EL CICLO DE LA UREA: REGULACION, NUEVAS ?· carbamil fosfato procedente del ciclo de la urea, y reflejan…

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  • UNIVERSIDAD DE VALENCIA

    INSTITUTO DE INVESTIGACIONES CITOLOGICAS Fundacin Valenciana de Investigaciones Biomdicas

    TESIS DOCTORAL

    EL CICLO DE LA UREA: REGULACION, NUEVAS FUNCIONES Y PATOGENESIS DE SUS ALTERACIONES

    Memoria para optar al grado de Doctor en Ciencias Biolgicas, presentada por:Miguel Angel Garca Prez Valencia, Junio de 1994

  • UMI Number: U607672

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  • NIVERSITAT DE VALENCIA

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  • VICENTE RUBIO ZAMORA, Investigador del CSIC y Jefe del Departamento de Citologa Cuantitativa del Instituto de Investigaciones Citolgicas de la Fundacin Valenciana de Investigaciones Biomdicas

    CERTIFICA: Que la presente Tesis Doctoral titulada "EL CICLO DE LA . UREA: REGULACION, NUEVAS FUNCIONES YPATOGENESIS DE SUS ALTERACIONES" ha sido realizada por el Licenciado en Ciencias Biolgicas, D. Miguel Angel Garca Prez bajo mi direccin en este Instituto.

    En Valencia, a 27 de Junio de 1994

  • Este trabajo de Tesis ha sido financiado por las Ayudas 89/0554 y 92/0374 del Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (FISS) y por la Ayuda CPE-049 de la Instituci Valenciana d'Estudis i Investigaci (IVEI). Durante una parte del tiempo de realizacin de este trabajo, el autor ha disfrutado de una beca del FISS con cargo al proyecto 89/0554.

  • Para la realizacin de un trabajo de esta ndole muchas son las personas con las que se ha de colaborar y a las que se tiene que recurrir en diversas ocasiones para pedir consejo ante unos resultados no satisfactorios, o cualquier otro tipo de problema. Sin la ayuda de todas estas personas la realizacin de este trabajo hubiese sido, sin duda alguna, mucho ms difcil.

    Deseo expresar mi agradecimiento, en primer lugar, al Dr. Vicente Rubio, director de este trabajo, sin cuya continua ayuda, estmulo y consejo no se hubiera podido realizar. Agradezco sinceramente la amistad y la desinteresada ayuda prestada por la Dra. Eulalia Alonso; ella ha sido, en no pocas ocasiones, orientadora a la vez que colaboradora. Debo agrader, de forma especial, la colaboracin y la amistad de todas las personas con las que he compartido el trabajo durante todo este tiempo: Filo Bote, Inmaculada Mico, JorgeBueso, Alberto Marina, Hugo Cabedo, Toni Garca-Espaa y Elvira de la Pea. Todos ellos han contribuido para que el laboratorio del tercero derecha sea un lugar agradable para trabajar; con todos ellos tengo alguna deuda pendiente. Agradezco asimismo a todos los dems miembros del Instituto de Investigaciones Citolgicas su colaboracin y disponibilidad para prestarte la ayuda necesaria en todo momento.

    Deseo expresar mi agradecimiento a los Drs. Barcia Salorio y Paco Corts del Hospital Clnico y La Fe, respectivamente, por la donacin desinteresada de muestras de

  • tumores obtenidos en intervenciones quirrgicas; y a la Dra. Consuelo Guerri por la diseccin de las regiones cerebrales y por permitirme usar, con bastante frecuencia, su ordenador.

    De forma muy especial quiero agradecer a mi familia, y especialmente a mis padres, todo el derroche de cario, esfuerzo y sacrificio que me han regalado durante tantos aos para que me pudiese dedicar a este campo, y a Marina Garcs, que me ha apoyado en todo momento, ha soportado y comprendido mejor que nadie mi estado de nimo, y ha supuesto, en definitiva, una valiossima ayuda.

  • A mi fa.mil

    A Marina

  • INDICE

    1. PREAMBULO..................................................... 1

    2. ACIDURIA OROTICA EXPERIMENTAL: DETERMINANTES METABOLICOS DELA ACUMULACION DE CARBAMIL FOSFATO.......................... 3

    2.1 INTRODUCCION................................................. 42.2 MATERIAL..................................................... 19

    2.2.1 Productos qumicos..................................... 192.2.2 Aparatos................................................ 202.2.3 Animales................................................ 212.2.4 Dietas.................................................. 22

