Bol. San. Veg. Plagas, 29: 593-612, 2003

El chancro de encinas y alcornoques causado por Botryosphaeriaspp. en Andalucía

M.E. SÁNCHEZ, J. VENEGAS, M.A. ROMERO, A.J.L. PHILLIPS, A. TRAPERO

Phytophthora cinnamomi está considerada como el principal agente asociado con eldecaimiento de Quercus en Andalucía. Sin embargo, frecuentemente aparecen chancrosen los árboles que sufren el decaimiento en esta región. En las prospecciones llevadas acabo en Andalucía en zonas afectadas de decaimiento, se detectó la presencia de áreasalargadas de corteza necrosada en las ramas enfermas. De estas lesiones se aislaron con-sistentemente tres especies de Botryosphaeria o taxones relacionados, Botryosphaeriastevensii, B. dothidea y Diplodia sarmentorum. La inoculación de aislados de las tresespecies en ramas cortadas de encina dieron lugar al desarrollo de chancros. Las inocu-laciones en ramas de árboles sanos en campo también indujeron la formación de chan-cros, aunque sólo B. stevensii causó lesiones que anillaron y mataron las ramas. La tem-peratura óptima de crecimiento de B. stevensii y B. dothidea fue de alrededor de 25°C,con crecimiento lento a 35°C. Por el contrario, D. sarmentorum presentó una tempera-tura óptima de crecimiento alrededor de 21 °C y no creció a 35°C. La frecuencia y ampliadistribución de estos patógenos, su asociación con los chancros y su capacidad parainfectar encinas y alcornoques sugiere su papel como agentes contribuyentes del decai-miento de Quercus en Andalucía.

M.E. SÁNCHEZ, J. VENEGAS, M.A. ROMERO, A. TRAPERO. Dpto. Agronomía. ETSIAM.Universidad de Córdoba. Apdo. 3048. 14080-Córdoba, España. Dirección de correoelectrónico: trapero@uco.esA.J.L. PHILLIPS. CREM, Faculdade de Ciencias e Tecnología, Universidade Nova de Lis-boa, Quinta da Torre, 2829-516 Caparica, Portugal.

Palabras clave: Bosque mediterráneo, Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeriaribis, Botryosphaeria stevensii, Decaimiento, Diplodia mutila, Diplodia sarmentorum,Fusicoccum aesculi, Otthia spiraeae, Quercus ilex, Quercus suber

INTRODUCCIÓN

Los ecosistemas dominados por encinas yalcornoques (montes o dehesas) constituyenla vegetación climax en gran parte de Anda-lucía y se caracterizan por su alta capacidadpara proteger y crear suelo bajo las condicio-nes climáticas semi-áridas características deesta región. La diversidad de ecosistemasdominados por los Quercus mediterráneosalbergan además una rica y variada fauna.Este hecho, junto con su importancia para laeconomía rural de la región, especialmente

la cría de ganado y la extracción de corcho,justifica ampliamente la necesidad de suconservación (MONTOYA, 1988).

Desde principios del siglo XX, las espe-cies de Quercus han sufrido a lo largo detoda Europa varios períodos de decaimientoy mortandad. En la cuenca mediterránea sedetectó un severo decaimiento a principiosde los años 80. Las especies más afectadasen España son Quercus súber y Quercus ilex,y en menor medida, Quercus faginea yQuercus pyrenaica (MONTOYA, 1994). Tam-bién se ha descrito un decaimiento similar

sobre Q. suber en Túnez, Portugal y Marrue-cos (BRITO DE CARVALHO, 1993; BRASIER,1996; EL-BADRI y ABADIE, 2000). En Italialas principales especies afectadas son Quer-cus cerris, Quercus frainetto y Quercuspubescens (RAGAZZI et al, 2000).

Se ha citado un amplio número de facto-res asociados con los decaimientos de losQuercus mediterráneos, como períodos recu-rrentes de sequía severa, encharcamientosestacionales, cambios en los aprovechamien-tos tradicionales de las masas, ataques deinsectos perforadores, podredumbres radica-les causadas por Phytophthora cinnamomi ychancros causados por Biscogniauxia medi-terranea {Hypoxylon mediterraneum) yBotryosphaeria stevensii {Diplodia mutila)(LUQUE y GIRBAL, 1989; RAGAZZI et al,1989, 2000; MONTOYA, 1992; LUISI et al,1993; BRASIER, 1996; TUSET et al, 1996;VANNINI et al, 1996; GALLEGO et al, 1999;LUQUE et al, 2000; SÁNCHEZ et al, 2000,2002 a, 2002 c). Además, la bacteria Brenne-ria {Erwinia) quercina también se ha asocia-do con el decaimiento de Quercus en España(SORIAE al, 1997).

Botryosphaeria stevensii se ha descritocomo el principal agente fúngico asociado aldecaimiento de Quercus en Italia (RAGAZZIet al, 1989, 1999, 2000), Marruecos (EL-BADRI y ABADIE, 2000), y nordeste español.De hecho, el chancro del tronco causado porB. stevensii se considera como la principalenfermedad causante de muerte de alcorno-ques en Cataluña (LUQUE y GIRBAL, 1989,LUQUE et al, 2000). Sin embargo, en elsudoeste (Andalucía y Extremadura) lacausa principal de muerte de encinas y alcor-noques es la podredumbre radical causadapor P. cinnamomi (BRASIER, 1996; TUSET etal, 1996; GALLEGO et al, 1999; SÁNCHEZ etal, 2002 a; 2002 c). Este patógeno es res-ponsable de la típica distribución de árbolesmuertos y moribundos en grandes grupos ofocos, y también de la asociación del decai-miento con depresiones topográficas u otrasáreas afectadas por encharcamientos estacio-nales (BRASIER, 1996; SÁNCHEZ et al, 2002a; TUSET et al, 1996). El chancro carbonoso

causado por B. mediterranea es una enferme-dad conocida desde antiguo en Andalucía,sobre todo afectando a Q. suber (TORRESJUAN, 1985), y también ha sido asociada conel decaimiento en esta región (NAVARRO yFERNÁNDEZ, 2000; SÁNCHEZ et al, 2000). Sinembargo no hay referencias de otros chan-cros fúngicos implicados en el decaimientode encinas y alcornoques en Andalucía.

