-1 gewachsenen Melanozyten lag nur bei
20 mJ/cm2 UVB über der Vergleichskultur (Abb.27). Gleiches gilt für die Nekroserate
(Abb.26).
0
5
10
15
20
25
30
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1
LM-1 + a6-block.mAb
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er fr
üh-a
popt
otis
chen
Zel
len
[%]
Abb.24. Anteil FITC+, PI- Zellen (entspricht frühen Apoptosestadien) 48 h p.i.. Einfluss von Laminin-1-Beschichtung mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte frühe Apoptose.
Ergebnisse
41
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1
LM-1 + a6-block.mAb
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er s
pät-
apop
totis
chen
Zel
len
[%]
Abb.25. Anteil FITC+, PI+ Melanozyten (entspricht späten Apoptosestadien) 48 h p.i.. Einfluss von Laminin-1-Beschichtung mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte Apoptose.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1
LM-1 + a6-block.mAb
Abb.26. Anteil FITC-, PI+ Zellen (entspricht nekrotischen Zellen) 48 h p.i.. Einfluss von Laminin-1 mit bzw. α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf UVB-induzierte Nekrose.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er n
ekro
tisch
en Z
elle
n[%
]
Ergebnisse
42
0
20
40
60
80
100
UVB-Dosis
unbeschichtet
Laminin-1
LM-1 + a6-block.mAb
Abb.27. Anteil FITC-, PI- Zellen (entspricht vitalen Zellen) 48 h p.i.. Einfluss von Laminin-1 mit bzw. ohne α6-Integrin-Antikörper GoH3 auf die Zellvitalität unter UVB-Bestrahlung.
unbestrahlt 10 mJ/cm2 20 mJ/cm2
Ant
eil d
er v
itale
n Z
elle
n [%
]
3.3 Mikroskopische Untersuchungen
Schließlich interessierte mich, wie die im ersten Teil der Experimente beobachtete UV-
induzierte Herunterregulation der α6-Integrinuntereinheit, der nach den Ergebnissen im
zweiten Teil möglicherweise eine Bedeutung für die Apoptoseempfindlichkeit der
Melanozyten zukommt, sich auf (sub-)zellulärer Ebene mit einem Konfokalmikroskop
darstellt.
Hierzu wurden Melanozyten auf zweikammerigen Chamber-Slides ausgesät. Nach UV-
Bestrahlung und Inkubation mit Antikörpern gegen α3- bzw. α6-Integrin wurden die
Zellen mit einem Sekundärantikörper markiert und mikroskopisch untersucht.
Es zeigte sich, dass unbestrahlte Melanozyten, die als Kontrolle mitgeführt wurden,
eine regelmäßige Verteilung von α3- bzw. α6-Integrin auf der Zelloberfläche aufwiesen
(Abb. 28 und 32). 24 Stunden nach UV-Bestrahlung war dagegen eine
zytoplasmatische Lokalisation der α6-Integrin positiven Granula erkennbar (Abb. 29
und 31), α3-Integrin positive Granula ließen sich nicht identifizieren (Abb. 33). Auf der
Zellmembran bestand lediglich eine schwache Restfluoreszenz gegen α6-Integrin
(Abb. 30).
Ergebnisse
43
Abb. 28. Immunfluoreszenz mit einem Antikörper gegen α6-Integrin. Unbestrahlte Melanozyten zeigen
eine relativ gleichmäßig und fein verteilte a6-Integrinexpression auf der Zellmembran.
Abb. 29. 24 h nach UVB-Bestrahlung mit 20 mJ/cm2 ist die membranöse a6-Integrin-Reaktivität
vermindert. Dagegen sieht man intensiv markierte zytoplasmatische Granula (Pfeile).
Ergebnisse
44
Abb. 30. Optische Schnitte (Dicke: 0,9 µm) durch die bestrahlten Zellen zeigen, dass auf der Ebene der
basalen Zellmembran lediglich eine schwache Restfluoreszenz besteht.
Abb. 31. Schnitte in der Ebene des Nukleus und des perinukleären Zytoplasmas derselben Zellen zeigen
die intrazelluläre, zytoplasmatische Lokalisation der α6-Integrin positiven Granula (Pfeile).
Ergebnisse
45
Abb. 32. Immunfluoreszenz mit einem Antikörper gegen α3-Integrin. Die unbestrahlten Melanozyten
zeigen eine gleichmäßig und fein verteilte α3-Immunfluoreszenz auf der Zellmembran.
Abb. 33. 24 h nach UVB-Bestrahlung (20 mJ/cm2) lässt sich weiterhin eine gleichmäßige Fluoreszenz des
Antikörpers gegen α3-Integrin erkennen. Intrazelluläre Granula lassen sich nicht identifizieren.
Diskussion
46
4 Diskussion
4.1 Melanozytäre Integrinexpression
4.1.1 Einfluss der UVB-Bestrahlung auf die Expression melanozytärer
Adhäsionsmoleküle
Es gibt bislang keine systematischen Untersuchungen zu der Frage, wie sich
Melanozyten unter UVB-Bestrahlung in Bezug auf die Expression von
Adhäsionsmolekülen verhalten. Die Wahl eines geeigneten Untersuchungsmodells ist
für diese Fragestellung von besonderer Bedeutung, da man weiß, dass sich
Melanozyten in vitro in vielerlei Hinsicht, so auch in der Expression von
Adhäsionsmolekülen, von Melanozyten in vivo unterscheiden. Das in vielen
Kulturmedien enthaltene chemische Mitogen 12-0-Tetradecanoylphorbol-13-azetat
(TPA) induziert eine Proliferation der Melanozyten, wohingegen in Abwesenheit von
TPA eine stärkere Differenzierung der Melanozyten resultiert. Danen et al. (1996)
beobachteten bei Benutzung eines TPA-freien Kulturmediums eine höhere Expression
von α6-Integrin. Um Kulturbedingungen zu schaffen, die der Situation in vivo näher
kommen, habe ich deshalb Phorbolester-freies Kulturmedium verwendet. Somit sind
die Änderungen der Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle in meinen
Versuchsreihen nicht auf chemische Mitogene zurückzuführen, sondern ausschließlich
durch UV-Licht und EZM-Bestandteile induziert. Ferner nutzte ich in meinen Versuchen
ausschließlich UVB-Licht, da bekannt ist, dass dieser Wellenlängenbereich besonders
starke biologische Effekte in der Haut hervorruft (Kadekaro et al., 2003). Sonnenlicht
wird in vivo von der Haut reflektiert oder in der Epidermis teilweise absorbiert wird. Die
Zellen wurden daher in vitro einer etwas geringeren Strahlungsdosis ausgesetzt als der
durchschnittlichen minimalen Erythemdosis kaukasischer Probanden (15 – 100
mJ/cm2).
Schon in früheren Studien wurden die Veränderungen der Expression einiger
Adhäsionsmoleküle nach UVB-Exposition in vitro untersucht. Nakazawa et al. (1995)
konnten in Melanozytenmonokulturen keine Veränderung der Expression von E-
Cadherin feststellen. Andere Autoren beobachteten dagegen eine leichte Reduktion
der E-Cadherinexpression (Seline et al., 1996). Die UV-induzierte Produktion des
Wachstumsfaktors Endothelin-1 durch Keratinozyten führt zu einer Herunterregulation
von E-Cadherin auf Melanozyten (Jamal und Schneider, 2002). Immunzytochemisch
Diskussion
47
konnte in anderen Untersuchungen ein leichter Anstieg von α5β1- und αVβ3-Integrin
nach UVB-Bestrahlung gezeigt werden (Neitmann et al., 1999). Dieser Anstieg ließ
sich durchflusszytometrisch allerdings nicht messen. Immunhistologische
Untersuchungen von Tronnier et al. (1997) zeigten einen Anstieg von α3-, α6-, β1- und
in geringem Maß auch α2-Integrin in der Epidermis nach Bestrahlung mit UVB-Licht;
diese Ergebnisse erlauben für Melanozyten jedoch keine Aussage, da sich deren
Immunreaktivität von der der umgebenden Keratinozyten nicht sicher abgrenzen lässt.
Es ist zu beachten, dass die Melanozyten in den zitierten Studien unterschiedlichen
UVB-Dosen zwischen 2,5 mJ/cm2 und 30 mJ/cm2 ausgesetzt waren, die neben der
oben erwähnten Zusammensetzung des Kulturmediums ebenfalls eine je nach
Arbeitsgruppe unterschiedliche Ansicht der Zelltoleranz widerspiegeln.
In den vorliegenden Untersuchungen an humanen Melanozytenkulturen konnte ich
nach UVB-Bestrahlung eine Veränderung der Expression verschiedener Integrine
messen (s. 3.1.1, Abb.4). Die durchflusszytometrisch gemessene Immunreaktivität
entspricht ännähernd der Expression der Adhäsionsmoleküle der melanozytären
Zellmembran. Die Höhe der Expression wird durch den Prozentsatz der
immunreaktiven Zellen ausgedrückt. Der Schwellenwert von 2% wurde durch
Negativkontrollen ermittelt (s. 2.3).
Unbestrahlt war die Expression aller gemessenen Integrine durchgehend am höchsten.
Die Expression von α2-Integrin war bei einer UVB-Dosis von 10 mJ/cm2 am
niedrigsten, erreichte bei einer UVB-Dosis von 15 mJ/cm2 einen etwas höheren Wert
und war bei einer UVB-Dosis von 20 mJ/cm2 wieder leicht rückläufig. α3-Integrin zeigte
eine besonders starke Expression, die unter allen UVB-Dosen so gut wie konstant
blieb. α5-Integrin zeigte dagegen eine kontinuierliche, mit der UVB-Dosis korrelierende
Herunterregulation. Die Herunterregulation von α6-Integrin war bei UVB-Dosen von 10
mJ/cm2 und 15 mJ/cm2 am stärksten ausgeprägt. Die Expression von αV-Integrin zeigte
ihren niedrigsten Wert bei einer UVB-Dosis von 15 mJ/cm2, während man bei einer
Dosis von 20 mJ/cm2 erneut einen Anstieg beobachten konnte. Der Einfluss von UVB-
Licht auf die Expression von β1-Integrin wurde von mir nicht gemessen, da
Voruntersuchungen der Arbeitsgruppe hier bereits eine eindeutige Konstanz der
(hohen) Expression gezeigt hatten. Die ohnehin geringe Expression von β3-Integrin fiel
zunächst ab, stieg aber bei UVB-Dosen von 15 mJ/cm2 und 20 mJ/cm2 wieder an.
