Andrés Antón Pagarolasaanton@vhebron.net

Unidad de Virus Respiratorios - Servicio de Microbiología

Hospital Universitari Vall d’Hebron

El Laboratorio de Microbiología frente a las Emergencias Víricas: Virus Respiratorios (Re-)Emergentes

Infección Respiratoria. Agentes Etiológicos / Infección Respiratoria.

Las infecciones respiratorias, destacando la NAC, están causadas por diferentes

microorganismos patógenos, como bacterias, virus, hongos y parásitos. En

menos de un 50% de los casos se llega a un diagnóstico del agente etiológico

causal (aún con los métodos moleculares).

Nuevos métodos diagnósticos más sensibles

Nuevos métodos moleculares independientes de secuencia (NGS)

Vacunación: S. pneumoniae, H. influenzae B (menor %)

Bacterias Virus

Semin Respir Crit Care Med 2012;33:220–231.

Infección Respiratoria. Agentes Etiológicos.

Los virus respiratorios más comunes asociados a infección respiratoria son:

• Virus de la gripe (A, B y C)

• Virus respiratorio sincitial (VRS-A y B)

• Virus parainfluenza (HVPI-1, 2, 3, 4a, 4b)

• Coronavirus (HCoV-229E, NL63, OC43, HKU1)

• Enterovirus (HEVA, B, C y D)

• Rinovirus (HRV-A, B y C)

• Parechovirus (HPeV1-6)

• Adenovirus (HAdVA-F)

• Metapneumovirus (HMPVA y B)

• Bocavirus (HBoV1-4)

• Poliomavirus (PyV KI y WU)

Otros virus con menor frecuencia:

• Virus varicela-zoster

• Hantavirus

• Virus de Epstein Barr

• Herpesvirus 6 y 7

• Virus del herpes simple

• Mimivirus

• Citomegalovirus (CMV)

• Virus del sarampión

Curr Opin Pulm Med 2012, 18:271–278

En realidad el papel de algunos de

los virus respiratorios “ya

reconocidos” como causa etiológica

de IRA todavía es discutido.

Infección Respiratoria. Virus (re)emergentes

Virus zoonóticos:

Cruzan barrera interespecie – adaptación:

• Causa de brotes epidémicos (c/ o s/ estacionalidad)

• Causa de enfermedad respiratoria grave (casos esporádicos).

Subtipos Virus de la Grip A:

Drifted-seasonal viruses, H5N1, H3N2v, H7N9, H5N1, H5N8

SARS-CoV

MERS-CoV

EV-D68

HAdV-14

Virus respiratorios humanos:

Desconocidos hasta el momento de ser revelada su presencia con

los nuevos métodos moleculares de diagnóstico.

Infección Respiratoria. Métodos de Diagnóstico Microbiológico.

En la mayoría de los casos, la inespecificidad del cuadro clínico hace

necesaria la realización de un diagnóstico microbiológico para determinar el

agente etiológico.

Características Principales:

Rápido: Herramienta apropiada en el manejo temprano de la infección.

En caso de alerta sanitaria: detección precoz medidas Salud Pública.

Fundamental: coordinación entre epidemiólogos, clínicos y microbiólogos.

Preciso: Permite determinar el agente etiológico causal.

Para:Tratamiento antiviral, si es posible. Cambio pauta antibiótica.

Medidas de control para evitar transmisión nosocomial.

Reducir coste pruebas diagnósticas adicionales.

Mayor información (+ caracterización genética / fenotípica, + info clínica): Presentación clínica asociada a la infección.

Coinfecciones virales / bacterianas asociadas (pronóstico)

Gravedad / grupos de riesgo / estado inmunitario de la población

Estacionalidad / vigilancia virológica / evolución genética.

Diseño de vacunas / antivirales (gripe, VRS, hAdV, …)

Diagnóstico microbiológico. Opciones Disponibles.

PCR de Diagnóstico

0 días 1 2 3 7- sem- meses

POC-PCR

Tipado / Subtipado

Resistencia Antivirales

(M. genotípico)

Epidemiología Molecular

Recepción Muestras

Detección

Caracterización

Adaptado de Bertelli C and Greub C. CMI 2013

NGS

Base datos local

Base datos

Identificación

Sensibilidad

Factores virulencia

Tipado

Resistencia Antivirales

(M. fenotípico)

Aislamiento Cultivo celular

Detección Antígeno

Técnicas serológicas

Diagnóstico microbiológico. Alerta Sanitaria.

