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UNIVERSIDAD DE COLIMA .
EL EFECTO DE LA TERBUTALINA SOBRE EL ACOPLE
EXCITACIÓN CONTRACCIÓN EN FIBRAS MUSCULARES LENTAS
DE RANA PIPIENS.
TESIS
Que para obtener el grado de
DOCTOR EN CIENCIAS MEDICAS
Presenta:
M. en C. RAUL LOPEZ ASCENCIO
ASESOR: D. en C. MIGUEL HUERTA VIERA
COASESOR : D. en C. XOCHITL A. R. TRUJILLO TRUJILLO
Colima, Col. septiembre del 2001.
DEDICATORIAS.
A mi esposa:
Martha Alicia Madrigal Madrigal:
Por su apoyo incondicional en todo momento.
A mis hijos:
Laura y Raúl.
Por cederme parte de su tiempo que ya no
podré regresárselos.
A mis Asesores:
Dr. Miguel Huerta Viera
Dra. Xochitl Trujillo Trujillo
Por brindarme su apoyo y su valiosos tiempo
para la realización de este trabajo.
A la Universidad de Colima:
De forma muy especial a los
Dres. Carlos Salazar Silva y Ramón A.
Cedillo Nakay; Por brindarme la
oportunidad de realizar esta Tesis.
A todos aquellos que de una u otra
forma me brindaron su apoyo incondicional
Gracias: Mario, Raymundo, Leo, Juan Carlos.
Colima, Colima. Septiembre del 2001.
INDICE
Página
RESUMEN.................................................................................................. 1
SUMMARY ................................................................................................ 2
I.- INTRODUCCIÓN ...................................................................................... 3
II.- ANTECEDENTES ...................................................................................... 5
2.1 Sarcolema ............................................................................................... 6
2.2 Túbulos-T. .............................................................................................. 7
2.3 Miofibrillas ............................................................................................. 10
2.4 Núcleo .................................................................................................... 11
2.5 Mecanismo de acople entre la excitación y la contracción ..................... 12
a).- Movimiento Intramembranal de Cargas .............................................. 15
b).- Control de la Liberación de Calcio Intracelular .................................... 16
2.6 Agonistas Adrenérgicos ......................................................................... 18
2.7 Clasificación de los receptores adrenérgicos ......................................... 19
2.8 Función de los receptores adrenérgicos β . ............................................. 19
2.9 Agonistas beta adrenérgicos. ................................................................. 21
A).- ANTECEDENTES MEDIATOS. ........................................................ 21
B).- ANTECEDENTES INMEDIATOS ...................................................... 26
a).- La Terbutalina ......... ............................................................................. 26
III.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................... 27
IV.- JUSTIFICACIÓN ....................................................................................... 28
V.- HIPÓTESIS ................................................................................................ 29
5.1 Hipótesis nula ........................................................................................ 29
5.2 Hipótesis alternativa ............................................................................... 31
VI.- OBJETIVO GENERAL................................................................................ 30
6.1 Objetivos específicos ............................................................................ 30
VII.- METODOLOGÍA ...................................................................................... 31
7.1 Diseño experimental .............................................................................. 31
7.2 Universo de estudio ................................................................................ 31
7.3 Definición de las unidades de observación ........................................... 31
7.4 Definición de las unidades de control ...................................................... 31
7.5 Criterios de inclusión ............................................................................... 32
7.6 Criterios de no inclusión .......................................................................... 32
7.7 Criterios de eliminación .......................................................................... 32
7.8 Proceso experimental ............................................................................... 32
7.8.1 Curva concentración respuesta ............................................................. 34
7.8.2 Contracturas en cero calcio ................................................................... 34
7.8.3 Soluciones ............................................................................................. 35
7.8.4 Reactivos ............................................................................................... 35
7.8.5 Análisis estadístico ................................................................................ 36
VIII.- RESULTADOS. .......................................................................................... 37
8.1 Efecto de la terbutalina sobre la contractura por K+. ............................... 37
8.2 Curva Concentración-Respuesta a la terbutalina en haces
de fibras lentas de Rana pipiens. ................................................................... 40
8.3 Modulación del curso temporal al pico máximo de tensión
por la terbutalina. ....................................................................................... 41
8.4 Recuperación del pico máximo de tensión después de la contractura de prueba.
8.5 Efecto de la terbutalina en contracturas realizadas en cero calcio. ......... 41
IX.- DISCUSIÓN. ............................................................................................... 45
X.- CONCLUSIONES. ...................................................................................... 47
XI.- BIBLIOGRAFÍA. ........................................................................................ 48
RESUMEN.
Introducción: La terbutalina es un agonista ß2 selectivo, que produce relajación del músculo
liso bronquial lo que lo vuelve útil en el manejo del asmático, sin embargo, el temblor
producido por la activación de receptores ß2 del músculo esquelético tiende a limitar su uso
(Hoffman y Lefkowitz, 1996). Objetivo: Conocer el efecto de la terbutalina sobre el acople
excitación contracción en los haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis de Rana
pipiens. Método : Se realizaron contracturas con alto potasio en haces de fibras tónicas del
músculo crulalis de rana, en soluciones con 1.8 mM de calcio y libres de calcio, en presencia
y ausencia de terbutalina. Resultados : La terbutalina produjo una disminución en la fuerza de
la contracción en fibras lentas del músculo cruralis de Rana pipiens, ésta fue dependiente de la
concentración, con una CE50 de 3 µM. Además, se produjo un retraso en el inicio del pico
máximo de tensión hasta de 24 segundos para concentraciones de 10 µM de terbutalina. La
concentración de 10 µM de terbutalina produjo una disminución del pico máximo de tensión
en un 18 % en soluciones sin calcio extracelular. Conclusión: El efecto de la terbutalina sobre
la fuerza de contracción en fibras lentas de rana, es dependiente de la liberación de calcio a
partir de fuentes intracelulares, como es el retículo sarcoplásmico.
SUMMARY.
Introduction: Terbutaline is a ß2 selective agonist, that produces relaxation in bronchial
smooth muscle being useful in the management of the asthmatics, however the trembling
produced by the activation of receptors ß2 in skeletal muscle tends to limit its use (Hoffman
and Lefkowitz, 1996). Objective: To Know the effect of terbutaline upon the excitation-
contraction coupling in fascicles of slow muscle fibers from crulalis of the frog Rana pipiens.
Method: The contracture with high potassium were carried out in tonic fibers of the crulalis of
the frog, in solutions with 1.8 mM of calcium and free of calcium, in the presence and in the
absence of terbutaline. Results: Terbutaline produced a decrease in the strength of the
contraction in slow fibers of the crulalis muscle of the frog Rana pipiens, an effect dependent
of the concentration, with a CE50 of 3 µM. Besides, a delay was produced in the beginning of
the peak of tension even in 24 seconds for concentrations of 10 µM of terbutaline. The
concentration of 10 µM of terbutaline produced a decrease in maximum peak of tension in
bout 18% in solutions without calcium. Conclusion: The effect of terbutaline upon the
strength of contraction in slow fibers of frog, is clerk of the liberation of calcium from
intracellular organelles as sarcoplasmic reticulum.
I.- INTRODUCCIÓN.
El músculo esquelético de rana posee dos tipos diferentes de fibras musculares; Las
fibras rápidas y las tónicas o lentas. Las fibras musculares lentas presentan una contracción
lenta y graduada con estimulación del nervio, diferente a la de las fibras rápidas, además, son
capaces de mantener su tensión muscular cuando su membrana se mantiene despolarizada de
manera continua (Kuffler y Vaughan Williams, 1953; Huerta, Muñiz y Stefani, 1985). El
desarrollo de tensión isométrica en respuesta a despolarizaciones intensas se instala cerca de
10 veces más lentamente que en las fibras rápidas y la relajación en respuesta a la
repolarización es igualmente lenta (Nuñez,1987). El desarrollo de tensión inducido por
despolarizaciones producidas con alto potasio, o con fijación de voltaje se mantiene mientras
perdura la despolarización. Para despolarizaciones sostenidas, a valores del Potencial de
membrana en reposo (Em) más positivos que - 40mV, la meseta está precedida de un pico
inicial de tensión (Nuñez, 1987). En las fibras tónicas, el pico inicial al igual que en las fibras
rápidas depende de Ca++
liberado de fuentes intracelulares (Gilly y Hui, 1980). Además se
conoce que el Ca++ extracelular es importante para el mantenimiento del desarrollo de
tensión durante despolarizaciones prolongadas (Luttgau,1963; Godt et al. 1984; Huerta, 1984).
Actualmente se conoce que las fibras tónicas de anfibio presentan una doble fuente de Ca++
activador, una fuente externa, y el retículo sarcoplásmico (Huerta y Stefani, 1981; Huerta,
Muñiz, y Stefani, 1985).
Así, cuando las fibras lentas son bañadas con altas concentraciones de K+ se producen
contracciones sostenidas, las cuales presentan dos fases: una fase temprana, y una fase de
mantenimiento; donde el Ca++
externo parece que no es esencial durante la fase temprana del
desarrollo de tensión (Miledi, Parker y Schalow, 1977; 1981 ). En contraste, el Ca++
extracelular es importante durante el mantenimiento de la fase de contractura en fibras lentas
de pollo (Page, 1969; Huerta y Stefani, 1981; Kikucki y Schmidt, 1983) y en Rana pipiens
(Huerta, Muñiz y Stefani, 1985).
Existen evidencias de que las aminas simpático miméticas modulan la contracción y
relajación en fibras de músculo esquelético de mamífero (Tomita, 1975; Bowman 1980;
Williams y Barnes, 1989). La naturaleza de la respuesta depende del tipo de fibras del
músculo: en fibras musculares de sacudida rápida, la fuerza medida al pico de la sacudida se
incrementa 10 a 20 % y la relajación se enlentece (Bowman y Zaimis, 1958; Bowman et al.