Insgesamt zeigte sich demnach, dass es im Vergleich zu unbestrahlten Melanozyten
nach UVB-Bestrahlung tendenziell zu einer Herunterregulation der
Integrinuntereinheiten kommt. Die Verminderung der Integrinexpression war für die
Diskussion
48
jeweiligen Integrine zwischen 10-15 mJ/cm2 am deutlichsten erkennbar.
Interessanterweise war die Expression von α3-Integrin vergleichsweise konstant.
Die Ergebnisse weichen von den Ergebnissen von Neitmann et al. (1999) ab.
Allerdings wurde dort mit der Immunzytologie eine für quantitative Aussagen weniger
geeignete Methode gewählt. Ferner könnten Unterschiede in Kulturbedingungen und
UV-Bestrahlung sowie die Verwendung anderer Antikörper die Unterschiede erklären.
Sollte die hier beobachtete tendenzielle Herrunterregulation melanozytärer
Adhäsionsmoleküle in vivo wirksam sein, würde das zu einer abgeschwächten Bindung
der Melanozyten an die EZM führen. Die durch Bestrahlung relativ gering beeinflusste
Expression von α3- und β1-Integrin weist daraufhin, dass die durch α3β1-Integrin
vermittelte Bindung von Melanozyten an Laminin-5-Moleküle der Lamina lucida eine
UV-stabilere Adhäsion darstellt, die möglicherweise die Adhäsion auch bei UV-
Bestrahlung aufrechterhält.
4.1.2 Einfluss extrazellulärer Matrix auf die Expression melanozytärer
Adhäsionsmoleküle nach UVB-Bestrahlung
Um die natürlichen Verhältnisse von Melanozyten näherungsweise zu simulieren,
beschichtete ich die Oberfläche der Kulturplatten mit Bestandteilen der extrazellulären
Matrix. Es ist bekannt, dass diese Bestandteile über Integrine viele Funktionen
epithelialer Zellen beeinflussen. Dabei ist zu beachten, dass die Affinität der Integrine
nicht für jeden dieser Liganden gleich ist (s. Einleitung, Tab. 1). Aus diesem Grund
wählte ich für die einzelnen Integrinuntereinheiten die jeweils relevanten
Beschichtungen (s. 3.1.2).
Epitheliale Zellen exprimieren eine Vielzahl von verschiedenen Adhäsionsmolekülen
auf ihrer Zelloberfläche. Wie diese Integrine in verschiedenen Stadien der epithelialen
Differenzierung und bei Zellantworten auf exogene Signale genutzt werden, ist in
Voruntersuchungen erarbeitet worden. Diese Ergebnisse werden im Folgenden vor der
Darstellung meiner Messergebnisse für die jeweiligen Integrinuntereinheiten kurz
rekapituliert.
α2β1-Integrin vermittelt den Kontakt von Keratinozyten zur epidermalen Basalmembran
(De Luca et al., 1990; Marchisio et al., 1991) sowie die Adhäsion von humanen
Melanozyten an Laminin und Kollagen Typ IV (Mengeaud et al., 1996). Es wurde
gezeigt, dass nach α2-Integrin-vermittelter Haftung von Melanozyten an Laminin und
Kollagen Typ IV eine verstärkte Differenzierung und Dendritenbildung einsetzt (Danen
et al., 1996; Hara et al., 1994). Morelli et al. (1993) konnten demonstrieren, dass die
Diskussion
49
Motilität von Melanozyten auf Kollagen Typ IV durch einen Antikörper gegen α2-
Integrin hemmbar ist. Dieser Effekt war auf Laminin und Fibronektin nicht nachweisbar.
Etoh et al. (1993) zeigten dagegen für Melanomzellen, dass durch α2β1-Integrin eine
durch entsprechende Antikörper blockierbare Migration auf Laminin und Kollagen Typ
IV vermittelt wird. In anderen Arbeiten konnte eine gesteigerte Expression von α2-
Integrin in Zusammenhang mit einer erhöhten Metastasierungspotenz von
Melanomzellen beobachtet werden (Danen et al., 1993).
In meinen Messungen war die UVB-induzierte Herunterregulation von α2-Integrin auf
Laminin-1 etwas geringer ausgeprägt als auf unbeschichteten Kulturoberflächen. Dies
könnte ein möglicher Hinweis auf eine UV-protektive Rolle des
Basalmembrankontaktes sein. Auf Kollagen Typ IV kultivierte Melanozyten zeigten
analog zu den Ergebnissen für Laminin-1 eine Herunterregulation der Expression von
α2-Integrin. Wie oben ausgeführt, vermittelt diese Integrinuntereinheit insbesondere die
Adhäsion der Zellen an Kollagen Typ IV (Danen et al., 1996; Hara et al., 1994). Auch
hier könnte die geringere Herunterregulation einen Hinweis für die UV-protektive Rolle
des Basalmembran-kontaktes darstellen.
Ähnlich wie für α2-Integrin konnte durch Morelli et al. (1993) eine gesteigerte Migration
von Melanozyten auf Kollagen Typ IV auch für α3-Integrin belegt werden. α3β1-Integrin
wurde sowohl auf der basalen als auch auf der lateralen Zellseite von Keratinozyten
gefunden (Carter et al., 1990). Dies lässt vermuten, dass es neben Zell-
Matrixverbindungen auch interzelluläre Adhäsion vermittelt. Bekannt ist, dass α3β1-
Integrin die Adhäsion an Laminin vermittelt (Mengeaud et al., 1996). Bei der Migration
von Melanomzellen auf Laminin und Kollagen scheint α3-Integrin dagegen keine
entscheidende Rolle zu spielen (Etoh et al., 1993).
In meinen Messungen konnte für α3-Integrin, im Gegensatz zur konstanten Expression
auf unbeschichteten Kulturplatten, eine UVB-induzierte Herunterregulation auf Laminin-
1 gezeigt werden. Dieses Ergebnis zeigt, dass der Effekt der Beschichtung keineswegs
immer in dieselbe Richtung geht, die Bedeutung der Beobachtung ist jedoch fraglich.
Bei Relevanz in vivo würde der Kontakt zu Laminin-1 im Gegensatz zu den
Ergebnissen für andere Integrine eine erhöhte Empfindlichkeit der Melanozyten
gegenüber UV-Licht bedeuten.
α5β1-Integrin vermittelt die Haftung melanozytärer Zellen an Fibronektin (Mengeaud et
al., 1996) und führt zu inhibierbaren chemotaktischen Effekten (Neitmann et al., 1999).
Obwohl Fibronektin der bevorzugte Bindungspartner ist, konnte auch eine, durch die
Diskussion
50
α5-Integrinuntereinheit vermittelte Migration und Dendritenbildung von Melanozyten auf
Kollagen Typ IV und Laminin beobachtet werden (Hara et al., 1994).
Einen UV-induzierten Anstieg der Expression von α5-Integrin auf Fibronektin, den
Neitmann et al. (1999) immunzytologisch beobachtet hatten, konnte ich nicht
nachweisen. Für dieses Integrin ergab sich vielmehr eine in etwa gleich bleibende
Herunterregulation trotz Fibronektin-Beschichtung und damit kein Hinweis für einen
Einfluss des EZM-Kontaktes auf die UV-Reaktivität.
α6β1-Integrin zeigt eine hohe Affinität zu der Basalmembrankomponente Laminin (Hall
et al., 1990; Sonnenberg et al., 1990). Dabei vermittelt α6-Integrin nach der Bindung an
Laminin verschiedene zelluläre Antworten. So konnte in Anwesenheit von
Wachstumsfaktoren ein stimulatorischer Effekt von Laminin-1 auf die proliferative
Aktivität von Melanozyten gezeigt werden (Mortarini et al., 1995). Dieser Effekt war
durch monoklonale Antikörper gegen α6- und β1-Integrin hemmbar. Auch eine
gesteigerte Zelldifferenzierung und die Ausbildung von Dendriten als Reaktion auf
Laminin- und Kollagen-IV-Kontakt werden durch α6-Integrin vermittelt (Danen et al.,
1996). Dieser Effekt ist für Laminin durch α6-Integrin-Antikörper hemmbar.
Melanomzellen weisen eine durch α6β1-Antikörper hemmbare Bindung an Laminin-1
und Kollagen Typ IV auf (Danen et al., 1993).
In meinen Messungen war die UVB-induzierte Herunterregulation von α6-Integrin auf
Laminin-1 signifikant und geringer ausgeprägt als auf unbeschichteten Kulturplatten.
Da sich durch diese Ergebnisse ein Einfluss von Laminin-1 auf die Expression von α6-
Integrin vermuten ließ, führte ich eine weitere Versuchsreihe durch. Auch die
Messungen zum zeitlichen Verlauf der Expression von α6-Integrin zeigten eine
geringere Herunterregulation auf Laminin-1. Der Effekt war bei einer UVB-Dosis von 20
mJ/cm2 zu allen Messzeitpunkten (24 h, 48 h, 72 h) signifikant gegenüber
unbestrahlten Melanozyten. Dies könnte wiederum ein Hinweis auf eine UV-protektive
Rolle des Basalmembrankontaktes sein.
Die β1-Integrinuntereinheit spielt für Melanozyten als Bestandteil der Integrindimere
α2β1, α3β1, α5β1 und α6β1 eine Rolle (Plow et al., 2000). In diesen Verbindungen
haben β1-Integrine diverse, oben ausgeführte Funktionen. Scott et al. (1997) fanden
u.a. heraus, dass die durch β1-Integrin vermittelte Bindung an Fibronektin Melanozyten
vor dem Eintritt in die Apoptose schützt.
β1-Integrin zeigte in meinen Messungen eine sowohl auf unbeschichteten
(Voruntersuchungen der Arbeitsgruppe, s.o.) als auch auf Laminin-, Kollagen Typ IV-
und Fibronektin-Beschichtung eine gleichmäßige, nach UV-Bestrahlung unveränderte
Diskussion
51
Expression. Hendrix et al. (1998) konnten für Keratinozyten zeigen, dass eine hohe
Expression von β1-Integrin der Zelle antiapoptotische Signale vermittelt, im Gegensatz
dazu niedrige Expressionswerte die Zelle empfindlicher für Apoptose machen. Die
gegenüber exogenen Faktoren (UV-Licht, EZM-Beschichtungen) relativ stabile
Expression des Moleküls legt auch für Melanozyten eine zellprotektive Rolle nahe.
