El Cuaderno 35_1.doc

7/24/2019 El Cuaderno 35_1.doc

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EDICIN N 35

Cultivo in vitrode plantas y su relacin con la Biotecnologa

El cultivo in vitro(trmino que literalmente significa en vidrio), inclue muc!astcnicas destinadas a introducir, multi"licar regenerar, entre otros recursos,material vegetal o animal en condiciones controladas as"ticas# El cultivo in vitro,constitue un "aso fundamental en la o$tenci%n regeneraci%n de "lantasgenticamente modificadas, o transgnicas, mediante tcnicas de ingenier&a gentica#Es decir que e'iste una estrec!a relaci%n entre el cultivo de teidos vegetales la$iotecnolog&a moderna# Normalmente se utilian cultivos de teidos, seguido de laregeneraci%n de la "lanta com"leta, la su$siguiente e'"resi%n de los genesintroducidos, o transgenes (*er Cuaderno N+ 5, -, .-, /-)#

Cultivo in Vitrode material vegetal0Cultivo de teidos vegetales1 es una descri"ci%n genrica que involucra diferentes

tcnicas de cultivo de material vegetal diverso, incluendo las de "roto"lastos (clulasdes"rovistas de su "ared celular), clulas, teidos, %rganos "lantas com"letas#2ediante stas otras tcnicas de cultivo, es "osi$le o$tener "lantas li$res demicro$ios en un medio nutritivo as"tico (estril) en condiciones am$ientalescontroladas (ver Cuaderno N 5)#4as "rimeras e'"eriencias relacionadas al cultivo de teidos vegetales se remontan a/., "ero recin en /.. se logr% el "rimer e'"erimento e'itoso6 germinaci%n in vitrode semillas de orqu&deas# 4uego de la germinaci%n, las "l7ntulas o$tenidas setransfirieron a un medio de cultivo en condiciones as"ticas, as& se mantuvieron"rotegidas del ataque de "at%genos (!ongos, virus $acterias)#

Esta tcnica tiene numerosas a"licaciones (ver Cuadernos 5, ., 5, -/, /3)6 8ro"agaci%n masiva de "lantas, es"ecialmente $eneficiosa "ara es"ecies de dif&cil

"ro"agaci%n "or otros mtodos, o en v&as de e'tinci%n Clonaci%n de individuos de caracter&sticas agron%micas mu desea$les durante todo

el a9o :$tenci%n de "lantas li$res de virus 8roducci%n de semillas sintticas Conservaci%n de germo"lasma6 material de un conunto de individuos que re"resenta

la varia$ilidad gentica de una "o$laci%n vegetal :$tenci%n de meta$olitos secundarios 8roducci%n de nuevos !&$ridos 2eora gentica de "lantas, incluendo o$tenci%n de "lantas transgnicas ;erminaci%n de semillas# 8roducci%n de !a"loides# Estudios fisiol%gicos diversos#


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%igura & 'plicaciones del cultivo de te$idos en plantas< la iquierda, micro"ro"agaci%n de violetaafricana a "artir de troos de !oas desinfectados e introducidos en condiciones de esterilidad# < laderec!a, semillas sintticas formadas "or em$riones som7ticos, o$tenidos "or cultivo de clulas,enca"sulados en una matri inerte (como alginato de calcio)# =otograf&a tomada de!tt"6>>???#s"#edu#sg>sc!ools>cls>$ioline@-#!tm

(as #ases #iolgicas del cultivo de te$idos) la totipotencialidad celular


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%igura . Cultivo de te$idos y trans/ormacin vegetal# En lafigura se o$servan e'"lantos que, luego del "roceso de selecci%n,!an "erdido coloraci%n , aquellas clulas transformadase'itosamente, se !an desdiferenciado rediferenciado "ara dar

origen a un $rote (ver te'to)#

4a re"roducci%n ase'ual de "lantas "or cultivo de teidos es "osi$le gracias a que, engeneral, las clulas de un individuo vegetal "oseen la ca"acidad necesaria "ara "ermitirel crecimiento el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningn ti"o de fusi%nde clulas se'uales o gametos# Esta ca"acidad se denomina toti"otencialidadcelular(ver Cuaderno N 5, F, -3), es caracter&stica de un gru"o de clulas vegetalesconocidas como clulas meristem7ticas, "resentes en distintos %rganos de la "lanta #