Las prospecciones llevadas a cabo endehesas y montes andaluces afectados deSeca desde 1998 (TRAPERO et al, 2000; SÁN-CHEZ et al, 2002 c) revelaron la presencia deárboles afectados por un chancro distinto alcausado por B. mediterranea. Esta enferme-dad no siempre aparece asociada con lasinfecciones radicales causadas por Phytopht-hora (SÁNCHEZ et al, 2002 c). Con estosantecedentes, los objetivos del presente tra-bajo fueron (i) describir la enfermedad en lasmasas de Quercus en Andalucía, (ii) identifi-car los agentes causales de la enfermedad ydeterminar sus temperaturas óptimas de cre-cimiento y (iii) determinar la patogenicidadde los hongos consistentemente aislados delos chancros. Los resultados preliminares deeste trabajo se han expuesto en varios con-gresos (SÁNCHEZ et al, 2001; VENEGAS etal, 2001; ROMERO et al, 2002).

MATERIAL Y MÉTODOS

Prospecciones y obtención de aisladosfúngicos

Desde 1998 se están llevado a cabo pros-pecciones por toda Andalucía en encinares yalcornocales afectados o no por el síndromede decaimiento de Quercus o Seca de losQuercus (TRAPERO et al, 2000; SÁNCHEZ etal, 2002 c). Para este trabajo, las tomas demuestras se llevaron a cabo en ocho fincasafectadas de Seca en las provincias de Cádiz,Córdoba, Huelva y Sevilla (Figura 1). Lasespecies predominantes eran Quercus ilexssp. ballota y Quercus suber. En cada una deestas fincas se eligió una parcela experimen-tal de 4 ha que incluía un foco de decaimien-to. En las parcelas seleccionadas se consig-naron los síntomas de la enfermedad y se

Figura I. Localización de las parcelas experimentales. 1: La Rozuela (Quercus ilex), 2: Viñuela Alta (Q. ilex), 3: LosLabrados (Quercus suber). 4: Las Navas y el Berrocal (Q. ilex), 5: La Encarnación (Q. ilex), 6: La Pizarra (Q. ilex), 7:

Monte Mogea Luenga (Q. suber), 8: San Carlos del Tiradero (Q. suber).

realizaron dos tomas de muestras, en prima-vera (abril-mayo) y otoño (noviembre-diciembre) de 2000.

La primera toma de muestras se realizósobre cuatro árboles con síntomas de chan-cro. De cada árbol se cortaron tres ramas conchancro aún vivas de 25 a 40 cm de longitudy 1,5 a 3,5 cm de diámetro. En otoño semuestrearon doce árboles por parcela, y setomaron cuatro ramas sintomáticas porárbol. Los chancros fueron desinfestadossuperficialmente con etanol. Posteriormente,les fue retirada la corteza externa por mediode un escalpelo estéril y se extrajeron cuñasde 2-3 mm2 de tejido cortical necrótico parasembrarlas en placas de Petri conteniendo elmedio de Patata-Dextrosa-Agar (DHINGRA ySINCLAIR, 1995) acidificado con ácido lácti-co (APDA) para inhibir el crecimiento bac-teriano. Se sembraron seis cuñas por chancroy placa de Petri. Las placas se incubaron a22°C en oscuridad durante 2 días, seguidos

de otros 4 días bajo luz-oscuridad (12 h-12h) a 22°C. Las colonias fúngicas crecidas apartir del tejido cortical necrótico se transfi-rieron separadamente a nuevas placas deAPDA.

Caracterización e identificación de losaislados fúngicos

La identificación se basó parcialmente enlas características de los cultivos en APDA, yprincipalmente en la micromorfología de losaislados en el huésped y en cultivo. La espo-rulación en el medio APDA se estimulómediante la incubación de las placas bajo luzfluorescente (12 h / día) a 25°C. Con losconidiomas y conidias producidos en cultivopuro se realizaron montajes microscópicosteñidos con fucsina acida en lactofenol al0,005%. Por medio de un ocular calibrado ya 1000 aumentos, se midió la longitud yanchura de 50 conidias de seis aislados decada uno de los distintos grupos morfológi-cos obtenidos. Los ascomas se tomaron

directamente de la corteza infectada pararealizar los montajes microscópicos. Se con-signó la forma de los ascomas y se midieronlas dimensiones de 15 aseas y 30 ascosporas.

Además se determinó la tasa de creci-miento micelial en APDA de los mismos seisaislados de cada grupo morfológico. Paraello, se tomaron cilindros de agar de 7 mmde diámetro del margen de colonias crecien-do activamente y se sembraron en el centrode placas de Petri de 9 cm de diámetro. Lasplacas se incubaron a 5, 10, 15, 20, 25, 30 o35°C a razón de tres placas por aislado ytemperatura. Tras 2 y 4 días de incubación,se midieron dos diámetros de colonia porplaca. Las tasas de crecimiento se expresa-ron en mm por día. El experimento fue repe-tido dos veces. Los datos obtenidos de la tasade crecimiento a cada temperatura ensayadase ajustaron a curvas de regresión por mediodel programa Statistix for Windows (Analy-tical Software, Tallahassee, USA). Sobreestas curvas se calcularon las temperaturascardinales de crecimiento.

Experimentos de patogenicidadSe eligieron dos aislados previamente

caracterizados de cada grupo morfológicopara determinar su patogenicidad en condi-ciones controladas de laboratorio y en condi-ciones de campo.