Die αV-Integrinuntereinheit kann mit verschiedenen β-Untereinheiten (β1, β3)
Heterodimere bilden (Van der Flier und Sonneberg, 2001). Das so entstandene Integrin
bindet je nach Zusammensetzung an verschiedene Liganden. αVβ3-Integrin bindet an
Fibronektin (Neitmann et al., 1999), nicht jedoch an Laminin und Kollagen Typ IV (Hara
et al., 1994).
αV-Integrin zeigte in meinen Messreihen nach UVB-Bestrahlung eine konstante, im
Vergleich zu unbeschichteten Kontrollen jedoch deutlich verringerte Expression auf
Fibronektin.
Über β3-Integrin sind bis jetzt nur wenige Ergebnisse bezüglich ihrer Funktion auf
Melanozyten verfügbar. So konnte eine durch α2-, α5- und αVβ3-Integrin geförderte
Bildung von Dendriten auf einer Laminin- und Kollagen Typ IV-Beschichtung
nachgewiesen werden (Hara et al., 1994); des Weiteren wurde eine durch αVβ3-
Integrin verstärkte Haftung von Melanozyten an Fibronektin gemessen (Neitmann et
al., 1999). Andere Untersuchungen weisen daraufhin, dass der Expression von αVβ3-
Integrin bei der Progression des Melanoms eine möglicherweise wichtige Rolle für die
Zell-Matrix-Interaktion zukommt (Li et al., 1998; Natali et al., 1997).
Eine nach UVB-Bestrahlung in etwa gleich bleibende Herunterregulation der
Expression war auch für das ohnehin schwach exprimierte β3-Integrin auf Fibronektin
zu beobachten. Daraus lässt sich folgern, dass der EZM-Kontakt die UV-Sensitivität
der β3-Integrin-Expression nicht beeinflusst.
Zusammengefasst betrachtet zeigten sich in meinen Untersuchungen bei einer UVB-
Dosis von 20 mJ/cm2 die deutlichsten Einflüsse des EZM-Kontaktes auf die Expression
von Integrinen (Abb. 5-7), wobei unbestrahlte Melanozyten unter Einfluss
extrazellulärer Matrixbestandteile bis auf αV-Integrin ein etwas höheres
Ausgangsexpressionsniveau als unbeschichtet gewachsene Melanozyten zeigten. Dies
könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Zellen in ihrem natürlichen Mikromilieu eine
von der in vitro-Situation verschiedene Expression von Adhäsionsmolekülen
aufweisen. Die deutlich verringerte Expression von αV-Integrin bei Beschichtung mit
Fibronektin dagegen weist daraufhin, dass die Präsenz des natürlichen Liganden zu
verminderter Expression dieses in vivo nur gering exprimierten Moleküls führt. Es ist
Diskussion
52
allerdings nicht auszuschließen, dass Unterschiede der Immunreaktivität nach
stattgehabter Bindung des Liganden ein methodisches Artefakt darstellen. Die
verminderte Expression bei Beschichtung wäre dann möglicherweise durch die
Blockade von Antikörperbindungsstellen erklärbar.
4.2 Melanozytäre Apoptoserate
4.2.1 Einfluss der UVB-Bestrahlung auf die melanozytäre Apoptoserate
Kim et al. (2000) sowie Kadekaro et al. (2003) konnten eine UVB-dosisabhängige
Zunahme der Zelltodrate in Melanozyten zeigen, wobei ähnliche UV-Wellenlängen wie
in meinen Versuchen verwendet wurden. Da ultraviolettes Licht die Bildung von
Sauerstoffradikalen induzieren kann, wurde von mir in einer parallelen Versuchsreihe
der Radikalfänger Pyrrolidendithiocarbamat (PDTC) eine Stunde vor der UVB-
Bestrahlung zu den kultivierten Melanozyten hinzugegeben. Die Herunterregulation
von α6-Integrin trat auch in diesem Experiment, also unabhängig von reaktiven
Sauerstoffspezies auf. Somit kann angenommen werden, dass der
Regulationsmechanismus nicht durch Radikale vermittelt, sondern direkt durch die
UVB-Strahlung auf der Zelloberfläche induziert wird oder einem anderen zellulären
Regulationsmechanismus unterliegt.
Es konnte von anderen Gruppen gezeigt werden, dass Keratinozyten im Vergleich zu
Melanozyten empfindlicher auf UV-Licht reagieren (Bowen et al, 2003; Larsson et al.,
2005). Melanozyten von dunkelhäutigen Individuen waren im Vergleich zu Melanozyten
von Individuen mit hellem Hauttyp („Kaukasier“) in vitro etwas weniger UV-empfindlich
(Barker et al., 1995). Um die Ergebnisse der Apoptoserate von „kaukasischen“
Melanozyten mit anderen Zellpopulationen vergleichen zu können, führte ich „negroide“
Melanozyten und Keratinozyten in den Experimenten mit.
Meine Ergebnisse zeigen einen dosisabhängigen Anstieg des Zelltodes in humanen
Melanozyten (s. 3.2.1, Abb. 12 u. 13). Hierbei war der Anstieg besonders deutlich für
die Gesamtapoptoserate (frühe + späte Apoptose = F2 + F4 [s. Tab. 2]). Die Rate
apoptotischer Zellen (F2 + F4) stieg bei den „kaukasischen“ Melanozyten („1,5K“) von
18% (unbestrahlte Zellen) auf 28 % (20 mJ/cm2, 24 h p.i.). Die Ergebnisse ähneln
denen von Kim et al. (2000). In diesen Versuchen wurde eine insgesamt etwas
niedrigere Apoptoserate von 10% bzw. 21% bei UVB-Dosen von 10 mJ/cm2 bzw. 20
mJ/cm2 gemessen. Diese Unterschiede sind durch unterschiedliche Kultur- und
Bestrahlungsbedingungen zu erklären.
Diskussion
53
Die Messungen für Keratinozyten entsprachen den aus Voruntersuchungen bekannten
Ergebnissen, die eine gegenüber Melanozyten überwiegend erhöhte Vulnerabilität der
Zellen für UV-induzierte Apoptose gezeigt hatten (s.3.2.1, Abb.12 u. 13). Allerdings
fand sich in meinen Messungen keine klare Dosisabhängigkeit. Im Gegensatz zu der
oben zitierten Arbeit (Barker et al., 1995) konnte ich für „negroide“ Melanozyten keine
erhöhte Apoptoseresistenz gegenüber „kaukasischen“ Melanozyten feststellen.
4.2.2 Einfluss von EZM-Bestandteilen auf die melanozytäre Apoptoserate nach UVB-
Bestrahlung
Um zu untersuchen, inwiefern die Bindung von Melanozyten an Bestandteile der
Basalmembran die Empfindlichkeit gegenüber UVB-Licht verändert, führten wir
dieselben Bestrahlungsexperimente nach Beschichtung mit Laminin-1, Fibronektin und
Kollagen Typ IV durch. Scott et al. (1997) konnten zeigen, dass Melanozyten durch
Bindung an Fibronektin wirksam vor Apoptose geschützt werden. Gniadecki et al.
(1997) stellten fest, dass die Blockierung von Integrinen auf Keratinozyten zu einer
gesteigerten Apoptose nach UV-Bestrahlung führte. Meine Messungen zeigten für die
auf Fibronektin und Kollagen Typ IV kultivierten Melanozyten eine deutlich höhere
Gesamtapoptoserate (frühe + späte Apoptose = F2 + F4 [s. Tab. 2]) und eine stärkere
Nekroserate als die ohne Beschichtung und auf Laminin-1 gewachsene Melanozyten
(3.2.1 und 3.2.2). Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass Laminin-1 die
Melanozyten vor UV-induzierter Apoptose schützt. Unter dem Einfluss höherer UV-
Dosen kommt es zu einer gestörten Basalmembraninteraktion, die in der Apoptose
mündet. Der Anteil nekrotischer Zellen blieb auch unter höheren UVB-Dosen bei
Beschichtung auf Laminin-1 konstant (Abb. 14 [s. 3.2.1]), was diese Vermutung
zusätzlich stützt. Die Bindung an Laminin könnte somit auch in vivo einen wichtigen
Einfluss auf die Aufrechterhaltung der melanozytären Homöostase ausüben.
In einer weiteren Messreihe untersuchte ich, ob konzentrationsabhängige
Veränderungen der extrazellulären Matrixbestandteile unterschiedlichen Einfluss auf
die melanozytäre Apoptoserate haben. Die Konzentrationen wurden so gewählt, dass
entsprechend vorausgegangenen Studien von einem Sättigungseffekt bei einer
Konzentration von 20 µg/ml Laminin-1 auf die Melanozyten auszugehen war (Neitmann
et al., 1999). Weder eine Konzentration von 2 µg/ml noch eine Konzentration von 20
µg/ml Laminin-1 führten zu signifikanten Änderungen der Apoptoserate im Vergleich zu
unbeschichtet kultivierten Melanozyten.
Diskussion
54
4.2.3 Einfluss eines blockierenden Antikörpers gegen α6-Integrin auf die
melanozytäre Apoptoserate nach UVB-Bestrahlung
Durch die nachfolgenden Experimente sollte die funktionelle Relevanz der α6-Integrin-
vermittelten Basalmembraninteraktion für die Apoptoseempfindlichkeit von
Melanozyten überprüft werden. Aufgrund der Tatsache, dass die α6-Integrin-Laminin-
Interaktion in der Literatur für andere Zelltypen (Oligodendrozyten,
Mammaepithelzellen, Fibroblasten) als apoptoseprotektiv beschrieben wurde (Corley et
al., 2001; Farrelly et al., 1999; Lin und Bertics, 1995) und die natürliche Lage der
Melanozyten auf der Basalmembran eine solche Rolle beim Schutz vor UV-induzierter
Apoptose nahe legt, bin ich in den folgenden Untersuchungen einem derartigen
Zusammenhang weiter nachgegangen. Hierzu wurde vor Bestrahlung ein
blockierender Antikörper gegen α6-Integrin zu den frisch auf Laminin-1 ausgesäten
Melanozyten gegeben. Die visuelle Kontrolle (Abb. 34 und 35 [s. Anhang]) zeigte
lichtmikroskopisch ein Maximum der inhibitorischen Aktivität dieses Antikörpers für die
Bindung an Laminin-1 nach ca. 6 h. In der Messreihe zeigten sich 24 h nach UVB-
Bestrahlung signifikante Unterschiede der für 6 h vorinkubierten Melanozyten
gegenüber Kontroll-Melanozyten (s. 3.2.3, Abb. 20-23). So konnte sowohl bei 10
mJ/cm2 als auch bei 20 mJ/cm2 eine signifikant erhöhte Apoptoseempfindlichkeit und
Nekroserate bei den durch den Antikörper gegen α6-Integrin blockierten Melanozyten
gemessen werden. Auch 48 Stunden nach UVB-Bestrahlung konnte die erhöhte
Apoptoseempfindlichkeit tendenziell noch nachgewiesen werden (s. 3.2.3., Abb. 24-
27).