A7sicamente, la re"roducci%n ase'ual se "uede realiar de$ido a que las clulasvegetales "oseen un mecanismo de divisi%n mit%tico, al igual que las clulas animales,mediante el cual cum"len sucesivas eta"as de crecimiento desarrollo# 4a divisi%ncelular mit%tica im"lica una re"licaci%n de los cromosomas de las clulas !ias, "or loque las mismas "oseen un genoti"o idntico al de la clula madre# 4a "otencialidad deuna clula diferenciada (una clula de conducci%n, e"idrmica, etc#) "ara generarteidos nuevos eventualmente un organismo com"leto, disminue con el grado dediferenciaci%n alcanado "or esa clula, "ero "uede revertirse "arcial o com"letamentesegn las condiciones de cultivo a las que se la someta (ver Cuaderno N F, -, -3)#


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4a formulaci%n del medio cam$ia segn se quiera o$tener un teido desdiferenciado(callo), crecer emas ra&ces, u o$tener em$riones som7ticos "ara "roducir semillasartificiales#El 'ito en la "ro"agaci%n de una "lanta de"ender7 de lograr la e'"resi%n de la"otencialidad celular total, es decir, que algunas clulas recu"eren su condici%nmeristem7tica# 8ara lograrlo, de$e inducirse "rimero la desdiferenciaci%n luego larediferenciaci%n celular# Bn "roceso de este car7cter sucede durante la formaci%n delas ra&ces adventicias en el enraiamiento de estacas, la formaci%n de emasadventicias o cuando se $usca la "ro"agaci%n de Aegonias, *ioleta africana (ver figura) o 8e"eronias mediante "orciones de !oas# Entre los factores m7s im"ortantes atener en cuenta "ara lograr la res"uesta morfogentica deseada, es la com"osici%n delmedio de cultivo#En todo intento de "ro"agaci%n vegetal, a sea in vitroo invivo, el car7cter del "rocesode diferenciaci%n de"ende del genoma de la es"ecie, est7 regulado "or el $alance

!ormonal "ro"io "or el estado fisiol%gico del %rgano, teido o clula "uesta en cultivo#Gin em$argo, tam$in se sa$e que ese $alance "uede ser modificado "or el agregado decom"uestos que imiten la acci%n de las !ormonas vegetales# Esos com"uestos,denominados reguladores del crecimiento+son los que se em"lean en los medios decultivo "ara conseguir la micro"ro"agaci%n de una "lanta

Pasos para generar plantas a partir de e0plantos aisladosEn los "rotocolos utiliados durante el cultivo in vitro, se "ueden distinguir lassiguientes eta"as (sintetiadas en la figura H)6

) Elecci%n de la "lanta >o teido donante de e'"lantos#

.) Esta$lecimiento6 desinfecci%n de los e'"lantos (generalmente con !i"oclorito desodio) su "osterior ada"taci%n al medio artificial de modo de inducir callo, $rote,ra& o em$ri%n som7tico, segn se desee#

3) 2ulti"licaci%n6 generar una masa vegetal suficiente "ara la regeneraci%n del nmerode "lantas necesarias#

H) Enraiamiento6 formaci%n de ra&ces con el fin de convertir los $rotes o em$rionessom7ticos en "l7ntulas com"letas#

5) usticaci%n6 aclimataci%n de las "l7ntulas o$tenidas in vitroa las condicionesmedioam$ientales e' vitro (suelo o algn sustrato inerte)

"El Cuaderno de PorQuBiotecnologa" es una herramienta didctica creada y desarrollada por elequipo pedaggico del Programa Educativo PorQuBiotecnologa !u reproduccin est autoriada#a$o la condicin de que se aclare la autora y propiedad de este recurso pedaggico por parte delPrograma Educativo PorQuBiotecnologa