1962; Tashiro 1973; Tomita 1975; Holmberg y Waldeck 1980). En contraste, la fuerza al pico
de la sacudida es deprimida en un 10 a 25 % en fibras musculares de sacudida lenta y la
relajación de la sacudida es acelerada (Bowman y Zaimis 1958; Bowman et al. 1962; Tashiro
1973; Tomita 1975). Sin embargo, bajo algunas condiciones la fuerza se incrementa en
músculos de sacudida lenta (Tashiro 1973; Tomita 1975; Holberg y Waldeck, 1980) o en
fibras tónicas (Huerta et al. 1991).
La terbutalina es un agonista β2 selectivo que en clínica es conocida como un
broncodilatador ß2 selectivo. Se ha utilizado para el tratamiento prolongado de las
enfermedades obstructivas de las vías aéreas y para tratar el broncoespasmo agudo (Creticos,
1993; Brown, 1993). Además, se ha utilizado en la prevención del parto prematuro (Vera,
1998). El uso continuo de la terbutalina genera efectos adversos tales como el tremor, por
estimulación de receptores ß2 del músculo esquelético, provocando un aumento en la
amplitud de los movimientos en el rango de frecuencia de los temblores fisiológicos (Lulich et
al. 1986).
En estudios realizados con terbutalina por Cairns y Dulhunty (1993) en fibras
musculares rápidas con sacudida única y en tétanos, ésta incrementa el pico de tensión y
disminuye el tiempo de la relajación en las preparaciones estudiadas. Sin embargo, no se han
realizado estudios con terbutalina en fibras lentas.
Por lo anterior se decidió conocer la actividad que la terbutalina produce en fibras
musculares lentas de Rana pipiens.
Para conocer el efecto de la terbutalina en fibras lentas se utilizaron haces pequeños (<
500 µm de diámetro) de fibras musculares tónicas de músculo cruralis de Rana pipiens, estos
fueron sometidos a soluciones con alto K+ (40 mM) con concentraciones de cero y de 1.8
mM de calcio en presencia y en ausencia de terbutalina.
En las contracturas con alto potasio y 1.8 mM de calcio la terbutalina produjo una
disminución del pico máximo de tensión dependiente de la concentración de terbutalina con
una CE50 de 3 µM, además de un retraso en la aparición del pico máximo de tensión hasta de
24 segundos para concentraciones de 210 µM de terbutalina, estos efectos sugieren la
presencia de receptores ß2 en las fibras musculares lentas de Rana pipiens, además que la
terbutalina no solo está afectando la cantidad de Ca++ liberado por el RS , sino la velocidad en
que este Ca++ es liberado por el mismo RS ( Hayatsu et al. 1981;Huerta et al. 1991).
Las contracturas realizadas en cero calcio permitieron aseverar que el efecto que la
terbutalina produce es a través de una disminución de la liberación de calcio por el retículo
sarcoplásmico, como se demuestra con la disminución del 18.8 % como promedio del pico
máximo de tensión producido por la terbutalina en cero calcio (Huerta, Muñiz y Stefani;
1986).
Aunque para concentraciones bajas de terbutalina (0.1nm y 1.0 µM) la recuperación del pico
máximo de tensión es casi completa (hasta un 97 % respecto al testigo), ésta difiere mucho
para concentraciones mayores (10 y 100 µM), donde la recuperación es incompleta (80.5
hasta un 59 % respecto al testigo). Al parecer, la recuperación es dependiente de la dosis. Sin
embargo, es muy posible que la recuperación sea incompleta solo para el tiempo de lavado
estudiado, y aunque se dejaron para algunas preparaciones hasta 1.5 horas la recuperación no
fue total. Esto podría atribuirse a un efecto metabólico producido por la activación de los
receptores β y la cascada de segundos mensajeros. Por otro lado, la lesión de la fibra podría
ser otra posibilidad que pudiese explicar la recuperación incompleta de los fascículos después
del lavado (Hoffman y Lefkowitz, 1996). De los resultados obtenidos se puede concluir que la
terbutalina produce una disminución de la tensión en fibras musculares lentas posiblemente
por un efecto ß2 adrenérgico, secundario a una disminución de la liberación de calcio por
fuentes intracelulares.
II.- ANTECEDENTES
El tejido muscular esquelético está compuesto por células multinucleadas llamadas
fibras, cuya longitud varia desde unos milímetros hasta varios centímetros y su diámetro entre
10 y 100 µm. Las células musculares esqueléticas no tienen ningún tipo de conexión entre sí
como ocurre con las células cardiacas, pero están unidas por tejido conectivo que las rodea y
que contiene a los capilares y a los nervios. Al tejido conectivo que rodea a las células
musculares se le llama endomisio y al que rodea a grupos de 10 a 20 células para formar un
fascículo se le llama perimisio. Los fascículos a su vez están agrupados por el epimisio
formando haces que son visibles a simple vista (Nuñez, 1987). Desde el punto de vista
esquemático es posible distinguir dos tipos de fibras, unas pálidas y otras más rojas, lo cual
permite correlacionar el color, la estructura, las propiedades mecánicas y las características
metabólicas de las fibras (Franzini-Armstrong y Peachey, 1981).
La gran mayoría de las células musculares son inervadas por un solo axón que termina
en una región especializada del músculo conocida como placa neuromuscular. Una neurona
puede inervar hasta 1000 fibras, pero en algunos músculos de movimiento fino como en los
oculares extrínsecos la relación puede ser 1:1. En la placa neuromuscular el axón se engruesa
y se pone en contacto casi directo con la membrana celular quedando separadas por una
hendidura o surco sináptico (Anderson- Cedergren, 1959). La neurona y las fibras musculares
inervadas por ésta, forman lo que se denomina “unidad motora”. Así las fibras musculares que
componen una unidad motora son del mismo tipo, pero un fascículo muscular puede contener
un 90 % de fibras del tipo rápido y un 10 % del tipo lento como ocurre en el flexor largo del
dedo del gato (Gauthier, Burke, Lowey y Hobbs, 1983), en el caso del sóleo del mismo
animal las fibras son casi todas de tipo lento ( Burke, Levine, Salcman y Tsairis, 1974).
En las fibras lentas de contractura de la rana, el único axón que las inerva forma
numerosas uniones neuromusculares relativamente pequeñas, en cambio en las fibras rápidas
(de sacudida) se forman pocas uniones o una unión más grande (Gauthier et al. 1983).
2.1 Sarcolema.
La célula muscular esquelética esta rodeada de una membrana plasmática: el sarcolema
(del griego sarcos = carne, lema = cáscara), que al igual que las demás células eucariontes,
está formada de una doble capa de fosfolípidos con proteínas inmersas para formar una
estructura de 8-10 nm de espesor, es continua y envuelve a todo el material contráctil,
organitos, núcleos y sarcoplasma (Nuñez, 1987). Visto el sarcolema a través del
microscopio electrónico, éste presenta depresiones mas o menos marcadas conocidas como
caveolas, las cuales aumentan el área aparente de la célula muscular por un factor de 1.8. Sin
embargo, se conoce que la longitud de la sarcómera es de 2.4 µm, entonces podrían servir
como una reserva de membrana que permite el estiramiento de la fibra sin que ésta se rompa
(Dulhunty y Franzini -Armstrong, 1975). De algunas de estas caveolas se originan
invaginaciones del sarcolema que en forma de delgados tubos constituyen lo que se llama
sistema de tubulos-T.
2.2.- Túbulos-T.
El sistema-T o sistema tubular transverso es el conjunto de túbulos-T de una célula
muscular, cuyo interior está en continuidad con el espacio extracelular (Huxley, 1964). En los
músculos rápidos de la rana cada túbulo-T está frente a la línea Z, mientras que en los
músculos lentos de los vertebrados y en la mayoría de los músculos de los invertebrados, la
disposición del sistema-T no es tan regular. En el túbulo-T se describen dos componentes
básicos: una porción delgada de sección circular y otra aplanada que se relaciona con el
retículo sarcoplásmico (RS) (ver figura 1). Esta última porción ocupa un 67% de la superficie
total del túbulo-T (Mobley y Eisenberg, 1975). En el músculo esquelético los túbulos-T tienen
un diámetro de 50 nm .
Figura 1.- Corte longitudinal del músculo sartorio de rana. En este se puede apreciar
los diferentes tipos de bandas que conforman el músculo esquelético. A nivel de las líneas z se
puede observar los túbulos-T (Nuñez, 1987).
El retículo sarcoplásmico. Todas las células superiores (eucariontes) tienen organitos
membranosos, éstos son sistemas de membranas que forman compartimientos cerrados,
aislados tanto del exterior como del citoplasma, uno de estos sistemas lo constituye el retículo
endoplásmico, rugoso y liso. Esta última porción adquiere gran importancia morfológica y
funcional en el tejido muscular en general. En las células musculares, este organito se
denomina retículo sarcoplásmico (RS). Las primeras descripciones que confirmaron su
existencia se hicieron con el microscopio electrónico (Benett y Porter, 1953; Fawcett,1961;
Revel 1962; Peachey 1965), describiéndolo como un sistema de cisternas y túbulos dispuestos
en sentido longitudinal entre las fibras contráctiles ( ver figura 1). En el músculo rápido de la
rana (Peachey, 1965) se distinguen tres porciones: a).- Una porción de sacos aplanados que
tienen contacto con el túbulo-T, llamado cisternas terminales. b).- Una segunda porción de
tubos longitudinales que se unen a los anteriores y, c).- una red fenestrada que rodea a las
miofibrillas a nivel de la banda A. Las dos últimas porciones del RS se encuentran
estrechamente relacionadas con el material contráctil y forman una malla de delgados tubos
que unen a dos cisternas terminales.