Übertragen auf die Situation in vivo lassen sich die Ergebnisse dahingehend
interpretieren, dass durch Bindung an die Basalmembran die Resistenz der
Melanozyten gegen UV-Licht erhöht wird. Dieser Schutz wird offenbar durch α6-
Integrin vermittelt, vermutlich als Heterodimer in der Verbindung mit β1-Integrin. Ein
solcher Mechanismus konnte bereits für andere Zelltypen gezeigt werden. So konnte
die durch α6- und β1-Integrin-vermittelte Haftung an Laminin in Langzeitkulturen von
Mammaepithelzellen die Apoptose wirkungsvoll unterdrücken (Farrelly et al., 1999;
Weaver et al., 2002). In anderen Arbeiten wurde gezeigt, dass die Haftung von
Oligodendrozyten an Laminin durch α6β1-Integrin der entscheidende Faktor in der
reduzierten Apoptoserate der Zellen ist (Corley et al., 2001). Di Persio et al. (2000)
konnten hingegen keine Induktion von Apoptose durch Blockierung von α3- und α6-
Integrin beobachten.
Diskussion
55
Der Verlust der Haftung von Epithelzellen an EZM-Bestandteile führt zur Anoikis, einer
speziellen Form der Apoptose (Frisch und Ruoslahti, 1997). Sowohl gesunde als auch
neoplastische Epithelzellen der Brustdrüse werden durch integrinvermittelte Bindung
an die Basalmembran resistent gegenüber proapoptotischen Stimuli (Weaver et al.,
2002). Speziell die α6-Integrin-Lamininbindung konnte in verschiedenen Zelltypen als
antiapoptotischer Mechanismus identifiziert werden. So vermittelt die α6-Integrin-
Lamininbindung in Fibroblasten das Überleben der Zelle und die Motiltität (Lin und
Bertics, 1995). Darüber hinaus stellt die α6-Integrin-Lamininbindung einen zentralen
antiapoptotischen Mechanismus in hepatozellulären und pankreatischen Karzinomen
dar (Nejiari et al., 1999; Sawai et al., 2003).
Interessanterweise reduzierte die Laminin-Bindung in meinen Experimenten nicht nur
die Apoptoseempfindlichkeit, sondern auch die UVB-induzierte Herunterregulation von
α6-Integrin (3.1.3, Abb. 10 und 11). Diese beiden gegensätzlichen Mechanismen
könnten eine über den Basalmembrankontakt fein regulierte Balance zwischen
Überleben und Apoptose der Melanozyten unter solarer Strahlung darstellen.
4.3 Regulation der Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle auf
zellulärer Ebene nach UVB-Bestrahlung
Die mögliche Rolle von α6-Integrin bei der Veränderung der UVB-Empfindlichkeit von
Melanozyten warf die Frage auf, welchem Mechanismus die UVB-induzierte
Herunterregulation dieser Integrinuntereinheit unterliegt. Es ist bekannt, dass Integrine
durch Endozytose in das Zytoplasma aufgenommen werden können. Durch diesen
Vorgang können sowohl Einflüsse auf zelluläre Adhäsion und Migration, als auch auf
Proliferation und Differenzierung ausgeübt werden.
So beobachteten Salicioni et al. (2004) und Poumay et al. (1993) eine Aufnahme von
β-Integrinuntereinheiten in das Zellinnere über Zellmembranproteine. Dieser Prozess
scheint eine kritische Rolle während der Zellmigration zu spielen. An der Zellseite, die
nicht in Bewegungsrichtung liegt, werden Integrine internalisiert, um an der Vorderseite
der Zelle wieder in die Zellmembran eingefügt zu werden (Powelka und Sun, 2004). In
weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, dass das Zellmembranprotein Tetraspanin
(CD82) mit α6-Integrin eine feste Verbindung eingeht, die via Internalisierung zur
verminderten Expression dieses Integrins an der Zelloberfläche führt. Daraus resultiert
eine verminderte Adhäsion an Laminin und eine Veränderung der Zellform (He et al.,
2005). Die Internalisierung des aus der Familie der Integrine stammenden LFA-1
Diskussion
56
(lymphocyte-function-associated antigen-1), auch als αLβ2-Integrin bezeichnet, scheint
der entscheidende Schritt in der Loslösung der Zellen von ihrem Untergrund zu sein.
Zellen, bei denen Punktmutationen im Gen dieses Integrins induziert wurden, waren
unfähig, dieses zu internalisieren. Bei der Zellmigration konnte man im Folgenden eine
ungewöhnliche Streckung der Zellform beobachten, die aus der schwer gestörten
Ablösung der Zellhinterseite von Polystyrolplatten resultierte (Tohyama et al., 2003).
Strachan und Condic (2004) beobachteten, dass die Internalisierung von Integrinen
von der Beschichtung abhängig ist, auf der die Zellen wachsen. So konnte auf Laminin
eine stärkere Aufnahme der Rezeptoren ins Zellinnere beobachtet werden als auf
Fibronektin.
Die Fähigkeit epithelialer Zellen, verschiedene Integrine auf der Oberfläche zu
exprimieren, könnte eine große Rolle während der Ontogenese und Regeneration von
Epithelien spielen. Der Mechanismus, mittels dessen durch Integrine ausgebildete
Zellkontakte unterbrochen werden und anschließend diese Adhäsionsmoleküle an
anderer Stelle der Zelloberfläche erneut exprimiert werden, ist unklar. Die
Rezeptorendozytose könnte eine mögliche Erklärung bieten.
Durch neuere Arbeiten scheint sich zu bestätigen, dass Veränderungen der
Integrinkonformation ebenfalls eine wichtige Rolle bei zellulärer Differenzierung und
Proliferation spielen. Die Bildung von Integrinclustern, die sich zu fokalen
Adhäsionsstellen formieren, ist detailliert untersucht worden. Sie scheinen an der
Signaltransduktion durch Bindung an zytoskelettale Verbindungsproteine und
nachfolgender Aktivierung der MAP (mitogen activated protein)-Kinase beteiligt zu sein
(Juliano und Haskill, 1993; Miyamoto et al., 1995). Integrine scheinen zudem mit
Tetraspaninen auf der Zelloberfläche assoziiert zu sein (s.o.). Diese Familie von
Zellmembranmolekülen induziert, neben der oben beschriebenen Internalisierung,
auch Signalwege durch Zusammenlagerung von Membranmolekülen in große
molekulare Komplexe. CD151 und CD36, Mitglieder der Tetraspaninfamilie, sind
spezifisch mit Laminin bindenden Integrinen assoziiert (Sterk et al., 2002; Thorne et al.,
2000). α3β1-Integrin scheint durch Komplexbildung mit Tetraspaninmolekülen an
Mechanismen, die die Apoptose und die Wundheilung regeln, beteiligt zu sein (Tsuji,
2004).
Die Zusammenlagerung von Integrinen in cholesterol- und sphingolipidreichen
Membranmikrodomänen („lipid rafts“) stellt einen alternativen Mechanismus der
Integrin-Umverteilung dar, der ebenfalls die Integrinaktivität reguliert (Leitinger und
Hogg, 2002). So wurde gezeigt, dass in den Membranmikrodomänen lokalisiertes
Diskussion
57
α6β1-Integrin bei Oligodendrozyten das wachstumsfaktorabhängige Überleben dieser
Zellen reguliert (Decker und Ffrench-Constant, 2004). Durch integrinvermittelte
Adhäsion, die die Internalisierung der Membranmikrodomänen verhindert, wird die
Signaltransduktion in haftungsabhängigen Zellen kontrolliert (Del Pozo et al., 2004).
Erst kürzlich wurde die Bildung von α2β1-Integrinclustern beschrieben, die aus lipid
rafts in intrazelluläre Vesikel verlagert werden, die sich aus Invaginationen der
Zellmembran bilden (Upla et al., 2004). Ich konnte mittels konfokaler Mikroskopie
zeigen, dass UVB-Bestrahlung zu einer Internalisierung von α6-Integrin führt. Die bei
unbestrahlten Melanozyten deutlich auf der Zelloberfläche sichtbare Fluoreszenz des
α6-Integrin-Antikörpers verlagerte sich nach UVB-Bestrahlung in das Zellinnere. Dort
lagen die internalisierten Integrine in Form kleiner Vesikel oder Granula vor. Im
Gegensatz dazu war bei Melanozyten, die mit einem fluoreszierenden Antikörper
gegen α3-Integrin angefärbt wurden, auch nach UVB-Bestrahlung keine Veränderung
der Lokalisation dieser Integrine erkennbar. Sie fanden sich weiterhin auf der
Zellmembran. Die Eigenschaft von UV-Licht, direkte stimulatorische Einflüsse auf
Zelloberflächenrezeptoren auszuüben, ist bekannt (Aragane et al., 1998; Kulms et al.,
2002). Ein Einfluss von UV-Licht auf die zelluläre Lokalisation bzw. eine UV-induzierte
Internalisierung von Integrinen wurde bisher noch nicht beschrieben. Es handelt sich
hierbei um einen neuen Mechanismus, dessen funktionelle Bedeutung noch zu klären
ist.