Experimento 1: Inoculación de ramascortadas. Para los experimentos de inocula-ción en laboratorio se cortaron ramas de 16 a32 cm de longitud y 6 a 15 mm de diámetrode encinas adultas y sanas de una parcelaexperimental localizada en Córdoba. Lasramas recién cortadas se sellaron por ambosextremos con Parafilm para evitar su deseca-ción. El punto de inoculación, situado en elpunto medio de cada rama cortada, se desin-festó con etanol y posteriormente se realizóuna herida de 7 mm de diámetro con un saca-bocados estéril. En esta herida se colocó uncilindro de APDA con el aislado creciendoactivamente y se selló con Parafilm. En lasramas testigo se reemplazaron los cultivosfúngicos por cilindros de APDA estéril. Lasramas así inoculadas se incubaron a 15, 20,25 o 30°C en el interior de cámaras húmedas

con 12h de luz y 12h de oscuridad por día.Se inocularon seis ramas por cada aislado ytemperatura ensayada, midiendo la longitudde las lesiones resultantes a intervalos. Laseveridad de síntomas se expresó como lon-gitud de la lesión / longitud de la rama, enporcentaje. Con los datos obtenidos se reali-zó un análisis de la varianza y se calcularonlas mínimas diferencias significativasmediante el test protegido de Fisher (STEELy TORRIE, 1985) utilizando el programa Sta-tistix for Windows.

Experimento 2: Inoculación de árboles encampo. Este experimento se realizó sobreencinas adultas y sanas creciendo en lamisma parcela experimental de donde seobtuvieron las ramas para el Experimento 1.Se realizaron dos inoculaciones, la primeraen diciembre de 2000 (inoculación de invier-no) y la segunda en marzo de 2001 (inocula-ción de primavera). Se inocularon ramas de6 a 15 mm de diámetro utilizando el mismométodo ya descrito. Para cada aislado ensa-yado se inocularon seis ramas elegidas alazar entre varios árboles, de forma que en unárbol individual no se inocularon más de seisramas. El análisis estadístico de los datosobtenidos (porcentaje de longitud de ramacon lesión) fue el mismo que en el Experi-mento 1.

Al término de cada experimento de inocu-lación se tomaron las ramas inoculadas y tes-tigo para el reaislamiento en medio APDA.Para ello se cortaron cuñas de tejido corticala intervalos de 1 cm desde el punto de ino-culación en dirección proximal y distal. Lasplacas se incubaron a 22°C en oscuridaddurante 2 días, seguidos por otros 15-30 díasde incubación bajo luz-oscuridad (12 h- 12h) para estimular la esporulación de las colo-nias obtenidas.

RESULTADOS

Incidencia y sintomatología de la enfer-medad

En primavera de 2000, se detectó unadesecación y marchitez de ramas de Quercusasociada con la presencia de chancros en

Cuadro 1.- Aislamiento de hongos a partir de chancros en ramas de Quercus

Botryosphaeria stevensii

Especies fúngicas aisladas

Diplodia sarmentorum Botryosphaeria dothidea

a Especie dominante: E = encina, A = alcornoqueb Incidencia, porcentaje de ramas afectadas de chancro de las que se aisló el hongo correspondientec Aislamiento, porcentaje de aislamiento en APDA de cada uno de los hongos a partir del tejido necrótico de las

ramas afectadasd no se observaron ramas con chancroe no se tomaron muestras

cuatro de las ocho fincas prospectadas. Sinembargo, todas las fincas mostraron sínto-mas de chancro en otoño (Cuadro 1). Lasintomatología de la enfermedad fue similaren todas las fincas. Los síntomas foliaresconsistieron en amarillez, empardecimientoy marchitez en ramas aisladas (Figura 2a, b).Todas las ramas en las que aparecían hojasmarchitas aún prendidas a la rama presenta-ron chancros en la corteza (Figura 2c, d).Estos chancros aparecían como zonas alar-gadas de corteza necrosada, visibles másfácilmente cuando se retiraba la cortezaexterna. Sin embargo, no todas las ramassecas y defoliadas necesariamente estabanafectadas de estas lesiones corticales. Loschancros en el tronco fueron frecuentes enlas fincas de alcornoque. Las lesiones apare-cían como hinchazones o abultamientos enel corcho de 5 a 20 cm de longitud, fre-cuentemente con una grieta central que deja-ba al descubierto la casca necrosada. Estaslesiones se alineaban a lo largo de las líneasde descorche, con un desarrollo muy pobre

del corcho que quedaba circundado por losabultamientos. De esta forma, el área afecta-da adquiría un aspecto aplanado que inclusollegaba a hacer perder al fuste su forma cilin-drica normal (Figura 3a). A pesar de que enocasiones el área de corcho afectada podíaser bastante extensa (Figura 3b, c), no seregistró ningún caso de anillamiento deltronco que diera lugar a la muerte del alcor-noque afectado.

Los síntomas descritos en ramas y troncotambién fueron observados en otras zonas deAndalucía, afectadas o no por el síndrome dedecaimiento o Seca de los Quercus. Dehecho, en zonas como en la Sierra Subbéticacordobesa, Sierras de Málaga y Cádiz, sehan detectado desecaciones de ramas deencinas y alcornoques asociadas a la presen-cia de chancros, en masas no afectadas por eldecaimiento (Fig. 4). Los datos referentes ala presencia de esta enfermedad de los Quer-cus en Andalucía, obtenidos en colaboracióncon la Consejería de Medio Ambiente de laJunta de Andalucía, junto con la identifica-

l.LaRozuela

2. Viñuela Alta

3. Los Labrados

4. Las Navas yEl Berrocal

5. La Pizarra

6.La Encarnación

7. Mogea Luenga

8. S Carlos delTiradero

ción de los agentes fúngicos implicados,serán objeto de una publicación posterior(SÁNCHEZ et al, datos no publicados).

Caracterización e identificación de lospatógenos

A partir de las muestras de chancros seobtuvo un elevado número de colonias fún-gicas (Cuadro 1). En un principio, todas lascolonias eran de color blanco en el medioAPDA, tornándose a gris verdoso y poste-riormente a gris oscuro con el tiempo. Tras15 días de incubación a 22°C, se distinguíantres morfologías de colonia distintas. De untotal de 112 aislados obtenidos en cultivopuro, 47 presentaban colonias gris claro conabundante micelio aéreo (Figura 5a). Estosaislados se denominaron DM. Otros 54 ais-lados formaron colonias de color gris muyoscuro y escasa producción de micelio aéreo(aislados DS) (Figura 5b), mientras que losrestantes 11 aislados formaron colonias gris

oscuro con micelio aéreo muy abundante(aislados FA) (Figura 5c). En tres parcelasexperimentales (1, 2 y 3) fue posible aislarlos tres grupos morfológicos. Sin embargo,en el resto de las parcelas sólo se aisló uno odos de los grupos morfológicos detectados(Cuadro 1).