Las estructuras más estudiadas son las cisternas dilatadas, llamadas cisternas
terminales; una o dos de éstas forman, junto con un túbulo-T, las llamadas tríadas, estructuras
en las que se efectúa el mecanismo de acople excitación-contracción. La tríada se forma por la
oposición estrecha de los dos sistemas membranosos, el RS y el sistema-T. La tríada la
forman dos cisternas terminales junto con una porción aplanada de un túbulo-T y
aproximadamente el 27 % del área total del RS forma parte de las tríadas (Mobley y
Eisenberg, 1975). Cuando los elementos son dos no tres se llama díada. Aproximadamente, de
un 60 a 70 % del área de la membrana del túbulo-T está asociada al RS ( Peachey, 1965;
Mobley y Eisenberg, 1975). Entre los dos sistemas membranosos queda un espacio de
aproximadamente 10 nm , que es ocupado por los pies , estructuras que miden 10 nm y tienen
una disposición regular sobre la membrana del RS , con una densidad de 1000/ µm2 (Franzini-
Armstrong, 1974).
La homogenización del músculo permite obtener dos fracciones microsomales
provenientes del RS: la fracción pesada y la fracción ligera. La primera se cree que
corresponde a las cisternas terminales, y la segunda a los elementos longitudinales. Hace poco
tiempo se comprobó la acumulación de Ca++
en la cisterna terminal (Somlyo, Shuman y
Somlyo, 1977). Más recientemente se han descrito otras estructuras en el espacio entre las
membranas de la tríada: los pilares. Mientras que el músculo en reposo tiene unos 40 pilares
por µm2, estos aumentarán a 66 cuando las fibras desarrollan contracturas con soluciones con
altas concentraciones de potasio, por esto se cree que éstos intervienen en el mecanismo de
acople excitación-contracción, ya sea como consecuencia de un movimiento de cargas fijas en
la membrana o de corrientes iónicas a través de ellas (Eisenberg y Eisenberg , 1982).
2.3.- Miofibrillas.-
Las estructuras más obvias de la fibra muscular son las miofibrillas, las cuales son las
unidades responsables de la contracción y relajación de la fibra. En los músculos estriados
esquelético y cardiaco las fibras muestran bandas claras y obscuras o estriaciones
características que se originan por la ordenación periódica de las dos proteínas contráctiles
(actina y miosina) a lo largo de cada miofibrilla, y por la coincidencia de esta ordenación entre
las diferentes miofibrillas. Las miofibrillas tienen de 0.5 a 2.0 µm de diámetro, se extienden a
todo lo largo de toda la fibra. Así la disposición regular de las proteínas a lo largo de la
miofibrilla da a la fibra muscular su apariencia bandeada bajo el microscopio. La banda clara
o banda I (de isotrópica) se tiñe menos intensamente con los colorantes histológicos, es menos
refringente cuando se observa con luz polarizada y aparece menos densa cuando se observa al
microscopio electrónico (ME). La otra banda, la banda A (de anisotrópica) se tiñe más
intensamente, desvía a la luz polarizada y se ve más densa al ME. En medio de la banda A, se
ve una banda clara llamada H; y en medio de la banda I se distingue una banda estrecha, que
se tiñe intensamente: la línea Z o disco Z. La estructura que queda comprendida entre dos
líneas Z se llama sarcómera, que además corresponde a la unidad contráctil del músculo
estriado (figura 1).
En la miofibrilla se distinguen dos tipos de filamentos contráctiles: los gruesos y los
delgados. Un tercer tipo de filamentos , los filamentos intermedios, no tienen función
contráctil, sino mecánica (Wang y Ramírez-Mitchell, 1983). Los filamentos gruesos y
delgados se disponen de tal manera que su sobreposición genera las bandas obscuras y claras
atrás mencionadas. Los filamentos gruesos tienen unos 10 nm de diámetro mientras que los
delgados tienen unos 5 nm. Los filamentos gruesos miden 1.5 µm de largo y su longitud es
muy constante en cada músculo; en cambio, los filamentos delgados tienen una longitud
variable en cada sarcómera (Traeger y Goldstein, 1983).
Los filamentos gruesos están formados por la proteína miosina, y presentan dos zonas:
una zona larga formada por dos cadenas ligeras de miosina arregladas en forma de una
estructura enrollada que terminan en una zona que tiene forma de bastón formada por dos
cabezas de miosina, las cuales poseen actividad ATPásica y son capaces de unirse a la actina.
Las moléculas de miosina están orientadas a partir del centro del filamento grueso en sentidos
opuestos dando así una simetría de orientación. Las colas de miosina se asocian entre sí
formando el cuerpo del filamento grueso (Olguín, 1987). Los filamentos delgados están
formados por la unión de moléculas de actina G. Esta se encuentra dispuesta en dos cadenas
entrelazadas como una doble espiral que da un giro completo cada 35 nm. Además de la actina
G, otras dos proteínas forman parte de estos filamentos: la tropomiosina que forma una
estructura helicoidal y que proporciona un apoyo estructural al filamento delgado y la
troponina (Tn) la cual a su vez se encuentra formada por tres subunidades: la TnI (o subunidad
inhibitoria la que en reposo se une a la actina), la TnT (subunidad que se une a la
tropomiosina) y la TnC (la subunidad que fija al Ca++
). Durante la contracción, ambos tipos de
filamentos se deslizan entre sí, interdigitándose y como resultado de este proceso la
sarcómera se acorta ( Nuñez, 1987).
2.4.- Núcleo.
Las células musculares esqueléticas tienen varios núcleos pequeños que se disponen en
la periferia inmediatamente por debajo del sarcolema. Las mitocondrias aportan la energía a
las células musculares esqueléticas, en general los músculos que son resistentes a la fatiga
tienen una mayor cantidad de mitocondrias que los que se fatigan más fácilmente (Franzini-
Armstrong y Peachey, 1981). En los músculo semitendinoso y el sartorio de la rana las
mitocondrias ocupan del 1 - 1.5 % del volumen citoplasmático (Mobley y Eisenberg, 1975).
2.5.- Mecanismo de acople entre la excitación y la contracción (EC).
El mecanismo de acople excitación contracción (EC) tradicionalmente se ha descrito
como el proceso que une la excitación eléctrica de la membrana muscular con la contracción
muscular (Ríos y Pizarro, 1991) posiblemente corresponda a un conjunto de eventos cuyo
resultado final es la apertura de canales y la liberación de Ca++
. Este fenómeno ha sido objeto
de amplios estudios y existen a la fecha varias hipótesis para explicarlo, sin embargo, ninguna
de ellas ha sido completamente probada y, en términos generales, aún persiste como un
fenómeno por describirse (Uribe, 1989). Al parecer la dificultad consiste en conocer cuál de
los pasos es el responsable en el mecanismo de acople EC que explique la dependencia del
voltaje, la liberación de calcio y la cinética del incremento de la concentración del calcio
intracelular. Por lo que una completa descripción sobre el voltaje de activación y el acople
entre la EC requiere no solo de la identificación de las proteínas que participan, sino de la
interacción entre las proteínas, las propiedades funcionales de las mismas, y de la contribución
de cada proteína, además, de las características de cambios de tensión producidos por la
despolarización de la superficie de membrana (Dulhunty, 1992). A continuación se pretende
tratar de abordar las diferentes teorías que intentan explicar el proceso del mecanismo de
acople EC.
Desde hace tiempo se conoce que los iones de Ca++
funcionan como mensajeros
intracelulares en el acople entre el estímulo y la respuesta celular, en una gran variedad de
tipos celulares incluyendo a las células musculares (Ebashi,1980). En el músculo estriado las
evidencias experimentales señalan que: a) la contracción es activada por un incremento en la
concentración de Ca++
libre en el mioplasma; y, b) que el Ca++
es liberado al mioplasma en
respuesta a la despolarización del sarcolema y de sus invaginaciones (sistema de túbulos
transversos) (Luttgau,1977; Luttgau y Moisescu, 1978; Caputo, 1983). El acople EC en las
células musculares esqueléticas está asociado a un pequeño incremento en la capacitancia de
la membrana el cual es inducido por la despolarización (Schneider y Chandler, 1973 ;
Dulhunty y Gage, 1983). Es posible que este incremento de la capacitancia de la membrana se
deba al movimiento lento de los dipolos, o grupos cargados eléctricamente, que estarían
localizados en el interio r de las membranas de los túbulos transversos y que serían sensibles al
voltaje transmembranal. Así, este movimiento de cargas podría controlar la liberación de Ca++
del RS mediante el desplazamiento mecánico de macromoléculas dispuestas entre las
membranas del túbulo transverso y la cisterna terminal del mismo (Gilly, 1981; Schneider,
1981; Hui, 1982).
Otra hipótesis para explicar el acople entre despolarización del sarcolema y la
liberación de Ca++
por el RS considera que entre ambos sistemas membranales, el del túbulo-T
y el de la cisterna terminal del RS, se forman conexiones transitorias de baja resistencia
eléctrica, con características similares a las de las uniones comunicantes presentes en otros
tejidos. Así, la liberación de Ca++
se activaría como consecuencia de la propagación de la
despolarización desde los túbulos-T hacia las membranas del RS (Mathias, Levi y Eisenberg,
1981). El mencionado incremento de la capacitancia quedaría explicado por el movimiento de
cargas durante la formación de las conexiones eléctricas, así como por el flujo de corriente a
través de ellas (Gilly, 1981).
El mecanismo de liberación de Ca++
inducido por Ca++
fue primeramente propuesto a
partir de experimentos realizados en fibras de músculo esquelético de anfibios, desprovistas
de sarcolema (Endo, Tanaka y Ogawa, 1970). Dado que este proceso dista mucho ser un
efecto fisiológico, actualmente esta teoría resulta más convincente para algunos autores porque
así ocurre en el miocardio ventricular de mamífero (Fabiato, 1983).