Setzt man voraus, dass vor allem α6β1- und α3β1-Integrin die Adhäsion der
Melanozyten an Laminin in der Basalmembran vermitteln (Zambruno et al., 1993), so
müsste es durch UV-induzierte α6-Integrin-Internalisierung zu einer Abschwächung der
Bindung an die Basalmembran kommen. In meinen Experimenten blieb die Expression
des Laminin bindenden Integrins α3β1 in der Versuchsreihe, die ohne zusätzliche
Beschichtungen durchgeführt wurde, fast unverändert, auf Laminin-1 zeigte sich nach
UV-Bestrahlung nur eine mäßige Herunterregulation dieses Adhäsionsmoleküls (s.
3.1.1 und 3.1.2). In den konfokalmikroskopischen Untersuchungen war
dementsprechend im Gegensatz zu α6-Integrin keine Internalisierung der α3-
Untereinheit nachweisbar.
Dies unterstreicht die Spezifität des beschriebenen UV-Effektes für α6-Integrin. Ob für
andere durchflusszytometrisch nach UVB-Bestrahlung herunterregulierte
Adhäsionsmoleküle, z.B. α2-Integrine, ebenfalls eine Internalisierung nachweisbar ist,
bleibt weiterführenden Untersuchungen vorbehalten. Zusammen mit der oben
beschriebenen, durch α6-Integrin vermittelten apoptoseprotektiven Eigenschaft von
Diskussion
58
Laminin ergibt sich aufgrund unserer Ergebnisse ein wichtiger Einblick in die Rolle von
Adhäsionsmolekülen für die Homöostase von Melanozyten unter Einfluss von UVB-
Licht. Spekulieren lässt sich darüber hinaus, ob die Internalisierung von α6-Integrin, die
die Melanozyten vermutlich durch Lockerung der Laminin-Bindung wiederum
empfindlicher für Apoptose macht, auch einen Schutz vor der Anhäufung UV-bedingter
DNA-Schäden darstellt. Demnach würde via α6-Integrin-Internalisierung ab einer
gewissen UV-Dosis der Untergang der einzelnen Zelle durch Lockerung der
Verankerung auf Laminin vorprogrammiert sein.
Der tatsächliche Einfluss der UV-induzierten α6-Integrin-Internalisierung auf die
Haftung der Melanozyten an Laminin-1 und Laminin-5 muss allerdings in Experimenten
zur Zellhaftung (attachment-assays) weiter untersucht werden. Des Weiteren muss
untersucht werden, ob die Internalisierung des α6-Integrins auf Melanozyten auch in
vivo zu beobachten ist, da in meinen Versuchen zwar die Lebensbedingungen der
Melanozyten möglichst genau simuliert wurden, es sich aber letztlich bislang lediglich
um in vitro-Befunde handelt.
Zusammenfassung
59
5 Zusammenfassung
Integrine sind auf der Zelloberfläche von Melanozyten lokalisiert und vermitteln die
Bindung an Bestandteile der extrazellulären Matrix. Jedes als EZM-Rezeptor dienende
Integrin hat dabei bestimmte Liganden, die es bevorzugt bindet. α6β1-Integrin
vermittelt die Haftung an Laminin-1, einer Komponente der epidermalen
Basalmembran. Durch Haftung an die extrazelluläre Matrix werden integrinvermittelte
Signale in das Zellinnere weitergeleitet. Dabei vermitteln Integrine sowohl proliferative
als auch antiapoptotische Signale. Ich konnte durchflusszytometrisch nachweisen,
dass es durch UVB-Bestrahlung zu einer reduzierten Expression von Integrinen auf der
Zellmembran von Melanozten kommt. Bei Experimenten mit EZM-Beschichtungen
zeigte sich zudem, dass die UV-induzierte Herunterregulation von α6-Integrin auf
Laminin-1 deutlich abgeschwächt ist.
Durch durchflusszytometrische Messung der Apoptoserate konnte ich zeigen, dass die
α6-Integrin-abhängige Adhäsion von Melanozyten an Laminin-1 zu einem Schutz
dieser Zellen vor UVB-induzierter Apoptose führt. Diese Schutzfunktion wurde durch
Zugabe eines blockierenden α6-Integrin-Antikörpers aufgehoben.
Konfokalmikroskopisch konnte ich eine UV-induzierte Internalisierung von α6-Integrin
als Erklärung für die durchflusszytometrisch messbare Herunterregulation
demaskieren.
Die Ergebnisse weisen auf die Bedeutung der durch α6-Integrin vermittelten Interaktion
zwischen Melanozyten und Basalmembran bei der Homöostase von Pigmentzellen hin,
insbesondere unter Einfluss von UV-Licht. Die UV-induzierte Internalisierung des α6-
Integrinmoleküls könnte einen dabei wirksamen Mechanismus darstellen. Die Relevanz
der Interaktion zwischen Melanozyten und Basalmembran bei physiologischen und
pathologischen Prozessen muss in weiterführenden Untersuchungen geklärt werden.
Literaturverzeichnis
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Anhang
76
7 Anhang (Bilder, Tabellen)
Abb. 34. Melanozyten, 6 h nach der Aussaat auf Laminin-1 (Melan A-Färbung, 10-fache Vergrößerung, s.
2.2.3)
Abb. 35. Melanozyten, 6 h nach der Aussaat auf Laminin-1 unter Zugabe eines monoklonalen Antikörpers
gegen α6-Integrin (Melan A-Färbung, 10-fache Vergrößerung; s. 2.2.3). Die abgerundete
Zellform bedingt eine im Vergleich zu Abb.34 wesentlich geringere Haftung der Zellen.
Anhang
77
Antikörper Klontyp Spezifität Hersteller
α2 Integrin, IgG1 16B4 Maus anti
Mensch
Acris (Bad
Nauheim,
Deutschland)
α5 Integrin, IgG2b SAM-1 Maus anti
Mensch
Acris (Bad
Nauheim,
Deutschland)
α6 Integrin, IgG2b 4F10 Maus anti
Mensch
Acris (Bad
Nauheim,
Deutschland)
β1 Integrin, IgG1 4B7R Maus anti
Mensch
Acris (Bad
Nauheim,
Deutschland)
β3 Integrin, IgG1 PM6/13 Maus anti
Mensch
Acris (Bad
Nauheim,
Deutschland)
α3 Integrin, IgG1 ASC-1 Maus anti
Mensch
Chemicon
(Temicula, USA)
αV Integrin, IgG1 P3G8 Maus anti
Mensch
Chemicon
(Temicula, USA)
α6 Integrin, IgG2a NKI-GoH3 Ratte anti
Mensch
Chemicon
(Temicula, USA)
Tabelle 3. Verwendete Antikörper (s. 2.3)
Anhang
78
Standard-Einzelmessungen Mittelwert abweichung
1 2 3 x SDα 2
0 mJ/cm2 86,90 79,50 82,80 83,10 3,7110 mJ/cm2 45,80 31,50 42,30 39,87 7,4515 mJ/cm2 48,00 57,50 52,90 52,80 4,7520 mJ/cm2
46,70 51,90 39,10 49,30 3,68α 3
0 mJ/cm2 98,60 95,80 98,10 97,50 1,4910 mJ/cm2 92,10 81,20 90,40 87,90 5,8615 mJ/cm2 90,20 91,40 93,30 91,63 1,5620 mJ/cm2
95,20 92,60 92,70 93,50 1,47α 5
0 mJ/cm2 99,50 83,10 97,00 93,20 8,8410 mJ/cm2 90,20 82,40 74,80 82,47 7,7015 mJ/cm2 67,40 66,60 69,20 67,73 1,3320 mJ/cm2
73,60 70,20 56,60 66,80 9,00α 6
0 mJ/cm2 96,10 95,70 95,70 95,83 0,2310 mJ/cm2 84,20 84,80 86,20 85,10 1,0315 mJ/cm2 66,20 49,40 45,00 53,53 11,1920 mJ/cm2
71,20 57,00 60,60 62,93 7,38α V
0 mJ/cm2 85,50 78,50 82,30 82,10 3,5010 mJ/cm2 71,60 72,40 86,20 76,73 8,2115 mJ/cm2 23,50 45,90 33,00 34,13 11,2420 mJ/cm2
45,60 55,70 49,20 50,17 5,12β 3
0 mJ/cm2 33,20 33,00 33,10 0,1410 mJ/cm2 2,82 2,08 3,53 2,81 0,7315 mJ/cm2 8,52 13,30 13,40 11,74 2,7920 mJ/cm2
12,10 11,20 11,90 11,73 0,47
Tabelle 4. Durchflusszytometrische Messung der Expression von Integrinuntereinheitenauf unbestrahlten und UVB-bestrahlten Melanozyten, 24 h p.i., n = 3,[% der positiven Zellen]
Anhang
79
Laminin-1 Mittel Standard-Einzelmessungen wert abweichung
1 2 3 x SDα 2
unbestr. 97,60 97,40 69,40 88,13 16,2220 mJ/cm2 74,20 75,70 43,60 64,50 18,12
α 3unbestr. 90,80 93,80 92,30 92,30 1,50
20 mJ/cm2 70,90 71,60 71,30 71,27 0,35
β 1unbestr. 99,60 100,00 99,70 99,80 0,21
20 mJ/cm2 91,00 96,30 92,10 93,10 2,80
α6unbestr. 95,90 97,60 96,80 96,77 0,85
20 mJ/cm2 70,30 60,60 65,50 65,47 4,85
Fibronektin Mittel- Standard-Einzelmessungen wert abweichung
1 2 3 x SD
α 5unbestr. 93,20 96,90 86,20 92,10 5,43
20 mJ/cm2 65,20 56,20 82,70 68,00 13,48
α Vunbestr. 38,80 21,00 29,90 12,59
20 mJ/cm2 24,80 34,60 29,70 6,93
β 1unbestr. 99,90 100,00 99,80 99,90 0,10
20 mJ/cm2 97,70 97,10 99,40 98,10 1,19
β 3unbestr. 36,30 35,50 61,90 44,60 15,02
20 mJ/cm2 12,00 13,40 56,80 27,40 25,47
Kollagen IV Mittel- Standard-Einzelmessungen wert abweichung
1 2 3 x SD
α 2unbestr. 98,70 99,10 70,30 89,40 16,51
20 mJ/cm2 74,70 78,00 36,00 62,90 23,35β 1
unbestr. 99,80 97,10 99,30 98,80 1,4420 mJ/cm2 97,50 96,00 93,10 95,50 2,24
Tabelle 5. Einfluss unterschiedlicher extrazellulärer Matrixmoleküle auf dieExpression von Integrinuntereinheiten bei unbestrahlten und UVB-bestrahltenMelanozyten. Durchflusszytometr. Messung, 24 h p.i., n = 3, [% der positiven Zellen]
Die Ergebniss für α6-Integrin sind in Tabelle 6 gesondert dargestellt.