Aunque la caracterización se basó en lospicnidios formados en cultivos puros, estasestructuras también se observaron en el teji-do cortical afectado. Las característicasmicroscópicas de los seis aislados seleccio-nados de cada grupo morfológico permitie-ron identificar tres especies fúngicas distin-tas, en clara correspondencia con los trestipos de colonia descritos.

En los picnidios de los aislados DM(Figura 6a) se observó la ausencia de coni-dioforos. Las células conidiógenas midieron17-26 x 4 u,m y eran hialinas, lisas, cilindri-cas y aseptadas. La formación de conidias

Figura 2. Síntomas del chancro de encinas y alcornoques en Andalucía, a, b) Empardecimiento y marchitez foliar enramas aisladas, c) encina severamente afectada, d) aspecto de la lesión (chancro) en rama de encina

fue holoblástica, formándose una conidiaindividual en el extremo de la célula coni-diógena que posteriormente proliferaba deforma percurrente, dando lugar a 2-3 collare-tes, o bien la proliferación ocurría al mismonivel originando hinchazones periclinales.

Las conidias obtenidas de los cultivospuros no difirieron de las producidas en losestromas del tejido vegetal infectado. Enambos casos fueron hialinas, aseptadas, conpared celular lisa y relativamente gruesa.

Aproximadamente el 80% eran cilindricas,con el ápice redondeado y la base redondea-da o truncada (Figura 6b, c). Sus dimensio-nes medias fueron 27.9 ± 2.7 x 13.2 ± 1.5\xm, con una relación longitud / anchura(L/A) de 2.1 ± 0.3. El 20% restante eran sub-globosas (Figura 6b), con unas dimensionesmedias de 16.7 ± 2.8 x 13.6 ± 1.2 u,m y unarelación L/A de 1.2 ± 0.2. Ocasionalmente seobservaron conidias cilindricas, de colormarrón claro y con una septa (Figura 6c). En

Figura 4. Marchitez foliar, chancro y muerte de ramas en encinas no afectadas por el decaimiento o Seca de Quercus.

Figura 3. Síntomas del chancro de encinas y alcornoques en Andalucía, a) Corteza necrótica bordeada deabultamientos situados a lo largo de las líneas de descorche. Nótese el aspecto aplanado del tronco afectado, b. c)

Chancros extensos que no llegaron a anillar el tronco.

Figura 5. Morfología de las colonias fúngicas a los15 días de incubación a 22°C en el medio APDA.

a) Colonias gris claro con abundante micelio aéreo delos aislados DM, b) colonias de color gris muy oscuro

con micelio aéreo escaso de los aislados DS,c) colonias grises con abundante micelio aéreo de los

aislados FA

Figura 6. Características microscópicas de los aisladosDM. identificados como D. mutila, a) Picnidios,

b) conidias hialinas aseptadas, cilindricas (80%) ysubglobosas (20%), c) conidias cilindricas de

extremos redondeados, hialinas y aseptadas (80%) yocasionalmente, oscuras y con una septa,

d) espermogonio con espermacias

Figura 7. Características microscópicas de los aislados DS, identificados como D. sarmentorum. a) Picnidios,b) conidias oscuras, rectas, ovoides a oblongas, con ápice obtuso y base truncada

los cultivos puros y en los tejidos corticalesinfectados también se produjeron esperma-cias hialinas, de 2 um de longitud y alrede-dor de 1 um de anchura. Las espermaciasaparecían entremezcladas con las conidias obien se producían en lóculos (espermogo-nios) independientes (Figura 6d). La mayo-ría de las características de los aislados DMse corresponden con las descritas para D.mutila, el anamorfo de B. stevensii (SHOE-MAKER, 1964; PHILLIPS, 2000).

En los picnidios de los aislados DS (Figu-ra 7a) tampoco se observaron conidioforos.Las células conidiógenas eran hialinas, lisas,

cilindricas, aseptadas, holoblásticas al prin-cipio, después mostraban proliferación per-currente con uno o dos collaretes. Susdimensiones fueron 12—15(—17) x 3—4.5 ¡xm.Las conidias obtenidas en cultivo fueronidénticas a las procedentes del tejido enfer-mo. Inicialmente eran hialinas y aseptadas,con pared gruesa, para posteriormenteadquirir una coloración marrón oscuro, conuna septa central, lisas externamente y orna-mentadas (verrucosas) internamente. Deforma recta, ovoide a oblonga, con ápiceobtuso y base truncada (Figura 7b). Susdimensiones medias fueron 23.9 ±2.1 x 9.4

Figura 8. Características microscópicas de los aislados DS, identificados como F. aesculi. a) Picnidios, b) conidiasfusiformes, hialinas, aseptadas u ocasionalmente con una septa, con ápice sub-agudo y base truncada

±1.1 im, con una relación L/A de 2.6 ± 0.3.Aunque los aislados DS poseen algunascaracterísticas que encajan bien en la des-cripción de D. mutila de SUTTON (1980), lacorrespondencia es mucho mayor con la des-cripción de la especie Diplodia sarmento-rum, estado anamórfico de Otthia spiraeae(BOOTH, 1958).

Los picnidios de los aislados FA (Figura8a) presentaron conidioforos hialinos, cilin-dricos, lisos, en ocasiones ramificados. Lascélulas conidiógenas eran hialinas, lisas, depared delgada y cilindricas, de más de 28 u.mde longitud x 2-2.5 mm de anchura, holo-blásticas, ocasionalmente proliferando almismo nivel para dar lugar a hinchazonespericlinales. Las conidias obtenidas en loscultivos resultaron idénticas a las proceden-tes de la corteza infectada y fueron hialinas,lisas, de pared delgada, fusiformes a elipsoi-

dales, con contenido granular, ápice sub-agudo, base truncada con una pequeña pro-tuberancia, más anchas en el tercio superiorde la conidia, mayoritariamente aseptadasaunque ocasionalmente presentaban unasepta (Figura 8b). Sus dimensiones mediasfueron 22.6 ± 3.4 x 4.5 ± 0.8 pm, con unarelación L/A de 5.2 ±1.1. Las característicasde los aislados FA en el huésped y en cultivocorresponden al género Fusicoccum, ana-morfos del género Botryosphaeria (PENNY-COOK y SAMUELS, 1985; CROUS y PALM,1999). Estos aislados se corresponden con ladescripción de la especie-tipo Fusicoccumaesculi descrita por CROUS y PALM (1999), yel teleomorfo corresponde a Botryosphaeriadothidea (PENNYCOOK y SAMUELS, 1985).