Una manera adicional de entrada de Ca++
es a través de un transporte transmembranal
de este ión activado por la despolarización. La despolarización produce un incremento en la
permeabilidad al Ca++
, esto produce una corriente de calcio (ICa) a favor de un gradiente
electroquímico (Hagiwara y Byerly, 1981). Al igual que otros tipos de canales iónicos
regulados primariamente por el voltaje transmembrana, los canales de Ca++
(a través de los
cuales fluye la ICa) aún constituidos por proteínas oligoméricas intrínsecas de la membrana,
las cuales son capaces de responder a las alteraciones del campo eléctrico transmembrana con
cambios en su forma, que implica la apertura o el cierre del canal por el cual fluye el Ca++
(Reuter, 1983; Tsien, 1983).
Otro mecanismo que podría explicar la entrada de Ca++
activado por la despolarización,
consiste en el intercambio de Ca++
extracelular por Na+ intracelular, mediante la operación del
intercambiador Na+/Ca++ el cual es un grupo de macromoléculas de la membrana que
funcionan como acarreadores iónicos, donde la entrada de este ión se reflejaría como una
corriente entrante, intercambiándose 3 o 4 iones de Na+ por uno de Ca
++. Así, el
intercambiador generaría una corriente neta saliente (Mullins, 1981). Sin embargo, Tsien
(1983) menciona que el mecanismo del intercambiador es difícil de explicar, solo interviene
en el intercambio iónico puesto que la ICa depende del voltaje y del tiempo. Tampoco explica
como un número tan grande de iones de Ca++
pueden ser transferidos por segundo a través de
una vía permeable. Por otro lado, Reuter (1983), menciona que posiblemente el canal y el
intercambiador sean rutas diferentes para la entrada de Ca++ separadas tanto espacial como
funcionalmente. En el axón gigante de calamar se observan salvas sostenidas durante decenas
de segundo y se descarta que el intercambiador Na+/Ca++ sea el principal mecanismo de
entrada de Ca++
(Mullins y Requena , 1981).
Como fue anteriormente mencionado el proceso que enlaza la excitación
eléctrica (despolarización) de la membrana muscular con la contracción recibe el termino de
acople excitación-contracción (E-C). Sin embargo, más recientemente, este término es usado
para describir el acople entre la despolarización de la membrana de los túbulos-T y la
liberación de calcio a partir del retículo sarcoplásmico (RS). Es posible distinguir tres
cambios o pasos implicados en el mecanismo de acople E-C.
A).- El primer paso es el proceso de sensor de voltaje. Existen evidencias de que este
proceso inicia con el primer registro de movimiento intramembranal de cargas (MIC)
(Schneider y Chandler, 1973).
B).- El segundo paso es el proceso de la liberación de calcio. Técnicamente el curso
temporal del proceso de liberación fue primeramente inferido, por su consecuencia mecánica,
el desarrollo de tensión (Ashley et al.1974). Posteriormente, en los 70s fue medido, el
transiente de calcio, como un indicador de la concentración de calcio mioplásmico originado
por un estímulo adecuado. Más tarde fue posible derivar el flujo de calcio liberado desde el
transiente de calcio. En los mismos 70s fue posible medir el flujo de este calcio (corriente de
compuerta) y la corriente iónica a través de los canales fue medida con la técnica de fijación
de voltaje. Comprobándose años más tarde que el proceso de compuerta y de liberación de
calcio, es un proceso biofísicamente similar al flujo de sodio (Ríos y Pizarro, 1988).
C).- El tercer paso es la transmisión. Lo que es necesario para unir el sensor de voltaje
y el canal de compuerta.
a).- MOVIMIENTO INTRAMEMBRANAL DE CARGAS (MIC).
El termino MIC se refiere a la corriente que surge del movimiento de moléculas
cargadas que presumiblemente residen en la membrana celular. Este MIC puede envolver
naturalmente a las moléculas que se encuentran cargadas (aminoácidos con carga dentro de
una proteína) o iones solubles en lípidos adicionados en situaciones experimentales.
Estrictamente, el movimiento de cargas es una corriente eléctrica. El término es correcto
porque la corriente eléctrica es experimentalmente medible. Sin embargo, el término es usado
para referir procesos físicos que genera la corriente, la cual incluye cambios
conformacionales en las proteínas específicas de la membrana. El término de carga móvil o
carga móvil intramembranal, se refiere a las moléculas cargadas, presumiblemente proteínas
que se encuentran envueltas en el proceso de "movimiento de carga" y se refiere más
específicamente a la carga total que circula como una consecuencia de un cambio dado de
voltaje (usualmente un pulso de fijación de voltaje), siendo la integral del tiempo de la
corriente medida (Ríos y Pizarro, 1991).
La medición del MIC es difícil ya que en ella hay inmersas corrientes pequeñas y las
corrientes iónicas introducen error en la lectura. Asimismo, la técnica de brecha de vaselina
tiene la ventaja que estabiliza los microeléctrodos, pero presenta fallas en lo propio.
Existen dos formas básicas de medir el MIC: la carga 1, que consiste en la medición
de carga en fibras que se encuentran próximas al potencial de membrana y la carga 2, la cual
es medida en fibras despolarizadas.
En la corriente de carga 1, se presentan dos componentes con diferente cinética, Iß e Iγ .
Para algunos, las corrientes Iß e Iγ surgen de diferentes especies de sensores de voltaje; para
otros, la Iγ es consecuencia de la liberación de calcio. La carga 2, se relaciona con la
contribución de esta al potencial de reposo, sin embargo, parece ser que su incremento ocurre
en la transición al estado inactivado del sensor de voltaje en el acople E-C (Ríos y Pizarro,
1991).
b).- CONTROL DE LA LIBERACION DE CALCIO INTRACELULAR:
ACTIVACION.
En respuesta a la despolarización de los túbulos-T, el calcio es liberado hacia el
mioplasma desde las cisternas terminales del RS (Peachey y Franzini-Armstrong,1983).
a).- Transiente de calcio.
La medición del transiente de calcio se hizo con Antipyrylazo III, sin embargo, debido
a los errores en la lectura, el antipyrylazo es aceptado en la cinética del transiente pero no en la
medición absoluta de los cambios con el calcio intracelular (Baylor et al. 1985 )
b).- Cinética de activación: retardo en la transmisión.
En 1977, Miledi et al. mostraron que la latencia de la activación con arsenazo
III se encuentra entre 0.6 y 4 ms en fibras musculares de rana, utilizando la técnica de fijación
de voltaje (Miledi et al. 1979). Además, Miledi et al (1981), sugirieron que los pulsos
subumbrales reducen la latencia e incrementan el transiente de Ca++
. Este fenómeno establece
la correspondencia del activador hipotético con un proceso que aumenta antes de la liberación
de Ca++
(Miledi et al. 1983) y que es llamado acoplador.
c).- Flujo de liberación de Ca++
El Ca++
es liberado del RS y la concentración del ión libre se incrementa.
Posteriormente ocurre una rápida remoción desde la solución por un proceso de bombeo que
incluye la unión a sitios blanco sobre la troponina C del filamento de actina y eventualmente el
resecuestro al RS.
El transiente de Ca++
es el resultado de la liberación de Ca++
y el proceso de remoción
del mismo que se puede representar con la siguiente ecuación:
d ( (Ca++
)i (f))/ df = flujo de entrada - el flujo removido
De donde : la d = a la derivada
(Ca++
)i = es igual al calcio intracelular
(f) es el flujo de calcio y df = es la derivada del flujo
De tal forma que: la derivada del producto del calcio intracelular por el flujo del mismo entre
la derivada del flujo es igual al flujo de entrada menos el flujo removido.
1).- Dependencia de voltaje de la liberación de Ca++
Existen evidencias que muestran el pico de flujo de liberación de Ca++
como una
función de los pulsos de voltaje de prueba en una fibra usando la técnica de doble brecha de
vaselina con fijación de voltaje (Brum et al. 1988; Melzer, et al. 1986; Zhu, et al. 1986).
2.-Cinética de la liberación de Ca++ .
Miledi et al. (1983) presentaron que la magnitud del transiente de Ca++
dado por un
pulso era dependiente de la aplicación previa de pulsos condicionantes subumbrales. La
magnitud del transiente de Ca++
causada por los pulsos condicionantes decrece con el voltaje,
sin embargo, este decaimiento no ocurre a través de la inactivación dependiente del voltaje del
sensor (Brum et al.1988).
Schneider et al. (1987) explican el decaimiento del flujo de liberación como la
consecuencia de la depleción de Ca++
desde el RS por una activación dependiente de Ca++
,
presumiblemente operado por un canal de liberación. La depleción de la liberación de Ca++
del
RS, presumiblemente se da por que el Ca++
se encuentra unido a la parvalbúmina y es
explicado por un modelo de 2 pasos
Ca++
+ R ⇒ Ca++
R⇐⇒ Ca++
R
Donde la inhibición puede requerir de la unión directa del Ca++
sobre el canal liberador
o de la función de un mediador, esto es, la formación de un complejo calmodulina-Ca++
. Este
último, deprime el flujo de Ca++
en vesículas aisladas de RS (Meissner 1986).
2.6.- AGONISTAS ADRENERGICOS
En años recientes se ha acumulado una enorme cantidad de información sobre las
catecolaminas y compuestos relacionados, sin embargo, ésta no hubiese sido posible sin la
identificación de los receptores en los cuales estos interactúan.
Clasificación de los receptores adrenérgicos
Ahlquist (1948) propuso por vez primera la existencia de más de un receptor
adrenérgico, designándolos α y β para los receptores del músculo liso donde las
catecolaminas producen respuestas excitadoras e inhibidoras. Más tarde, los receptores β se
subdividieron en β1 (miocardio) yβ2 (músculo liso y otros sitios), por que la adrenalina y la
noradrena lina son esencialmente equipotentes en los primeros sitios, mientras que la
adrenalina es de 10-50 veces más potente que la noradrenalina en los últimos sitios (Lands et
al. 1967). Recientemente se ha aislado un gen humano que codifica para un tercer tipo de
receptor adrenérgico (β3, de tejido adiposo) (Emorine et al. 1989). La subdivisión de los
receptores α (α1 y α2) se basó en las consideraciones funcionales y anatómicas, al observarse
que la noradrenalina y otros agonistas α adrenérgicos podían inhibir la liberación de la
noradrenalina en las neuronas (Langer, 1980; Stark, 1987). Este efecto inhibitorio esta
mediado por receptores presinápticos a los cuales se les denominó α2 mientras que a los
receptores excitatorios postsinápticos se les denominó α1 (Langer y Lehmann, 1988).