Anhang
80
Standard-Einzelmessungen Mittelwert abweichung
24 h 1 2 3 x SD
0 mJ/cm2 94,90 98,10 84,20 92,40 7,2810 mJ/cm2 78,60 72,70 73,30 74,87* 3,2520 mJ/cm2
55,60 43,60 56,40 51,87* 7,17
48 h 1 2 3 x SD
0 mJ/cm2 94,20 95,10 89,80 93,10 2,8410 mJ/cm2 86,40 89,60 87,20 87,73 1,6720 mJ/cm2
61,80 43,10 43,80 49,57* 10,60
72 h 1 2 3 x SD
0 mJ/cm2 94,60 87,60 86,40 89,53 4,4310 mJ/cm2 91,30 92,90 93,70 92,63 1,2220 mJ/cm2
76,70 77,20 67,40 73,77* 5,52
24 h (L) 1 2 3 x SD
0 mJ/cm2 95,90 97,60 96,80 96,77 0,8510 mJ/cm2 92,10 91,90 82,40 88,80* 5,5420 mJ/cm2
70,30 60,60 65,50 65,47* 4,85
48 h (L) 1 2 3 x SD
0 mJ/cm2 89,90 97,80 96,30 94,67 4,2010 mJ/cm2 95,60 94,00 94,50 94,70 0,8220 mJ/cm2
64,50 60,10 57,30 60,63* 3,63
72 h (L) 1 2 3 x SD
0 mJ/cm2 94,60 93,40 96,10 94,70 1,3510 mJ/cm2 94,50 94,00 91,10 93,20 1,8420 mJ/cm2
76,20 63,40 77,80 72,47* 7,89
Durchflusszytometr. Messung, 24 h p.i. [% der positiven Zellen]
* signifikant (p < 0,05) gegenüber unbestrahlten Melanozyten
Tabelle 6. Kinetik der α6-Integrin-Expression nach UVB-Bestrahlung undEffekt einer Laminin-1-Beschichtung (L)
Anhang
81
unbeschichtet Standard-Einzelmessungen Mittelwert abweichung
1 2 3 x SD
0 mJ/cm294,3 83,9 93,2 90,5 5,7
20 mJ/cm259,9 58,1 54,6 57,5 2,7
unbeschichtet + PDTC
1 2 3 x SD
0 mJ/cm295,6 85,2 90,3 90,4 5,2
20 mJ/cm252,1 45,6 47,5 48,4 3,3
Tabelle 7. Expression von α6-Integrin unter der Zugabe des RadikalfängersPDTC. Annexin V-Assay. Durchflusszytometrische Messung, 24 h p.i.
Anhang
82
Standard-
Einzelmessungen Mittelwert abweichung
1,5K 1 2 3 4 x SD
0 mJ/cm2
F1: 1,97 F2: 10,0 F3: 78,7 F4: 9,29
F1: 3,02 F2: 8,19 F3: 79,3 F4:9,53
F1: 7,87 F2: 8,68 F3: 81,4 F4: 2,05
F1: 4,29 F2: 8,96 F3: 79,0 F4: 9,41
F1: 3,15 F2: 0,94 F3: 0,42 F4: 0,17
10 mJ/cm2
F1: 1,74 F2: 7,68 F3: 83,1 F4: 7,51
F1: 2,26 F2: 8,67 F3: 82,1 F4: 6,99
F1: 2,00 F2: 8,18 F3: 82,6 F4: 7,25
F1: 0,37 F2: 0,70 F3: 0,71 F4: 0,37
20 mJ/cm2
F1: 2,08 F2: 17,1 F3: 61,5 F4: 19,3
F1: 4,94 F2: 16,5 F3: 62,7 F4: 15,8
F1: 3,41 F2: 6,57 F3: 81,7 F4: 8,30
F1: 3,48 F2: 13,4 F3: 68,6 F4: 14,5
F1: 1,43 F2: 5,91 F3: 11,3 F4: 5,62
1,5KKollagen 1 2 3 4 x SD
0 mJ/cm2
F1: 5,72 F2: 19,8 F3: 68,0 F4: 6,46
F1: 9,32 F2: 14,3 F3: 72,8 F4: 3,56
F1: 7,11 F2: 10,7 F3: 74,2 F4: 7,99
F1: 6,79 F2: 7,43 F3: 78,6 F4: 7,22
F1: 7,24 F2: 14,4 F3: 73,4 F4: 6,31
F1: 1,51 F2: 5,49 F3: 4,37 F4: 1,94
10 mJ/cm2
F1: 8,17 F2: 12,7 F3: 59,7 F4: 19,4
F1: 6,25 F2: 13,3 F3: 60,9 F4: 19,5
F1: 9,57 F2: 22,9 F3: 42,7 F4: 24,8
F1: 8,31 F2: 13,6 F3: 57,2 F4: 20,9
F1: 8,08 F2: 15,6 F3: 55,1* F4: 21,2*
F1: 1,37 F2: 4,86 F3: 8,43 F4: 2,53
20 mJ/cm2
F1: 16,9 F2: 14,5 F3: 42,5 F4: 26,1
F1: 7,99 F2: 25,5 F3: 38,8 F4: 27,7
F1: 12,3 F2: 27,6 F3: 34,6 F4: 25,2
F1: 14,1 F2: 14,0 F3: 43,8 F4: 28,2
F1: 12,8 F2: 20,4 F3: 39,9 F4: 26,8*
F1: 3,74 F2: 7,16 F3: 4,13 F4: 1,39
1,5KFibronektin 1 2 3 4 x SD
0 mJ/cm2
F1: 4,23 F2: 5,85 F3: 86,9 F4: 3,01
F1: 11,6 F2: 8,21 F3: 74,8 F3: 5,40
F1: 4,54 F2: 2,41 F3: 92,2 F4: 0,85
F1: 3,33 F2: 3,63 F3: 91,4 F4: 1,65
F1: 5,93 F2: 5,03 F3: 86,3 F4: 2,73
F1: 3,82 F2: 2,56 F3: 8,03 F4: 1,99
10 mJ/cm2
F1: 2,71 F2: 6,10 F3: 80,4 F4: 10,8
F1: 7,46 F2: 4,27 F3: 82,7 F4: 5,59
F1: 9,06 F2: 13,9 F3: 64,7 F4: 12,3
F1: 5,89 F2: 10,8 F3: 71,4 F4: 11,9
F1: 6,28 F2: 8,77 F3: 74,8 F4: 10,1*
F1: 2,71 F2: 4,39 F3: 8,31 F4: 3,10
20 mJ/cm2
F1: 15,2 F2: 30,9 F3: 36,0 F4: 17,9
F1: 13,8 F2: 21,6 F3: 47,8 F4: 16,7
F1: 11,8 F2: 30,9 F3: 44,8 F4: 12,6
F1: 14,9 F2: 32,7 F3: 40,0 F4: 12,4
F1: 13,9* F2: 29,0 F3: 42,2* F4: 14,9*
F1: 1,54 F2: 5,02 F3: 5,21 F4: 2,82
Tabelle 8. Einfluss unterschiedlicher Beschichtungen auf UVB-induzierte Apoptose bei kaukasischen und negroiden Melanozyten bzw. bei Keratinozyten.Annexin V-Assay. Durchflusszytometrische Messung, 24 h p.i.
* signifikant (p < 0,05) gegenüber jeweils kleinerer UVB-Dosis
Anhang
83
Mittel- Standard-
Einzelmessungen wert abweichung
2,5N 1 2 3 4 x SD
0 mJ/cm2
F1: 5,31 F2: 6,25 F3: 74,6 F4: 13,8
F1: 5,51 F2: 6,95 F3: 68,9 F4: 18,6
F1: 5,41 F2: 6,60 F3: 71,8 F4: 16,2
F1: 0,14 F2: 0,49 F3: 4,03 F4: 3,39
10 mJ/cm2
F1: 6,95 F2: 9,10 F3: 69,4 F4: 14,5
F1: 5,98 F2: 8,81 F3: 64,8 F4: 20,4
F1: 6,47 F2: 8,96 F3: 67,1 F4: 17,5
F1: 0,69 F2: 0,21 F3: 3,25 F4: 4,17
20 mJ/cm2
F1: 4,89 F2: 4,97 F3: 70,9 F4: 19,3
F1: 4,20 F2: 5,87 F3: 69,2 F4: 20,7
F1: 4,55 F2: 5,42 F3: 70,1 F4: 20,0
F1: 0,49 F2: 0,64 F3: 1,20 F4: 0,99
Keratino-zyten 1 2 3 4 x SD
0 mJ/cm2
F1: 0,98 F2: 15,7 F3: 66,2 F4: 17,1
F1: 1,80 F2: 15,3 F3: 67,9 F4:15,0
F1: 4,06 F2: 25,6 F3: 49,4 F4: 21,0
F1: 1,88 F2: 17,1 F3: 59,4 F4: 21,6
F1: 2,18 F2: 18,4 F3: 60,7 F4: 18,7
F1: 1,32 F2: 4,85 F3: 8,40 F4: 3,16
10 mJ/cm2
F1: 1,56 F2: 12,6 F3: 70,7 F4: 15,1
F1: 1,01 F2: 10,4 F3: 73,6 F4: 15,0
F1: 0,92 F2: 19,0 F3: 60,3 F4: 19,8
F1: 1,42 F2: 19,8 F3: 60,2 F4: 18,6
F1: 1,23 F2: 15,5 F3: 66,2 F4: 17,1
F1: 0,31 F2: 4,66 F3: 6,97 F4: 2,45
20 mJ/cm2
F1: 1,14 F2: 12,2 F3: 72,6 F4: 14,1
F1: 1,78 F2: 7,06 F3: 79,6 F3: 11,6
F1: 0,62 F2: 21,8 F3: 50,4 F4: 27,2
F1: 0,34 F2: 20,1 F3: 54,6 F4: 24,9
F1: 0,97 F2: 15,3 F3: 64,3 F4: 19,5
F1: 0,63 F2: 6,90 F3: 14,0 F4: 7,75
Tabelle 8 (Fortsetzung)F1: nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv)F2: spät apoptotisch / früh nekrotisch (Annexin V positiv, PI positiv)F3: vital (Annexin V negativ, PI negativ)F4: früh apoptotisch (Annexin V positiv, PI negativ)
1,5K = Melanozyten eines hellhäutigen Kaukasiers (Alter: 1,5 a)2,5N = Melanozyten eines dunkelhäutigen Negroiden (Alter: 2,5 a)
Die Ergebnisse für die Laminin-1-Beschichtung sind in Tabelle 9 (1,5K Laminin,20 µg/ml) gesondert dargestellt.