Las estructuras de reproducción sexual(ascomas) sólo se observaron inmersas en eltejido cortical afectado procedente del tron-

Figura 9. Características microscópicas del estado teleomórfico identificado como B. stevensii. a) Ascomas (lóculos)en el tejido cortical de Q. suber, b) ascoma mostrando aseas inmaduras y ascosporas hialinas aseptadas y oscuras con

dos septas, c) aseas bitunicadas, hialinas y claviformes con ocho ascosporas ovoides, hialinas, lisas y aseptadas, d)detalle del interior de un asea con dos ascosporas hialinas, aseptadas y una oscura con dos septas

co de alcornoques descorchados 2 años antesdel muestreo (Figura 9a). Estos ascomaseran estructuras multiloculares, de colormarrón oscuro a negro (Figura 9b). En suinterior se encontraban aseas bitunicadas,hialinas y claviformes (Figura 9c), de 112.0± 9.5 x 25.2 ± 1.8 um. Las ocho ascosporaseran ovoides, mayoritariamente hialinas,lisas y aseptadas, pero también se encontra-ban en el mismo asea y con menor frecuen-cia, ascosporas oscuras con dos septas(Figura 9d). Las dimensiones medias de lasascosporas fueron 28.6 ± 2.1 x 13.3 ± 1.7um, con una relación L/A de 2.2 ± 0.3. Estascaracterísticas encajan bastante bien con ladescripción de Botryosphaeria stevensii(SHOEMAKER, 1964; PHILLIPS, 2002). No seobservó ningún otro estado teleomórfico enlas ramas infectadas ni en las lesiones deltronco. Tampoco se formó ningún tipo deascoma en cultivo.

La correspondencia entre anamorfo yteleomorfo se estableció mediante la obten-ción de cultivos del anamorfo desarrollado apartir de ascosporas individuales sembradasen el medio APDA. Se obtuvieron un total de58 cultivos monoascospóricos mediante elmétodo desarrollado por TRAPERO y KAISER(1992). La morfología de colonia de estoscultivos fue idéntica a la de los aislados DMobtenidos de las lesiones corticales e identi-ficados como D. mutila. Además, la forma y

dimensiones de los picnidios y conidias pro-ducidos por los monoascospóricos no difirie-ron de las descritas para los aislados DM.

Para expresar la tasa de crecimiento enfunción de la temperatura, la ecuación selec-cionada fue un polinomio de cuarto grado: y= a + bT + cT2 + dT3 + eT4, donde y repre-senta la tasa de crecimiento diario (mm día -*), T es la temperatura de crecimiento y a, b,c y d son los coeficientes de regresión (Figu-ra 10). El análisis de la varianza y el test deFisher mostró diferencias significativas entrelas tasas de crecimiento a las distintas tem-peraturas ensayadas. No obstante, las tasasde crecimiento correspondientes a los aisla-dos de la misma especie no difirieron signi-ficativamente entre sí para cada temperatura.

La temperatura óptima de crecimientoestimada para D. sarmentorum fue cercana alos 22° C, y resultó más elevada (>25° C)para B. stevensii y B. dothidea. Además, B.stevensii y B. dothidea crecieron a 35°C,mientras que D. sarmentorum no creció aesta temperatura.

PatogenicidadTodas las inoculaciones dieron lugar a

lesiones corticales. En el Experimento 2 seregistró además la presencia de síntomasfoliares (marchitez) y muerte de la rama ino-culada. Estos síntomas nunca aparecieron enlas ramas testigo, por lo que estos valores deseveridad de síntomas (siempre 0) no se

Cuadro 2.- Severidad de síntomas3 en ramas cortadas de Quercus ilex inoculadas con Botryosphaeria stevensii, B.dothidea o Diplodia sarmentorum e incubadas a diferentes temperaturas

a Expresada como porcentaje de la longitud del chancro / longitud de la ramab DME1, DMA1: Botryosphaeria stevensii; DSE27, DSE14: Diplodia sarmentorum; FAE2, FAE5: B. dothidea

Para cada columna, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente según el test LSD protegidode Fisher para P = 0,05

Figura IO. Curvas de crecimiento de los aislados en elmedio de cultivo APDA. a) Botryosphaeria stevensü,b) Diplodia sarmentorum, c) B. dothidea. Las flechas

indican las temperaturas óptimas de crecimientoestimadas. Los puntos representan los valores mediosde tasa de crecimiento de seis aislados de cada especie

a las distintas temperaturas ensayadas

incluyeron en los análisis estadísticos. Nohubo diferencias entre la extensión de laslesiones en sentido distal y proximal en nin-guno de los dos experimentos. En algunoscasos, la longitud del chancro alcanzó la lon-gitud total de la rama inoculada. Por estemotivo, la severidad de síntomas se expresócomo porcentaje de rama con lesión. Laespecie inoculada se recuperó en todos loscasos a partir del tejido necrótico de lalesión, con porcentajes de reaislamientosuperiores al 70%. De la misma manera queocurre con las infecciones naturales, el pató-geno se hallaba presente a lo largo de toda lalongitud del chancro. Únicamente se aisla-ron ocasionalmente algunas colonias delgénero Fusarium y de bacterias.

Experimento 1: Inoculación de ramascortadas. Cuatro semanas tras la inocula-ción, algunas lesiones corticales ocupabanprácticamente toda la longitud de la rama(16 a 32 cm). Los valores medios del por-centaje de longitud de rama con lesión (seve-ridad de síntomas) aparecen en el Cuadro 3.El análisis de los datos mostró que a las tem-peraturas de incubación más bajas (15 y20°C), los aislados de B. stevensii y el aisla-do DSE27 de D. sarmentorum produjeronsíntomas significativamente más severos queel resto de aislados (Figura 1 la). Por el con-trario, a las temperaturas más altas (25 y30°C), los aislados de las tres especies pro-dujeron síntomas severos, no detectándosediferencias significativas entre ellos (Figuralib).