2.7.- Función de los receptores adrenérgicos β.
Todos los receptores β adrenérgicos estimulan la adenilciclasa (enzima
membranal), fenómeno mediado por las proteínas G (G inhibitoria Gi, G estimuladora Gs). La
estimulación del receptor conduce a la acumulación de AMP cíclico (AMPc), lo cual activa a
la proteincinasa AMPc dependiente, que altera numerosas proteínas celulares como resultado
de la fosforilación (ver figura 2). La Gs puede aumentar directamente la activación de los
canales de Ca++
voltaje sensible en la membrana plasmática del músculo esquelético (Brown y
Birnabaumer, 1988). Gran número de compuestos sintéticos estructuralmente semejantes a las
catecolaminas naturales pueden interactuar con los receptores α o β adrenérgicos y producir
un efecto simpático mimético. A estos compuestos se les denomina agonistas α y β
(Lefkowitz et al. 1991).
Figura 2 .- En este esquema se muestra el mecanismo de acción de la activación de los
diferentes receptores adrenérgicos por los neurotransmisores. El neurotransmisor ( H) se
une al receptor (ß AR), activando la proteína Gs, que a su vez activa la adenilciclasa , como
resultado se produce un incremento de AMPc a partir de ATP. Este AMPc activa a la
proteincinasa A generándose la respuesta celular. (Lefkowitz, R. J., Hofman, B.B. y Taylor,
P. 1991)
2.8 Agonistas beta adrenérgicos
Los agonistas β adrenérgicos se hallan involucrados en varias circunstancias clínicas.
En la actualidad juegan un papel importante en el control del asma y como estimulantes
cardiacos. Existen agonistas como el isoproterenol que tiene efecto importante tanto en
receptores ß1 como en ß2, y que al ser utilizados en el control del asma provoca efectos
adversos al estimular a los receptores ß1. En concordancia, se han desarrollado drogas con
afinidad preferencial por los receptores ß2 en comparación con los receptores ß1. Sin embargo,
esta selectividad no es absoluta y se pierde con concentraciones elevadas de estas drogas. A
pesar de ello se les ha denominado agonistas ß2 selectivos. Entre estos fármacos se encuentran:
el metaproterenol, el albuterol, la terbutalina, el pirbuterol, y el bitolterol (Hoffman y
Lefkowitz, 1991).
A).- ANTECEDENTES MEDIATOS.
El músculo esquelético de rana posee dos tipos diferentes de fibras musculares; Las
fibras rápidas y las tónicas o lentas. Existen evidencias de que las fibras musculares lentas
presentan una contracción lenta y graduada con estimulación del nervio, diferente a la de las
fibras rápidas, además, son capaces de mantener su tensión muscular cuando su membrana se
mantiene despolarizada de manera continua (Kuffler y Vaughan Williams, 1953; Huerta,
Muñiz y Stefani, 1985).
Las fibras musculares de la mayoría de los músculos esqueléticos de anfibios son del
tipo de sacudida, en contraste las fibras tónicas solo constituyen un pequeño porcentaje en
algunos músculos como el iliofibularis, el piriformis (Elizalde, Huerta y Stefani, 1983; y el
cruraris (Muñiz 1981).
Características de las fibras tónicas. Estas fibras tienen un axón único que las inerva
formando numerosas uniones neuromusculares relativamente pequeñas; son incapaces de
generar potenciales de acción dependientes de sodio (Na+). Además la conductancia de la
membrana en reposo es extremadamente baja, dando lugar a propiedades eléctricas pasivas
como alta resistencia efectiva y grandes constantes de tiempo y de espacio (Stefani y
Steinbach, 1969). Se conoce que el sistema membranal interno está desarrollado, pero en
menor grado que en las fibras rápidas (Franzini-Armstrong, 1973). La activación y regulación
de la contracción, bajo condiciones fisiológicas, depende de la suma espacial y temporal de los
potenciales sinápticos lentos generados en las múltiples placas motoras a lo largo de la célula.
El desarrollo de tensión isométrica en respuesta a despolarizaciones intensas se instala cerca
de 10 veces más lentamente que en las fibras rápidas y la relajación en respuesta a la
repolarización es igualmente lenta (Nuñez,1987). El desarrollo de tensión inducido por
despolarizaciones producidas con alto potasio, o con fijación de voltaje se mantiene mientras
perdura la despolarización. Para despolarizaciones sostenidas, a valores del Potencial de
membrana en reposo (Em) más positivos que - 40mV, la meseta está precedida de un pico
inicial de tensión (Nuñez, 1987).
En las fibras tónicas, el pico inicial al igual que en las fibras rápidas depende de Ca++
liberado de fuentes intracelulares (Gilly y Hui, 1980). Para pulsos despolarizantes
relativamente cortos (< 100 ms) el incremento transitorio en la concentración de Ca++
libre
intracelular no se modifica apreciablemente al incrementar la despolarización de 0 a +100
mV, lo cual reduciría apreciablemente la entrada pasiva de Ca++
, además, estos cambios
transitorios en la concentración de Ca++
no se modifican cuando el Ca++
extracelular es
sustituido por Mg++
(Miledi et al. 1981), pero el Ca++ extracelular es importante para el
mantenimiento del desarrollo de tensión durante despolarizaciones prolongadas; primero la
amplitud de la meseta de las contracturas inducidas por potasio ( K+) 100 mM aumenta en más
del 100 % cuando la concentración extracelular de Ca++
es elevada de 0.25 mM a 4.0 mM.
Cuando la concentración de K+ es de 50 mM, la amplitud de la meseta aumenta en un 25 % si
la concentración de Ca++
se eleva de 2 mM a 20 mM (Luttgau,1963; Godt et al. 1984). El
incremento en la concentración externa de Ca++
durante la mesta de la contractura, aumenta
apreciablemente la amplitud de la misma (Huerta, 1984). La capacidad de mantener la tensión
durante una despolarización con K+ se pierde al reducir la concentración extracelular de Ca++
a
nivel µM y se recupera cuando la concentración de Ca++
es nuevamente elevada a mM. A
diferencia de las fibras rápidas, el Ni++
no es capaz de reemplazar al Ca++
en esta función
(Huerta, 1984). La elevación transitoria del Ca++
intracelular (utilizando arsenazo III), se
mantiene durante la despolarización prolongada en presencia de Ca++
(12 mM) en el medio
extracelular; pero no ocurre así si el Ca++
es reemplazado por Mg++
cuando la concentración de
Ca++
es de 1.8 mM , se observa un comportamiento intermedio ( Miledi et al. 1981).
Las propiedades eléctricas y mecánicas de las fibras tónicas están bajo control neural
(Huerta ,1974). Cuando las fibras tónicas son desnervadas adquieren la capacidad de generar
potenciales de acción dependientes de Na+ extracelular (Miledi et al. 1991; Bondi, et al.
1984), sin embargo, la propiedad de producir contracturas sostenidas se conserva en las fibras
desnervadas (Lehmann y Achmidt, 1979), pero se pierde si son reinervadas por axones de alta
velocidad de conducción (Miledi y Orkand, 1966) y se readquiere cuando los axones lentos
reestablecen contactos sinápticos normales (Elul et al. 1970). Por lo cual se puede argumentar
que los axones presentan una acción trófica sobre el mecanismo de acople entre la EC de las
fibras tónicas (Miledi et al. 1981).
Por otro lado, evidencias experimentales sugieren que la activación contráctil en fibras
lentas es mediada por un incremento en la concentración de calcio libre miosplásmico,
liberado desde almacenes internos de manera similar que en las fibras rápidas (Franzini –
Armstrong, 1973; Miledi, Parker y Shalow 1977; Gilly y Hui, 1980). La relajación de la
contracción es promovida por un secuestro de calcio en el RS o por la salida de calcio a través
del sarcolema. En diversas células, el intercambiador Na+/Ca++ ayuda a regular la
concentración intracelular de calcio (Blaustein, 1974; Donoso y Hidalgo, 1989). Existen
evidencias de que las fibras musculares tónicas de rana poseen un sistema de intercambiador
Na+/Ca++ el cual podría jugar un papel importante en la regulación del Ca++
intracelular. Por
otro lado, hay evidencias de que las fibras lentas no producen un potencial de acción (Gilli y
Hui, 1980). Sin embargo, en estudios recientes con la técnica de fijación de voltaje se
demostró la presencia de una corriente entrante lenta y sostenida de Ca++ en las fibras
musculares lentas (Huerta y Estefani, 1986), la cual podría participar en el proceso inicial que
es mediado por la translocación de Ca++
intracelular (Huerta, Muñiz, y Stefani, 1986).
Actualmente existen evidencias de que las fibras tónicas de anfibio presentan una doble fuente
de Ca++
activador, una fuente externa, y el retículo sarcoplásmico (Huerta y Stefani, 1981;
Huerta, Muñiz, y Stefani, 1985). Cuando las fibras lentas son bañadas con altas
concentraciones de K+ se producen contracciones sostenidas, las cuales presentan dos fases:
una fase temprana, y una fase de mantenimiento; donde el Ca++
externo parece que no es
esencial durante la fase temprana del desarrollo de tensión (Miledi, Parker y Schalow, 1977;
1981 ). En contraste, el Ca++
extracelular es importante durante el mantenimiento de la fase de
contractura en fibras lentas de pollo (Page, 1969; Huerta y Stefani, 1981; Kikucki y Schmidt,
1983) y en Rana pipiens (Huerta, Muñiz y Stefani, 1985). Por otro lado, algunos cationes
como el Ni++
, Co++
no pueden reemplazar al Ca++
en el mantenimiento de la tensión de fibras
lentas de pollo (Kikuchi y Schmidt, 1983) y en Rana pipiens (Huerta, Muñiz, y Stefani, 1985).
