EKSPRESI GEN 3

Ani Retno PrijantiFKUI2010

Regulasi Ekspresi Gen

Ekspresi gen, adl produksi suatu produk RNA dari suatu gen tertentu yg dikontrol oleh mekanisme yg kompleks.

Secara normal hanya sebagian tertentu DNA dalam suatu sel akan diekspresikan pada suatu waktu.

Ekspresi gen diregulasi secara berbeda antara prokariot dan eukariot.

Regulasi ekpresi gen pada prokariot.Pd prokariot ekspresi gen diregulasi terutama

dgn mengontrol inisiasi transkripsi gen.

Suatu set yg terdiri atas gen-gen yg disusun dalam suatu operon dan tiap operon dikendalikan oleh satu promotor (regulatory region).

Protein regulator yg disebut represor dapat terikat pada promotor dan menghambat pengikatan RNA polimerase = kontrol negatif

Sedangkan protein aktivator memfasilitasi pengikatan RNA polimerase = kontrol positif.

Represor dikendalikan oleh nutrien atau metabolitnya yg disebut inducer atau corepressor.

Regulasi dapat juga terjadi melalui atenuasi transkripsi.

Regulasi sintesis protein pada eukariot.

Eukariot lebih kompleks drpd prokariot.Sebagai contoh embrio manusia berkembang

s/d organisme multiseluler, berbagai set gen diaktifkan dan berbagai grup protein diproduksi, menghasilkan diferensiasi tipe sel yg morfologinya berbeda dan memperlihatkan fungsi yand berbeda pula.

Bahkan pada umur diatas usia reproduktif, sel tertentu masih berdiferensiasi contohnya:Sel yg memproduksi antibodi dalam merespon terhadap suatu infeksi.

Produksi sel darah merah baru.Penggantian sel epitel saluran pencernaan baru terhadap sel tua yg dilepaskan.

Semua proses perubahan fisiologis ini diatur/diregulasi secara kompleks dalam ekspresi gennya (terjadi pada level DNA).

Aktivasi gen memerlukan perubahan dlm state kromatin (chromatin remodeling) yg difasilitasi oleh asetilasi histon dan metilasi basa-basanya. Perubahan pd DNA menentukan gen mana yg dapat ditranskripsi.

DNA eukariot akan diorganisasi ke dalam bentuk nukleosom kromatin dan gen-gen harus dlm keadaan struktur aktif utk diekspresikan dlm sel.

Operon tidak terdapat dalam DNA eukariot. Gen-gen utk protein-protein yg fungsinya

bekerja bersama terletak dalam kromosom yg berbeda. Karena itu tiap gen membutuhkan promotor masing-masing.

Selain itu proses-proses transkripsi dan translasi:

1. Terjadi di ruang-ruang yg terpisah (kompartemen: nukleus, sitosol, retikulum endoplasmik) di sel eukariot.

2. Berbeda waktu berlangsungnya: hnRNA eukariot harus diproses dulu dan dikeluarkan dari nukleus sebelum ditranslasi .

Regulasi ekspresi gen terjadi pada multiple level:

DNA dan kromosom termasuk chromosome remodeling dan gene rearrangement.

Transkripsi, melalui faktor transkripsi yg berikatan dg RNA polimerase.

Proses transkripsi Inisiasi translasi dan stabilitas mRNA

Agar gen dapat diekspresikan: Chromatin remodeling Metilasi DNA Gene rearrangement Gen amplificatio/Deletion

Regulasi pada level transkripsi:Dengan cara mengontrol penyusunan basal

transcription complex yg mengandung RNA polimerase dan TATA box dari promotor.

Faktor transkripsi akan dapat terikat upstream pada berbagai tempat di region promotor. Faktor ini akan meningkatkan frekuensi transkripsi dan diperlukan agar promotor berfungsi pd level yg adequate.

Region control gen juga mengandung gene-spesific transcription factor (transactivator/ activator) yg dpt berinteraksi dg protein mediator (coactivator), dapat meningkatkan transkripsi s/d 1000 x atau lebih.

Dg cara membentuk loop dlm DNA, coactivator berinteraksi dg basal transcription complex dan mengaktifkan pengikatan pd initiation site dlm promotor.

DNA regulatory sequences dapat terletak jauh dr promotor, bisa upstream ataupun downstream dari initiation site.

Proses Post transkripsi RNA.Terjadi setelah hnRNA dibentuk, kemudian

akan dibuat mRNA mature. Alternative splicing dan polyadenilation

site RNA editing.