Experimento 2: Inoculación de árboles encampo. Las evaluaciones de síntomas encampo se prolongaron durante tres mesespara la inoculación de primavera y seismeses para la inoculación de invierno.

Seis meses tras la inoculación de invierno,se desarrollaron lesiones en las ramas inocu-ladas (Figura 12a). Los aislados de D. sar-mentorum y B. dothidea originaron peque-ños chancros rodeados por una capa de callo.Sin embargo, los chancros que aparecieronen las ramas inoculadas con B. stevensü nodesarrollaron callo. En ningún caso se llega-ron a expresar síntomas foliares, a pesar de

Figura 11. Inoculación de ramas cortadas, a) Necrosis cortical en ramas cortadas de encina incubadas a 15°C. Dearriba a abajo, rama testigo, rama inoculada con B. dothidea, rama inoculada con D. sarmentorum y rama inoculadacon B. stevensii b) Necrosis cortical en ramas cortadas de encina incubadas a 25°C. De arriba a abajo, rama testigo,

rama inoculada con B. dothidea, rama inoculada con D. sarmentorum y rama inoculada con B. stevensii. En todos loscasos se ha retirado la corteza externa para apreciar mas facilmente la necrosis cortical

que dos de las ramas inoculadas con B. ste-vensii estaban anilladas.

Tres meses después de la inoculación deprimavera, las ramas inoculadas con ambosaislados de B. stevensii mostraban marchitezfoliar, anillamiento y muerte de la rama(Figura 12b, c). Sin embargo, en las ramasinoculadas con D. sarmentorum y F. aesculi,las lesiones corticales no llegaron a anillar(Figura 12d) y por tanto, no hubo expresiónde síntomas foliares. No se detectó produc-ción de callo en ninguna de las lesiones,

independientemente de la especie inoculada.El análisis global de la varianza de la

severidad de síntomas, expresada como por-centaje de longitud de rama con lesión corti-cal, mostró diferencias significativas en fun-ción del aislado inoculado, del momento deinoculación (invierno-primavera) y de lainteracción entre ambos factores. La severi-dad de síntomas fue significativamentemayor en las ramas inoculadas con ambosaislados de B. stevensii que en las inoculadascon las otras dos especies. También se obtu-

Figura 12. Inoculación de árboles en campo, a) Chancro desarrollado en rama de encina inoculada con B. stevensii eninvierno b) ramas de encina inoculadas con B. stevensii en primavera, mostrando marchitez foliar, anillamiento y

muerte de la rama, c) detalle de rama de encina inoculada con B. stevensii en primavera, d) chancro desarrollado enrama de encina inoculada con B. dothidea en primavera

vieron valores de severidad significativa-mente mayores en las inoculaciones de pri-mavera que en las de invierno.

El análisis estadístico individualizadopara cada momento de inoculación (Cuadro

3), mostró que en la inoculación de inviernola severidad de síntomas fue significativa-mente mayor en las ramas inoculadas con elaislado DME1 de B. stevensii (Cuadro 3),procedente de Q. ilex, que con los otros dos

Cuadro 3.- Severidad de síntomas en ramas de Quercus ilex inoculadas en campo con Botryosphaeria stevensii,B. dothidea y Diplodia sarmentorum.

a Expresada como porcentaje de la longitud del chancro / longitud de la ramab DMAI, DME1: Botryosphaeria stevensii; DSE27, DSE14: Diplodia sarmentorum,, FAE2, FAE5: B. dothidea

Para cada columna, los valores seguidos de la misma letra no difieren significativamente según el test LSD protegidode Fisher para P = 0,05

patógenos. En la inoculación de primavera,esta mayor patogenicidad del aislado DME1fue más acusada, difiriendo significativa-mente incluso del aislado DMA1, obtenidode Q. suber (Cuadro 3).

DISCUSIÓN

Las encinas y alcornoques afectados demarchitez foliar y muerte cortical en Andalu-cía occidental, invariablemente presentabanlesiones o chancros en sus ramas. Sin embar-go, la presencia de ramas defoliadas no aso-ciadas a la presencia de chancros, tambiénfue muy frecuente en las fincas prospectadas.De hecho, en seis de las ocho parcelas expe-rimentales muestreadas, los árboles tambiénsufrían la podredumbre radical causada por P.cinnamomi (SÁNCHEZ et al, 2002 c), enfer-medad que produce síntomas secundariosinespecíficos, como defoliación y puntiseca-do de ramas. Por otra parte, la enfermedad seha detectado en masas de encina y alcorno-que que no sufren decaimiento (SÁNCHEZ etal, datos no publicados).

A partir de la corteza necrótica se aislaronconsistentemente tres especies diferentes delgénero Botryosphaeria o géneros relaciona-dos. Dado que los teleomorfos de Botryosp-haeria son morfológicamente muy similares,las especies se diferencian en función de lascaracterísticas de los anamorfos. Algunascaracterísticas, como el color o la septaciónde las conidias o la morfología del estromapicnidial, son muy plásticas (JACOBS y REH-NER, 1998; DENMAN et al, 2000). De hecho,el color y la septación de las conidias varíacon su edad, por lo que es difícil describirlasadecuadamente. A pesar de que la prolifera-ción percurrente de las células conidiógenasse ha considerado como más típica del géne-ro Sphaeropsis (SUTTON, 1980), este caráctertambién se da en Diplodia (PHILLIPS, 2002).Se han citado cinco especies distintas deDiplodia causando enfermedad en Quercusspp., D. longispora, D. mutila, D. quercina,D. sarmentorum y D. suberina (SHOEMAKER,1964; FARR et al, 1989; FRISULLO et al,2000). El género Diplodia incluye alrededor

de 1000 especies y no se ha abordado unarevisión taxonómica adecuada (HAWKS-WORTH et al, 1995; DENMAN et al, 2000).Por tanto, para evitar confusiones asociadasa la nomenclatura de los anamorfos, normal-mente se utiliza el nombre del holomorfopara nombrar a estos hongos, y esta es laregla que se sigue en este trabajo.