Sin embargo, Schmidt (1987) fundamenta que algunos cationes divalentes ( Sr++
, Ni++
. Co++
,
Cd++
y Mg++
), producen un efecto cualitativamente similar al producido por el Ca++
. En
contraste un efecto marcado fue descrito por Pauschinger y Brecht (1961), cuando los haces de
fibras fueron incubados por tiempo prolongado en bajo Ca++
. Miledi et al. (1977; 1981)
mencionan que en algunas especies las señales intracelulares de Ca++
durante el mantenimiento
de la despolarización, llega a convertirse en un transiente con bajas concentraciones de Ca++
.
En fibras lentas de Rana pipiens, la fase sostenida de la contractura con K+ es reducida
después de remover el Ca++
externo o por aplicación de nifedipina (Huerta et al. 1985). La
Nifedipina produce una disminución de la corriente de Ca++
(Almers, Fink y Palade, 1981) y
en fibras lentas de Rana pipiens produce un efecto similar (Huerta y Stefani, 1986). Por lo
que cabe la posibilidad de que el mantenimiento de la tensión sea dado por una entrada de
Ca++
, o por su unión a sitios superficiales de la célula (Huerta y Stefani 1986). Posiblemente
este último mecanismo sea esencial en fibras lentas de Rana temporaria, porque el
mantenimiento de la tensión, no solo es dado por el Ca++
externo, sino, por la adición de
algunos cationes divalentes (Schmidt, 1987). Existen evidencias de que los iones más
efectivos para el mantenimiento de la tensión son Co++
y Ni++
(Schmidt, 1987), sin embargo, en
fibras musculares rápidas producen bloqueo de canales de Ca++
(Almers y Palade, 1981;
Palade y Almers, 1985). De manera contrastante, el Mg++
presenta un efecto menor de bloqueo
de los canales de Ca++
, similarmente, la tensión desarrollada por éste es menor que la
producida por el Co++
y el Ni++
(Schmidt, 1987). De estos resultados se puede inferir que el
mantenimiento de la contractura es mejor entre menor sea la entrada de Ca++
(Schmidt, 1987).
Neuhaus (1987) fundamenta con fijación de voltaje que en fibras lentas o rápidas de rana, el
bloqueo de la entrada de Ca++
con Nifedipina prolonga la fase de meseta de la contractura.
Esto es, la unión de Ca++
u otros iones divalentes sobre sitios específicos en la superficie
celular, puede ser un factor importante en el mantenimiento de la tensión (Schmidt, 1987).
Existen evidencias de que la unión de Ca++
con sitios de superficie, origina un movimiento de
carga y que este movimiento es necesario para liberación de Ca++
desde almacenes
intracelulares (Brune et al. 1987).
B).- ANTECEDENTES INMEDIATOS.
a).- LA TERBUTALINA
La estimulación de receptores β2 causa relajación tanto en el músculo liso uterino
como en el músculo bronquial. Desde hace tiempo, los agonistas β2 se han utilizado como
agentes tocolíticos para prevenir el parto prematuro, o para reducir la resistencia de la vías
aéreas durante el tratamiento de las enfermedades obstructivas de las vías aéreas como el
asma y para el broncoespasmo (Creticos, 1993).
La terbutalina es un agonista β2 selectivo que en clínica es conocida como un
broncodilatador ß2 selectivo. Esta se ha utilizado para el tratamiento prolongado de las
enfermedades obstructivas de las vías aéreas y para tratar el broncoespasmo agudo y su inicio
de acción va de 5 a 10 minutos con un tiempo de acción de 3 a 4 horas (Creticos, 1993;
Brown, 1993). Por otro lado, se ha utilizado en la prevención del parto prematuro, pero su
infusión continua produce complicaciones tales como dolor torácico, taquicardia, disnea y
edema pulmonar, por lo que su uso en obstetricia prácticamente ha desaparecido (Vera, 1998).
El uso continuo de terbutalina en el paciente con enfermedad obstructiva pulmonar o en el
asma genera otro tipo de efectos adversos tales como el tremor. Esta acción puede ser
explicada por estimulación de los receptores ß2 del músculo esquelético, el cual parece estar
provocando un aumento en la amplitud de los movimientos en el rango de frecuencia de los
temblores fisiológicos (Lulich et al. 1986).
Además, existen evidencias de que las aminas simpático miméticas modulan la
contracción y relajación en fibras de músculo esquelético de mamífero (Tomita, 1975;
Bowman 1980; Williams y Barnes, 1989). La naturaleza de la respuesta depende del tipo de
fibras del músculo: en fibras musculares de sacudida rápida, la fuerza medida al pico de la
sacudida se incrementa 10 a 20 % y la relajación se enlentece (Bowman y Zaimis, 1958;
Bowman et al. 1962; Tashiro 1973; Tomita 1975; Holmberg y Waldeck 1980). En este mismo
tipo de fibras, la amplitud del tétanos se incrementa en un 60 % y el tiempo de fusión es
disminuido (Bowman y Zaimis, 1958; Bowman y Nott, 1970; Holberg y Waldeck, 1980). En
contraste, la fuerza al pico de la sacudida es deprimida en un 10 a 25 % en fibras musculares
de sacudida lenta y la relajación de la sacudida es acelerada (Bowman y Zaimis 1958;
Bowman et al. 1962; Tashiro 1973; Tomita 1975). La amplitud del tétanos es disminuida en
un 60 % y la fusión se reduce (Bowman y Zaimis 1958; Bowman y Nott, 1970; Holberg y
Waldeck, 1980). Sin embargo, bajo algunas condiciones la fuerza se incrementa en músculos
de sacudida lenta (Tashiro 1973; Tomita 1975; Holberg y Waldeck, 1980) o en fibras tónicas
(Huerta et al. 1991). Asimismo, Cairns y Dulhunty (1993) mostraron que la terbutalina
produce un incremento en la fuerza de la sacudida y al pico del tétanos en músculo de
sacudida lenta de rata; y, disminuye la sacudida y la relajación del tétanos. Confirmando que
los receptores adrenérgicos en músculo esquelético de mamífero son predominantemente del
tipo ß2.
III.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La terbutalina es una amina simpático mimética que en clínica es conocida como un
broncodilatador ß2 selectivo. Esta se ha utilizado para el tratamiento prolongado de las
enfermedades obstructivas de las vías aéreas y para tratar el bronco espasmo agudo. Su uso
continuo en este tipo de tratamiento produce en los pacientes tremor. Este efecto ha sido
correlacionado con la estimulación de los receptores ß2 del músculo esquelético, el cual,
parece estar provocando un aumento en la amplitud de los movimientos en el rango de
frecuencia de los temblores fisiológicos.
El músculo esquelético de Rana se ha utilizado en modelos experimentales in vitro
para estudiar el efecto de algunos fármacos y la acción de estos es correlacionada con
cualquier tipo de músculo esquelético independientemente de la especie que se trate.
Las fibras musculares de la mayoría de los músculos esqueléticos de Rana son del tipo
de sacudida o fibras rápidas, sin embargo, las fibras tónicas solo constituyen un pequeño
porcentaje en algunos músculos tales como el iliofibularis, el piriformis y el cruralis. En
estudios in vitro, en fibras musculares rápidas explorando en la sacudida única y en el tétanos,
se observó que la terbutalina incrementa el pico de tensión y disminuye el tiempo de la
relajación.
Basados en lo anterior nos surgió la siguiente pregunta:
¿ La presencia de terbutalina en haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis
de Rana pipiens in vitro produce un aumento o una reducción en la fuerza contráctil?.
IV.- JUSTIFICACION.
Existen evidencias de que los receptores adrenérgicos en músculo esquelético de
mamífero son predominantemente del tipo ß2 (Cairns y Dulhunty, 1993). Si bién es cierto,
existen estudios sobre la actividad de las aminas simpático miméticas (entre ellas la
terbutalina) en músculo esquelético de mamífero como los realizados por Cairns y Dulhunty
(1993) donde en fibras musculares rápidas con sacudida única y en tétanos, ésta incrementa el
pico de tensión y disminuye el tiempo de la relajación en las preparaciones estudiadas. Sin
embargo, otras aminas simpaticomiméticas como la adrenalina ofrece acciones contradictorias
en el músculo esquelético de mamífero y rana (Huerta et al. 1991)
Por otro lado, aunque se conoce que el Ca++
extracelular es importante en el
mantenimiento de la contractura en fibras lentas (ver antecedentes), en fibras lentas de Rana
temporaria, la situación es menos clara. Lüttgau (1963), Gilly y Hui (1980) y Schmidt (1987)
fundamentan que no existe una influencia del Ca++
extracelular en el mantenimiento de la
tensión. Así, Schaechtelin (1961) y Nasledov et al. (1966) solo atribuyen al Ca++ un efecto
pequeño. De cualquier modo, el papel del calcio externo durante el mantenimiento de la
contractura permanece poco claro (Nasledov et al. 1966; Miledi et al. 1977; Gilli y Hui 1980).
Huerta, Muñiz y Stefani (1986), exploraron el efecto del Ca++ externo sobre las contracturas
por K+ y atribuyen la meseta de la contractura al Ca++ externo y el pico de la misma al Ca++
del RS. Así, estas dos acciones del Ca++ son moduladas por la adrenalina (Huerta et al. 1991).
Esta modula también la corriente entrante de Ca++ (Huerta et al. 1997). Así, aunque existen
estudios del efecto de las aminas simpático miméticas en fibras musculares de sacudida- lenta
(Bowman y Zaimis 1958; Bowman et al. 1962; Tashiro 1973; Tomita, 1975), no se han
realizado estudios con terbutalina en fibras lentas de rana.
V.- HIPÓTESIS.
