Ejercicio en Mapas de Restricción

Laboratorio 5Biol 3030 –Laboratorio Biología del Desarrollo

JACarde, PhD

Objetivos

• Introducción de principios básicos de mapas de restricción

• Discusión teórica de como preparar mapas de restricción

• Uso de simulaciones y bioinformática para preparar un mapa de restricción asignado.

Plásmidos

• Son moleculas pequeñas de DNA, de configuración circular, extracromosomales

• Por lo general encontrados en organismos simples como E coli, algas y levaduras.

• Pueden variar en tamaños: pocos miles ha varios cientos de miles de pb

• Se replican usando su propio origen de replicación y sus proteínas, y pueden transferirse a otras células por conjugación.

Plásmidos• Comunmente contienen genes que

codifican para resistencia a uno o mas antibióticos, asi confieren resistencia a sus hospederos, de ahí su importancia clínica.

• Usados por biólogos moleculares como vectores que contienen fragmentos de DNA ajenos ligados, insertados o clonados en ellos.

• Finalmente, pueden ser aislados independientes del genoma bacteriano por su tamaño.

Plásmidos• Un mapa de plásmido incluye

información básica sobre:• 1) el tamaño• 2) los genes presentes• 3) el origen de replicación • 4) los lugares de restricción

para enzimas.

• La molécula es circular, asi que hay un 0 arbitrario y todos los lugares de restricción son indicados con un número entre 0 y el total de pb en el plásmido.

Plásmidos• Los tamaños de los fragmentos se

calculan restando o sumando los puntos en el plásmido.

• El nombre del plásmido y su tamaño aparece en el centro del circulo.

• El origen de replicación aparece marcado como Ori, el gen para beta-lactamasa (enzimas que confiere la resistencia contra ampicilina) y la localización para el DNA de bacteriófago lambda son mostradas

Enzimas de restricción

• También conocidas como endonucleasas de restricción

• Reconocen secuencias específicas de bases en el DNA DS y las cortan en lugares específicos en ambas hebras

• Hidrolizan el enlaces fosfodiester en cada hebra• Reconocen secuencias de 4- 8 pb• Son secuencias palindrómicas• Leen los mismo en ambas hebras en la misma

dirección 53

Enzimas de restricción

• Las flechas indican los puntos donde se rompe el enlace fosfodiesterico

• Una vez el esqueleto azucar-fosfato es roto los enlaces de H no son suficiente para mantener la doble hebra y se separan.

Ingeniería Genética

• Una importante aplicación de las enzimas y los plasmidos es la clonación.

• El DNA de organismos distintos se puede manipular cortándolo con enzimas

• Fragmentos de organismos distintos cortados con la misma enzima se pueden unir o ligar

• Gen quimérico o clono• Introducirse en otro organismo y expresarse

Sticky and Blunt

Ends; 2 enzymes

Sticky ends, one enzyme

Sticky ends, one enzymeTransformati

onCulture

Antibiotic

Mapas de Restricción

• Poderosa técnica de biología molecular para analizar moléculas de DNA usando enzimas de restricción

• 1979 Nathans, Smith y Arber ganan Nobel por descubrirlas y aplicarlas de forma creativa a los mapas de genes.

- Figura 1 muestra el DNA de lambda digerido con la enzima PstI para producir fragmentos de DNA de tamaños conocidos.- Se usan esos tamaños conocidos de fragmentos de DNA para estimar los tamaños de los fragmentos desconocidos - Luego sume los tamaños de los fragmentos individuales de cada digestion para determinar el tamaño original del DNA sin cortar. - Luego determine el numero de veces que cada enzima corta el DNA y la distancias entre los cortes.- Finalmente determine donde ubican los sitios de corte, relativos unos a otros.

Paso para la construcción de un mapa de restricción

• El DNA desconocido fue sometido a 4 distintas digestiones (Fig 1).

• Tres enzimas de restricción se usaron: HpaI, PstI, and SspI.

• Muestras de nuestro DNA se incubaron con HpaI sola, Hpa1 y PstI, Hpa1 y SspI o HpaI, PstI y SspI

• La digestiones simples ayudan a deducir el número de lugares para cortes presentes en la molecula.

• Las digestiones doble y triples permiten ubicar los sitios de cortes unos relativos a otros.

Paso a Paso• 1. Estimar los tamaños de los fragmentos de DNA en

pb al compararlos con los fragmentos rotulados del marcador (la digestián de DNA lambda con PstI) No tienen que ser tamaños exactos. Determinar tamaños de fragmentos pequeños es mas preciso que para tamaños grandes.

• 2. Determinar el tamaño total del DNA digerido sumando los tamaños de los fragmentos de cada digestión. Usar los tamaños de las cuatro digestiones. Recuerde que el mismo DNA fue digerido en cada muestra, así que los fragmentos de cada digestión deben sumar lo mismo.

Paso a Paso• 3.Hay dos sitios para HpaI presentes.

Basándose en el número de fragmentos obtenidos de la digestión con HpaI, es este DNA linear o circular. Dibuje la molécula con los lugares para HpaI ilustrados

• 4.Cuantos lugares para PstI hay presentes?

• 5.Donde se encuentra el lugar para PstI. Dibuja la posición del sitio PstI en el plásmido, relativo a los sitios para HpaI. Recuerda que el plásmido es una molécula de DNA pequeña y circular.

• 6.Cuantos lugares hay para SspI?• 7.Donde esta localizado el lugar para SspI. Dibuje la

posicón del sito para SspI, relativo a los de HpaI en el plásmido. Lo mejor es hacerlo en un dibujo separado al de PstI, porque no sabemos cual relacion hay entre ellos.

• 8.Permanece el fragmento de 600 de HpaI sin cambios luego de digestión con PstI o SspI. (Figura 1).

• 9. Cuales fragmentos no cambian de la digestión con HpaI/PstI a la HpaI/PstI/SspI? Cuales fragmentos desaparecen? Porque desaparecen estos fragmentos?

• 10. Cuales fragmentos no cambian de la digestión con HpaI/SspI a la HpaI/PstI/SspI? Cuales fragmentos desaparecen? Porque desaparecen estos fragmentos?

• 11. Hay un fragmento que sólo aparece en la digestión con HpaI/PstI/SspI? Que significa esto?

• 12. Dibuja el mapa del plásmido completo, con todos los lugares para las enzimas presentes en sus posiciones relativas.