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%igura 1 Etapas de la regeneracin in Vitro de ma#=uentes6 !tt"6>>???#cid#csic#es>de"artaments>genetica>torne>inde'C#!tml !tt"6>>???#$iologie#uni!am$urg#de>$online>e.-@.>maie#!tml

El 'ito de la tcnica de"ende de muc!os factores, entre ellos la edad de la "lanta (amaor edad, menor "otencial de regeneraci%n), el genoti"o las condicionesmediam$ientales# Entre las ventaas del cultivo in vitrode material vegetal, se "uedenincluir los tiem"os m7s cortos, la "osi$ilidad de ocu"ar un es"acio muc!o m7s "eque9oque si se desea "ro"agar material in vivo (ver Cuaderno N /-)#

'lgunos elementos necesarios para hacer cultivo de te$idos vegetales8ara llevar adelante este tra$ao, se necesitanequi"amientos que generen las condiciones necesarias deesterilidad, como los /lu$os laminares, que sonestaciones de tra$ao que !acen circular aire filtrado estril, "rotegiendo as& a la muestra con la que se deseatra$aar (figura 5)#

%igura 2 %lu$os laminares para el cultivo de te$idos Ge o$servauno de los modelos de fluo laminar que "uede usarse "ara "reservarla esterilidad de las muestras# Imagen6???#aelsa#com>la$oratorioH#!tml


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Fuente de carbonoGeneralmente se usa sacarosa. La fuente de carbono se necesita porque losexplantos no son completamente auttrofos, no pueden cubrir susnecesidades con la fotos!ntesis que pueden reali"ar in Vitro

#ustancias inorg$nicasacroelementos &', (, ), *a, g, #+ microelementos &Fe, *o, "n, 'i, , Al,n, o, *u, -+, en una proporcin adecuada para la planta elegida.

itaminasitaminas /, 0, 1, 2itamina 3, 2itamina 4, $cido flico, $cido nicot!nico,entre otras.

3ormonas reguladoresdel crecimiento

Auxinas promue2en la elongacin celular, la formacin de callos ra!cesad2enticias, in6iben la formacin de brotes axilares ad2enticios , a 2eces,in6iben la embriog7nesis.*itoquininas promue2en la di2isin celular, regulan el crecimiento eldesarrollo de los te8idos 2egetalestras giberelinas, $cido abs!cico, etileno.

e"clas de sustanciaspoco definidas

48emplos extracto de le2adura, extractos 2egetales.

ateriales inertes:sados como soporte. -ncluen agar, a"arosa, otros polisac$ridos, lana de2idrio, papel de filtro, arena.


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%igura 5 (a micropropagacin vegetal# < "artir de una "lanta madre, se o$tienen numerosos e'"lantosque, suetos a condiciones medios de cultivo adecuados, dar7n lugar a nuevas "lantas iguales o similares ala "lanta original, "ermitiendo su multi"licaci%n#


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Cultivo de clulas y rganos vegetales en #iorreactoresBna ve o$tenidos los callos a "artir de algn e'"lanto, los mismos "ueden disgregarse"ara o$tener una sus"ensi%n de clulas# 4a misma "uede utiliarse "ara generarem$riones som7ticos (la $ase de las semillas sintticas), o "uede directamentecultivarse "ara "roducir meta$olitos secundarios, que son com"uestos qu&micossintetiados "or las clulas vegetales en determinadas condiciones, con gran utilidad"ara las industrias farmacutica alimenticia, entre otras (ver Cuadernos F, ., .5,./, H5, H/, 5, 5.)# 8or eem"lo, son meta$olitos secundarios el mentol las drogasanticancer&genos vincristina ta'ol, algunos edulcorantes, entre otros# 4os cultivoscelulares se llevan a ca$o en $iorreactores, que son reci"ientes de distinta ca"acidad(de unos "ocos a miles de litros), dise9ados "ara "ro"iciar el crecimiento >o lamulti"licaci%n de distinto ti"o de clulas >u %rganos (figura -)#

%igura 7 Cultivo declulas y rganosvegetales< "artir de une'"lanto, se "uedenesta$lecer cultivos declulas "ara "roducircom"uestos de inters, o"ara o$tener em$rionessom7ticos semillasartificiales, entremlti"les a"licaciones#