Pero sin duda lo principal frente a una alerta sanitaria…

… es actuar como muchos de los virus emergentes (virus ARN) ...

… de nuestra metodología, recursos y conocimientos.

EVOLUCIÓN

Y ADAPTACIÓN

Diagnóstico microbiológico. Alerta Sanitaria.

Y la primera pregunta antes de proceder a realizar/solicitar las

primeras determinaciones para el diagnóstico:

Sospecha clínica / Epidemiología

MERS-CoV

http://www.ecdc.europa.eu

H7N9

La confirmación de laboratorio para virus emergentes debe

realizarse en paralelo a la detección de los agentes etiológicos

habitualmente detectados en la comunidad (sin demoras).

Diagnóstico microbiológico. Sospecha / Probable / Confirmado (MERS-CoV).

Consultar definición de caso:MERS-CoV (14 July 2014): http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/case_definition/en/

Confirmed case

A person with laboratory confirmation of MERS-CoV infection,1 irrespective of clinical signs and symptoms.

Laboratory confirmation: detection of viral nucleic acids or serology.

Probable case

A febrile acute respiratory illness with clinical, radiological, or histopathological evidence of pulmonary

parenchymal disease (e.g. pneumonia or Acute Respiratory Distress Syndrome) AND Direct epidemiologic

link with a confirmed MERS-CoV case AND Testing for MERS-CoV is unavailable, negative on a single

inadequate specimen3 or inconclusive4

A febrile acute respiratory illness with clinical, radiological, or histopathological evidence of pulmonary

parenchymal disease (e.g. pneumonia or Acute Respiratory Distress Syndrome) AND The person resides or

travelled in the Middle East, or in countries where MERS-CoV is known to be circulating in dromedary

camels or where human infections have recently occurred AND Testing for MERS-CoV is inconclusive.

An acute febrile respiratory illness of any severity AND Direct epidemiologic link with a confirmed MERS-

CoV case AND Testing for MERS-CoV is inconclusive.

Direct Epidemiologic Link: The epidemiological link may have occurred within a 14-day period before or

after the onset of illness in the case under consideration.

Diagnóstico microbiológico. Toma de la Muestra.

Nuevos Métodos Diagnóstico & Viejos Problemas

Toma de muestra: Determina en buena medida la sensibilidad de una técnica.

Factores a tener en cuenta:

• Localización: tracto respiratorio superior (TRS) / inferior (TRI).

Virus con gran tropismo TRI (MERS-CoV): las muestras de TRI (AT, BAL, esputo)

presentan mayor carga viral, por lo que es posible TRS (-) / TRI (+).

• Tipo de muestra condiciona sensibilidad: ANF > FNF >> FOF / FF / FN.

En el caso de algunos virus como MERS-CoV, se recomienda recoger otras muestras

como sangre (suero), orina y heces (menor carga viral no Dx).

• Cuando (días desde inicio de los síntomas):

A más días desde +0, menor excreción viral.

• Conservación en condiciones óptimas.

Diagnóstico microbiológico. Detección de Antígeno.

Detección de antígeno (IC / IFA):

Métodos basados en la detección directa/indirecta del antígeno viral utilizando

anticuerpos monoclonales (inmunocromatografía capilar, IC;

enzimoinmunoanálisis, EIA; o inmunofluorescencia, IF).

Técnicas relativamente sencillas, rápidas y económicas.

Presentan menor sensibilidad (IC: 10-75%; IFA: 50-80%) vs. los métodos

moleculares (no se recomiendan en el paciente adulto: menor carga viral, menor

periodo excreción, …). VPP elevado en periodo epidémico.

Inconveniente: Posibles reacciones cruzadas entre virus relacionados

(antigénicamente).

Métodos comerciales:

IFA: VGA, VGB, HAdV, HVPI-1, 2, 3, VRS y HMPV.

IC: VGA, VGB y VRS.

Para virus de la gripe las técnicas IC presentan una variabilidad en la

sensibilidad según subtipos (especialmente para subtipos no estacionales)

==> NO SE RECOMIENDA su utilización.