En nuestro estudio, la especie más fre-cuentemente aislada se identificó como B.stevensii. El estado sexual fue identificado apartir de los chancros presentes en el troncode alcornoques descorchados en 1998. Losascomas nunca se produjeron en cultivo,como previamente comprobaron SINCLAIR etal. (1987) para este género. Algunas caracte-rísticas del estado anamórfico de nuestrosaislados coinciden con los de B. quercuum.Por ejemplo, las conidias subglobosas seconsideran más típicas de B. quercuum quede B. stevensii. El principal carácter utiliza-do para distinguir entre estas dos especies(SHOEMAKER, 1964) es la forma de la coni-dia, expresada como relación L/A. Las coni-dias de nuestros aislados resultaron dimórfi-cas, y se produjeron tanto conidias subglo-bosas como cilindricas. La relación L/A delas conidias subglobosas fue de 1,2, lo queestá muy cerca del valor referido por SHOE-MAKER (1964) para B. quercuum (1,5). Sinembargo, la relación L/A obtenida para lasconidias cilindricas fue de 2,1, valor máscercano a B. stevensii (SHOEMAKER, 1964).Como únicamente el 20% de las conidiasfueron subglobosas, hemos basado la identi-ficación de estos aislados en las caracterís-ticas de las conidias mayoritarias, que soncilindricas, y por lo tanto, hemos identifica-do a esta especie como B. stevensii. Las rela-ciones filogenéticas que se han establecidoentre las distintas especies de Botryosphae-ria y táxones relacionados en base a lasecuenciación de las regiones ITS del rDNA,sugieren que el nombre B. stevensii ha sidoaplicado a más de una especie, y que aisla-dos que se han identificado como B. quer-cuum deberían incluirse en la misma especieque otros que han sido nombrados como B.stevensii (ZHOU y STANOSZ, 2001).

La segunda especie más frecuente de lasconsistentemente asociadas a los chancrosde Quercus, se ha identificado como D. sar-mentorum (STEVENS, 1936), especie que seha considerado como el estado anamórficode O. spiraeae (BOOTH, 1958; SIVANESAN,1984). Como refirió LAUNDON (1973), D.sarmentorum está claramente relacionadacon los anamorfos del género Botryosphae-ria, lo que pone en duda la validez del géne-ro Otthia. Este punto de vista también hasido respaldado por DENMAN et al. (2000),que sugieren que Otthia podría ser conside-rado como sinónimo del género Botryospha-eria, aunque se necesitan más estudios mor-fológicos y moleculares antes de estableceresta sinonimia. El teleomorfo de D. sarmen-torum no ha sido observado en el presenteestudio, por lo que no nos es posible confir-mar si estos aislados son una especie de Ott-hia o de Botryosphaeria. Consecuentemente,en el presente trabajo nos referimos a estosaislados mediante el nombre del anamorfo.

La morfología de la especie de Botryosp-haeria menos frecuentemente aislada corres-ponde a los anamorfos del género Fusicoc-cum (SUTTON, 1980; PENNYCOOK y SAMUELS,1985; JACOBS y REHNER, 1998; CROUS yPALM, 1999; DENMAN et al, 2000). Lascaracterísticas de estos anamorfos se corres-ponden muy bien con la descripción de laespecie-tipo F. aesculi, que es el anamorfode B. dothidea (CROUS y PALM, 1999). Sinembargo, también coinciden en gran partecon el anamorfo de Botryosphaeria ribis,Fusicoccum sp. (PUNITHALINGAM y HOLLI-DAY, 1973; MAAS y UECKER, 1984), a pesarde que sus conidias son más estrechas quelas descritas para esta especie en otros hués-pedes (PUNITHALINGAM y HOLLIDAY, 1973;SUTTON, 1980; MORGAN-JONES y WHITE,1987, SÁNCHEZ et al, 2002 b). De nuevo, ennuestro estudio no fue posible obtener elteleomorfo en cultivo y tampoco se observóen material de campo infectado. En ocasio-nes B. dothidea y B. ribis se han considera-do sinónimos (SHAHIN y CLAFLIN, 1980;MAAS y UECKER, 1984; SIVANESAN, 1984;CLINE, 1994), pero también han sido tratadas

como dos especies diferentes (VON ARX,1987, FARR et al, 1989). De hecho, B. dothi-dea se considera como un complejo de espe-cies que han de ser convenientemente sepa-radas en base a sus características morfoló-gicas y moleculares (PENNYCOOK ySAMUELS, 1985; PHILLIPS et al, 2002). Aun-que algunos estudios morfológicos acercadel complejo B. dothidea/B. ribis, junto conestudios filogenéticos basados en las secuen-cias ITS del rDNA, apoyan la sinonimia delas dos especies (PENNYCOOK y SAMUELS,1985; PHILLIPS y LUCAS, 1997; JACOBS yREHNER, 1998; CROUS y PALM, 1999; DEN-MAN et al, 2000), otros estudios similaresestablecen la diferenciación entre ellas(ZHOU y STANOSZ, 2001). Mientras seresuelve esta controversia, hemos preferidoconsiderar las dos especies como sinónimosy utilizar la nomenclatura más antigua, B.dothidea (1863) para referirnos a nuestrosaislados.

Las curvas de crecimiento en función dela temperatura de incubación obtenidas paralos aislados de B. dothidea se ajustan bastan-te bien a las descritas anteriormente paraFusicoccum aislada de Cistus ladanifer enAndalucía (SÁNCHEZ et al, 2002 b), que cre-cen lentamente a 10 y a 35°C, con tempera-turas óptimas alrededor de los 28°C. Sinembargo, otros aislados de Fusicoccum obte-nidos de otros huéspedes no crecen a 35°C(BROOKS y FERRIN, 1994; JACOBS y REHNER,1998). No obstante, hay que destacar que lastemperaturas óptimas de crecimiento paraaislados de Fusicoccum procedentes dearbustos nativos de California fueron tam-bién similares a las obtenidas en este estudio(BROOKS y FERRIN, 1994). Esto sugiere quelos distintos aislados difieren en sus tem-peraturas óptimas de crecimiento en funciónde su origen geográfico. Los aislados deBotryosphaeria stevensii crecieron a 35°C,en contraste con los datos de JACOBS y REH-NER (1998) para esta especie. Únicamente D.sarmentorum no creció a 35°C.