La terbutalina es un agonista ß2 el cual participa modulando el acople entre la
excitación y la actividad contráctil del músculo esquelético cuando se une a receptores ß2. In
vitro, la presencia de terbutalina en haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis de
Rana pipiens produce una disminución de la fuerza contráctil.
5.1.- HIPÓTESIS NULA.
In vitro, la presencia de terbutalina en haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis
de Rana pipiens no produce una disminución de la fuerza contráctil.
5.2.- HIPÓTESIS ALTERNATIVA.
In vitro, la presencia de terbutalina en haces de fibras musculares lentas del músculo cruralis
de Rana pipiens produce un aumento de la fuerza contráctil.
VI.- OBJETIVO GENERAL.
Conocer el efecto de la terbutalina sobre el acople excitación contracción en los haces
de fibras musculares lentas del músculo cruralis de Rana pipiens.
6.1.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
1). - Elaborar una curva concentración-respuesta a la terbutalina en fibras lentas del músculo
cruralis de Rana pipiens.
2).- Estudiar el efecto de la terbutalina sobre el acople excitación contracción en haces de
fibras musculares lentas en músculos cruralis de Rana pipiens .
VII.- METODOLOGIA
7.1.- Diseño experimental.
7.2.- Universo de estudio
Se usaron ranas de la especie Rana pipiens de sexo indistinto, con un peso corporal
entre 20 y 40 g, las cuales fueron obtenidas del Bioterio de la Facultad de Medicina de la
Universidad de Colima. Las ranas fueron alimentadas a base de insectos y complementada con
hígado de pollo enriquecido con aceite de hígado de bacalao, expuestas a ciclos normales de
luz y oscuridad.
7.3.- Definición de las unidades de observación.
Haces pequeños (< 500 µm de diámetro) de fibras musculares tónicas de músculo
cruralis de Rana pipiens fueron sometidos a soluciones con alto K+ (40 mM) en presencia de
terbutalina. Con estas soluciones el fascículo desarrolla una contractura (contractura por K+ )
la cual presenta una fase inicial o pico seguida por una fase mantenida o meseta. La acción de
la terbutalina fue evaluada sobre estas fases de la contractura.
7.4.- Definición de la unidades de control.
Las unidades de control fueron los haces de fibras musculares tónicas de músculo
cruralis de Rana pipiens sometidos a contracturas con alto K+ (40 mM) en ausencia de
terbutalina y que referiremos más adelante como contracturas control.
7.5.- Criterios de Inclusión.
= Ranas de la especie Rana pipiens sanas.
= De uno y otro sexo.
= Con peso corporal entre 20 y 40 g.
= Que la contractura por K+ en el haz de fibras tónicas sea adecuado (presencia de pico y
meseta).
7.6.- Criterios de no inclusión.
= Ranas con patología aparente.
= Peso mayor a 40 g o menor a 20 g.
= Que la respuesta al K+ no sea adecuada.
7.7.- Criterios de eliminación.
= Ranas que no correspondan a la especie pipiens.
7.8.- Proceso experimental.
En este estudio el proceso experimental fue realizado en pequeños haces de fibras
tónicas de Rana pipiens disecados del músculo cruralis (Gilly, 1975 ), con un diámetro menor
a 500 µm. Una vez obtenidos, éstos fueron montados y perfundidos en un cámara
experimental de lucita, a temperatura ambiente (22 - 23 oC). Para el registro de tensión
isométrica el extremo dis tal del haz se fijó al fondo de la cámara experimental, sujeto con
alfileres entomológicos de acero inoxidable, y el otro extremo se sujetó al gancho de un
transductor mecanoeléctrico (Cambridge Technology 400 A) (fig.3). El transductor era
sostenido por un soporte que podía deslizarse, por medio de una cremallera fina, en el sentido
horizontal para ajustar la tensión basal del haz de fibras.
Figura 3.- En esta figura se muestra en una vista lateral del esquema del dispositivo
experimental donde se montaron los fascículos de fibras musculares lentas del músculo
cruralis de la Rana pipiens. En A, el fascículo de fibras lentas; en B, la cámara experimental
de lucita; en C, llave de 3 vías por la cual se perfunde el haz de fibras lentas; en D,
transductor mecanoeléctrico; en E, el tubo de succión con el cual se retiraban las soluciones
perfundidas, y en F, la cremallera (micromanipulador) para ajustar la tensión basal del
músculo.
Las señales producidas por el fascículo fueron amplificadas con un amplificador
Cyberamp 320 (Axon Instruments) e inscritas gráficamente con un registrador rectilíneo
(Gould 220). Las fibras fueron estiradas 1.3 veces de su longitud en reposo. Dadas las
características de la cámara experimental, la cual presenta una capacidad de 0.5 ml, el líquido
a través de ella podría ser recambiado en un tiempo no mayor de 3 segundos. Para el paso de
las soluciones, se uso una jeringa sin embola con capacidad para 10 ml. Los haces de fibras
fueron equilibrados por 3-5 minutos con un flujo constante (30 ml/min.) de la solución normal,
antes de aplicar la solución de contractura (alto potasio 40 mM). Una vez realizada la primer
contractura con alto potasio se mantuvo esta, por un espacio de tiempo de 7 minutos, siendo
lavado a perfusión continua con la solución normal. Antes de realizar la contractura de prueba
(en presencia de terbutalina) se realizaron por lo menos dos contracturas como testigo
(contracturas control). Entre cada contractura, se lavó la preparación con la solución normal
(ver soluciones) hasta alcanzar la línea basal, (de 15 a 25 min.). En presencia de la solución
normal, la preparación fue incubada por 5 minutos con solución normal a la cual se le había
agregado la concentración correspondiente de terbutalina. Posteriormente a este tiempo de
incubación se procedió a realizar la contractura de prueba con una perfusión continua (1.5 ml
por minuto) de la solución de alto contenido de potasio más terbutalina (solución de prueba)
ver soluciones. Las observaciones experimentales se hicieron para cada concentración
correspondiente de terbutalina en 5 haces de fibras (n = 5).
7.8.1.- Curva concentración respuesta.
Para la obtención de la curva concentración respuesta, se inició con concentraciones
bajas de terbutalina (0.l nM), mismas que fueron incrementadas en las diferentes series
experimentales hasta obtener la concentración efectiva máxima (CEmax). De estas curvas, se
obtuvo la Concentración efectiva 50 (CE50
).
7.8.2.-Contracturas en cero calcio
Otros haces de fibras musculares tónicas (n =5) fueron utilizados para la obtención de
contracturas en cero calcio, estos haces al igual que los anteriores fueron perfundidos con
Ringer rana normal, antes de obtener la contractura testigo con alto potasio (40 mM), después
de la contractura control o testigo, los haces fueron perfundidos con una solución con cero
calcio más 40 mM de KCl (ver soluciones) para obtener contracturas sin la fase sostenida, solo
con la fase inicial, (Huerta, Muñiz y Stefani; 1986). Se utilizó la solución de prueba en cero
calcio, ver soluciones, esta primera contractura que solo posee la fase inicial, la llamaremos
como testigo de cero calcio, posteriormente las preparaciones fueron incubadas en una
concentración de 10 µM de terbutalina (Posterino y Fryer 1999), obteniéndose el registro de
prueba en cero calcio, después del lavado se tomó un segundo registro de testigo en cero
calcio, regresando posteriormente a solución Ringer rana imidazol, para originar una nueva
contractura con alto potasio (40 mM) obteniéndose así un control final.
7.8.3.- Soluciones.
La solución normal (Ringer rana imidazol) estaba compuesta por: (mM) Na Cl, 117.5,
KCl, 2.5, CaCl2, 1.8. El pH fue ajustado con cloruro de imidazol (2 mM) a 7.4. La solución con
alto K+ (40mM) fue preparada por reemplazo isotónico del NaCl por KCl. La solución de
prueba (40 mM de KCl) con diferentes concentraciones de terbutalina fue preparada en la
solución con alto contenido de potasio, a la cual se le adicionó para cada experimento
concentraciones de terbutalina que variaron entre 0.1 nM, 1 nM, 0.5 µM, 1µM , 10 µM, hasta
100 µM respectivamente. Estas concentraciones fueron agregadas en forma separada a la
solución normal para incubar cada una de las preparaciones antes de adicionar la solución de
prueba (40 mM de KCl más terbutalina). La solución con cero calcio se preparó con los
mismos componentes de la solución Ringer rana imidazol, pero sin calcio, y adicionándole
EGTA Na+ (1mM), la solución con alto potasio y cero calcio fue preparada por reemplazo
isotónico de NaCl por KCl (40 mM KCl + EGTA Na+ y 0 CaCl2 ). La solución de prueba para
cero calcio (40 mM KCl + EGTA Na+ y 0 CaCl2) se le adicionó terbutalina para tener en
solución una concentración de 10 µM.
7.8.4 .- Reactivos.
Como fármaco de prueba se usó Terbutalina en sal obtenida de laboratorios SIGMA,
St. Louis MO; y para obtener las soluciones normal y de contractura se usaron las siguientes
Sales: KCl, NaCl, CaCl2 , Imidazol y EGTA Na+ obtenidas de laboratorios SIGMA, St. Louis
MO.
7.8.5.- Análisis estadístico:
Para el análisis estadístico de los datos se emplearon medidas de tendencia
central(medias) y de dispersión (desviación estándar y error estándar). Para determinar la
posible diferencia entre los promedios se utilizó la prueba “t” Student. El índice de confianza
utilizado fue de un 95 % y un error alfa del 5 %, considerando diferencia significativa si p <
0.05.
VIII.- RESULTADOS
8.1.- Efecto de la terbutalina sobre la contractura por K+.
En experimentos preliminares realizados en haces de fibras lentas del músculo cruralis
de Rana pipiens, se determinó el efecto de la terbutalina sobre contracturas con alto potasio
(40 mM). Véase en la figura 4 el efecto de la terbutalina con una concentración de 0.1 µM.