MERS-CoV (IFA): no disponibles (pendiente de diseño y comercialización)

Diagnóstico microbiológico. Métodos Moleculares.

Métodos Moleculares:

Demostración de la presencia de un virus respiratorio a partir de la detección de su

material genético (ARN / ADN): PCR simple, PCR multiple, Nested-PCR, PCR en

tiempo real, NASBA, LAMP, PCR+microarrays, PCR+EIA

Ventajas:

• Rápido, sensible (5x).

• Identificar / detectar diferentes dianas (diferentes canales) (multiplex).

• No se ve afectado por pequeñas concentraciones residuales de antiviral.

• Capacidad para detectar virus no viables.

• Posibilidad de automatización: menor RRHH, menos errores, mayor rendimiento.

• Capacidad de adaptación de dianas / incorporación nuevas dianas.

Inconvenientes:

• Presencia de inhibidores en algunas muestras.

• Exige revisión periódica para evitar perdida de sensibilidad por acumulación de

mutaciones en las regiones diana (iniciadores y sondas) en cepas circulantes

(problema: sistemas comerciales).

• Capacidad de cuantificación: valorable.

• Elevado coste vs. métodos detección de antígeno (IF).

Diagnóstico microbiológico. Métodos Moleculares.

Métodos Moleculares:

Métodos rápidos:

VENTAJAS

• Simplicidad de uso

Extracción + PCR + lectura

• Resultado rápido.

• Alta sensibilidad / especificidad.

INCONVENIENTES

• Coste elevado.

• Patógeno-específico.

Métodos Moleculares. Influenza Virus (tipado / subtipado)

Muestras clínicas

Alícuotas

Aislamiento CC

Extracción ARN

PCR A/B (M, NP)

Positiva

Negativa

PCR HA (16) / NA (9)

Colección

5%

Todas las muestras no tipables con

Cts bajas (carga viral elevada) deben

ser especialmente caracterizadas

Estudios

adicionales

Métodos Moleculares. Influenza Virus (caracterización genética)

Secuenciación (parcial / completa):

Métodos Moleculares. Influenza Virus (drifted viruses y reordenamientos)

Secuenciación (parcial / completa):

Métodos Moleculares. Influenza Virus (Resistencia Antivirales)

Métodos genotípicos:

Emerg Infect Dis. 2015;21(1):136-41

Most patients infected with an oseltamivir-

resistant influenza A(H1N1)pdm09 virus had no

prior exposure to oseltamivir. These findings are

consistent with a low, and locally variable,

level of circulation of resistant viruses.

VIGILANCIA VIROLÓGICA

(paciente hospitalizado)

A(H1N1) – H275Y

Temp 2007 - 2008

Métodos Moleculares. Influenza Virus (Resistencia Antivirales)

Mutaciones de Compensación (+H275Y):

R222Q, V234M y D344N

(ausencia de presión farmacológica)

A(H1N1)pdm09 H275Y viruses was

detected among patients without prior

oseltamivir exposure

V241I, N369K y N386S

¿mutaciones de compensación?

Scientifica (Cairo). 2014;2014:430629

US A(H1N1)pdm09 2013-2014:

All had V241I and N369K.

≈10% of resistant viruses and

≈20% of susceptible viruses had

an additional substitution (N386K)

Emerg Infect Dis. 2015;21(1):136-41

Métodos Moleculares. Influenza Virus (Resistencia Antivirales)

Secuenciación Sanger (parcial o completa de NA).

RT-PCR Restriction-Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Real time RT-PCR: Discriminación alélica (SNPs).

Ultra-Deep Sequencing (por ejemplo, pirosecuenciación)

Ventajas: rapido, directo de muestra, sencillo.

Desventajas: solo SNPs caracterizados, mezclas, correlación

con fenotipo.