Regulasi Translasi dan Stabilitas mRNA.Biasanya melibatkan faktor eIFs (eukaryotic

initiation factors) dg mekanisme fosforilasi.

Transpor dan stabilitas mRNAStabilitas mRNA berperan dl regulasi ekspresi

gen, sebab mRNA yg half life-nya panjang dpt menghasilkan jumlah lebih besar protein dimaksud.

mRNA eukariot relatif stabil (jam s/d hari).mRNA dapat didegradasi oleh nuklease dlm

nukleus dan sitoplasma sebelum ditranslasikan.

Untuk mencegah degradasi selama transport dr nukleus ke sitoplasma, mRNA terikat pada protein yg membantu mencegah degradasi mRNA.

Sekuen ujung juga membantu mencegah degradasi yaitu poli A. Poly A tail ini memendek selama proses transpot

Penggunaan Tehnik DNA Rekombinan dlm kedokteran.

Aplikasi klinis:Polimorfisme: Variasi sekuens DNA utk suatu

gen, yg diwariskan, banyak tdp di populasi.Banyak perubahan sekuens DNA

dihubungkan dgn penyakit.Uji variasi DNA lebih sensitif utk mendeteksi

polimorfisme drpd tehnik lain (enzyme assay) dan memungkinkan diketahui sejak dini dan karena itu lebih awal terapi dpt diberikan.

Uji ini juga dpt mengidentifikasi penyakit keturunan shg dapat dilakukan konseling yg tepat

DNA finger printing: analisis perbedanaan sekuens DNA dapat digunakan utk:

menentukan adanya hubungan keluarga antar individu

dapat juga digunakan utk menetapkan tersangka dlm kasus kriminal.

DNA rekombinan: suatu tehnik biologi molekuler yg dapat digunakan dlm pencegahan dan terapi penyakit.

Saat ini tehnik DNA rekombinan bermanfaat bagi manusia utk: terapi diabetes melitus (insulin), hemofilia (faktor VIII), vaksin hepatitis.

Terapi gen masih dalam tahap penelitian.

Utk memastikan normal atau patologis variasi genetik, DNA harus diisolasi dari sumber sel, jumlahnya cukup.

Tehnik isolasi dan amplifikasi gen serta manipulasinya dapat digunakan enzim-enzim restriksi, cloning vector, polymerase chain reaction/PCR gel electrophoresis, blotting dlm nitrocellulose paper persiapan probe yg dpt hibridisasi dg

target sekuens DNA

Terapi gen, meliputi isolasi gen normal dan diinsersikan ke dlm sel yg sakit sehingga gen normal dapat diekspresikan, memungkinkan sel yg sakit kembali normal.

Tehnik DNA Rekombinan.

Adl tehnik utk menggabungkan sekuens DNA ke suatu kombinasi baru, tehnik ini diciptakan utk eksplorasi dan manipulasi gen, dan sekarang dpt digunakan utk identifikasi defective gene yg berhubungan dg penyakit.

1. Isolasi fragmen DNA dan memperbanyak/ kopi gen.Meliputi: Restriction fragments Produksi DNA oleh reverse

transcriptase Sintesis kimia DNA

2. Tehnik Identifikasi sekuens DNA.Meliputi: Probe Gel electrophoresis Deteksi sekuens DNA spesifik DNA sequencing.

3. Tehnik amplifikasi sekuen DNA.Digunakan utk memperbanyak jumlah DNA yg telah diisolasi sebab utk suatu studi DNA dibutuhkan sejumlah DNA yg cukup banyak, sementara hasil isolasi DNA dari sumber sel hanya sedikit sekali.Jenis tehnik: Cloning DNA Polymerase chain reaction

Enzim endonuklease restriksi dapat memotong segmen DNA dari genom beragam sel atau fragmen DNA dr sumber lain.

Enzim ini mengenali secara spesifik sekuens pendek biasanya 4 – 6 pasang basa dan memotong ikatan fosfodiester dikedua rantai DNA dalam sekuen. Enzim ini hanya memotong sekuens tertentu (palindrom) dimana kedua DNA mengandung sekuens yg sama bila dibaca dari arah 5’ ke 3’ dgn hasil potongannya sticky end.

G A A T T CC T T A A G

Ada jenis tumpul/ blunt hasil potongan enzimnya.

Beratus enzim restriksi ini dgn berbagai spesifikasi telah dapat diisolasi.

Contoh:Enzim restriksi Sumber Cleavage

Site

AluI Arthrobacter A G C Tluteus T C G A

EcoRI Escherecia coli G A A T T CRY13 C T T A A G