Figura 4 . En esta figura se muestra el efecto de la terbutalina a una concentración
de 0.1 µM. De arriba hacia abajo A y C representan los testigo, B representa la contractura
en presencia de terbutalina. a una concentración de 0.1 µM.
En los experimentos preliminares se puede apreciar como el efecto de la terbutalina
sobre la contractura con alto potasio fue dependiente de la concentración de ésta, en las figuras
5 y 6, se presenta el efecto para una concentraciones de terbutalina de 10 y 100 µM
respectivamente.
Figura 5 . En esta figura se muestra el efecto de la terbutalina a una concentración
de 10 µM. De arriba hacia abajo A y C representan los testigo, B representa la contractura
en presencia de terbutalina. a una concentración de 10 µM.
Figura 6 . En esta figura se muestra el efecto de la terbutalina a una concentración
de 100 µM. De arriba hacia abajo A y C representan los testigo, B representa la contractura
en presencia de terbutalina. a una concentración de 100 µM.
8.2.- Curva Concentración-Respuesta a la terbutalina en haces de fibras
lentas de Rana pipiens.
Para la obtención de la curva dosis respuesta se midió el efecto de la terbutalina sobre
el pico máximo de tensión de las contracturas producidas con alto potasio, en haces de fibras
de músculo cruralis. Se exploró un rango de concentraciones que fue desde 0.1nm, 1nm, 0.5
µM, 10 µM hasta 100 µM de terbutalina. El análisis estadístico fue significativo con una p <
0.05, para todas las concentraciones de terbutalina exploradas, comparadas con la contractura
testigo. La CE50 se encontró a una concentración de 3 µM de terbutalina (ver figura 7).
Figura 7.- En la cual se muestra la curva concentración-respuesta a la terbutalina.
Los puntos corresponden al promedio del efecto obtenido con la terbutalina ± el error
estándar del promedio (X ± E. E.). En las abscisas se presentan los logaritmos de diferentes
concentraciones de terbutalina y en las ordenadas el % de la disminución de la tensión pico
con respecto al testigo.
8.3.- Modulación del curso temporal al pico máximo de tensión por la
terbutalina.
Se analizó en cada registro el tiempo que tarda en instalarse el pico máximo de tensión
en ausencia y en presencia de terbutalina, el tiempo fue medido en segundos desde la línea
basal del inicio de la contractura hasta alcanzar la máxima tensión al pico. En presencia de dos
concentraciones diferentes de terbutalina, 1µM y 10 µM como se observa en la figura 8. En
presencia de ambas concentraciones de terbutalina existe un retraso al pico máximo de
tensión, que varia de 12 segundos para concentraciones bajas de terbutalina (1µM) , hasta 24
segundos para concentraciones de 10 µM de terbutalina.
8.4.- Recuperación del pico máximo de tensión después de la contractura
de prueba.
En todos los experimentos se realizó un registro testigo posterior a la contractura de
prueba a la cual se le llamará recuperación. La recuperación del pico máximo de tensión
registrado, fue total para concentraciones bajas de terbutalina y baja para concentraciones altas
de este fármaco (figura 9), el promedio de recuperación fue desde 97.3, 97.7, 80.5 y 59 %
para las siguientes concentraciones de terbutalina , 0.1 nm, 0.5, 1, 10 y 100 µM,
respectivamente.
8.5.- Efecto de la terbutalina en contracturas realizadas en cero calcio
(0 Ca++ ).
Para la medición de la actividad de la terbutalina en cero calcio se comparó el pico
máximo de tensión en contracturas realizadas en cero calcio, en ausencia de terbutalina,
contra el efecto presentado con la presencia de 10 µM de terbutalina (n= 5), obteniéndose una
disminución de la fuerza de contracción del pico máximo en un 18.88 % como promedio ±
3.9688249 D. E. con respecto al testigo (ver fig. 10).
Figura 8.- En esta figura se presentan dos registros representativos con dos
concentraciones de terbutalina A y C, son concentraciones testigo para A y B. En b se puede
apreciar el retraso en el inicio del pico de tensión máxima registrada en presencia de
terbutalina para concentraciones de 1 µM (en A) de 10 µM (en B).
RECUPERACIÓN POSTLAVADO
Figura 9.- En esta figura se presentan dos series de registros. En A con una
concentración baja de terbutalina (0.1 µM) y en B, con una concentración alta de terbutalina
(10 µM). Se puede observar en c, la recuperación del pico máximo de tensión con respecto a
las contracturas testigo (a) después de 1h de lavado con solución normal. En algunas
preparaciones se lavó hasta 1.5 horas y la recuperación fue muy similar.
Figura 10.- En esta figura se presenta un registro representativo con una
concentración de terbutalina de 10 µM en B, en cero calcio, obsérvese la disminución del pico
máximo de tensión con respecto al testigo (A). En A se presenta el registro de una contractura
en alto potasio (40 mM) y cero calcio mas EGTA (1mM), y en C el registro testigo
postlavado.
IX.- DISCUSION
La terbutalina es conocida como un agonista ß2 selectivo, lo cual es cierto a
concentraciones terapéuticas (10 µM), pero a concentraciones mayores (20 µM) presenta un
efecto ß1 y como efecto alfa. Este fármaco se ha utilizado para el manejo terapéutico del
asmático o en la amenaza de aborto. Sin embargo, aún a la dosis terapéutica citada,
administrada en forma sistémica produce efectos adversos tales como, nerviosismo, ansiedad,
inquietud y de mayor importancia que conduce a los pacientes a limitar su uso es el temblor
producido por la activación de receptores ß2 del músculo esquelético (Hoffman y Lefkowitz,
1996).
La disminución del pico máximo de tensión es dependiente de la concentración de
terbutalina como se puede apreciar en la figuras 4 y 5, de nuestros resultados. La disminución
del pico máximo de tensión producido por la terbutalina, fue estadísticamente significativo
(p<0.05) para concentraciones de 1.0 µM y mayores. Aunque esta concentración involucra
aquellas concentraciones comúnmente utilizadas en la terapéutica en el humano, es de
importancia aclarar que la terbutalina presenta cierto grado de unión a proteínas plasmáticas
y el medio en que se realizaron los experimentos se encuentra libre de este tipo de proteínas
(Hoffman y Lefkowitz, 1996). Aunque existen evidencias de que los receptores adrenérgicos
en músculo esquelético de mamífero son predominantemente del tipo ß2 (Cairns y Dulhunty,
1993). Los antecedentes que muestran los efectos de la adrenalina en fibras musculares
esqueléticas de rana sugieren que esta actúa como modulador al producir la liberación de Ca++
desde el RS (Huerta et al. 1991). Esto sugiere la existencia de receptores adrenérgicos en este
tipo de fibras lentas. Asimismo existen antecedentes que indican que la terbutalina a
concentraciones de 10 µM produce activación de receptores ß2 en músculo esquelético, esto
es, actúa como agonista selectivo ß2 (Hoffman y Lefkowitz, 1996).
En el presente trabajo la terbutalina produce disminución del pico máximo de tensión
en fibras musculares lentas del músculo cruralis de la Rana pipiens. Así los cambios en el
pico de tensión máxima, sería indicativo de la existencia de receptores adrenérgicos, y, siendo
la terbutalina un agonista selectivo ß2, hace posible sugerir que la existencia de estos
receptores ß2 en la membrana de las fibras lentas de músculo cruralis de la Rana pipiens, al
igual que sucede en fibras musculares lisas (Hoffman y Lefkowitz, 1996). De manera similar
la terbutalina en las fibras musculares lisas y en las fibras tónicas produce disminución de la
fuerza de la contracción. En el caso de las fibras musculares lentas del cruralis de rana, la
disminución del pico máximo de tensión es el resultado de una disminución en la liberación
de calcio del RS durante la activación de este tipo de receptores, como se demuestra con la
disminución del pico máximo de tensión producido por la terbutalina en cero calcio, ver figura
8, (Huerta, Muñiz y Stefani; 1986).
El retraso producido por la terbutalina en alcanzar el pico máximo de tensión y la
disminución de la amplitud del pico de tensión en presencia de terbutalina (ver figura 4 , 5 y
8), sugiere que la terbutalina no solo está afectando la cantidad de Ca++ liberado por el RS ,
sino la velocidad en que este Ca++ es liberado por el mismo RS ( Hayatsu et al. 1981;Huerta et
al. 1991).
Aunque para concentraciones bajas de terbutalina (0.1nm y 1.0 µM) la recuperación
del pico máximo de tensión es casi completa (hasta un 97 % respecto al testigo), ésta difiere
mucho para concentraciones mayores (10 y 100 µM), donde la recuperación es incompleta
(80.5 hasta un 59 % respecto al testigo). Al parecer, la recuperación es dependiente de la dosis.
Sin embargo, es muy posible que la recuperación sea incompleta solo para el tiempo de lavado
estudiado, y aunque se dejaron para algunas preparaciones hasta 1.5 horas la recuperación no
fue total. Esto podría atribuirse a un efecto metabólico producido por la activación de los
receptores β y la cascada de segundos mensajeros. Por otro lado, la lesión de la fibra podría
ser otra posibilidad que pudiese explicar la recuperación incompleta de los fascículos después
del lavado.
X.- CONCLUSIONES
De los resultados obtenidos en la presente tesis se puede concluir lo siguiente:
1).- La terbutalina reduce la tensión de las fibras musculares lentas de rana.
2).- La disminución del pico máximo de tensión con terbutalina es dependiente de la
concentración de ésta.
3).- La disminución en el pico máximo de contracción encontrada, es el resultado de una
menor disminución en la liberación de Ca++ por el RS.
4).- El efecto de la terbutalina sugiere ser el resultado de una activación de receptores beta 2
adrenérgico.
5).- El retraso en la producción del pico máximo de tensión se debe a dos posibles efectos :
a).- Una disminución en la liberación de Ca++ por parte del RS.
b).- Un disminución en la velocidad de liberación de calcio por RS.
O ambos efectos.
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