120

140

160

180

200

220

240

260

E S G C A T C G A T A

T:100% C:0%

5

C 100%

T 0%

C 81%

T 19%

C 24.9%

T 75.1%

C 0%

T 100%

120

140

160

180

200

220

240

260

E S G C A T C G A T A

T:100% C:0%

5

C 100%

T 0%

120

140

160

180

200

220

240

260

E S G C A T C G A T A

T:100% C:0%

5

C 100%

T 0%

C 81%

T 19%

C 81%

T 19%

C 24.9%

T 75.1%

C 24.9%

T 75.1%

C 0%

T 100%

C 0%

T 100%

Secuenciación

Sanger (>20 %)

Ultra-Deep

Sequencing

Métodos Moleculares. MERS-CoV

Caso confirmado:

(1)Detección de al menos de dos dianas, o

(2)Detección de una diana + secuenciación a partir de otra.

Considerado muy sensible (screening)

Hasta el momento no se han detectado falsos resultados

positivos al detectar otros coronavirus humanos (cross-

reactivity).

Confirmación

N: nucleocapsed; Orf: open reading frame; RdRp: RNA-dependent RNA polymerase

Dos regiones genómicas:

RNA‐dependent RNA polymerase (RdRp):muy

conservada en hCoV,

y, gen Nucleocapside (N)

TGEV (G1a) NC002306

FIPV (G1a) AY994055

FIPV (G1a) AF124987

PRCV (G1a) DQ811787

btCoV-HKU2 (G1b) EF203064

NC005831

AY567487HCoV-NL63 (G1b)

btCoV-HKU8 (G1b) NC010438

BtCoV/ 512/ 2005 (G1b) NC009657

BtCoV1A (G1b) NC010437

BtCoV1B(G1b) NC010436

NC003436

AF353511PEDV (G1b)

AF304460

NC002645HCoV-229E (G1b)

Alfa-CoV

Gamma-CoV NC010646

TCoV (G3a) NC010800

TCoV (G3a) AF124991

NC001451

Z30541IBV (G3a)

Gamma-CoV

MuCoV-HKU13 (G3c) NC011550

BuCoV-HKU11 (G3c) NC011548

ThCoV-HKU12 (G3c) NC011549

Delta-CoV

btCoV-HKU5 (G2c) NC009020

btCoV-HKU4 (G2c) NC009019

London1novelCoV2012nsp12(partial)

btCoV-HKU9 (G2d) NC009021

bat-SARS-CoV (G2b) NC009694

AY313906

NC004718SARS-CoV (G2b)

HCoV-HKU1 (G2a) NC006577

NC006852

X51939MHV (G2a)

SDAV AF124990

ECoV (G2a) NC010327

AF391541

NC003045BCoV (G2a)

CRCV AY150273

AF124988

NC007732PHEV (G2a)

AY391777

NC005147HCoV-OC43 (G2a)

Beta-CoV

100

100

100

100

100

100

100

99

100

100

84

100

100

79

99

76

77

79

100

99100

97

97

95

87

0,05

No concluyente

Métodos Moleculares. EV-D68

J. Virol. April 2012 vol. 86 no. 7 3905-3915

Phylogeny and GENETIC classification of thePicornaviridae.

Shown is a maximum likelihood phylogeny of 38

picornaviruses representing species diversity based on the

family-wide conserved proteins 1B, 1C, 1D, 2C, 3C, and 3D.

Importante: Necesidad de revisar la

sensibilidad y especificidad de

nuestros métodos moleculares

(también los comerciales).

Métodos de diagnóstico microbiológico. Aislamiento Cultivo Celular

Aislamiento Cultivo Celular / Huevo Embrionado:

Diagnóstico (3 – 21 días), en diferentes líneas celulares (según virus).

Método más “universal” que métodos moleculares (no dependiente de secuencia),

aunque sensible a divergencia genética (H3N2: MDCK / MDCK-SIAT1).

Permite recuperar la cepa para estudios posteriores (selección de variantes in-vitro).

Viabilidad / capacidad infectiva del virus.

Confirmación aislamiento: IFA / IHA / Actividad Neuraminidasa. No se recomienda

utilización de PCR para la confirmación del aislamiento.

Nivel bioseguridad: gripe estacional (BSL-2), otros subtipos, MERS-CoV (BSL-3).

Métodos de diagnóstico microbiológico. Caracterización antigénica.