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C89!:;E4'C:89E! :C'!El tema desarrollado en este Cuaderno se vincula con conce"tos "revios que los alumnos"oseen, "ro$a$lemente de la vida cotidiana, como es la multi"licaci%n de "lantas que"ueden realiar en su "ro"io ard&n o !uerta# Es im"ortante retomar en clase estasideas "revias tra$aarlas a "artir de los conce"tos te%ricos que se "resentan en elCuaderno# Esto se ver7 favorecido con el an7lisis de te'tos con la realiaci%n deltra$ao "r7ctico que se "ro"one, el cual "uede llevarse a ca$o en la escuela, conmateriales cotidianos en forma sencilla#Gi estos temas se incluen al tra$aar el tema re"roducci%n, es interesante que losalumnos "uedan esta$lecer similitudes diferencias entre los diferentes ti"os mecanismos de re"roducci%n que "resentan las "lantas los animales# Ge "ueden incluirconce"tos tales como6 %rganos re"roductivos, clulas se'uales, meiosis, mitosis,fecundaci%n, gestaci%n, semilla, tero, etc#4os temas vinculados con las "lantas su crecimiento se a$ordan !a$itualmente desde

los niveles inferiores de la ense9ana escolar, "articularmente a "artir de e'"erienciasde germinaci%n de semillas, o del estudio de la fotos&ntesis# Gin em$argo, los conce"tosvinculados con el ciclo de vida de las "lantas suelen ser temas com"leos que, enocasiones, llevan a errores conce"tuales# Entre ellos, uno de los m7s frecuentes entrelos alumnos es la confusi%n entre los "rocesos de fotos&ntesis res"iraci%n en las"lantas, o la "oca claridad en cuanto a la relaci%n entre la flor, el fruto la semilla#Gi $ien este Cuaderno no est7 destinado es"ec&ficamente a tra$aar esos conce"tos, esim"ortante clarificarlos, se "ueden incor"orar al estudiar la re"roducci%n enanimales, en el ser !umano, com"arar las estructuras "rocesos que involucran# 4acom"rensi%n de estos "rocesos "ermite inter"retar c%mo la $iotecnolog&a "odr&a

intervenir en su modificaci%n (ver Cuaderno N F)#:tro as"ecto que es "osi$le tra$aar con los alumnos se refiere al conce"to mismo dela clonaci%n# Ka$itualmente, se considera la clonaci%n una tcnica nueva de$ido,fundamentalmente, a la difusi%n que reci$i% en los medios de comunicaci%n la clonaci%nde la ovea Doll# Es interesante inter"retar la clonaci%n de "lantas como un"rocedimiento antiguo (que, de !ec!o, realian en sus casas al cortar un gao de una"lanta) , a su ve, "lantear las diferencias que "resenta con la clonaci%n de animalescuas clulas difieren en cuanto a su toti"otencialidad#Este Cuaderno, a su ve, resulta una fuente interesante de informaci%n que se "uedeada"tar al aula en tra$aos m7s sim"les destinados a com"render c%mo tra$aan losinvestigadores, c%mo se realia un cultivo de clulas c%mo es "osi$le o$servar clulas#Ge sugiere introducir estas ideas a "artir de conocimientos m7s cotidianos que tienenlos alumnos# 8or eem"lo, es "osi$le que a muc!os alumnos se les !aa "racticado enalguna o"ortunidad un e'udado de fauces, como consecuencia de una infecci%n o dolorde garganta# Ge "uede utiliar este caso "ara e'"licar qu !ace luego el mdico con esamuestra, c%mo se !ace el cultivo de clulas en el la$oratorio de an7lisis, la detecci%n de$acterias la realiaci%n de un anti$iograma "ara determinar el anti$i%tico a recetar#Esta ser&a una a"licaci%n "r7ctica m7s "r%'ima a los alumnos que "odr&a acercar elconce"to de cultivo de clulas su utilidad, m7s all7 de su uso en la investigaci%n