Las ecuaciones polinómicas que hemosutilizado para describir el crecimiento de loshongos en función de la temperatura no tie-

nen necesariamente una significación bioló-gica, pero resultan útiles para determinar sustemperaturas cardinales de crecimiento. Así,las curvas de crecimiento en función de latemperatura obtenidas para B. stevensii y B.dothidea sugieren que estas dos especiespodrían estar mejor adaptadas que D. sar-mentorum para colonizar la corteza de Quer-cus a las temperaturas generalmente altasque se registran durante la primavera y elverano en Andalucía.

La patogenicidad de los aislados sedemostró en cada uno de los experimentosrealizados, cumplimentándose los postuladosde Koch. La inoculación de ramas cortadasde encina indica que las tres especies presen-tan una gran capacidad para infectar ysobrevivir en el tejido cortical debilitado atemperaturas superiores a 25°C. Las diferen-cias en virulencia entre especies y aisladossólo se detecta a temperaturas más bajas. Estecomportamiento de Botryosphaeria y espe-cies relacionadas como patógenos de debili-dad, e incluso como saprofitos oportunistas,ha sido observada frecuentemente (SCHOENE-WEISS, 1975, 1981; WENE y SCHOENEWEISS,1980; SINCLAIR et al, 1987; GILBERT y STE-VEN, 1996; RAYACHHETRY et al, 1996).

Sin embargo, las inoculaciones en árbolesvigorosos en condiciones de campo (Experi-mento 2), sugieren que la debilidad del hués-ped no es una condición necesaria para quese desarrollen las lesiones en la cortezainfectada. En el caso de los aislados de B.stevensii, el desarrollo de los chancros estu-vo claramente favorecido por las altas tem-peraturas (inoculación de invierno-inocula-ción de primavera), y varía significativamen-te con el aislado inoculado. LUQUE et al(2002) mostraron que la longitud de laslesiones en plántulas de Q. suber estabadirectamente relacionada con la temperaturamínima en el momento de la inoculación; laslesiones de mayor tamaño se desarrollaronen los plantones inoculados en el períodomás cálido del año (agosto). En nuestrosexperimentos, sólo las inoculaciones de pri-

mavera con B. stevensii dieron lugar a lossíntomas secundarios de la enfermedad, estoes, el anillamiento y muerte de la rama y lasubsecuente marchitez foliar. Estos resulta-dos sugieren que B. stevensii es un patógenoprimario de la encina y el alcornoque enAndalucía, como fue descrito por LUQUE yGIRBAL (1989) para Q. suber en Cataluña yFRISULLO et al (2000) para diferentes espe-cies de Quercus en Italia. Botryosphaeriastevensii también se ha citado como uno delos principales factores bióticos implicadosen el decaimiento de Quercus en Cataluña(LUQUE et al, 2000), Italia (RAGAZZI et al,2000) y Marruecos (EL-BADRI y ABADIE,2000). Las otras dos especies fúngicas consi-deradas en este trabajo han mostrado sucapacidad para producir necrosis corticalesextensas en ramas de encina debilitadas,pero aunque produjeron lesiones, no fueroncapaces de anillar ramas de árboles vigoro-sos. Este último hecho también se ha obser-vado para estos hongos en especies de Quer-cus italianas (FRISULLO et al, 2000).

De todo lo expuesto se puede concluir queaunque únicamente B. stevensii se ha mos-trado como un patógeno primario de Q. ilexy Q. suber, las tres especies estudiadasdeben ser consideradas como factores contri-buyentes del decaimiento de Quercus enAndalucía.

AGRADECIMIENTOS

Los autores quieren expresar su agradeci-miento a Francisca Gutiérrez y Jonatan E.Sánchez por su colaboración en las tareas delaboratorio y campo. Este trabajo ha sidofinanciado por el Programa FEDER de laUE. (proyecto 1FD97-0911-CO3-03), elMCyT (proyecto AGL2002-00530) y elConvenio suscrito entre la Consejería deMedio Ambiente de la Junta de Andalucía yla Universidad de Córdoba para el estudio dela Seca de Quercus en Andalucía. M.E. Sán-chez disfruta de un contrato de investigacióndel programa "Ramón y Cajal" del MCyT.

ABSTRACT

SÁNCHEZ M.E., J. VENEGAS, M.A. ROMERO, A.J.L. PHILLIPS, A. TRAPERO. 2003. Botr-yosphaeria canker of holm and cork oak in Andalucía (southern Spain). Bol. San. Veg.Plagas, 29: 593-612.

Root rot caused by Phytophthora cinnamomi is considered to be the main diseaseassociated with oak decline in southwestern Spain. However, cankers are frequentlyobserved on declining Mediterranean Quercus species in this region. In surveys carriedout in declining oak forests in southern Spain, strips of necrotic bark were common ondiseased branches. Three Botryosphaeria or related species, namely Botryosphaeria ste-vensii, B. dothidea and Diplodia sarmentorum, were consistently isolated from affectedbranches. Isolates of all three species caused cankers when inoculated onto excised oakbranches. Inoculations on healthy branches in the field also induced canker development,but only B. stevensii caused lesions that girdled and killed the branches. The optimumtemperature for growth of B. stevensii and B. dothidea was above 25°C, with slow growthat 35°C. In contrast, D. sarmentorum had an optimum temperature for growth of about21°C, and did not grow at 35°C. The common occurrence and wide distribution of thesepathogens, their association with cankers and their ability to infect oaks suggests thatthey may contribute to the decline of Quercus in southwestern Spain.

Key words: Botryosphaeria dothidea, Botryosphaeria ribis, Botryosphaeria steven-sii, Diplodia mutila, Diplodia sarmentorum, Fusicoccum aesculi, Mediterranean forest,oak decline, Otthia spiraeae, Quercus ilex, Quercus suber.

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(Recepción: 11 febrero 2003)(Aceptación: 25 febrero 2003)