Anhang
84
Mittel- Standard-Einzelmessungen wert abweichung
1,5K 1 2 3 x SD
0 mJ/cm2
F1: 6,05 F2: 2,12 F3: 90,0 F4: 1,81
F1: 7,55 F2: 2,47 F3: 87,9 F4: 2,06
F1: 5,60 F2: 1,13 F3: 91,8 F4: 1,51
F1: 6,40 F2: 1,91 F3: 89,9 F4: 1,79
F1: 1,02 F2: 0,70 F3: 1,95 F4: 0,28
10 mJ/cm2
F1: 6,97 F2: 6,65 F3: 79,1 F4: 7,28
F1: 3,87 F2: 4,82 F3: 86,5 F4: 4,77
F1: 6,54 F2: 4,15 F3: 86,6 F4: 2,67
F1: 5,79 F2: 5,21 F3: 84,1 F4: 4,91
F1: 1,68 F2: 1,29 F3: 4,30 F4: 2,31
15 mJ/cm2
F1: 10,2 F2: 14,6 F3: 60,0 F4: 15,2
F1: 5,22 F2: 12,3 F3: 70,8 F4: 11,6
F1: 6,56 F2: 13,6 F3: 68,6 F4: 11,2
F1: 7,33 F2: 13,5 F3: 66,5 F4: 12,7
F1: 2,58 F2: 1,15 F3: 5,71 F4: 2,20
20 mJ/cm2
F1: 6,89 F2: 14,6 F3: 69,3 F4: 9,21
F1: 7,80 F2: 15,3 F3: 64,3 F4: 12,6
F1: 5,91 F2: 11,4 F3: 75,4 F4: 7,35
F1: 6,87 F2: 13,8 F3: 69,7 F4: 9,72
F1: 0,95 F2: 2,08 F3: 5,56 F4: 2,66
1,5K; Laminin (2
µg/ml) 1 2 3 x SD
0 mJ/cm2
F1: 3,39 F2: 2,26 F3: 91,4 F4: 2,93
F1: 4,08 F2: 2,15 F3: 91,7 F4: 2,05
F1: 5,05 F2: 1,86 F3: 91,2 F4: 1,87
F1: 4,17 F2: 2,09 F3: 91,4 F4: 2,28
F1: 0,83 F2: 0,21 F3: 0,25 F4: 0,57
10 mJ/cm2
F1: 1,94 F2: 4,27 F3: 90,0 F4: 3,81
F1: 2,81 F2: 4,65 F3: 88,9 F4: 3,68
F1: 2,85 F2: 4,75 F3: 88,8 F4: 3,58
F1: 2,53 F2: 4,56 F3: 89,2 F4: 3,69
F1: 0,51 F2: 0,25 F3: 0,67 F4: 0,12
15 mJ/cm2
F1: 8,82 F2: 14,9 F3: 63,5 F4: 12,8
F1: 6,74 F2: 13,2 F3: 70,3 F4: 9,79
F1: 4,92 F2: 9,42 F3: 78,4 F4: 7,31
F1: 6,83 F2: 12,5 F3: 70,7 F4: 9,97
F1: 1,95 F2: 2,81 F3: 7,46 F4: 2,75
20 mJ/cm2
F1: 8,39 F2: 9,44 F3: 76,8 F4: 5,40
F1: 8,36 F2: 13,2 F3: 70,5 F4: 7,87
F1: 6,59 F2: 14,7 F3: 68,5 F4: 10,2
F1: 7,78 F2: 12,4 F3: 71,9 F4: 7,82
F1: 1,03 F2: 2,71 F3: 4,33 F4: 2,40
Tabelle 9. Einfluss der Laminin-1-Beschichtung in unterschiedlicher Konzentrationauf UVB-induzierte Apoptose. Durchflusszytometr. Messung, 24 h p.i.
Anhang
85
Mittel- Standard- Einzelmessungen wert abweichung
1,5K; Laminin
(20 µg/ml) 1 2 3 x SD
0 mJ/cm²
F1: 4,47 F2: 2,01 F3: 91,1 F4: 2,42
F1: 4,45 F2: 1,40 F3: 91,6 F4: 2,51
F1: 6,62 F2: 0,84 F3: 90,2 F4: 2,39
F1: 5,18 F2: 1,42 F3: 91,0 F4: 2,44
F1: 1,25 F2: 0,59 F3: 0,71 F4: 0,06
10 mJ/cm²
F1: 3,94 F2: 4,99 F3: 86,3 F4: 4,75
F1: 4,12 F2: 4,94 F3: 85,5 F3: 5,42
F1: 4,53 F2: 5,16 F3: 84,5 F4: 5,79
F1: 4,20 F2: 5,03 F3: 85,4 F4: 5,32
F1: 0,30 F2: 0,11 F3: 0,90 F4: 0,53
15 mJ/cm²
F1: 7,64 F2: 12,7 F3: 69,0 F4: 10,7
F1: 5,48 F2: 14,2 F3: 69,8 F4: 10,6
F1: 5,83 F2: 11,5 F3: 73,6 F4: 9,06
F1: 6,32 F2: 12,8 F3: 70,8 F4: 10,1
F1: 1,16 F2: 1,35 F3: 2,46 F4: 0,92
20 mJ/cm²
F1: 6,20 F2: 13,5 F3: 71,0 F4: 9,32
F1: 6,07 F2: 14,4 F3: 69,1 F4: 10,4
F1: 5,85 F2: 14,8 F3: 68,0 F4: 11,3
F1: 6,04 F2: 14,2 F3: 69,4 F4: 10,3
F1: 0,18 F2: 0,67 F3: 1,52 F4: 1,00
Tabelle 9 (Fortsetzung) F1: nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv) F2: spät apoptotisch /früh nekrotisch (Annexin V positiv, PI positiv) F3: vital (Annexin V negativ, PInegativ) F4: früh apoptotisch (Annexin V positiv, PI negativ)
1,5 K = Melanozyten eines hellhäutigen Kaukasiers (Alter: 1,5a) 2,5 N = Melanozyten eines dunkelhäutigen Negroiden (Alter: 2,5a)
Anhang
86
Laminin Mittel- Standard-
Einzelmessungen wert abweichung
1 2 3 4 5 x SD
0 mJ/cm2
F1: 6,97 F2: 5,07 F3: 82,8 F4: 5,14
F1: 8,09 F2: 6,68 F3: 80,0 F4: 5,21
F1: 7,89 F2: 3,87 F3: 83,5 F4: 4,74
F1: 9,88 F2: 4,50 F3: 80,5 F4: 5,11
F1: 10,3 F2: 2,50 F3: 85,3 F4: 1,93
F1: 8,63 F2: 4,52 F3: 82,4 F4: 5,05
F1: 1,41 F2: 1,54 F3: 2,19 F4: 1,41
10
mJ/cm2
F1: 5,07 F2: 7,75 F3: 83,7 F4: 3,47
F1: 3,60 F2: 8,50 F3: 84,0 F4: 3,93
F1: 3,67 F2: 8,10 F3: 84,6 F4: 3,63
F1: 4,48 F2: 8,11 F3: 83,1 F4: 4,33
F1: 3,22 F2: 9,05 F3: 82,3 F4: 5,44
F1: 4,22² F2: 8,30² F3: 83,5² F4: 4,16
F1: 1,09 F2: 0,50 F3: 0,88 F4: 0,79
20
mJ/cm2
F1: 3,30 F2: 8,87 F3: 84,4 F4: 3,46
F1: 3,41 F2: 9,82 F3: 80,6 F4: 6,12
F1: 2,98 F2: 13,3 F3: 77,8 F4: 5,92
F1: 3,49 F2: 13,5 F3: 77,8 F4: 5,22
F1: 3,30² F2: 11,4 F3: 80,2 F4: 5,18
F1: 0,22 F2: 2,37 F3: 3,13 F4: 1,21
Laminin + GOH31 2 3 4 5 x SD
0 mJ/cm2
F1: 6,35 F2: 3,90 F3: 86,5 F4: 3,29
F1: 8,08 F2: 3,62 F3: 84,6 F4: 3,68
F1: 10,2 F2: 4,76 F3: 81,0 F4: 4,04
F1: 9,62 F2: 4,75 F3: 81,6 F4: 4,04
F1: 10,7 F2: 4,68 F3: 81,1 F4: 3,57
F1: 8,99 F2: 4,34 F3: 83,0 F4: 3,72
F1: 1,77 F2: 0,54 F3: 2,47 F4: 0,32
10
mJ/cm2
F1: 5,27 F2: 17,8 F3: 69,3 F4: 7,61
F1: 6,88 F2: 19,7 F3: 64,8 F4: 8,64
F1: 6,53 F2: 15,7 F3: 71,4 F4: 6,38
F1: 5,54 F2: 17,6 F3: 68,5 F4: 8,30
F1: 5,62 F2: 17,7 F3: 69,0 F4: 7,67
F1: 5,97¹ F2: 17,7¹ F3: 68,6¹ F4: 7,72¹
F1: 0,70 F2: 1,42 F3: 2,39 F4: 0,87
20
mJ/cm2
F1: 4,60 F2: 16,6 F3: 71,1 F4: 7,66
F1: 5,05 F2: 14,6 F3: 72,9 F4: 7,40
F1: 4,76 F2: 14,8 F3: 72,9 F4: 7,53
F1: 4,32 F2: 14,7 F3: 72,5 F4: 8,45
F1: 5,26 F2: 13,8 F3: 73,2 F4: 7,72
F1: 4,80¹ F2: 14,9¹ F3: 72,5¹ F4: 7,75¹
F1: 0,37 F2: 1,03 F3: 0,83 F4: 0,41
unbeschichtet1 2 3 4 x SD
0 mJ/cm2
F1: 6,04 F2: 5,98 F3: 83,6 F4: 4,37
F1: 7,55 F2: 4,68 F3: 83,7 F4: 4,08
F1: 8,65 F2: 4,65 F3: 83,5 F4: 3,24
F1: 7,41 F2: 5,10 F3: 83,6 F4: 3,90
F1: 1,31 F2: 0,76 F3: 0,10 F4: 0,59
10
mJ/cm2
F1: 4,95 F2: 13,6 F3: 76,4 F4: 5,07
F1: 6,85 F2: 14,1 F3: 73,1 F4: 5,88
F1: 4,21 F2: 11,8 F3: 78,6 F4: 5,37
F1: 5,81 F2: 11,7 F3: 78,0 F4: 4,55
F1: 5,34 F2: 12,8 F3: 76,5 F4: 5,22
F1: 1,36 F2: 1,23 F3: 2,46 F4: 0,56
20
mJ/cm2
F1: 5,47 F2: 9,47 F3: 80,1 F4: 4,91
F1: 7,07 F2: 12,5 F3: 75,1 F4: 5,26
F1: 5,83 F2: 9,64 F3: 79,5 F4: 5,04
F1: 5,18 F2: 8,94 F3: 81,2 F4: 4,66
F1: 5,89 F2: 10,1 F3: 79,0 F4: 4,97
F1: 0,83 F2: 1,60 F3: 2,68 F4: 0,25
Tabelle 10. Einfluss von Laminin-1-Beschichtung bzw. α6-Integrin-blockier. Antikörper auf dieUVB-ind. Apoptose. Annexin V-Assay, durchflusszytom. Messung [% d. pos. Zellen], 24 h p.i.F1: nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv)F2: spät apoptotisch / früh nekrotisch (Annexin V positiv, PI positiv)F3: vital (Annexin V negativ, PI negativ) F4: früh apoptotisch (Annexin V positiv, PI negativ)