Inhibición Hemaglutinación

(IHA)

Influenza Virus. Resistencia Antivirales (métodos no moleculares)

Métodos fenotípicos:

Method Speed* Sensitivity RobustReagent

Cost

Specialist

Equipment

Skill

Level

Standardised

SOP

Kit

Available

MUNANA 4-6 hrs ++ ++ $ Fluorimeter + No No

NA Star 1-2hrsa +++ ++ $$$ Luminometer + Yes Yes, ABI

Ventajas:

Se puede cuantificar el perfil de resistencia de una

cepa (actividad enzimática NA).

Detecta cualquier cambio de sensibilidad: nuevas

mutaciones, sinergia entre mutaciones, pérdida de

actividad requiere asociación con carac. molecular.

Inconvenientes:

Siempre a partir de aislamiento en cultivo celular.

Requiere estandarización (panel WHO).

Requiere equipamiento adicional / entrenamiento.

Los resultados no son comparables entre ambos

métodos.

Métodos de diagnóstico microbiológico. Influenza A Virus

Existe correlación entre la presencia (en diferentes % de una mezcla de

variantes para una mutación caracterizada) y el perfil de resistencia observado.

Métodos de diagnóstico microbiológico. Métodos serológicos.

(Micro)neutralizaciónInhibición

Hemaglutinación

Diagnóstico (sueros pareados): suero fase aguda – suero fase convalescente.

Estudios sero-epidemiológicos: seroprevalencia.

No se acostumbran a utilizar en laboratorio para diagnóstico (laboratorios de

referencia). Dificil disponibilidad de reactivos comerciales para virus de la gripe

no-estacionales. Se pueden necesitar condiciones BSL-3 para neutralización.

Establece la presencia de anticuerpos

frente a diferentes tipos / subtipos.

Utilizado para virus de la gripe y otros

con capacidad de hemaglutinación.

Los títulos de los anticuerpos

neutralizantes son fiables y representan

estado real de protección (para virus

capaces de replicar in-vitro)

Aplicaciones potenciales: Descubrimiento de patógenos (Metagenómica): independiente de secuencia de referencia.

Análisis de diversidad viral entre- y intra-huesped, y evolución(Ultra-deep sequencing / Whole Genome

Sequencing):

Sensibilidad antivirales; Genotipado viral; Epidemiología molecular; Diseño nuevas antivirales y

vacunas

Estudios de interacción huesped-parásito (RNA-sequencing).

Análisis del transcriptoma (factores virales con capacidad inmunomoduladoras, por ejemplo)

Factores del huesped asociados a mayor susceptilidad / virulencia a la infección.

Investigación factores del huesped y asociación con una mayor predisposición a la infección (genes

involucrados en respuesta inmune), farmacogenómica (medicina personalizada).

Métodos de diagnóstico microbiológico. Next Generation Sequencing (NGS)

Los procesos en un laboratorio de Microbiologia se pueden

clasificar en:

1. Detección.

Aislamiento en cultivo celular.

Detección de antígeno.

Métodos moleculares.

2. Identificación.

3. Estudios de sensibilidad (antivirales).

4. Epi. / Caract. Molecular.

Factores de virulencia.

Mutaciones de resistencia.

Estudios de epidemiologia molecular.

PLoS Pathog 2012;8: e1002824

VIGILANCIA VIROLÓGICA

Virus (Re-)emergentes. Informació Adicional / Informació Actualitzada

Influenza. World Health Organization (WHO)

http://www.who.int/topics/influenza/en/

Coronavirus Infections. Global Alert and Response. WHO.

http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/en/

Manual for the laboratory diagnosis and virological surveillance of influenza.

WHO Global Influenza Surveillance Network.

http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548090_eng.pdf

European Influenza Surveillance Network (EISN).

European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC).

http://www.ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EISN/Pages/index.aspx

ECDC Communicable Disease Threats Reports (CDTR).

http://www.ecdc.europa.eu/en/activities/epidemicintelligence/pages/epidemicintelligence

_threatcommunicationcdtr.aspx

Andrés Antón Pagarolas

Unitat de Virus Respiratoris / Secció de Virologia

Laboratori de Microbiologia (segona planta, box 220)

Hospital Universitari Vall d’Hebron

Grup de Recerca Consolidat (2014 SGR 1194)

Passeig de la Vall d’Hebron, 119-129 | 08035 Barcelona | Tel. 93 274 00 00 (ext 6918)

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