    2.3 METODOS....................................................... 232.3.1 Tratamiento de los animales........................... 232.3.2 Obtencin del extracto heptico....................... 242.3.3 Determinacin de carbamil fosfato................... 252.3.4 Determinacin de acetilglutamato.................... 272.3.5 Determinacin de ornitina y arginina............... 282.3.6 Determinacin de citrulina.......................... 292.3.7 Determinacin de argininosuccinato.................. 302.3.8 Determinacin de orotato............................ 302.3.9 Otras determinaciones.................................. 31

    2.4 RESULTADOS Y DISCUSION...................................... 342.4.1 Induccin de aciduria ortica......................... 342.4.2 Orotato y carbamil fosfato hepticos.................. 372.4.3 Determinantes metablicos de la acumulacin de carba

    mil fosfato tras la administracin de glicina......... 432.4.4 Influencia de la administracin de ornitina sobre la

    acumulacin de carbamil fosfato inducida por glicina. 512.4.5 Determinantes metablicos de la acumulacin de carba

    mil fosfato tras la administracin de alanina......... 60

  • 2.4.6 Consideraciones finales............................... 662.5 REFERENCIAS..................... 74

    3. N-ACETIL-L-GLUTAMATO EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL:INVESTIGACIONES SOBRE SU ORIGEN Y METABOLISMO.............. 82

    3 . 0 ABREVIATURAS................................................. 833.1 INTRODUCCION................................................. 833.2 MATERIAL..................................................... 94

    3.2.1 Productos qumicos.................................. . 943.2.2 Animales y tejidos............... 953.2.3 Aparatos................................................ 97

    3.3 METODOS................................. 983.3.1 Sntesis de acetilglutamato y acetilaspartato radiac

    tivos................................................... 983.3.2 Obtencin de fracciones subcelulares................. 993.3.3 Determinacin de acetilglutamato, acetilaspartato y

    acetilaspartilglutamato................................. 1003.3.4 Determinacin de N-Acetil-L-glutamina................. 1063.3.5 Ensayo de las actividades aspartoacilasa y deacilasa

    de acetilglutamato...................................... 1063.3.6 Ensayo de la actividad L-aspartato-N-acetil-

    transferasa.............................................. 1073.3.7 Ensayo de transacetilasa en el cerebro................ 1083.3.8 Otros ensayos............................................ 109

    3.4 RESULTADOS.................................................... 1103.4.1 Niveles cerebrales de acetilglutamato en animales

    adultos....................................... 1103.4.2 Cambios en el nivel de acetilglutamato durante el

    desarrollo.............................................. 1163.4.3 Acetilglutamato en tumores intracraneales humanos... 1183.4.4 Actividades cerebrales capaces de sintetizar y de

    degradar acetilglutamato............................... 1203.4.5 Estudios adicionales sobre la actividad hidrolitica

  • de acetilglutamato.................................... 1233.4.6 Distribucin regional de la deacilasa de acetil

    glutamato y de la aspartoacilasa...................... 1313.5 DISCUSION......... ........................................... 1363.6 REFERENCIAS.................................................. 142

    4. HALLAZGO DE LA MUTACION SPF-ASH EN PACIENTES CON DEFICIENCIADE ORNITINA TRANSCARBAMILASA DE MODERADA SEVERIDAD......... 152

    4.1 INTRODUCCION................................................. 1534.2 MATERIAL..................................................... 162

    4.2.1 Instrumentos........................................... 1624.2.2 Compuestos radiactivos................................ 1634.2.3 Oligonucletidos y sondas............................. 1634.2.4 Enzimas.......................... ...................... 1644.2.5 Soluciones.............................................. 164

    4.3 METODOS...................................................... 1664.3.1 Marcado de la sonda con digoxigenina.... *............ 1664.3.2 Obtencin de ADN genmico y deteccin de fragmentos

    de restriccin polimrfica (RFLP)................... 1674.3.3 Amplificacin de ADN mediante la reaccin en cadena

    de la polimerasa (PCR)................................ 1694.3.4 Polimorfismos conformacionales de simple cadena

    (SSCP)..................... 1724.3.5 Secuenciacin directa de fragmentos de PCR de doble

    cadena.................................................. 1734.3.6 Otros ensayos.......................................... 175

    4 . 4 RESULTADOS................................................... 1784.4.1 Historias clnicas..................................... 1784.4.2 Actividad ornitina transcarbamilasa.................. 1814.4.3 Anlisis de la herencia de los RFLP en la familia A.. 1844.4.4 Anlisis de microsatlites cercanos al gen de la OTC

    en la familia A ........................................ 186

  • 4.4.5 Anlisis de los SSCP................................... 1884.4.6 Secuenciacin directa del exn 4 amplificado por PCR. 1904.4.7 Digestin del exn 4 con MspI.......................... 194

    4.5 DISCUSION................