¹ signifikant (p < 0,05) gegenüber Laminin-1 kultivierte Melanozyten² signifikant (p < 0,05) gegenüber ohne Beschichtung kultivierte Melanozyten
Anhang
87
Laminin Mittel- Standard-Einzelmessungen wert abweichung
1 2 3 x SD
0 mJ/cm2
F1: 4,72 F2: 3,12 F3: 89,0 F4: 3,16
F1: 5,74 F2: 1,83 F3: 90,4 F4: 2,06
F1: 8,49 F2: 1,55 F3: 87,9 F4: 2,06
F1: 6,31 F2: 2,17 F3: 89,1 F4: 2,43
F1: 1,95 F2: 0,84 F3: 1,25 F4: 0,64
10 mJ/cm2
F1: 9,04 F2: 29,1 F3: 36,7 F4: 25,2
F1: 5,94 F2: 37,1 F3: 36,2 F4: 20,7
F1: 7,77 F2: 25,3 F3: 41,0 F4: 26,0
F1: 7,58 F2: 30,5 F3: 34,2 F4: 24,0
F1: 1,56 F2: 6,02 F3: 5,83 F4: 2,86
20 mJ/cm2
F1: 3,56 F2: 34,5 F3: 44,4 F4: 17,6
F1: 4,11 F2: 29,6 F3: 46,6 F4: 19,7
F1: 3,55 F2: 26,8 F3: 51,8 F4: 17,8
F1: 3,74 F2: 30,3 F3: 47,6 F4: 18,4
F1: 0,32 F2: 3,90 F3: 3,80 F4: 1,16
Laminin+ GOH31 2 3 x SD
0 mJ/cm2
F1: 7,38 F2: 2,87 F3: 87,0 F4: 2,77
F1: 5,18 F2: 1,19 F3: 90,5 F4: 3,11
F1: 8,62 F2: 2,18 F3: 86,0 F4: 3,26
F1: 7,06 F2: 2,08 F3: 87,8 F4: 3,05
F1: 1,74 F2: 0,84 F3: 2,36 F4: 0,25
10 mJ/cm2
F1: 4,78 F2: 33,8 F3: 37,0 F4: 24,5
F1: 5,72 F2: 35,5 F3: 35,9 F4: 23,1
F1: 4,31 F2: 31,3 F3: 39,1 F4: 25,3
F1: 4,93 F2: 33,5 F3: 37,3 F4: 24,3
F1: 0,72 F2: 2,11 F3: 1,63 F4: 1,11
20 mJ/cm2
F1: 6,79 F2: 37,1 F3: 36,8 F4: 19,4
F1: 7,56 F2: 40,1 F3: 33,0 F4: 19,4
F1: 6,61 F2: 35,4 F3: 39,8 F4: 18,2
F1: 6,99 F2: 37,5 F3: 36,5 F4: 19,0
F1: 0,50 F2: 2,38 F3: 3,41 F4: 0,69
unbeschichtet1 2 3 x SD
0 mJ/cm2
F1: 8,59 F2: 4,23 F3: 84,3 F4: 2,89
F1: 13,1 F2: 2,45 F3: 82,6 F4: 1,87
F1: 10,9 F2: 1,90 F3: 85,3 F4: 1,87
F1: 10,9 F2: 2,86 F3: 84,1 F4: 2,21
F1: 2,26 F2: 1,22 F3: 1,37 F4: 0,59
10 mJ/cm2
F1: 7,18 F2: 28,6 F3: 49,4 F4: 14,8
F1: 12,8 F2: 32,0 F3: 37,8 F4: 17,4
F1: 11,7 F2: 28,6 F3: 42,1 F4: 17,6
F1: 10,6 F2: 29,7 F3: 43,1 F4: 16,6
F1: 2,98 F2: 1,96 F3: 5,86 F4: 1,56
20 mJ/cm2
F1: 10,3 F2: 33,3 F3: 41,8 F4: 14,5
F1: 11,3 F2: 39,7 F3: 31,8 F4: 17,3
F1: 11,2 F2: 36,4 F3: 35,9 F4: 16,5
F1: 10,9 F2: 36,5 F3: 36,5 F4: 16,1
F1: 0,55 F2: 3,20 F3: 5,03 F4: 1,44
Tabelle 11. Einfluss von Laminin-1-Beschichtung bzw. α6-Integrin-blockierendem Antikörper auf die UVB-ind. Apoptose. Annexin V-Assay, durchflusszytometr. Messung [% d. pos. Zellen], 48 h p.i.F1: nekrotische Zellen (Annexin V negativ, PI positiv)F2: spät apoptotisch / früh nekrotisch (Annexin V positiv, PI positiv)F3: vital (Annexin V negativ, PI negativ)F4: früh apoptotisch (Annexin V positiv, PI negativ)
Erklärung
88
8 Erklärung
Die vorliegende Arbeit wurde in der Klinik für Dermatologie, Allergologie und
Venerologie der Universität zu Lübeck unter Anleitung von PD Dr.med. Sven Krengel
durchgeführt. Ich habe die vorliegende Dissertation selbständig und ohne fremde Hilfe
angefertigt, keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel
verwendet und wörtlich oder inhaltlich entnommene Zitate aus den benutzten Werken
als solche kenntlich gemacht.
Ich versichere außerdem, nicht vorher oder gleichzeitig andernorts einen
Zulassungsantrag gestellt zu haben und habe mich zuvor keinem anderen
Promotionsverfahren unterzogen. Die Arbeit wurde keiner anderen Promotionsbehörde
im In- oder Ausland vorgelegt.
Lübeck, April 2007 Christian Geuchen
Danksagung
89
9 Danksagung
Ich bedanke mich herzlichst bei PD Dr. Sven Krengel für die Überlassung dieses
Themas, welches mir ermöglichte, experimentell tätig zu werden. Er unterstützte mich
über die ganze Promotionsabeit hinweg und erschloss mir stets neue, mir noch
verborgen gebliebene Sichtweisen.
Mein weiterer Dank gelten Herrn PD Peter Schlenke sowie Herrn Prof. Andreas
Gebert, die mir die notwendigen Gerätschaften zum erfolgreichen Durchführen meiner
Experimente zur Verfügung stellten.
Große Dankbarkeit gilt meinen Eltern, die mich während des Studiums und der
Promotionsarbeit fortwährend motivierten und finanziell unterstützten.
Ich bedanke mich auch bei Dorothea, die mich seit Beginn des Praktischen Jahres
immer wieder dazu animierte, den Abschluss der Doktorarbeit nicht aus den Augen zu
verlieren.
Lebenslauf
90
10 Lebenslauf
Persönliche Informationen
Name: Christian Geuchen
Geburtstag: 27.02.1980
Geburtsort: Bocholt
Familienstand: ledig
Eltern: Dr.med.Heinrich Geuchen,
Gisela Geuchen, geb. Kozok
Wohnhaft: Ratzeburger Allee 88 G, 23562
Lübeck
Tel.: 0451-7074302
E-Mail: [email protected]
1986 – 1990 Grundschule
1990 – 1999 Wittekind-Gymnasium Lübbecke/NRW
14.06.1999 Abitur am Wittekind-Gymnasium Lübbecke/NRW
September 1999 – Juli 2000 Wehrdienst
2000 - 2006 Studium der Humanmedizin
2000 – 2002 Vorklinisches Studium an der Universität des Saarlandes (Homburg/Saar)
Lebenslauf
91
2002 Ärztliche Vorprüfung
2002 – 2006 Klinisches Studium an der Universität Schleswig-Holstein (Campus Lübeck)
2003 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2005 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Oktober 2005 – September 2006 Praktisches Jahr
01.November 2006 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Ab 02.01.2007 Assistenzarzt Innere Medizin
DRK KH Ratzeburg
September 2003 – April 2007: Experimentelle Promotionsarbeit zum Thema „Einfluss
von ultraviolettem Licht und extrazellulärer Matrix auf Pigmentzellhomöostase und
Expression melanozytärer Adhäsionsmoleküle“
Publikation: S. Krengel, I. Stark, C. Geuchen, B. Knoppe, G. Scheel, P. Schlenke, A.
Gebert, L. Wünsch, J. Brinckmann, M. Tronnier: Selective downregulation of the α6-
integrin-subunit in melanocytes by UVB-light. Exp Dermatol 14, 411-419 (2005)
Lübeck, im April 2007