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$7sica# 8ara tra$aar estas ideas se sugiere realiar una e'"eriencia sim"le de cultivode microorganismos (ver erminacin de porotos de so$a in vitro-Esta actividad e'"erimental inclue varios "asos, "or lo que se sugiere una lectura"revia con los alumnos de toda la e'"eriencia, antes de ir al la$oratorio "arainter"retar cada eta"a, familiariarse con la metodolog&a a em"lear, conocer loso$etivos de la e'"eriencia, las o$servaciones registros que de$er7n realiar#


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Gi los gru"os de$en com"artir elementos de tra$ao, es im"ortante que el docenteordene los gru"os "ara tra$aar de manera organiada, sin que se amontonen alumnos se corran riesgos#

a# 8re"araci%n de medio de cultivo2ateriales6 so$re de gelatina sin sa$or, cantidad "ara litro de gelatina# Nota6 en el "r7ctico selo disuelve con menos l&quido "ara que resulte m7s consistente# . g de acar F5 ml# de agua caliente 2ec!ero de Aunsen :lla a "resi%n . $otellas de litro de vidrio resistente al calor, con ta"a

8rocedimiento# Dividir el agua en dos $otellas de litro de vidrio agregar la gelatina sin sa$or de

forma equitativa en los dos frascos#.#


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8ina de metal eci"ientes $ien lim"ios "ara desinfectar las semillas

8rocedimiento# Bsando una "ina estril, "asar los granos de soa durante un minuto "or una

soluci%n de alco!ol FO#.# 4uego sumergirlos en lavandina al .O durante 5 minutos "or ltimo, darles H

lavados en agua estril#Nota6 Janto "ara la desinfecci%n como "ara la siem$ra, la "ina se esteriliar7 de la siguientemanera6 moar la "ina en alco!ol "uro, quemarla a roo en el mec!ero, dear enfriar Esto serealiar7 al inicio de cada eta"a que requiera el uso de la "ina# Gi la "ina se usa muc!as veces"ara lo mismo, solo se moar7 la "ina con alco!ol se quemar7 sin llevar a roo# No usar guantesmientras se tra$aa con el mec!ero#

d# Giem$ra# Gem$rar con "ina estril H granos "or frasco de modo que el !ilio ("unto oscuro)

quede !undido en el medio de cultivo el resto del grano "or encima del mismo#.#


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es"uestas6# Gustancias nutritivas, "or eem"lo,

acar, "ara los em$riones que se desarrollan en las semillas, o "ara cualquierorganismo que creca en ese medio#

.# El medio de cultivo se de$eesteriliar "ara eliminar cualquier agente e'tra9o, como microorganismos, que"uedan !a$erlo contaminado que "odr&an alterar los resultados de la e'"eriencia#

3# Ge esterilia con calor# >???#i"n#uniTiel#de>ei$e>BNIJ/EG#8D=

F# 2icro$ios molculasM >???#i"n#uniTiel#de>ei$e>BNIJEG#8D=

-# Aart!elem , Da?son U, 4ee < (/FF) Jcnicas "ara el la$oratorio de $iolog&a# Com"a9iaEditorial Continental

/# Devlin, # (/F) =isiolog&a vegetal# Editorial :mega## 8ieriT, #4#2# (/-F) In vitroculture of !ig!er "lants# Editorial 2artinus Ni!off 8u$lis!ers# Gtras$urger, E# (/-) Jratado de Aot7nica# Editorial 2arin

http://fai.unne.edu.ar/biologia/reproduccion/sexual.htm#INDICEhttp://fai.unne.edu.ar/biologia/reproduccion/sexual.htm#INDICEhttp://www.urbanext.uiuc.edu/gpe_sp/index.htmlhttp://www.ipn.uni-kiel.de/eibe/UNIT09ES.PDFhttp://www.ipn.uni-kiel.de/eibe/UNIT01ES.PDFhttp://fai.unne.edu.ar/biologia/reproduccion/sexual.htm#INDICEhttp://www.urbanext.uiuc.edu/gpe_sp/index.htmlhttp://www.ipn.uni-kiel.de/eibe/UNIT09ES.PDFhttp://www.ipn.uni-kiel.de/eibe/UNIT01ES.PDF

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